Name: Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj metody badania migracji i inwazji komórek in vitro, w tym test zamknięcia rany oraz transwell. Techniki te pozwalają analizować dynamikę ruchu komórkowego w biologii nowotworów i immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Mike'owi Mylesowi, Samowi Saundersowi i C.W. Eltonowi z ECU Multimedia & Technology Services za pomoc w produkcji wideo. Dziękujemy za wsparcie grantowe ze strony North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association oraz ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. i M.J.R.).

1. Test zamykania ran w hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Odłącz komórki od płytki do hodowli tkankowej za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Osad komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej. Umieść odpowiednią liczbę komórek na 6-dołkowej płytce, aby uzyskać 100% konfluencję w ciągu 24 godzin. 
	Uwaga: Mogą być konieczne testy w celu określenia czasu i liczby komórek, aby osiągnąć 100% zbieżność ze względu na typ komórki i wielkość używanej studzienki (na przykład 1 x 106 komórek czerniaka B16F10 wysiewa się w studzience 6-dołkowej płytki 24 godziny przed generacją rany). Alternatywnie można użyć płytek 12-dołkowych lub 24-dołkowych. 
	Uwaga: Jeśli jest to możliwe, komórki można wysiać do wkładki hodowlanej (firmy ibidi LLC) na poddanej działaniu metody hodowli tkankowej, dzięki czemu rana jest wstępnie odlewana. Wkładka hodowlana może chronić powierzchnię płytki do hodowli tkankowej przed uszkodzeniem przez końcówkę pipety. Jeśli używana jest wkładka kulturowa, należy pominąć krok 1.2.</li>
	<li>W sterylnym środowisku (zazwyczaj kaptur bezpieczeństwa biologicznego) użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby mocno docisnąć do górnej części płytki do hodowli tkankowej i szybko wykonaj pionowe nawinięcie w dół przez monowarstwę komórki. Można użyć końcówki do pipety o innym rozmiarze, aby uzyskać pożądany rozmiar rany. Nie należy używać nadmiernej siły doczepianej końcówki pipety do hodowli tkankowej, ponieważ może to uszkodzić powierzchnię. Jeśli rana jest wstępnie zagipsowana, ten krok można pominąć.</li>
	<li>Ostrożnie zassać pożywkę i resztki komórek. Powoli dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej do ściany studzienki, aby przykryć dno studzienki i uniknąć odłączania dodatkowych komórek. Po wytworzeniu i oględzinach rany należy wykonać wstępne zdjęcie. Umieścić płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze ustawionym na odpowiednią temperaturę i stężenie CO2 (zwykle 37 °C i 5% CO2 ).</li>
	<li>W kilku momentach, np. co 3 godziny, wyjmuj płytkę z inkubatora i umieszczaj ją pod mikroskopem odwróconym, aby wykonać migawkę i sprawdzić, czy rana się zamknęła. Jeśli dostępna jest mikroskopia poklatkowa, rób zdjęcie co X minut (zwykle zaczynając od co 5 minut) przez dowolny czas w komorze o kontrolowanej temperaturze i CO2 . W zależności od typu ogniwa czas zamykania rany może się różnić.</li>
	<li>Aby przeanalizować wyniki zdjęć migawkowych, zmierz odległość jednej strony rany od drugiej za pomocą podziałki liniowej. Przeanalizuj i przejrzyście przedstaw zamykanie się ran w czasie za pomocą wykresu punktowego lub wykresu słupkowego, np. Rysunek 1.</li>
	<li>Aby przeanalizować zdjęcia poklatkowe, zaimportuj je do oprogramowania ImageJ (dostępnego bezpłatnie pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/), aby nagrać wideo. Aby to zrobić, otwórz ImageJ, kliknij Plik, Importuj i Sekwencja obrazów. Znajdź plik ze zdjęciami; Kliknij pierwsze zdjęcie w pliku. Zapisz wideo, wybierając Plik, Zapisz jako i AVI. Można zaobserwować pojedyncze migrujące komórki, aby scharakteryzować ruch kierunkowy. Ponadto można również badać cechy morfologiczne, takie jak tworzenie się blaszek i cofanie się krawędzi spływu (ryc. 2 i film uzupełniający).</li>
</ol>
2. Test migracji i inwazji komórek Transwell
<ol>
	<li>W sterylnym środowisku (zazwyczaj kaptur bezpieczeństwa biologicznego) odłącz komórki od płytki do hodowli tkankowej za pomocą nieenzymatycznego bufora dysocjacyjnego komórek lub 0,25% roztworu trypsyny-EDTA, osadź komórki przez odwirowanie i odessaj istniejące podłoże opuszczające granulowane komórki. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórek wolnych od surowicy zawierającej 0,1% BSA (albumina surowicy bydlęcej). 
