Name: Wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj metodę wykrywania uszkodzeń barier tkankowych za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego. Technika ta umożliwia szybką i czułą diagnostykę integralności bariery jelitowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy tego artykułu nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

1. PEDOT:Przygotowanie roztworu PSS
<ol>
	<li>Do 50 ml PEDOT:PSS dodać glikol etylenowy (zwiększa przewodność) w stosunku objętościowym 1:4 (glikol etylenowy do PEDOT:PSS), 0,5 μl/ml kwasu dodecylobenzenosulfonowego (DBSA) jako środek powierzchniowo czynny i 10 mg/ml 3-glicydoksypropylotrimetoksysilanu (GOPS) jako środek sieciujący w celu zwiększenia przyczepności polimeru przewodzącego do szkiełka</li> podstawowego.
</ol>
2. Produkcja OECT (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Zdefiniowanie termicznie odparowanych styków źródła złota i odpływu za pomocą litografii typu lift-off:
	<ol>
		<li>Fotorezystor z powłoką wirową na normalnym czystym szkiełku szkiełkowym z prędkością 3,000 obr./min przez 30 sek. Wymiary szkła to 3 cale x 1 cal.</li>
		<li>Definiowanie wzorów za pomocą fotolitografii. Wymiary mogą ulec zmianie, jednak podane tutaj wymiary zostały pokazane, aby zapewnić optymalną czułość. Następnie skorzystaj z pomocy programisty.</li>
		<li>Odparować odpowiednio 5 nm i 100 nm chromu i złota.</li>
		<li>Zdejmij fotorezyst, zanurz go w kąpieli acetonowej na 1 godzinę, pozostawiając podłoże ze źródłem i drenuj tylko obszar styków Au.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żądana długość kanału PEDOT:PSS wynosi 1 mm. Osiąga się to poprzez modelowanie przy użyciu techniki peel-off parylenu-C (Pa-C):
	<ol>
		<li>Załaduj 3,5 g Pa-C do zestawu do powlekania. Równomiernie odparować 2 μm parylenu-C na wierzchu podłoża za pomocą styków Au.</li>
		<li>Wzór kanału za pomocą fotolitografii:
		<ol>
			<li>Fotorezystor wirowy z prędkością 3 000 obr./min przez 30 sek.</li>
			<li>Użyj maski, aby oświetlić kanał i złoty kontakt 20 sekund do UV, naświetlony fotorezyst stanie się rozpuszczalny w wywoływaczu.</li>
			<li>Użyj programisty, aby otworzyć obszar kanału na fotorezyście.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wytrawić Pa-C w obszarze kanału za pomocą 15-minutowego kroku plazmowego (plazma O2 (50 sccm) i CHF4 (3 sccm) o mocy 160 W) w celu otwarcia kanału i złotego styku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór mieszaniny PEDOT:PSS należy rozlać wirowo z prędkością 500 obr./min na 45 sek. Piec przez 30 sekund w temperaturze 110 °C.</li>
	<li>Oderwij Pa-C, aby odsłonić kanał PEDOT:PSS podłoża pod spodem. Kanał ten powinien nieznacznie pokrywać się z kontaktami Au nawiązanymi w Protokole 1.</li>
	<li>Piec próbki przez 1 godzinę w temperaturze 140 °C w warunkach atmosferycznych.</li>
</ol>
3. Montaż urządzenia
<ol>
	<li>Wykonać PDMS przez zmieszanie dwóch roztworów (zwykle dostarczanych razem w zestawie) w stosunku 1:10 roztworu utwardzającego w roztworze podstawowym. Piecz przez 1 godzinę w temperaturze 120 °C.</li>
	<li>Zaprojektuj dobrze, używając dziurkacza i wytnij kwadrat wokół żądanego obszaru.</li>
	<li>Dobrze przyklej PDMS na górze kanału, aby uzyskać powierzchnię kanału około 6 mm2. Upewnij się, że styki źródła i odpływu nie są zakryte.</li>
	<li>Wykonaj plastikową podporę z otworem w niej (można użyć uchwytu do wkładu do hodowli komórkowej), a następnie przyklej ją do PDMS. Pozostaw do wyschnięcia na noc.</li>
