Name: Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego u myszy z oknem czaszkowym do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia długoterminową obserwację dynamiki nowotworu i mikrośrodowiska komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy serdecznie dziękują Dr. KK Fenrichowi, Dr. M-C. Amoureux, P. Weber i A. Jaouen za pomocne dyskusje; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, personel zakładu dla zwierząt w IBDML oraz personel platformy obrazowania PicSIL w IBDML w celu uzyskania wsparcia technicznego. Prace te były wspierane przez granty z Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) dla GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) dla FD, przez stypendia z Fédération de la Recherche Médicale i Cancéropole PACA dla Republiki Czeskiej.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z francuskim ustawodawstwem i zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 24 listopada 1986 roku (86/609/EWG) w sprawie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Badania na zwierzętach zostały autoryzowane przez Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licencja D-13-055-21) i zatwierdzone przez komisję etyczną Prowansji Cote d'Azur nr 14 (Projekt 87-04122012).
1. Przygotowanie sferoid
<ol>
	<li>Przygotowanie szalek Petriego pokrytych agarozą
		<ol>
			<li>Zmieszać 1 g agarozy ze 100 ml pożywki do hodowli komórkowych nieuzupełnionej płodową surowicą bydlęcą. Użyj kuchenki mikrofalowej (850 W przez 40 sekund, następnie 3 x 15 sekund; mieszaj roztwór między każdą sesją mikrofalową), aby zagotować roztwór i całkowicie rozpuścić agarozę. Autoklawuj ten 1% roztwór agarozy przez 20 minut w temperaturze 120 °C, aby zapewnić sterylność. Uwaga: Należy pamiętać, aby całkowicie rozpuścić agarozę przed protokołem autoklawu. Niejednorodność może zagrozić tworzeniu się sferoid.</li>
			<li>Po wyjęciu z autoklawu wlać 10 ml 1% roztworu agarozy na szalki Petriego o wymiarach 100 x 20 mm. Pozostaw szalki Petriego na 20 minut w temperaturze pokojowej, aby 1% roztwór agarozy zestalił się.</li>
			<li>Dodaj 10 ml PBS powyżej agarozy, aby utrzymać wilgotność. Uszczelnić pokrywę szalek Petriego pokrytych agarozą, owijając je parafilmem, aby uniknąć parowania. Szalki Petriego mogą być przechowywane do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C, jeśli są odpowiednio nawilżone przez warstwę PBS.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Kultura sferoidalna
		<ol>
			<li>W kolbie o średnicy 75cm2 hodować komórki glejaka w zalecanym pożywce jako monowarstwę.</li>
			<li>Zastąpić PBS z jednej z 1% pokrytych agarozą płytki Petriego 1,5 ml "wstępnie kondycjonowanej pożywki" pobranej z kolby zawierającej monowarstwę 2D komórek glejaka.</li>
			<li>Usunąć pożywkę z kolby zawierającej monowarstwę 2D komórek glejaka.</li>
			<li>Delikatnie spłucz monowarstwę 10 ml PBS.</li>
			<li>Dodać 2 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA i inkubować kolbę przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Uwaga: Czas inkubacji może się różnić w zależności od użytej linii komórkowej.</li>
			<li>Dodać 8 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać działanie trypsyny, delikatnie przepłukać zawiesinę komórkową. Uwaga: Należy uważać, aby nie spłukiwać powietrza w zawiesinie komórek, ponieważ zwiększa to śmierć komórek.</li>
			<li>Umieścić 6 ml zawiesiny komórkowej w jałowej fiolce.</li>
			<li>Odwirować fiolkę przez 4 minuty przy 800 obr./min.</li>
			<li>Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 3 ml pożywki hodowlanej.</li>
			<li>Wysiewać zawiesinę komórkową na przygotowanej szalce Petriego pokrytej agarozą.</li>