	Uwaga: W zależności od badanej linii komórkowej 0,25% trypsyny-EDTA może wpływać na migrację i inwazję komórek z powodu rozszczepienia różnych receptorów na powierzchni komórki17, 
	Uwaga: Liczba komórek na ml zależy od wielkości komórek. Mogą być potrzebne dalsze testy, aby znaleźć gęstość wysiewu, która zapewnia najlepsze wyniki. Zazwyczaj 1 x 106 komórek/ml jest dobrym punktem wyjścia dla większości typów komórek podczas korzystania z 24-dołkowej wkładki transwell. Istnieje szereg rozmiarów wkładek transwell, a liczba dodawanych komórek powinna być odpowiednio dostosowana.</li>
	<li>Umieścić 100 μl roztworu komórkowego na membranie filtracyjnej we wkładce transwell i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić komórkom ustabilizowanie się. 
	Uwaga: Konkretna wielkość porów zastosowanej membrany transwell zależy od indywidualnej wielkości komórek w próbce. Na przykład, jeśli komórki są zbyt małe, mogą przejść przez pory bez konieczności ułatwiania migracji lub jeśli są zbyt duże, mogą nie zmieścić się w porach. Istnieje kilka wkładek transwell o rozmiarach porów w zakresie od 3 μm, 5 μm i 8 μm do testów migracji komórek. Wkładki transwell są dostępne w handlu w firmach takich jak Corning. 
	Uwaga: Test migracji transwell można łatwo zmodyfikować w celu przeprowadzenia testu inwazji komórek. Aby to zrobić, dodaj materiały macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na wierzchu membrany transwell, a następnie dodaj komórki na wierzchu ECM. Na przykład Matrigel rozmraża się i upłynnia na lodzie, a następnie 30-50 μl Matrigelu dodaje się do 24-dołkowej wkładki transwell i zestala w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 15-30 minut, tworząc cienką warstwę żelu. Roztwór komórkowy dodaje się na wierzch powłoki Matrigel, aby symulować inwazję przez macierz zewnątrzkomórkową. 
	Uwaga: Istnieją wyraźne różnice między testami migracji komórek transwell a testami inwazji komórek transwell. Test migracji komórek transwell mierzy zdolność chemotaktyczną komórek w stosunku do chemoatraktantu. Test inwazji komórek transwell mierzy jednak zarówno chemotaksję komórek, jak i inwazję komórek przez macierz zewnątrzkomórkową, proces, który jest powszechnie spotykany w przerzutach raka lub rozwoju embrionalnym.</li>
	<li>Za pomocą pipety bardzo ostrożnie dodaj 600 μl pożądanego chemoatraktantu na dno dolnej komory na 24-dołkowej płytce. Dodaj chemo-atraktant bez przesuwania wkładki transwell i unikaj generowania pęcherzyków. Upewnij się, że ciecz chemoatraktantyczna w dolnej studzience styka się z membraną w górnej studzience, tworząc gradient chemotaktologiczny. Czas inkubacji zależy od typu komórki i stosowanego chemoatraktantu. 