	<li>Przetestuj studnię pod kątem wycieków, wstępnie napełniając ją wodą.</li>
	<li>przewody elektryczne do źródła i spuść styk cyny.</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W DMEM dodaj 1% glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 0,5% penicyliny-streptomycyny i 0,1% gentamycyny.</li>
		<li>Wysterylizuj pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą sterylnego urządzenia filtrującego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymać komórki Caco-2 między pasażem 49 i 68 w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w pożywkach do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dziel komórki raz w tygodniu za pomocą trypsyny i nasion w proporcji 1,5 x 104 komórki/wkładkę.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych dwa razy w tygodniu przez 3 tygodnie.</li>
</ol>
5. Pomiary za pomocą OECT
<ol>
	<li>Podłącz przewód Ag/AgCl do miernika źródłowego, aby użyć go jako elektrody bramki. Zanurz końcówkę w pożywce do hodowli komórkowych, która jest używana jako elektrolit, jak pokazano na rysunku 1a.</li>
	<li>Podłącz przewody od źródła i odpływu do miernika źródła (konfiguracja dwukanałowa).</li>
	<li>Zastosować dodatnie napięcie impulsu kwadratowego (VGS) między bramką a źródłem (używane jako elektroda odniesienia: masa). Przykładane jest ujemne stałe napięcie między drenem a źródłem (VDS) i mierzony jest odpowiedni prąd (IDS).</li>
	<li>Użyj komputera, na którym uruchomiono zbieranie danych programu. Parametry OECT wprowadzone w niestandardowym programie akwizycji powinny być następujące: VDS = -0,2 V, VGS = 0,3 V, VGS czas włączenia = 2 sekundy, czas wyłączenia = 28 sekund.</li>
	<li>Odczyt prądu drenu źródła (IDS) i prądu bramki (IGS). Przeprowadzaj pomiar przez kilka minut, aby zapewnić stabilny sygnał podstawowy.</li>
</ol>
6. Integracja komórek z OECT do pomiaru
Uwaga: Przed eksperymentem, integralność warstwy komórkowej może być zweryfikowana poprzez pomiar TER za pomocą urządzenia do spektroskopii impedancyjnej. Przenikanie nerwowe każdej 3-tygodniowej wkładki z komórek Caco-2 powinno wynosić powyżej 400 Ω.cm2.
<ol>
	<li>W czasie wolnym od pomiaru OECT: Wyjmij elektrodę bramki z elektrolitu, włóż wkładkę do hodowli komórek i włóż elektrodę bramki do wkładki do hodowli komórek.</li>
	<li>Przeprowadzaj pomiar linii podstawowej z komórkami przez kilka minut, aby zapewnić stabilny sygnał. Ta linia bazowa zostanie wykorzystana do obliczenia znormalizowanej wartości odpowiadającej nienaruszonej monowarstwie (0).</li>
</ol>
7. Przygotowanie i wprowadzenie toksycznego związku
<ol>
	<li>Przygotować 1 M roztwór EGTA w wodzie DI, najpierw dostosowując pH roztworu do 7,4 za pomocą zasady Tris.</li>
	<li>Dodać roztwór EGTA w odpowiedniej objętości, aby uzyskać pożądane stężenie (np. między 5 mM a 100 mM), biorąc pod uwagę objętość. EGTA należy dodać do komory podstawowej w czasie wyłączenia.</li>
	<li>Mierzyć w sposób ciągły przez 90 minut, jak w protokole 5. Jeśli pomiar jest wykonywany w temperaturze pokojowej, stabilność ogniw nie pozostanie stała po 90 minutach.</li>
	<li>Pod koniec cyklu należy zarysować warstwę ogniwa, aby spowodować całkowite zniszczenie warstwy barierowej i mierzyć przez 15 minut, ten punkt można wykonać, wyjmując filtr i zanurzając elektrodę bramki w mediach. Ta linia bazowa zostanie wykorzystana do obliczenia znormalizowanej wartości odpowiadającej zniszczonej monowarstwie.</li>
</ol>