			<li>Umieścić szalkę Petriego w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 na 2 do 3 dni, aż utworzą się sferoidy o pożądanej średnicy.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
2. Implantacja sferoidów i okien
<ol>
	<li>Przygotowanie układu wtryskowego
		<ol>
			<li>Oczyść szklane kapilary (o średnicy 1 mm) poprzez sonikację w 70% etanolu przez 10 minut. Spłucz dwa razy wodą przed umieszczeniem w inkubatorze do wyschnięcia.</li>
			<li>Pociągnij kilka oczyszczonych szklanych kapilar za pomocą ściągacza do pipet, aby przygotować mały bulion.</li>
			<li>Złam końcówkę naciągniętej kapilary, drapiąc koniec o kawałek bibuły, aby uzyskać ściętą kończynę o pożądanym rozmiarze: zwykle o średnicy zewnętrznej 300-350 μm i średnicy wewnętrznej 250-300 μm. Podczas tego procesu kształtowania należy kontrolować średnicę naczynia włosowatego za pomocą makroskopu, którego oko jest wyposażone w stopniowaną mirę.</li>
			<li>Podłącz nieskośny koniec kapilary do kolektora 3-drogowego za pomocą kawałka plastikowej rurki, której wewnętrzna średnica pasuje do zewnętrznej średnicy kapilary.</li>
			<li>Za pomocą plastikowej rurki podłącz dwie pozostałe drogi kolektora do strzykawki o pojemności 25 μl w mikrolitrach i do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej olejem mineralnym zgodnym z histem.</li>
			<li>Wyreguluj selektor kolektora, aby ustalić ścieżkę między strzykawką o pojemności mikrolitrów a strzykawką o pojemności 1 ml. Wyjąć tłok strzykawki o pojemności 1 ml i wstrzyknąć olej mineralny do tyłu do strzykawki o pojemności 1 ml, aż do wycieku, naciskając tłok strzykawki o pojemności 1 ml. Wymienić tłok strzykawki z mikrolitrami, uważając, aby nie pozostawić pęcherzyków powietrza w probówce.</li>
			<li>Wyregulować przełącznik kolektora, aby ustalić drogę między kapilarą a strzykawką o pojemności 1 ml. Napełnij kapilarę olejem mineralnym, aż wycieknie z końcówki, uważając, aby nie pozostawić pęcherzyków powietrza w rurce.</li>
			<li>Wyreguluj selektor kolektora, aby ustanowić połączenie między strzykawką o pojemności mikrolitrów a kapilarą. Wyrzuć około 10 μl oleju mineralnego.</li>
			<li>Zanurz końcówkę kapilary w roztworze PBS i za pomocą miernika strzykawki o pojemności mikrolitrów zassaj 5 μl PBS do kapilary. Należy pamiętać, że łąkotka między olejem a PBS jest wyraźnie widoczna.</li>
			<li>Zamocuj kapilar na 3-osiowym mikromanipulatorze pasującym pod makroskopem chirurgicznym. System ten będzie wykorzystywany do kierowania kapilary do miejsca wstrzyknięcia pod kontrolą wzrokową.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Implantacja sferoidalna
		<ol>
			<li>Lekko uspokoić mysz poprzez wdychanie izofluranu w komorze indukcyjnej (1,5% w powietrzu przez 1 do 1,5 minuty).</li>
			<li>Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny ketaminy/ksylazyny (120 mg/kg, 12 mg/kg). Należy pamiętać, że znieczulenie często obniża temperaturę ciała zwierzęcia. Zaleca się przeprowadzenie zabiegu chirurgicznego w pomieszczeniu o temperaturze 26 °C i utrzymanie zwierzęcia w cieple za pomocą leżącej pod spodem termokontrolowanej poduszki grzewczej.</li>
			<li>Nałóż maść na oczy, aby uniknąć wysuszenia oczu.</li>
			<li>Ogol skórę głowy zwierzęcia.</li>
			<li>Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej za pomocą nauszników i ustnika.</li>
			<li>Oczyść skórę jodem powidonu (3% mydła, następnie 10% roztwór).</li>
			<li>Wykonaj nacięcie o długości 1 cm wzdłużnie na środku skóry głowy za pomocą skalpela. Za pomocą nożyczek odetnij i usuń skórę nad kośćmi ciemieniowymi.</li>
			<li>Za pomocą ostrza skalpela delikatnie usuń okostną nad czaszką. Obficie nałóż cyjanoakrylan na wierzch kości, aby uzyskać szorstką powierzchnię do późniejszego przylegania cementu.</li>