	Uwaga: W celu określenia okresu inkubacji mogą być konieczne dalsze badania. 
	Uwaga: W przypadku komórek przylegających, migrowane komórki przyczepią się do drugiej strony błony1,8. Oznaczanie ilościowe migrowanych komórek można przeprowadzić zgodnie z krokami od 2.4 do 2.8 (kroki 2.4-2.8 nie muszą być wykonywane w sterylnym środowisku). W przypadku komórek nieprzylegających migrowane komórki wpadną do pożywki w dolnej komorze. Liczbę migrowanych komórek można policzyć za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego5.</li>
	<li>Wyjmij wkładkę transwell z płyty. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką tyle razy, ile to konieczne, aby ostrożnie usunąć podłoże i pozostałe komórki, które nie migrowały z górnej części membrany, nie uszkadzając jej.</li>
	<li>Dodaj 600-1,000 μl 70% etanolu do dołka na 24-dołkowej płytce. Umieść wkładkę transwell w 70% etanolu na 10 minut, aby umożliwić utrwalenie komórek. Wyjmij wkładkę transwell z płytki 24-dołkowej i użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć pozostały etanol z górnej części membrany. Pozostaw membranę transwell do wyschnięcia (zwykle 10-15 minut).</li>
	<li>Dodaj 600-1,000 μl 0,2% fioletu krystalicznego do dołka 24-dołkowej płytki i umieść w niej membranę w celu barwienia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.</li>
	<li>Delikatnie usuń fiolet krystaliczny z górnej części membrany za pomocą końcówki pipety lub aplikatora z bawełnianą końcówką. Bardzo ostrożnie, aby uniknąć zmycia utrwalonych komórek, zanurz membranę w wodzie destylowanej tyle razy, ile potrzeba, aby usunąć nadmiar fioletu krystalicznego. Pozostaw membranę transwell do wyschnięcia.</li>
	<li>Spójrz pod odwrócony mikroskop i policz liczbę komórek w różnych polach widzenia, aby uzyskać średnią sumę komórek, które migrowały przez błonę w kierunku chemoatraktantu i przyczepiły się na spodniej stronie błony (ryc. 3).</li>
</ol>

<ol><li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+to+apoptotic+%26%2334%3Bfind-me%26%2334%3B+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Migration to apoptotic &#34;find-me&#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li>
<li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li>
<li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li>
<li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li>
<li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li>
<li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+determinants+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%22%5BJournal%5D)">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li>
<li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li>
<li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+new+insights+into+cancer-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li>
<li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li>
<li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Migracja komórek jest ważnym aspektem do zbadania w badaniach nad rakiem i może być również zastosowana w badaniach rozwojowych, immunologicznych i gojenia ran. Test zamykania ran w hodowli komórkowej oraz testy migracji i inwazji komórek transwell ujawniają szczegółowe informacje na temat zachowań migracyjnych komórek i mogą być wykorzystane do zbadania molekularnych mechanizmów migracji komórek1,2,10,14. W naszym badaniu wykorzystaliśmy te testy ruchliwości komórek do określenia prędkości migracji i zdolnośc...

Ruchliwość jest istotną cechą żywych komórek. Migracja komórek bierze udział w poczęciu życia, rozwoju embrionalnym, odpowiedzi immunologicznej i wielu procesach patologicznych, takich jak przerzuty raka i stan zapalny1-9. Dlatego metody badania zachowań migracyjnych komórek są bardzo przydatnymi narzędziami badawczymi dla szerokiego zakresu dyscyplin nauk biomedycznych, biologii, bioinżynierii i dziedzin pokrewnych.
