Name: Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj odwrócony dwuhybrydowy system drożdży do identyfikacji reszt receptorów jądrowych PXR oddziałujących z ketokonazolem. Metoda umożliwia odkrycie mutacji wpływających na odporność receptora na lek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Granty CA127231 oraz The Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award (CI 1502) (dla S.M.). Chcielibyśmy podziękować profesorowi Zdenkowi Dvorakowi z Uniwersytetu Palackiego w Ołomuńcu w Czechach za jego pomocne spostrzeżenia na temat możliwości przeniesienia tej techniki do ich instytucji i standaryzacji protokołu.

1. Budowa fuzji PXR i SRC-1 w wektorach drożdży
<ol>
	<li>Amplifikacja PCR ludzkiego PXR LBD (107-434 aminokwasów) i ludzkiej pełnej długości SRC-1 (1-1401 aminokwasów).
	<ol>
		<li>Użyj plazmidu pSG5-hPXR8 jako matrycy PXR LBD, użyj plazmidu pCMX-SRC1 jako szablonu SRC-1.</li>
		<li>Rozmrozić PCR SuperMix, matryce DNA i startery (patrz Materiały), trzymać je na lodzie.</li>
		<li>Dodać 0,25 μg/μl matrycy DNA 1 μl, 10 mM par starterów po 2 μl każda, PCR SuperMix 45 μl i dodaćH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl.</li>
		<li>Ustaw PCR na jeden cykl 94 °C przez 2 min, 20 cykli 94 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 2 minuty, a następnie jeden cykl 72 °C przez 10 minut w celu przedłużenia. Sprawdź produkty PCR, uruchamiając je na 1% żelu agarozowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klonowanie produktów PCR do wektorów Y2H.
	<ol>
		<li>Oczyść produkty PCR z 1% żelu agarozowego. Trawić wektor PXR, LBD, PCR i Y2H pSH2-1 z BamHI i SalI; trawić SRC-1 PCR i wektor Y2H pGADNOT z NotΙ i SalΙ. Aby to zrobić, dodaj 1 μg DNA, 3 μl 10x buforu reakcyjnego, 1 μl enzymów restrykcyjnych, a na koniecH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 30 μl.</li>
		<li>Próbki mineralizacji umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Sprawdź trawienie, stosując 1% żel agarozowy.</li>
		<li>Oczyść próbki trawienia z 1% żelu agarozowego, podlizaj strawione produkty PCR i wektory Y2H i przekształć w komórki kompetentne DH5α.</li>
		<li>Wybierz kolonie i wyizoluj plazmidowe DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj plazmidowe DNA pSH2-1-PXR przez trawienie BamHI/SalI, zidentyfikuj plazmidowe DNA pGADNOT-SRC-1 przez trawienie NotI/SalI. Zweryfikuj wszystkie dodatnie plazmidowe DNA przez sekwencjonowanie.</li>
</ol>
2. Drożdże Testy dwuhybrydowe
<ol>
	<li>Zaszczepić szczep drożdży w 5 ml YPAD i inkubować przez noc przez ciągłe mieszanie (220 obr./min w temperaturze 30 °C). Uwaga: Szczep Saccharomyces cerevisiae to CTY10-5d (MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ), który zawiera zintegrowany gen GAL1-lacZ z operatorem lexA 10. Aby uzyskać żywotne komórki drożdży odporne na ketokonazol, ale te, które nie przenosiły zmian transportera jako przyczyny oporności na azol18-20, uzyskano nowe szczepy drożdży CTY10-5d, najpierw usuwając ERG3 (erg3Δ), a następnie wprowadzając dodatkową delecję w genach ERG11 ( erg3Δ / erg11Δ) przez rekombinację homologiczną. Szczegóły konstrukcyjne zostały opisane we wcześniej opublikowanym rękopisie6 .</li>
	<li>Następnego dnia (rano) zaszczepić drożdże (1:20) w 5 ml YAPD i inkubować do uzyskania OD600 ~ 0,2 przez ciągłe mieszanie (220 obr./min w 30 °C).</li>