			<li>Wywierć kość ciemieniową pod makroskopem chirurgicznym, aby uzyskać kraniotomię o średnicy 4 mm. Podczas całej procedury obficie dodawaj lodowaty PBS zawierający Pencillin (1 000 U/ml) i streptomycynę (1 mg / ml), aby zapobiec podgrzaniu. Usuń małe fragmenty kości za pomocą kleszczy i mokrej sterylnej gazy. Należy uważać, aby wywiercić co najmniej 1 mm od szwów ciemieniowych czaszki, aby uniknąć krwotoków.</li>
			<li>Rozrzedzić kość na granicy kraniotomii, gdzie zostanie uszczelnione szklane okienko. Celem jest zapewnienie późniejszego płaskiego ustawienia szklanego okna z maksymalną powierzchnią kontaktu między mózgiem a szkłem. Powoli usuń kość za pomocą kleszczy i oczyść odsłoniętą oponę twardą roztworem PBS.</li>
			<li>Weź okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 5 mm, wyczyść je alkoholem i osusz bibułą. Spróbuj użyć szkiełka nakrywkowego jako pokrywki do kraniotomii i upewnij się, że duża płaska powierzchnia mózgu styka się ze szkłem. W razie potrzeby usuń szkiełko nakrywkowe, aby jeszcze bardziej rozrzedzić kości boczne. Kontynuuj, aż mózg zostanie ściśnięty płasko, jeśli delikatnie dociśniesz szkiełko nakrywkowe po umieszczeniu go na miejscu.</li>
			<li>Ponownie wyczyść szkiełko nakrywkowe alkoholem, osusz je bibułą i zachowaj osobno.</li>
			<li>Za pomocą igły o rozmiarze 26 wykonaj otwór w oponie twardej w środku kraniotomii, unikając jednak głównych naczyń krwionośnych. Upewnij się, że nie uszkodzisz miąższu mózgu, ponieważ celem tego kroku jest po prostu otwarcie opony twardej.</li>
			<li>Delikatnie oczyść oponę twardą roztworem PBS, aby usunąć krew krwotoczną. Przykryj kawałkiem bibuły podczas przygotowywania iniekcji sferoidowej.</li>
			<li>Za pomocą sferoidalnego systemu iniekcyjnego przygotowanego w kroku 2.1 należy odessać okrągły sferoid pasujący do wewnętrznej średnicy kapilary (około 200-250 μm) z płytki Petriego przygotowanej w kroku 1.2. Spheroid powinien być dostarczany wraz z około 5 μl pożywki hodowlanej. Pod jego ciężarem powinien opaść na czubek kapilary.</li>
			<li>Usunąć mokrą bibułę użytą do przykrycia kraniotomii i umieścić zwierzę pod systemem iniekcyjnym.</li>
			<li>Opuścić pipetę iniekcyjną, aż dotknie otworu wykonanego w oponie twardej. Następnie ponownie obniż go o 250 μm. Poczekaj 30 sekund.</li>
			<li>Powoli wstrzyknąć sferoidę za pomocą tłoka strzykawki mikrolitrowej (2-3 μl), jednocześnie wypompowując nadmiar płynu cienkim kawałkiem bibuły. Odczekać 30 sekund, a następnie delikatnie podnieść pipetę iniekcyjną o 50 μm w kierunku powierzchni. Odczekaj ponownie 30 sekund i powtórz procedurę podnoszenia w krokach co 50 μm, aż do powierzchni. Czas oczekiwania pozwala uniknąć ekstrakcji sferoidy, która przykleiłaby się do pipety.</li>
			<li>Potwierdź obecność sferoidy w mózgu za pomocą makromikroskopu fluorescencyjnego.</li>
			<li>Na szalce Petriego zmieszać usieciowane kulki żelowe dekstranu o średnicy 100-300 μm z roztworem PBS. Odczekaj 1 minutę i wyryj kilka uwodnionych koralików. Umieść je na kości przylegającej do kraniotomii.</li>
			<li>Pod kontrolą makroskopową wybierz jeden koralik o średnicy zbliżonej do wielkości otworu opony twardej. Przetnij usieciowany żel dekstranowy na dwie połowy za pomocą kleszczy.</li>
			<li>Delikatnie umieścić usieciowany żel dekstranowy hemi-kulka do otworu iniekcyjnego wypukłą powierzchnią w kierunku sferoidy. Uważaj, aby nie usunąć sferoidy i delikatnie dociskaj w dół, aż granica wklęsłości zetknie się z otaczającą oponą twardą.</li>
			<li>Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na szkiełku podstawowym; zanurz końcówkę wykałaczki w kropli, aby pobrać niewielką ilość kleju. Szybko uszczelnij krawędzie usieciowanego żelu dekstranowego hemi-beshed do sąsiedniej opony twardej, stemplując klej dookoła. Uważaj, aby wykonywać szybkie i dokładne ruchy, aby uniknąć przyklejania usieciowanego żelu dekstranowego do wykałaczki. Unikaj nadmiaru kleju, który może się rozprzestrzeniać i utrudniać, a nawet uniemożliwiać obrazowanie po wyschnięciu. Odczekaj 2 minuty, aż klej wyschnie, a następnie wyczyść kraniotomię i otaczającą kość roztworem PBS.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Implantacja okienna