Badanie migracji komórek w badaniach nad rakiem jest szczególnie interesujące, ponieważ główna przyczyna zgonów u pacjentów z rakiem jest związana z progresją przerzutów. Aby rak mógł się rozprzestrzeniać i rozprzestrzeniać w całym ciele, komórki rakowe muszą migrować i atakować przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM), wewnątrznaczynić do krwiobiegu, przyczepiać się do odległego miejsca, a na końcu wynaczynić, tworząc odległe ogniska1,10-12. Do szczegółowego zbadania tych zdarzeń można zastosować różne metody biologiczne. Zamykanie ran w hodowlach komórkowych oraz testy migracji i inwazji transwelli są szeroko stosowane w środowisku naukowym1,10. Testy te mogą dostarczyć niezbędnych danych, które mogą pozwolić zrozumieć, jak dobrze dany typ komórek może spontanicznie migrować lub reagować na chemoatraktant i kierunkowo migrować w jego kierunku. Opisano kilka fenotypów wędrownych. Komórki mogą migrować w formie pojedynczej komórki, takiej jak obserwowana w ruchu mezenchymalnym lub podobnym do ameboidu lub w ruchu wielokomórkowym zwanym migracją zbiorową lub strumieniowaniem komórek13. Metodę ruchu zastosowaną w komórkach ruchliwych można łatwo zaobserwować za pomocą testu zamykania ran w hodowli komórkowej.
Wśród licznych sposobów badania migracji komórek, test zamykania ran komórkowych jest jednym z najprostszych. Ta metoda jest przydatna do określenia zdolności migracyjnej całych mas komórek. Idąc o krok dalej, można go wykorzystać do obserwacji cech morfologicznych poszczególnych komórek podczas migracji14. Po analizie zamknięcia rany może ujawnić się wiele fenotypów. Pomiar zamkniętej odległości w czasie w porównaniu z grupą kontrolną może ujawnić specyficzne zmiany migracyjne lub upośledzony fenotyp migracyjny, który był wcześniej nieznany. Co więcej, tworzenie się blaszek jednokomórkowych, cofanie ogona i ruch kierunkowy mogą dać wskazówki na temat tego, co może być upośledzone lub wzmocnione w komórkach będących przedmiotem zainteresowania14.
Testy migracji i inwazji transwell mogą być używane do analizy zdolności pojedynczych komórek do kierunkowego reagowania na różne chemo-atraktanty, niezależnie od tego, czy są to chemokiny, czynniki wzrostu, lipidy czy nukleotydy4,5,8,15,16. Może również oceniać zróżnicowaną zdolność migracyjną spowodowaną nadmierną ekspresją receptora1,14. Testy te mogą być również wykorzystane do identyfikacji i scharakteryzowania kluczowych regulatorów migracji komórek, takich jak rodzina Rho małych GTPaz2. Po tych krótkich i łatwo dostępnych testach można również określić sposób migracji komórek i zdolność komórki do inwazji na matrycę 3D.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 0,25%</td> <td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Krystaliczny fiolet</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>Rozpuszczony w wodzie w stężeniu 0,2%</td></tr><tr><td>Bufor dysocjacyjny komórek</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator kultur komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>Kaptur bezpieczeństwa biologicznego SterilGARD</td><td>The Baker Company, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Model # VBM-600</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony EVOS Fl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Numer katalogowy różni się w zależności od rodzaju płytki hodowlanej</td></tr><tr><td>Wkładka Corning Transwell</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Numer katalogowy różni się w zależności od wielkości porów membrany</td></tr></tbody></table>

metody in vitro testy migracji i inwazji komórek

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migracja jest kluczową właściwością żywych komórek i ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju, odpowiedzi immunologicznej i procesów chorobowych, takich jak przerzuty raka i stany zapalne. Metody badania migracji komórek są bardzo przydatne i ważne dla szerokiego zakresu badań biomedycznych, takich jak biologia nowotworów, immunologia, biologia naczyniowa, biologia komórki i biologia rozwoju. Tutaj używamy migracji i inwazji komórek nowotworowych jako przykładu i opisujemy dwa powiązane testy, aby zilustrować powszechnie stosowane, łatwo dostępne metody pomiaru tych procesów. Pierwszą metodą jest test zamykania ran w hodowli komórkowej, w którym na zlewającej się monowarstwie komórki generowana jest rysa. Szybkość zamykania się ran i migracji komórek można określić ilościowo, wykonując zdjęcia migawkowe za pomocą zwykłego mikroskopu odwróconego w kilku odstępach czasu. Bardziej szczegółowe zachowanie migracji komórek można udokumentować za pomocą systemu mikroskopii poklatkowej. Drugą metodą opisaną w tym artykule jest test migracji i inwazji komórek transwell, który mierzy zdolność ruchliwości i inwazyjności komórek w kierunku gradientu chemoatraktantu. Naszym celem jest opisanie tych metod w sposób przystępny, tak aby procedury mogły być z powodzeniem wykonywane w laboratoriach badawczych nawet przy podstawowej konfiguracji biologii komórki.