	<li>Granulować komórki z prędkością 2 000 obr./min w mikrowirówce przez 2 minuty i wyrzucić supernatant. Następnie przemyj granulat dwukrotnie wodą w autoklawie i raz 0,1 M LiAc.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu odrzucić supernatant i dodać następujące odczynniki do osadu komórkowego: 240 μl PEG 3500 50% w/v, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg/ml gotowanego nasienia łososia ssDNA, H2O 34 μl. Wirować do wymieszania, dodać 1 μg pSH-PXR i 1 μg pGADNOT-SRC-1 DNA i wymieszać.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do probówki okrągłodennej z polistyrenu, zamieszać przemianę, mieszać (220 obr./min w 30 °C) przez 30 min. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i inkubować przez dodatkowe 30 min.</li>
	<li>Odwirować probówkę z prędkością 2 000 obr./min przez 2 minuty i usunąć supernatant. Umyj granulat raz wodą w autoklawie.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl sterylnej wody do probówki, ponownie zawiesić komórki poprzez delikatne stukanie palcem i pipetowanie, a następnie umieścić na płytkach -His/-Leu Dropout Medium (preparat na jeden litr -His/-Leu Dropout Medium: 20 g dekstrozy, 1,7 g YNB, 0,67 g CSM-His/-Leu, 5 g siarczanu amonu, 1,5% agaru) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3-4 dni w celu wyizolowania transformantów.</li>
</ol>
3. Test filtra X-gal
<ol>
	<li>Przyciąć membranę nitrocelulozową do rozmiaru części szalki Petriego. Oznacz membranę nitrocelulozową, aby zaznaczyć orientację.</li>
	<li>Umieść oznaczoną membranę nitrocelulozową na koloniach drożdży, upewnij się, że membrana styka się z powierzchnią podłoża płytkowego.</li>
	<li>Zdjąć membranę, ułożyć ją stroną kolonijną do góry na bibule filtracyjnej o grubości 3 mm i umieścić membranę i bibułę filtracyjną w temperaturze -80 °C na 15 minut.</li>
	<li>Przygotuj roztwór X-gal. Dodać 50 μl 20 mg/ml X-gal i 15 μl β-merkaptoetanolu do 5 ml buforu Z (1 l buforu zawiera 16,1 g Na2HPO47H2O, 5,5 g NaH2PO4 H2O, 0,75 g KCl, 0,25 gMgSO4•7H2O) . Jeśli bufor Z był przechowywany w temperaturze 4 °C, przed dodaniem tych odczynników należy go doprowadzić do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umieścić dwa kółka z bibuły filtracyjnej o grubości 3 mm na szalce Petriego i namoczyć je w 5 ml roztworu X-gal. Odcedź nadmiar buforu z szalki Petriego i umieść membranę nitrocelulozową stroną z kolonią do góry.</li>
	<li>Zamknij pokrywę, upewnij się, że membrana całkowicie styka się z bibułą filtracyjną i jest całkowicie mokra. Zawinąć szalkę Petriego w folię i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut do nocy.</li>
</ol>
4. Test płynnego β-galonu
<ol>
	<li>Hoduj drożdże w płynnym podłożu -His/-Leu Dropout do OD600 0,7.</li>
	<li>Przenieść 1 ml pożywki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 3 000 obr./min przez 2 min. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu Z w celu ponownego zawieszenia osadu, ponownie odwirować z prędkością 3 000 obr./min przez 2 minuty. Wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 150 μl buforu Z z 2ME w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego, wymieszać, a następnie dodać 50 μl chloroformu i 20 μl 0,1% SDS. Energicznie wirować próbkę przez 15 sekund.</li>
	<li>Dodać 700 μl roztworu ONPG (1 mg/ml w buforze Z). Ustawić stoper, inkubować w temperaturze 30 °C wystarczająco długo, aby umożliwić rozwinięcie się żółtego koloru i zanotować całkowity czas reakcji.</li>
	<li>Dodać 500 μl 1 M Na2CO3 w celu zatrzymania reakcji i oznaczyć absorbancję przy 420 nm. Ślepa próba to 700 μl roztworu ONPG plus 500 μl 1 M Na2CO3 .</li>
</ol>
Oblicz jednostki Millera w następujący sposób: Jednostki Millera = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)
Å420: jednostki absorbancji przy 420 nanometrach; Å600: jednostki absorbancji przy 600 nanometrach; min: czas reakcji w minutach; ML: objętość reakcji w ml