		<ol>
			<li>Umieścić okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 5 mm powyżej kraniotomii (patrz 2.2.12). Krawędzie szkiełka nakrywkowego muszą znajdować się na przerzedzonej czaszce na zewnętrznej stronie kraniotomii. Szkiełko nakrywkowe musi stykać się z oponą twardą i rozrzedzoną kością na krawędziach. Bardzo ważne jest, aby mieć bezpośredni kontakt między oponą twardą a szkiełkiem nakrywkowym, w przeciwnym razie może rozwinąć się tkanka bliznowata, która utrudnia przejrzystość optyczną.</li>
			<li>Za pomocą chusteczki należy wchłonąć PBS na krawędziach szkiełka nakrywkowego, tak aby roztwór nie pokrywał całkowicie kraniotomii przy wywieraniu niewielkiego nacisku na środek szkiełka nakrywkowego. Zapewni to, że kość, szkło i mózg zostaną sklejone ze sobą po stronie obszaru zainteresowania.</li>
			<li>Utrzymuj niewielki nacisk na środku szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy, delikatnie nakładając cyjanoakrylan na granicy między kością a szkiełkiem nakrywkowym. Klej będzie się spontanicznie rozprzestrzeniał aż do granicy faz z roztworem PBS. Roztwór będzie działał jak bariera, biorąc pod uwagę hydrofobowość kleju. Uszczelnienie powinno być skuteczne w czasie krótszym niż minuta, ale należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przesuwać szkiełka nakrywkowego, dopóki nie zostanie zamocowane. W przeciwnym razie spowodowałoby to wyciek cyjanoakrylanu na oponie twardej, a tym samym doprowadziłoby do niepowodzenia operacji.</li>
			<li>W przypadku, gdy klej rozlałby się na wierzchu szkła, usuń go za pomocą ostrza mikroskalpela, wykonując ruchy spiralne, ponieważ w przeciwnym razie może to zmniejszyć przejrzystość optyczną. Uważaj, aby nie rozbić szklanego szkiełka nakrywkowego podczas zabiegu z powodu nadmiernego nacisku.</li>
			<li>Utrwal mocowanie szkła, nakładając cement dentystyczny na krawędzie szkiełka nakrywkowego w kierunku sąsiedniej czaszki. Upewnij się, że zakrywasz całą odsłoniętą czaszkę aż do skóry głowy. Używając dodatkowego cementu, zbuduj boczne ściany wokół szkiełka nakrywkowego, aby stworzyć kałużę wymaganą do zanurzenia obiektywu. Cement dentystyczny utwardza się w mniej niż 10 minut.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna i przygotowanie do obrazowania
<ol>
	<li>Opieka pooperacyjna
		<ol>
			<li>Wyjąć mysz z ramy stereotaktycznej, wstrzyknąć deksametazon (0,2 mg/kg) i rimadyl (5 mg/kg) s.c. w okolice miednicy i umieścić ją w klatce z ciepłym gniazdem tkankowym. </li>
			<li>Monitoruj zwierzę, aż efekty znieczulenia znikną. Na ogół 2 do 3 godzin po zabiegu myszy są w pełni mobilne. Upewnij się, że zwierzę ma łatwy dostęp do jedzenia i wody. Podaj zwierzęciu agarozę zawierającą glukozę (agaroza 3%, glukoza 3%).</li>
			<li>Należy codziennie monitorować masę ciała zwierzęcia i wstrzykiwać deksametazon (0,2 mg/kg) i Rimadyl (5 mg/kg) dośrodkowo przez pierwsze 10 dni po zabiegu. Ze względów etycznych należy poddać myszy eutanazji, gdy utrata przekracza 15% ich pierwotnej wagi. Ciśnienie śródczaszkowe wzrasta wraz z wielkością guza, co prowadzi do upośledzenia motorycznego zwierzęcia. Jest to zależne od linii komórek nowotworowych i występuje z różnym opóźnieniem po operacji. Należy zwrócić szczególną uwagę na scharakteryzowanie punktu końcowego eksperymentu z użytą linią komórkową.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do obrazowania
		<ol>