<ol><li>Farquhar, M. G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+complexes+in+various+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctional complexes in various epithelia.</a> J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).</li>
<li>Gaillard, J. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+polarization+and+differentiation+on+entry+of+Listeria+monocytogenes+into+the+enterocyte-like+Caco-2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line.</a> Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).</li>
<li>Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+regulation+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure and regulation of tight junctions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).</li>
<li>Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+targets+of+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as targets of infectious agents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).</li>
<li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+tight+junctions+and+their+role+in+epithelial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22News.+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport.</a> News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).</li>
<li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions%3A+Closing+in+on+the+seal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junctions: Closing in on the seal.</a> Curr. Biol. 9, (1999).</li>
<li>Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+TNF-%7Balpha%7D+modulation+of+Caco-2+intestinal+epithelial+tight+junction+barrier%3A+role+of+myosin+light-chain+kinase+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).</li>
<li>Schulzke, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+tight+junctions+in+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epithelial tight junctions in intestinal inflammation.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).</li>
<li>Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ethanol+metabolite+acetaldehyde+increases+paracellular+drug+permeability+in+vitro+and+oral+bioavailability+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+J.+Pharmacol.+Exp.+Therap%22%5BJournal%5D)">The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo.</a> The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).</li>
<li>Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+modulation+of+intestinal+epithelial+tight+junction+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier.</a> Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).</li>
<li>Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hydrogen+peroxide+on+interleukin-8+synthesis+and+death+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopharmacol.+Immunotoxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells.</a> Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).</li>
<li>Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+into+the+epithelial+apical-junctional+complex--news+from+pathogen+hackers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaking into the epithelial apical-junctional complex--news from pathogen hackers.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).</li>
<li>Nusrat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+toxins+disrupt+epithelial+barrier+function+by+altering+membrane+microdomain+localization+of+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins.</a> Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).</li>
<li>Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus-induced+structural+and+functional+alterations+in+tight+junctions+of+polarized+intestinal+Caco-2+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers.</a> J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).</li>
<li>Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+calcium-induced+E-cadherin+rigidification+and+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization.</a> Nature. 380, 360-364 (1996).</li>
<li>Boulenc, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+paracellular+pathway+for+the+transport+of+a+new+bisphosphonate+using+the+human+Caco-2+monolayers+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model.</a> Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).</li>
<li>Artursson, P., Magnusson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+transport+of+drugs+in+cell+culture.+II%3A+Effect+of+extracellular+calcium+concentration+on+the+paracellular+transport+of+drugs+of+different+lipophilicities+across+monolayers+of+intestinal+epithelial+%28Caco-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells.</a> J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).</li>
<li>Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+transport+of+drugs+in+cell+culture.+I%3A+A+model+for+studying+the+passive+diffusion+of+drugs+over+intestinal+absorptive+%28Caco-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells.</a> J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).</li>
<li>Artursson, P., Karlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+oral+drug+absorption+in+humans+and+apparent+drug+permeability+coefficients+in+human+intestinal+epithelial+%28Caco-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li>
<li>Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+fast+%284+day%29+96-well+plate+Caco-2+permeability+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).</li>
<li>Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Path+Impedance+Spectroscopy+for+Measuring+Paracellular+and+Transcellular+Epithelial+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance.</a> Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).</li>
<li>Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-well+device+to+measure+transepithelial+electrical+resistances+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions.</a> BioTechniques. 37, 592-594 (2004).</li>
<li>Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+is+Required+for+Tumor+Necrosis+Factor+%28TNF%29-Mediated+Regulation+of+Tight+Junction+%28TJ%29+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function.</a> Gastroenterology. 140, (2011).</li>
<li>Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+electronics+at+the+interface+with+biology%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Organic electronics at the interface with biology.</a> MRS Bull. , (2010).</li>
<li>Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Application+of+Organic+Electrochemical+Transistors+in+Cell-Based+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors.</a> Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).</li>
<li>White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Derivatization+of+an+Array+of+3+Gold+Microelectrodes+with+Polypyrrole+-+Fabrication+of+a+Molecule-Based+Transistor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole - Fabrication of a Molecule-Based Transistor.</a> J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).</li>
<li>Bernards, D. A., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+and+transient+behavior+of+organic+electrochemical+transistors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors.</a> Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).</li>
<li>Jimison, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Barrier+Tissue+Integrity+with+an+Organic+Electrochemical+Transistor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor.</a> Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).</li>
<li>Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+EGTA+Mediated+Barrier+Tissue+Disruption+with+an+Organic+Transistor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor.</a> Biosensors. 3, 44-57 (2013).</li>
<li>Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+organic+electrochemical+transistor+for+in+vitro+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).</li>
<li>Zhu, Z. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+poly%283%2C4-ethylene+dioxythiophene%29%2Fpoly%28styrene+sulfonic+acid%29+transistor+for+glucose+sensing+at+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH.</a> Chem. Commun. , 1556-1557 (2004).</li>
<li>Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+organic+electrochemical+transistors+in+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors.</a> Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).</li>
</ol>