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
<li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li>
<li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+%27Jekyll+and+Hyde%27+Nature+of+PXR%3A+The+Case+for+Discovering+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li>
<li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Rev%22%5BJournal%5D)">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li>
<li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine%2Fthreonine+kinase+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li>
<li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li>
<li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22TiPS%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li>
<li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li>
<li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li>
<li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li>
<li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+%28steroid+and+xenobiotic+receptor%29+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li>
<li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+agents%3A+mode+of+action%2C+mechanisms+of+resistance%2C+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li>
<li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+multidrug+resistance+pump%2C+Pdr5p%2C+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li>
<li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+cellular%2C+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li>
<li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+peptides%2C+proteins%2C+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li>
<li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W naszym zmodyfikowanym teście Y2H zidentyfikowaliśmy ważne reszty dla interakcji ketokonazolu na PXR6. Ponieważ SRC-1 jest koaktywatorem (i został sklonowany do wektora pGADNot), przetestowaliśmy również, czy SRC-1 może aktywować ekspresję lacZ po sklonowaniu do systemu wektorów pSH i czy zmieni to profil aktywacji i / lub wpłynie na nieszczelność testu dwuhybrydowego drożdży. Korzystając z naszych przeprojektowanych plazmidów, przeprowadziliśmy testy dwuhybrydowe w drożdżach erg3Δ/erg11Δ. T...

Test dwuhybrydowy (Y2H) drożdży jest szeroko stosowany do odkrywania interakcji białko-białko, a ostatnio do odkrywania nowych małych cząsteczek, które zakłócają kompleksy interakcji białko-białko 7, 8, 9, 10, 11. Jednak konwencjonalne podejścia tego testu, stosowane do odkrywania leków lub "trafień", nie pozwalają na wykrycie reszt oddziaływań allosterycznych związków chemicznych na powierzchni białko-białko, które po zmianie nadal oddziałują i pozwalają na badanie zmienionych reszt11. Rzeczywiście, taka metoda(y), jeśli jest możliwa do opracowania, umożliwiłaby stworzenie elastycznego systemu drożdży do wysokoprzepustowej oceny reszt interakcji allosterycznych, które mają kluczowe znaczenie dla zakłócenia interakcji białko-białko. W kontekście odkrywania leków, najbardziej bezpośrednim sposobem ustalenia interakcji związków z białkami byłoby określenie strukturalne (np. krystalizacja kompleksu białko-inhibitor). Metody te są kłopotliwe, zużywają skomplikowane zasoby i nie jest technicznie wykonalne przeprowadzenie badań strukturalnych na każdym białku.
Możliwe do wykonania genetyczne systemy badań przesiewowych leków zostały ustanowione w bakteriach1, 2 i innych systemach modelowych, takich jak dwuhybrydowe ssaki. Systemy te wymagają jednak optymalizacji, a systemy alternatywne, takie jak Y2H, są nadal najczęściej testowane w odkrywaniu leków. Istnieją ograniczenia, które obejmują słabą czułość i wiarygodność oddziaływań przy użyciu metod pojedynczych13 , jednak pojedynczy test Y2H można zmodyfikować, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące pozostałości interakcji. W dziedzinie badań nad receptorami jądrowymi Y2H został wykorzystany do zdefiniowania oddziałujących białek14, jednak te interakcje białkowe rzadko były wykorzystywane do określenia charakteru, w którym ligandy/antagoniści oddziałują z kompleksami receptor-białko jądrowe. W związku z tym nasze laboratorium skoncentrowało wysiłki na zdefiniowaniu metody, szczególnie w przypadku białek receptorowych, które nie są łatwo podatne na metody oparte na proteomice, która pozwoliłaby odkryć nowe reszty oddziałujące ligand/antagonista przy użyciu platformy odkrywczej opartej na odwrotnym Y2H.
Na podstawie naszego poprzedniego odkrycia, że ketokonazol zakłóca PXR i jego aktywator SRC-1, opracowaliśmy nowatorski system odwrotnego Y2H, który umożliwia nam definiowanie i badanie reszt oddziałujących z ketokonazolem na PXR6. Nasza metoda opiera się na właściwościach drożdżowego białka GAL4, które składa się z rozłącznych domen odpowiedzialnych za wiązanie DNA i aktywację transkrypcji. Białko PXR LBD ulega ekspresji jako fuzja z domeną wiążącą DNA LEXA (DNA-BD), podczas gdy białka koaktywatorów pełnej długości SRC-1 (koaktywator receptora steroidowego 1) ulegają ekspresji jako fuzje z domeną aktywacji GAL4 (AD). Interakcja między białkami fuzyjnymi PXR i SRC-1 prowadzi do transkrypcyjnej aktywacji miejsc wiążących GAL4 zawierających gen reporterowy β-LacZ, który jest zintegrowany z genomem drożdży. Ketokonazol, antagonista PXR, zaburza interakcję PXR i SRC-1 15, 16, 17 i możemy wykryć interakcję PXR i SRC-1 w obecności lub braku ketokonazolu po zabarwieniu kolonii na filtrach pod kątem aktywności X-gal. Zasada działania Y2H jest zilustrowana na rysunku 1, a procedura eksperymentalna jest podsumowana na rysunku 2.