Przedstawione tutaj badanie zamykania rany (wound closure assay) oraz badanie migracji komórek w systemie transwell zostały przeprowadzone z wykorzystaniem komórek czerniaka mysiego B16F10 jako modelu badawczego. W badaniu zamykania rany komórki B16F10 wysiano na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i inkubowano do osiągnięcia 100% konfluencji w ciągu 24 godzin. Za pomocą końcówki pipety wykonano ranę o szerokości około 700 µm, a proces zamykania rany (migrację komórek) rejestrowano przy użyciu mikroskopii time-lapse. A...

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Migracja komórek jest procesem niezwykle dynamicznym. Ma ona kluczowe znaczenie dla wielu funkcji fizjologicznych, takich jak prawidłowy rozwój zarodkowy, odpowiedź immunologiczna, a także dla procesów chorobowych, na przykład przerzutów nowotworowych i stanów zapalnych.Badanie migracji komórek jest istotne dla szerokiego zakresu nauk biomedycznych, takich jak biologia nowotworów, immunologia, biologia komórki i biologia rozwoju. Migrację komórek można podzielić na cztery mechanicznie odrębne etapy: wysuwanie wypustek, tworzenie nowych adhezji, skurcz ciała komórki i na koniec odrywanie się ogonka. W niniejszym materiale opiszemy dwie proste metody służące do dokładnego badania dynamicznej natury migracji komórek in vitro.Pierwszą metodą jest test zamknięcia w hodowli komórkowej. Test ten jest powszechnie stosowany i łatwo dostępny dla laboratoriów z najbardziej podstawowym wyposażeniem. Test zamknięcia w hodowli komórkowej to badanie, w którym przy użyciu końcówki pipety tworzy się zadrapania w konfluencyjnej monowarstwie komórek, a konfluencyjna monowarstwa komórkowa z czasem zamyka wcześniej powstałą ranę.Dynamikę migracji komórek można szczegółowo badać za pomocą fotografii time-lapse lub zdjęć punktowych. Można zmierzyć przebyty dystans, a następnie obliczyć prędkość, z jaką przemieszczały się komórki. Druga powiązana metoda, test migracji i inwazji komórek w systemie transwell, jest również wysoce dostępna po wysianiu komórek na membranę transwell.Znane również powszechnie jako komora Boydena. Można za ich pomocą zmierzyć zdolność migracji komórek w kierunku gradientu chemoatraktanta. Obie te, łatwo dostępne procedury eksperymentalne są niezwykle cenne w wielu obszarach badań.Rozdział drugi, analiza w zamkniętej komorze do hodowli komórkowych. Dzień dobry, nazywam się Calvin Justice. Jestem doktorantem w laboratorium dr Yang z Katedry Onkologii na Brody School of Medicine na East Carolina University.Dzisiaj zaprezentuję dwie procedury służące do pomiaru zdolności migracyjnych i inwazyjnych komórek in vitro. Przejdźmy teraz do przygotowania hodowli komórkowej. Test komórki użyte w hodowli komórkowej.Test można przeprowadzić w płytkach do hodowli tkankowej, stosując konwencjonalne techniki hodowli komórkowej. W celu rozpoczęcia należy odessać pożywkę wzrostową używaną do hodowli komórek, wypłukać raz PBS, a następnie dodać do płytki dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA i wstawić ją do inkubatora na trzy minuty. Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać trzy mililitry DMM uzupełnionego o 10% FES.Usunąć pożywkę z płytki i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez pięć minut przy 1500 RPMs. Po wirowaniu resuspender komórki w dwóch mililitrach DMM uzupełnionego o 10% FES.Następnie należy policzyć komórki za pomocą cytometru hematologicznego. Po zakończeniu liczenia wysiać taką liczbę komórek, aby osiągnęły one pełną konfluencję w ciągu 24 godzin. Płytkę należy umieścić w inkubatorze na 24 godziny, aby umożliwić adhezję i rozprzestrzenianie się komórek.Wyjmij płytkę z inkubatora i obejrzyj ją pod mikroskopem, aby upewnić się, że warstwa komórek jest w 100% konfluentna. Następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając końcówki pipety, ostrożnie i bez uszkadzania płytki do hodowli tkanek, wykonaj ranę od góry do dołu studzienki. Po utworzeniu rany końcówką pipety, odessaj medium i delikatnie przemyj dwa mililitry pożywki wzrostowej.W tym przypadku należy użyć DMEM uzupełnionego o 10% FES, aby wypłukać wszelkie istniejące zanieczyszczenia, a następnie ponownie odessać medium. Na koniec dodać dwa mililitry medium wzrostowego i, jeśli jest taka możliwość, umieścić płytkę w komorze z kontrolą temperatury i poziomu CO2 pod mikroskopem. W tym przypadku dostępna jest funkcja fotografii poklatkowej.Funkcja poklatkowa nie jest dostępna. Wykonaj zdjęcie początkowe miejsca oznaczenia oraz dołka, a następnie umieść płytkę w inkubatorze. Jeśli fotografia poklatkowa jest dostępna, skonfiguruj funkcje time-lapse w mikroskopie.Ustawimy czas lapse na 16 godzin. Po 16 godzinach, przy zdjęciu wykonywanym co pięć minut, płytkę można wyjąć z komory, a zdjęcia pozyskane w trakcie trwania eksperymentu zapisać na dysku flash. Włóż dysk USB do komputera i otwórz program Image J.Kliknij Plik. Importuj sekwencję obrazów. Znajdź obrazy, które zostały wykonane podczas eksperymentu.Kliknij pierwszy plik, a następnie kliknij otwórz. Pojawią się kolejne opcje sekwencji. Wybierz pierwsze zdjęcie z listy fotografii i wprowadź przyrosty potrzebne do filmu.Teraz wyświetlą się opcje czytnika AVI. Wybierz opcję najlepiej dopasowaną do Twojego eksperymentu i kliknij. Program ImageJ utworzy teraz wideo; aby je zapisać, kliknij plik, zapisz jako AVI lub wybierz inną opcję, która będzie odpowiednia dla Twojego eksperymentu.Następnie można przeanalizować wideo w badaniu komórek pod kątem cech migracji, które mogą być interesujące. Możliwe cechy podlegające badaniu to wysuwanie wypustek, skurcz ciała komórki i odrywanie się ogonka. W przypadku braku fotografii poklatkowej, płytkę, która została umieszczona w inkubatorze na 12 do 16 godzin po wykonaniu pierwszego zdjęcia, można wyjąć.Obszar, który został sfotografowany początkowo, należy sfotografować ponownie i dodać pasek skali w celu przeprowadzenia dalszych pomiarów. Po zmierzeniu początkowej szerokości rany widocznej na pierwszym zdjęciu, wartość zmierzoną w pikselach należy przeliczyć na mikrometry przy użyciu paska skali. Następnie należy zmierzyć w pikselach szerokość rany na końcowych zdjęciach w tym samym obszarze co poprzednio i ponownie przeliczyć ją na mikrometry, korzystając z paska skali.Ostatnim krokiem jest odjęcie końcowej szerokości od szerokości początkowej, aby uzyskać całkowitą szerokość, o którą rana zamknęła się w wyznaczonym okresie czasu. Pomiar końcowej odległości migracji należy podzielić