			<li>Lekko uspokaj mysz poprzez wdychanie izofluranu w komorze indukcyjnej (1,5% w powietrzu przez 1 do 1,5 min).</li>
			<li>Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny ketaminy / ksylazyny (100 mg/kg, 10 mg/kg). Takie znieczulenie zazwyczaj pozwala na 45 minut obserwacji. Aby wykonać dłuższe sesje obrazowania, mysz umieszcza się pod ciągłym wdychaniem izofluranu w powietrzu (0,25-0,75%).</li>
			<li>Nałóż maść na oczy, aby uniknąć wysuszenia oczu.</li>
			<li>Umieść zwierzę na ramie stereotaktycznej i zablokuj czaszkę za pomocą nauszników.</li>
			<li>Aby uwidocznić naczynia krwionośne, można wstrzyknąć dożylnie barwnik fluorescencyjny.</li>
			<li>Jeśli okno wydaje się brudne, można je wyczyścić, delikatnie usuwając zanieczyszczenia cienkim ostrzem i rogiem chusteczki. Nie używaj alkoholu do czyszczenia okna, ponieważ nie zawsze jest on kompatybilny z cementem dentystycznym i może ochłodzić mózg pod oknem.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Brain tumors.</a> N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).</li>
<li>Ricard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+brain+tumours+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Primary brain tumours in adults.</a> Lancet. 379, 1984-1996 (2012).</li>
<li>Prados, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+III+randomized+study+of+radiotherapy+plus+procarbazine%2C+lomustine%2C+and+vincristine+with+or+without+BUdR+for+treatment+of+anaplastic+astrocytoma%3A+final+report+of+RTOG+9404%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).</li>
<li>Piao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+resistance+to+anti-VEGF+therapy+is+associated+with+myeloid+cell+infiltration%2C+stem+cell+accumulation%2C+and+a+mesenchymal+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype.</a> Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li>
<li>Studwell, A. J., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shift+from+cell+cultures+to+creatures%3A+in+vivo+imaging+of+small+animals+in+experimental+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine.</a> Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243, 221-226 (2011).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+synchrotron+irradiation+on+vasculature+and+tissue+in+healthy+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain.</a> J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).</li>
<li>von Baumgarten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bevacizumab+has+differential+and+dose-dependent+effects+on+glioma+blood+vessels+and+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells.</a> Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , 680(2008).</li>
<li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li>
<li>Van Meir, E. G. Ch. 12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNewcomb%2C+E+%22CNS+Cancer%2C+Cancer+Drug+Discovery+and+Development%22">CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development</a>. , Humana Press. 227-241 (2009).</li>
<li>Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+rigidity+of+the+extracellular+matrix+regulates+the+structure%2C+motility%2C+and+proliferation+of+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells.</a> Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Takie podejście pozwala na wykorzystanie metod obrazowania optycznego do monitorowania przez dni i tygodnie wzrostu glejaka wszczepionego ortotopowo. To samo zwierzę może być następnie poddane praktycznie dowolnej metodzie obrazowania mózgu w trakcie patologii; Jednak preparat specyficzny dla mikroskopii dwufotonowej oferuje wyjątkową możliwość osiągnięcia subkomórkowej rozdzielczości wewnątrz mózgu żywego zwierzęcia. Nasz protokół ma tę zaletę, że wymusza wzrost guza w miąższu mózgu, a nie poza oponą, jak to ma miejsce,...