<table><tbody><tr><td>Szczep drożdży CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>Nasze drożdże</td><td></td><td>laboratoryjne CTY10-5d zostały podwójnie znokautowane ERG3 i ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;/erg11&Delta;) 6 .</td></tr><tr><td>YPD Pożywka wzrostowa</td><td>BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Drożdżowa baza azotowa (YNB) bez aminokwasów i siarczanu amonu</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-Leu Kompletna mieszanka suplementów</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenyl &Beta;-D-galaktopiranozyd).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>Ugotowane DNA plemników łososia (10 mg / ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Ketokonazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% roztwór PEG-3350, sterylizowany filtrem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATCATGTCC-3'nasz</td> <td>laboratoryjny</td><td></td><td>PXR LBD do przodu starter do pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'nasz</td> <td>laboratorium</td><td></td><td>PXR LBD odwrotny starter do pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGCATCATCC -3'nasz</td> <td>laboratoryjny</td><td></td><td>SRC-1 do przodu podkład do pGADNOT</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'nasze</td> <td>laboratorium</td><td></td><td>SRC-1 odwrócony starter do pGADNOT</td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>nasze laboratorium</td><td>R0136</td> SalI nasze laboratorium R0138 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>nasze laboratorium</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Jako krytyczny regulator metabolizmu leków i stanu zapalnego, receptor Pregnane X (PXR), odgrywa ważną rolę w patofizjologii choroby łączącej metabolizm i stan zapalny (np. stłuszczenie wątroby)1,2. Poczyniono znaczne postępy w identyfikacji ligandów agonistycznych dla PXR, jednak istnieją ograniczone opisy antagonistów podobnych do leków i ich miejsc wiązania na PXR3,4,5. Krytyczną barierą była niezdolność do skutecznego oczyszczenia białka o pełnej długości do badań strukturalnych z antagonistami, pomimo faktu, że PXR został sklonowany i scharakteryzowany w 1998 roku. Nasze laboratorium opracowało nowatorski, wysokoprzepustowy test dwuhybrydowy na bazie drożdży w celu zdefiniowania antagonisty, ketokonazolu, wiążących reszty na PXR6. Nasza metoda polega na stworzeniu bibliotek mutacyjnych, które uratowałyby efekt pojedynczych mutacji na powierzchni AF-2 PXR, co do którego oczekuje się, że będzie oddziaływać z ketokonazolem. Możliwe jest przeprowadzenie drugich mutacji ratunkowych lub "wzmocnień funkcji" w taki sposób, że możliwe jest wyciągnięcie wniosków dotyczących interakcji genetycznej ketokonazolu i pozostałości powierzchniowych na PXR. W związku z tym opracowaliśmy wysokoprzepustowe, dwuhybrydowe badanie przesiewowe drożdży mutantów PXR oddziałujących z jego koaktywatorem, SRC-1. Stosując to podejście, w którym drożdże zostały zmodyfikowane w celu dostosowania do badania leku przeciwgrzybiczego, ketokonazolu, mogliśmy wykazać specyficzne mutacje na PXR wzbogaconym w klony niezdolne do wiązania się z ketokonazolem. Stosując odwrotną logikę, wnioskujemy, że pierwotne reszty są pozostałościami bezpośredniego oddziaływania z ketokonazolem. Test ten stanowi nowatorski, wykonalny test genetyczny do badań przesiewowych w poszukiwaniu miejsc wiązania antagonistów na powierzchni receptorów jądrowych. Test ten można zastosować do dowolnego leku, niezależnie od jego potencjału cytotoksycznego dla drożdży, a także dla białek komórkowych, których nie można badać przy użyciu standardowych metod biologii strukturalnej lub proteomiki. Potencjalne pułapki obejmują interpretację danych (przydatne metody komplementarne), poleganie na pojedynczej metodzie Y2H, wiedzę specjalistyczną w zakresie obchodzenia się z drożdżami lub wykonywania testów dwuhybrydowych drożdży oraz optymalizację testów.