Projekt ten jest wspierany przez FP7-People-2009-RG, projekt Marie Curie nr 256367 (CELLTOX) oraz wniosek Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych ERC-2010-StG nr 258966 (IONOSENSE), a także wspólny grant z Conseil Regional de Provence Alpes Cote d'Azur i CDL Pharma dla ST. Dziękujemy George'owi Malliarasowi za przydatne dyskusje dotyczące projektowania i funkcji OECT.

Technika ta zapewnia nowatorską metodę integracji organicznego tranzystora elektrochemicznego z żywymi komórkami w celu pomiaru integralności tkanki barierowej. Głównymi zaletami tej techniki są szybkość i czułość, ale także niski koszt urządzenia do dynamicznego monitorowania tkanki barierowej.
Ponieważ ta metoda wykorzystuje żywe komórki, punktem krytycznym jest upewnienie się, że używasz monowarstwy, która reprezentuje nienaruszoną warstwę barierową. Parametry bariery powinny być określone ...

Nabłonek przewodu pokarmowego jest przykładem tkanki barierowej, która kontroluje przepływ cząsteczek między różnymi przedziałami ciała. Nabłonek składa się z wydłużonych komórek walcowatych połączonych ze sobą kompleksami białek, które zapewniają fizyczną barierę1 przed patogenami i toksynami, jednocześnie umożliwiając przepływ wody i składników odżywczych niezbędnych do utrzymania organizmu. Ta selektywność wynika z polaryzacji komórek nabłonkowych, która tworzy dwie różne domeny błonowe: wierzchołkową stronę komórek wystawioną na światło i podstawową stronę komórek zakotwiczonych w leżących poniżej tkankach2,3. Połączenia ścisłe (TJ) to kompleksy białek obecne w wierzchołkowej części komórek nabłonkowych i są częścią większego kompleksu znanego jako połączenie wierzchołkowe4. Przepływ jonów przez tkankę barierową może przebiegać przez szlak transkomórkowy (przez komórkę) lub parakomórkowy (między dwiema sąsiednimi komórkami). Suma transportu przez obie drogi jest znana jako opór przeznabłonkowy. Złącze wierzchołkowe jest odpowiedzialne za regulację jonów i cząsteczek przechodzących przez barierę5,6 poprzez specyficzną funkcję otwierania i zamykania. Dysfunkcja lub zakłócenie tych kompleksów białkowych jest często związane z chorobą7-11. Ponadto wiadomo, że wiele patogenów/toksyn jelitowych jest specyficznie ukierunkowanych na ten kompleks, wnikając w ten sposób do organizmu i prowadząc do biegunki, najprawdopodobniej w wyniku masywnego rozregulowania przepływu jonów / wody przez barierę12-14. Tkanka barierowa może być również modyfikowana poprzez zmianę mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego. Kadheryna jest białkiem krytycznym dla adhezji komórka-komórka i bierze udział w tworzeniu połączenia wierzchołkowego. Wapń jest niezbędny do prawidłowej konformacji strukturalnej kadheryny, a wykazano, że spadek wapnia zewnątrzkomórkowego powoduje zniszczenie połączenia komórka-komórka, a następnie otwarcie szlaku parakomórkowego między komórkami15. W tym badaniu EGTA (Ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra octowy kwas), specyficzny chelator wapnia, został użyty do wywołania pęknięcia w tkance barierowej, ponieważ wykazano, że ma szybki i drastyczny wpływ na przepływ jonów przykomórkowych16,17. Ten chelator wapnia zastosowano na zlewającej się i zróżnicowanej monowarstwie linii komórkowej Caco-2. Wiadomo, że ta linia komórkowa, hodowana we wkładkach do hodowli komórkowych, rozwija cechy przewodu pokarmowego i jest szeroko stosowana w przemyśle farmaceutycznym do testowania wchłaniania leków18,19.