przez wyznaczony czas, aby obliczyć prędkość zamykania rany w mikrometrach na godzinę. Metodę snapshot można powtórzyć w wielu studzienkach o różnych rozmiarach w celu przeprowadzenia bardziej ilościowej analizy migracji komórek, rozdział trzeci, Transwell Cell Migration and Invasion Assay.W pierwszej kolejności należy wyhodować badane komórki na płytce do hodowli tkanek na potrzeby procedury. Następnie należy jednokrotnie przemyć je PBS i odłączyć badane komórki od płytki do hodowli tkanek za pomocą buforu do dysocjacji komórek lub trypsyny. Sugerujemy również zapoznanie się z literaturą dotyczącą wpływu trypsyny na badane komórki, ponieważ jej zastosowanie może wpłynąć na otrzymane wyniki.Po wirowaniu w celu odseparowania komórek przy 1500 RPM przez pięć minut, należy usunąć i odessać obecne pożywkę, a następnie resuspender komórki w 0,1% BSA. Otwórz opakowanie wkładu Transwell i umieść go w dołku przeznaczonym dla jego konkretnego rozmiaru. Jeśli w pierwszej kolejności wykonujesz test inwazji Transwell, nałóż matrigel na górną część wkładu i inkubuj przez 30 minut przed przejściem do następnego kroku.Nanieś 100 µL zawiesiny komórek na powierzchnię membrany transwell. Inkubuj przez 10 minut, aby komórki mogły osiąść. Liczba naniesionych komórek zależy od rodzaju komórek i mogą być wymagane dalsze eksperymenty optymalizacyjne.Aby określić tę liczbę, należy za pomocą pipety ostrożnie dodać wybrany chemoatraktant pod wkładkę, na dno dołka. Należy starać się nie wyjmować wkładki. Czas inkubacji zależy od rodzaju komórek.Po inkubacji wyjmij wkładkę transwell i za pomocą patyczka z watą, powtarzając czynność tyle razy, ile będzie to konieczne, delikatnie usuń z górnej powierzchni membrany nadmiar medium oraz komórki, które nie migrowały do membrany. Należy uważać, aby nie uszkodzić membrany. Do dolnej komory pustego naczynia dodaj od 600 do 1000 µL 70% etanolu.Wstaw insert do dołka zawierającego 70% etanol i inkubuj przez 10 minut w celu utrwalenia komórek. Ponownie użyj aplikatora z bawełnianą końcówką tyle razy, ile będzie to konieczne, aby usunąć pozostały etanol z komórek, które nie migrowały do membrany, z jej górnej powierzchni. Do dołka dodaj od 600 do 1000 µL 0,2% fioletu krystalicznego i umieść w nim insert w celu barwienia komórek.Inkubować przez 10 minut. Z powierzchni membrany usunąć nadmiar barwnika fioletowego krystalicznego. Następnie, bardzo ostrożnie, aby uniknąć wypłukania zmigrowanych komórek, zanurzać membranę w wodzie destylowanej tyle razy, ile będzie konieczne, aby usunąć pozostałości fioletu krystalicznego.Pozostaw membranę do wyschnięcia, aby móc obejrzeć komórki pod mikroskopem. Membranę można ostrożnie odciąć skalpelem i umieścić na szkiełku nakrywce lub można obserwować komórki, gdy wkłady wciąż znajdują się w studzience. Przy użyciu mikroskopu odwróconego należy wykonać zdjęcia z kilku pól widzenia.Aby uzyskać rzetelną reprezentację liczby migrujących komórek, można policzyć komórki za pomocą narzędzia do liczenia w programie Adobe Photoshop. Zebrane dane można wprowadzić do wykresu słupkowego, aby w optymalny sposób zaprezentować wyniki. Rozdział czwarty, wyniki reprezentatywne.Następnie przedstawimy reprezentatywne wyniki testu hodowli komórkowej w