Przeprowadziliśmy analizę, aby sprawdzić, czy jesteśmy w stanie wykryć kolorymetryczny odczyt asocjacji PXR oraz koaktywatora receptora steroidowego-1 (SRC-1). Ponieważ drożdże charakteryzują się znaczną produkcją steroli, wcześniej wykazano, że ekspresja lacZ w drożdżach może być indukowana bez konieczności dodawania dodatkowego ligandu egzogennego. Stwierdziliśmy, że ekspresja lacZ (niebieskie kolonie) jest również indukowana w szczepie drożdży transformowanym PXR i SRC-1; jednak nie obserwuje się indukcji ekspresji La...

Ketokonazol wiąże się z aktywacją receptora Pregnane X (PXR) i antagonizuje ją. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów PXR u drożdży definiują unikalny region wiązania ketokonazolu. Ta metoda genetyczna oparta na drożdżach odkrywa nowe interakcje receptorów jądrowych z ligandami, które wiążą się z miejscami wiązania powierzchniowego.

Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis wysokoprzepustowego dwuhybrydowego testu drożdżowego, który ujawnia oddziaływania między receptorem Pregnan X lub PXR a małocząsteczkowym inhibitorem ketokonazolem. Zostaje to osiągnięte poprzez wcześniejszą konstrukcję dwuhybrydowych plazmidów drożdżowych, z których jeden wykazuje ekspresję domeny wiążącej ligand ludzkiego PXR, a drugi ekspresję koaktywatora receptora steroidowego 1 lub SRC1. Obecność ketokonazolu zaburza oddziaływanie ludzkiego PXR z SRC1, co zostaje wykazane za pomocą płynnych testów beta-galaktozydazy.W połączeniu z kolorymetrycznym przesiewaniem kolonii na filtrze, przesiewanie mutantów PXR w obecności ketokonazolu pozwala na identyfikację mutacji, które czynią receptor niewrażliwym na działanie leku, co w konsekwencji prowadzi do niskiej ekspresji stwierdzanej poprzez inspekcję wizualną oraz wyniki ciekłych testów beta-galaktozydazy. Testy SEASE są wykorzystywane do wykazania zmian w aktywacji PXR w obecności ketokonazolu, co umożliwia identyfikację pierwotnych reszt zaangażowanych w oddziaływanie. Pomysł na tę metodę powstał najpierw w laboratorium dr. Manny'ego, gdzie jestem współpracownikiem.W obliczu niekompletnych ustrukturyzowanych danych dotyczących PXR, techniki biochemiczne nie pozwalały nam na przeprowadzenie identyfikacji, szczególnie w przypadku oddziaływań o bardzo niewielkiej skali, które nie były łatwo modyfikowalne w celu charakterystyki strukturalnej. Opierając się na zasadzie wykrywania mutantów PXR odpornych na kiton, opracowaliśmy metodę, która jest przystępna, wykonalna i może zostać przeprowadzona w ciągu kilku dni w sposób wysokoprzepustowy.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat siły wiązania farmakologicznego małych cząsteczek z białkami receptorowymi, można ją również zastosować do innych układów, takich jak każde białko odgrywające patogenną rolę w chorobie, co szczególnie niweluje ograniczenia w podejściach biologii strukturalnej przy wstępnej identyfikacji reszt wiążących w celu lepszego zrozumienia i projektowania małocząsteczkowych interaktorów celowych. Aby rozpocząć, należy przeprowadzić amplifikację domeny wiążącej ligand ludzkiego PXR oraz pełnej długości ludzkiego SRC 1 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Produkty PCR należy sprawdzić, przeprowadzając elektroforezę w 1% żelu agarozowym.Następnie oczyść produkty PCR z żelu agarozy. Przetraw produkty PCR oraz dwa wektory hybrydowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie umieść próbki poddawane trawieniu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na jedną godzinę. Oczyść przetrawione próbki z żelu agarozy 1%, a następnie przeprowadź ligację przetrawionych i oczyszczonych produktów PCR oraz dwóch wektorów hybrydowych przed transformacją do kompetentnych komórek DH5α po inkubacji nocnej w temperaturze 37 °C.Wybrać kolonie i wyizolować plazmidowe DNA, a następnie zastosować trawienie enzymami restrykcyjnymi w celu potwierdzenia obecności wektora i insertu; wszystkie pozytywne próbki plazmidowego DNA należy zweryfikować poprzez sekwencjonowanie. Zaszczepić szczep drożdży w 5 mL podłoża YAPD i inkubować przez noc w warunkach stałego mieszania przy 220 RPM i 30 °C. Następnego dnia wykonać posiew drożdży w stosunku od 1:10 do 1:20 w 5 mL podłoża YAPD i inkubować przy stałym mieszaniu do momentu uzyskania gęstości optycznej 0,2 przy 600 nm.Odwiruj komórki w mikrocentryfudze przy 2000 RPM przez dwie minuty i odlej nadsącz. Następnie przemyj osad dwukrotnie wodą z autoklawu oraz raz 0,1 M octanem litu. Po usunięciu nadsączu z ostatniego przemycia, dodaj do osadu komórkowego odczynniki do transformacji wymienione w protokole tekstowym i wymieszaj za pomocą wortexa.Następnie, przed wymieszaniem, dodać przygotowane wektory zawierające PXR oraz wektory zawierające SRC. Ponownie przenieść mieszaninę transformacyjną pipetą do polistyrenowej probówki z okrągłym dnem i agitować przez 30 minut. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i inkubować przez kolejne 30 minut.Następnie, po usunięciu nadsączu, wiruj probówkę z prędkością 2000 RPM przez dwie minuty. Przemyj osad raz wodą autoklawowaną: pipetuj 100 µL sterylnej wody do probówki i resuspenduj komórki poprzez delikatne opukiwanie palcem oraz pipetowanie. Następnie wysiej komórki na podłoże selekcyjne (dropout medium) bez histydyny i leucyny i inkubuj w temperaturze 30 °C przez trzy do czterech dni w celu wyizolowania transformantów.Aby rozpocząć test filtracyjny Xga, wytnij z membrany nitrocelulozowej trójkąt dopasowany do 10 milimetrowego fragmentu szalki Petriego. Oznacz membranę nitrocelulozową, aby zaznaczyć jej orientację. Umieść wcześniej oznaczoną membranę nitrocelulozową na koloniach drożdży, upewniając się, że membrana styka się z powierzchnią pożywki na szalce.Usuń membranę. Połóż ją stroną z koloniami do góry na papierze filtracyjnym o średnicy 3 mm i umieść membranę wraz z papierem filtracyjnym w temperaturze -80 °C na 15 minut. Następnie umieść dwa krążki papieru filtracyjnego o średnicy 3 mm w szalce Petriego i nasącz je 5 ml roztworu xal.Odlać nadmiar buforu z szalki Petriego i umieścić membranę nitrocelulozową w szalce stroną z koloniami do góry. Zamknąć pokrywę, upewniając się, że membrana całkowicie przylega do papieru filtracyjnego i jest w pełni zwilżona. Owinąć szalkę Petriego folią i inkubować w temperaturze 37 °C od 30 minut do całej nocy, aby wyhodować drożdże i nanieść medium ciekłe bez histydyny i leucyny do gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej 0,7.Przenieś 1 ml pożywki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 3000 RPM przez dwie minuty. Po odlaniu nadsączu dodaj 1 ml buforu Z do osadu i wiruj. Następnie dodaj 150 µl buforu Z z etanolem tumor capto, aby resuspendować osad komórkowy.Następnie energicznie dodaj 50 µL chloroformu oraz 20 µL 0,1% SDS. Wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex przez 15 sekund. Następnie dodaj 700 µL roztworu ONPG, ustaw stoper i inkubuj w temperaturze 30 °C przez czas wystarczający do pojawienia się żółtego zabarwienia.Po pojawieniu się zabarwienia należy odnotować całkowity czas reakcji. W celu zatrzymania reakcji należy dodać 500 µL jednomolowego węglanu sodu. Następnie należy wyznaczyć absorbancję przy 420 nm.W ostatnim kroku oblicz jednostki Millera zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ponieważ drożdże wykazują znaczącą produkcję sterylną, ekspresję laxy w drożdżach można indukować bez konieczności stosowania dodatkowego liganda egzogennego. Test xal lift wykazał, że ekspresja laxy, wizualizowana za pomocą niebieskich kolonii, jest indukowana w szczepie drożdży transformowanym PXR i SRC one.Zostało to wykazane również w płynnym teście beta-galaktosydazy. Jednakże w drożdżach transformowanych samymi pustymi wektorami PXR lub samym SRC-1 nie nastąpiła indukcja ekspresji lacZ. Ketokonazol zaburza oddziaływania PXR i SRC-1 w drożdżach, ponieważ wszystkie kolonie z filtra replikacyjnego były białe, co zostało również potwierdzone istotnie zmniejszoną aktywnością beta-galaktosydazy w płynnych testach enzymatycznych.Przeprowadzenie transformacji drożdży z użyciem S rrc one u podwójnego mutanta P XR wykazało, że kolonie eksponowane na ketokonazol nadal wykazują ekspresję laxy. Jest to zbieżne z wcześniejszymi badaniami w tym laboratorium, które wykazały, że ten sam PXR może być aktywowany przez silny ligand, lecz jest odporny na antagonistyczne działanie ketokonazolu w testach na komórkach ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak starannie przeprowadzić hybrydowy AC oraz jakie modyfikacje są niezbędne do badania pozostałości wiązania małych cząsteczek w białkach.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby uzyskać wysoce zróżnicowaną bibliotekę mutantów receptora, osiągnąć wysoką wydajność transformacji dla każdego z ponad 200 wariantów, przygotować niemal identyczne repliki filtra z dodatkiem leków i bez nich, a na koniec przeprowadzić dokładną inspekcję wizualną i chemiczną w celu detekcji nukleaz. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak Ian 200 a Acids protein pro as acids oraz iCal docking homologous models, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy bend uc jest odpowiedni dla białek w komórkach ludzkich. A jeśli tak, czy można stworzyć model, który wykorzystuje te pozostałości jako farmakofor.