Metod monitorowania integralności tkanki barierowej jest mnóstwo. Metody te są często optyczne, polegając na barwieniu immunofluorescencyjnym określonych białek, o których wiadomo, że znajdują się na złączu wierzchołkowym20, lub polegają na oznaczaniu ilościowym fluorescencyjnej cząsteczki znacznikowej, która jest normalnie nieprzepuszczalna dla tkanki barierowej21,22. Jednak metody bez znakowania (tj. bez fluoroforu/chromoforu) są preferowane, ponieważ użycie etykiety może powodować artefakty i często zwiększa koszty i czas testu. Elektryczne, bezznacznikowe monitorowanie tkanki barierowej stało się ostatnio metodą dynamicznego monitorowania23. Na przykład niedawny postęp technologiczny w dziedzinie spektroskopii impedancji elektrycznej pozwolił na opracowanie dostępnego na rynku aparatu skanującego24,25, który może mierzyć opór przeznabłonkowy (TER), czyli pomiar przewodnictwa jonów w warstwie komórkowej.
Elektronika organiczna stworzyła wyjątkową okazję do połączenia świata elektroniki i biologii26,27 28,29 poprzez użycie przewodzących polimerów, które mogą przewodzić zarówno nośniki elektroniczne, jak i jonowe. Niedawno wprowadzono nową technikę wykrywania naruszeń w tkance barierowej za pomocą OECT30-32. To urządzenie zostało zweryfikowane pod kątem istniejących technik stosowanych do oceny integralności tkanki barierowej, w tym immunofluorescencji, testów przepuszczalności przy użyciu żółtego Lucyfera i spektroskopii impedancyjnej przy użyciu Cellzscope. W przypadku wszystkich badanych związków toksycznych stwierdzono, że OECT działa z równą lub lepszą czułością i zwiększoną rozdzielczością czasową w porównaniu z powyższymi technikami. W tym urządzeniu PEDOT:PSS, polimer przewodzący, który okazał się stabilny i biokompatybilny33,34, jest używany jako materiał aktywny w kanale tranzystorowym. OECT składa się z elektrod drenujących i źródłowych po obu stronach przewodzącego kanału polimerowego. Jest on następnie umieszczany w kontakcie z elektrolitem, który stanowi integralną część urządzenia. Elektroda bramki jest zanurzona w elektrolicie (rysunek 1), a gdy na bramce zostanie przyłożone dodatnie napięcie bramki, kationy z elektrolitu są wtłaczane do kanału, powodując w ten sposób dodomieszkowanie przewodzącego polimeru i powodując zmianę prądu drenu źródła. Dzięki temu urządzenie jest niezwykle wrażliwe na drobne zmiany strumienia jonowego spowodowane wzmocnieniem przez tranzystor. Warstwę komórkową wyhodowaną na wkładzie do hodowli komórkowej umieszczono między elektrodą bramki a kanałem z przewodzącego polimeru. Obecność nienaruszonej warstwy komórkowej działa jako bariera dla kationów wchodzących do polimeru przewodzącego, dlatego w obecności nienaruszonej monowarstwy prąd drenu zmniejsza się (rysunek 2: przejście z regionu a do b). W obecności toksycznego związku tkanka barierowa będzie stopniowo tracić swoją integralność, umożliwiając kationom wejście do filmu polimerowego i zwiększając prąd drenażowy (rysunek 2: region c). Dzięki tej technice pęknięcie w tkance barierowej jest widoczne poprzez modulację prądu drenażowego, odpowiadającą modulacji strumienia w poprzek monowarstwy. To urządzenie jest w stanie mierzyć drobne zmiany strumienia jonowego z niespotykaną rozdzielczością czasową i czułością w czasie rzeczywistym. Technologia ta będzie interesująca w dziedzinie toksykologii do testowania leków, diagnostyki chorób lub badań podstawowych, ponieważ model bariery można łatwo dostosować. Metoda ta przyczyni się również do ograniczenia eksperymentów na zwierzętach, ponieważ pozwoli na walidację modeli in vitro w celu zastąpienia badań in vivo.