zamknięciu (enclosure assay) oraz testu migracji komórek w systemie transwell. Są to dwie powiązane metody badania ruchliwości komórek opisane w tym filmie; zaczniemy od testu hodowli komórkowej w zamknięciu. Tutaj prezentujemy zdjęcia wykonane w 0, 4, 8 i 12 godzinach.Jak widać, po powstaniu rany można wykonać zdjęcia, a następnie w czasie mierzyć dystans jej zamykania się. Dane przedstawiamy za pomocą wykresu punktowego i stosując wcześniej omówioną metodę, wyznaczamy prędkość zamykania się rany w czasie. Ponadto, dzięki zastosowaniu fotografii poklatkowej, można szczegółowo badać migrację pojedynczych komórek.W tym przypadku przybliżamy obraz poszczególnych komórek podczas zamykania rany, śledzimy ich migrację w czasie i obserwujemy sposób ich poruszania się. Można szczegółowo zbadać cechy takie jak wysuwanie krawędzi prowadzącej, retrakcja ogonka oraz ogólny ruch. Przejdziemy teraz do omówienia niektórych wyników testu migracji komórek w poprzek. Przedstawiamy tutaj dwa zdjęcia błony wykonane po przeprowadzeniu testu migracji komórek w systemie transwell.Na pierwszym zdjęciu przedstawiono wyniki bez chemoatraktanta, w których migracja komórek przez membranę była niewielka lub nie wystąpiła. Drugie zdjęcie pokazuje wyniki z chemoatraktantem, gdzie zaobserwowano zwiększoną migrację komórek w kierunku membrany. Po prawej stronie przedstawiono wyniki ilościowe eksperymentu w formie wykresu słupkowego z słupkami błędów reprezentującymi błąd standardowy.Rozdział piąty, podsumowanie: dane zgromadzone po przeprowadzeniu testu zamknięcia kultur komórkowych w teście migracji poprzecznej lub inwazji komórkowej ujawniają zdolności migracyjne komórek w środowisku 2D lub 3D. Wyniki te można porównać z innymi danymi, aby potencjalnie odkryć nieznane wcześniej zależności, a także korelować je z innymi testami biochemicznymi. Te dwa powiązane, powszechnie stosowane testy są wartościowe i łatwo dostępne dla najbardziej podstawowych laboratoriów biologii komórki.Dziękujemy za dołączenie do nas i życzymy powodzenia w przyszłych przedsięwzięciach naukowych.

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vitro Testy migracji i inwazji komórkowej

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ten artykuł wideo opisuje zmodyfikowaną metodę in vitro do badania roli hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu w napędzaniu inwazji komórek rakowych.

Zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu peptydów na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Metoda ta pozwala na szybkie i wysoce powtarzalne uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości migracji komórek i zamykania ran.

Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Tutaj prezentujemy wysoce przystępny protokół oceny ruchu komórek w ludzkich komórkach trofoblastu za pomocą trzech testów in vitro: testu zadrapania, testu inwazji transwell i testu proliferacji komórek.

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Poznaj metody badania migracji i inwazji komórek in vitro, w tym test zamknięcia rany oraz transwell. Techniki te pozwalają analizować dynamikę ruchu komórkowego w biologii nowotworów i immunologii.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Przeglądaj więcej filmów