reverse-yeast-two-hybrid-system-to-identify-mammalian-nuclear

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System odwrotnej hybrydy dwuskładnikowej do zidentyfikowania resztek receptorów jądrowych ssaków, które współdziałają z ligandami i/lub antagonistami

Metoda MYTH umożliwia czułą detekcję przejściowych i trwałych oddziaływań między białkami ekspresowanymi w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Została ona z powodzeniem zastosowana do badania egzogennych oraz drożdżowych białek błonowych w celu wysokoprzepustowej identyfikacji ich partnerów interakcji.

System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Opisany tutaj zmodyfikowany test na jedną hybrydę drożdży jest rozszerzeniem klasycznego testu na hybrydę drożdży (Y1H) do badania i walidacji interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w systemie heterologicznym dla dowolnego funkcjonalnego badania genomicznego.

Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Ten protokół opisuje, jak ustanowić system reporterowy, który może być używany do identyfikacji i ilościowego określania interakcji receptor-ligand.

System BW Reporter do badania oddziaływań receptor-ligand

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Projektowanie białek polega na budowie sekwencji aminokwasów i włączaniu określonych motywów w celu stworzenia funkcjonalnych wariantów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla opracowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) do zwalczania patogenów opornych na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę budowy białek z wykorzystaniem różnych narzędzi bioinformatycznych.

Zastosowanie I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, serwera HADDOCK i lorii HEX do projektowania białek De Novo i In Silico

Poznaj odwrócony dwuhybrydowy system drożdży do identyfikacji reszt receptorów jądrowych PXR oddziałujących z ketokonazolem. Metoda umożliwia odkrycie mutacji wpływających na odporność receptora na lek.

Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami (Wideo) | JoVE Journal

Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami

Przeglądaj więcej filmów