<table><tbody><tr><td>Clevios pH 1000</td><td>Heraus Żywica Clevios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ9260</td><td>Cipec Specialties</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas dodecylobenzenosulfonowy (DBSA)</td><td>Acros Organiczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-glicydoksypropypropylotrymisilan (GOPS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa wkładka do hodowli komórek zawieszonych Millicell&nbsp; PET 0,4 &mu; m Millipore</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51705</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej BD Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51705</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GPT PES 0,22 &mu; M</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM Marque GIBCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3434T</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inact.</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3470C</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3524T</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3513N</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-kwas tetraoctowy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy, bezwodny, 99,8%,</td> ogniwa <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184 ELASTOMER</td><td></td>SILIKONOWY</tr><tr><td>Au (99,99%)</td><td>NEYCO</td><td>AU3X6</td><td></td></tr><tr><td>Chrom (99,95%)</td><td></td>Specjalistyczne systemy powłokowe NEYCO <td></td><td></td></tr><tr><td>Parylene C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drut Ag/AgCl</td><td>Aparatura</td><td></td><td></td>Harvarda</tr><tr><td>Fotorezystor</td><td>Specjalności</td><td></td><td></td> Cipec</tr></tbody></table>

wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Przewód pokarmowy jest przykładem tkanki barierowej, która stanowi fizyczną barierę przed wnikaniem patogenów i toksyn, jednocześnie umożliwiając przepływ niezbędnych jonów i molekuł. Naruszenie tej bariery może być spowodowane zmniejszeniem stężenia wapnia w zewnątrzkomórkach. To zmniejszenie stężenia wapnia powoduje zmianę konformacyjną w białkach biorących udział w uszczelnianiu bariery, co prowadzi do wzrostu strumienia parakomórkowego. Aby naśladować ten efekt, chelator wapnia glikol etylenowy-bis(eter beta-aminoetylowy)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas (EGTA) zastosowano na monowarstwie komórek, o których wiadomo, że są reprezentatywne dla przewodu pokarmowego. Istnieją już różne metody wykrywania przerwania tkanki barierowej, takie jak testy immunofluorescencji i przepuszczalności. Metody te są jednak czasochłonne i kosztowne oraz nie nadają się do pomiarów dynamicznych lub wysokoprzepustowych. Istnieją również elektroniczne metody pomiaru integralności tkanki barierowej do pomiaru oporności przeznabłonkowej (TER), jednak są one często kosztowne i złożone. Pilnie potrzebne jest opracowanie szybkich, tanich i czułych metod, ponieważ integralność tkanki barierowej jest kluczowym parametrem w odkrywaniu leków i diagnostyce patogenów/toksyn. Organiczny tranzystor elektrochemiczny (OECT) zintegrowany z komórkami tworzącymi tkankę barierową okazał się nowym urządzeniem zdolnym do dynamicznego monitorowania integralności tkanki barierowej. Urządzenie jest w stanie mierzyć niewielkie zmiany strumienia jonowego z niespotykaną rozdzielczością czasową i czułością, w czasie rzeczywistym, jako wskaźnik integralności tkanki barierowej. Ta nowa metoda opiera się na prostym urządzeniu, które może być kompatybilne z aplikacjami przesiewowymi o wysokiej przepustowości i wytwarzane przy niskich kosztach.

Podczas pierwszego etapu pomiaru prąd dren może ulegać niewielkim wahaniom, jednak w większości przypadków powinien pozostać stabilny (Rycina 2, sekcja a). Jeśli sygnał nie jest stabilny, tranzystor należy odrzucić i wymienić. Kontrola stabilności zapewnia również, że ewentualne początkowe straty przewodnictwa urządzenia nie wpłyną na późniejszy pomiar. Po kilku minutach pomiaru na górze kanału umieszcza się wkład z komórkami tworzącymi tkankę barierową. Prąd dren powinien natychmiast spaść (Ryci...

Organiczny tranzystor elektrochemiczny jest zintegrowany z żywymi komórkami i służy do monitorowania przepływu jonów przez barierę nabłonkową przewodu pokarmowego. W tym badaniu mierzony jest wzrost strumienia jonów, związany z rozerwaniem połączeń ścisłych, wywołany obecnością chelatora wapnia EGTA (glikol etylenowy-bis(beta-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas).

Wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie taniej, czułej i szybkiej metody diagnostycznej do monitorowania stanu tkanki barierowej. Zostanie to osiągnięte poprzez wykonanie organicznego tranzystora elektrochemicznego, który może w sposób szybki i czuły monitorować zmiany przepływu jonów w elektrolycie poprzez pomiar zmian prądu dren-źródło tranzystora. W drugim kroku, na urządzeniu OECT zintegrowana zostanie warstwa zdrowej tkanki barierowej wyhodowana na filtrze, aby umożliwić monitorowanie przepływu jonów przez warstwę tkanki barierowej, który będzie częściowo zablokowany, jeśli warstwa komórkowa pozostanie zdrowa.Jeśli dodany zostanie związek toksyczny, który niszczy lub zaburza warstwę tkanki barierowej, przepływ jonów przez warstwę komórek nie będzie już blokowany. Uzyskane wyniki wykazują, że OECT może skutecznie wykrywać toksyczne działanie związku modelowego, co dowodzi, że pomiary z tranzystora mogą służyć jako diagnostyka do monitorowania stanu zdrowia tkanki barierowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak spektroskopia impedancyjna, jest fakt, że organiczne urządzenia elektroniczne mają potencjał do niskokosztowej p

sensing-barrier-tissue-disruption-with-an-organic-electrochemical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Czucie uszkodzenia tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje konstrukcję multipleksowego czujnika opartego na mikroiigłach. Urządzenie to jest opracowywane w celu prowadzenia pobierania próbek in situ oraz analizy elektrochemicznej wielu analitów w sposób szybki i selektywny. Przewidujemy zastosowanie tych czujników opartych na mikroigłach w medycynie klinicznej oraz badaniach biomedycznych.

Czujnik oparty na pustych mikroiğłach do multipleksowego transdermalanego detekcji elektrochemicznej

Opisujemy protokół produkcji i pomiaru urządzeń dla biosensorów wysokiej częstotliwości opartych na nanorurkach węglowych. Technika wykrywania wysokiej częstotliwości łagodzi podstawowy efekt ekranowania jonowego (Debye) i umożliwia pracę biosensora z nanorurkami w roztworach o wysokiej sile jonowej, w których zawodzą konwencjonalne bioczujniki elektroniczne. Nasza technologia stanowi unikalną platformę dla elektronicznych bioczujników przyłóżkowych (POC) działających w warunkach fizjologicznie...

Wytwarzanie nanoelektronicznego biosensora wysokiej częstotliwości z nanorurek węglowych do wykrywania w roztworach o wysokiej sile jonowej

W tym artykule prezentujemy protokół selektywnego osadzania materiałów organicznych na tekstyliach, który pozwala na bezpośrednią integrację organicznych urządzeń elektronicznych z urządzeniami do noszenia. Wyprodukowane urządzenia można w pełni zintegrować z tekstyliami, szanując ich mechaniczny wygląd i umożliwiając wykrywanie.

Prosta i skalowalna metoda wytwarzania organicznych urządzeń elektronicznych na tekstyliach

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować tani woltoamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który może być używany z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiarów przezprzeznabłonkowego/śródbłonkowego oporu elektrycznego.

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania urządzenia opartego na tranzystorze polowym z modulacją ładunku organicznego (OCMFET) do łączenia komórkowego in vitro. Urządzenie, zwane macierzą micro OCMFET, jest elastycznym, tanim i niereferencyjnym urządzeniem, które umożliwi monitorowanie aktywności elektrycznej i metabolicznej elektroaktywnych kultur komórkowych.

In vitro Wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku

Poniższe badanie ocenia profil toksykologiczny wybranego szkieletu metaloorganicznego za pomocą wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i substratu (ECIS), techniki badań przesiewowych w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości.

Elektryczne wykrywanie podłoża komórkowego do oceny profili toksykologicznych struktury metaloorganicznej w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje niezawodny i skuteczny model in vitro bariery mózgowo-krwiennej. Metoda wykorzystuje mysie komórki śródbłonka naczyniowego mózgu bEnd.3 i mierzy transbłonowy opór elektryczny.

Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

Tutaj prezentujemy protokół użycia organicznych tranzystorów elektrochemicznych (OECT) do translacji aktywności zewnątrzkomórkowego transferu elektronów (EET) w Shewanella oneidensis na sygnały elektryczne. Hybrydowy system OECT zapewnia zwiększoną solidność, czułość i potencjał do szybkich, wysokowydajnych testów, co czyni go skutecznym narzędziem do pomiarów EET.

Translacja zewnątrzkomórkowych działań związanych z przenoszeniem elektronów za pomocą organicznych tranzystorów elektrochemicznych

Protokół ten opisuje wytwarzanie jednoczęściowego tranzystora polowego (ISFET) na bazie tlenku indu i cyny (ITO), który może być skonstruowany jako czujnik FET bramkowany roztworem (np. czujnik pH) przy użyciu krótkiego i prostego procesu (około pół dnia). Ten jednoczęściowy tranzystor ITO-ISFET może być również stosowany do biodetekcji.

Wytwarzanie jednoczęściowego tranzystora na bazie tlenku indu i cyny z bramką rozpuszczającą, umożliwiającego czułą biodetekcję

Poznaj metodę wykrywania uszkodzeń barier tkankowych za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego. Technika ta umożliwia szybką i czułą diagnostykę integralności bariery jelitowej.

Wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

Przeglądaj więcej filmów