Glejak wielopostaciowy wydaje się być najbardziej agresywną formą guza mózgu u dorosłych, z medianą przeżycia 12 miesięcy i 5-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 5%. Postępowanie kliniczne opiera się na zabiegu chirurgicznym, radioterapii i chemioterapii, często stosowanych w połączeniu. Jednak efekty tych zabiegów pozostają paliatywne1-3.
Do tej pory większość badań neuroonkologicznych opiera się na technikach, które są w stanie zapewnić jedynie statyczny widok i są przeprowadzane na dużych kohortach zwierząt z nowotworami, które zostały uśmiercone w różnych punktach czasowych (zobacz na przykład4,5). Niedawny rozwój metod obserwacji opartych na obrazowaniu przyżyciowym pozwala na badanie wzrostu glejaka i interakcji między komórkami nowotworowymi a ich patofizjologicznym mikrośrodowiskiem na tym samym zwierzęciu w czasie. Otwiera to drogę do ekskluzywnej informacji, która do tej pory była nieosiągalna6. Transgeniczne zwierzęta wykazujące ekspresję znaczników fluorescencyjnych w komórkach będących przedmiotem zainteresowania mogą być wykorzystane do badania specyficznych interakcji między komórkami nowotworowymi a np. neuronami w tym artykule.
W ciągu ostatniej dekady, mikroskopia dwufotonowa>7 stała się złotym standardem w podstawowych badaniach neuroonkologicznych i próbach przedklinicznych8,9 ze względu na zdolność do wykonywania głębokich obserwacji śródżyciowych mózgu myszy (>500 μm poniżej opony twardej) z mikrometryczną rozdzielczością przestrzenną10. Korzystając z przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej z ortotopowymi modelami zwierzęcymi z wszczepionym przewlekłym oknem czaszkowym11, możliwe jest śledzenie progresji guza w czasie na tej samej myszy9,12.
Jedną z głównych wad tych wcześniej opublikowanych modeli zwierzęcych jest jednak to, że nie naśladują one fizycznych ograniczeń, które rządzą wzrostem guza, ponieważ opona twarda nie jest uszczelniona po wstrzyknięciu zawiesiny komórkowej9,13,14. Komórki glejaka mogą przeciekać w przestrzeni zewnątrzoponowej, przekształcając model glejaka ortotopowego w heterotopowy.
Prezentowany tutaj model zwierzęcy polega na wstrzyknięciu sferoidy komórek glejaka fluorescencyjnego do kory mózgowej na głębokość 200 μm, a następnie uszczelnieniu opony twardej za pomocą usieciowanego żelu dekstranowego hemi-beada i kleju zgodnego z histo. Wzrost guza jest następnie ograniczony do miąższu mózgu, który utrzymuje patofizjologiczne ograniczenia fizyczne. Przewlekłe szklane okienko wszczepione nad guzem umożliwia łatwy dostęp optyczny do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta wykazujące ekspresję znaczników fluorescencyjnych w interesujących komórkach, możliwe jest przeprowadzenie obserwacji wzrostu glejaka w czasie i zbadanie jego interakcji z mikrośrodowiskiem (w tym przypadku z neuronami i naczyniami krwionośnymi podkreślonymi fluorescencyjnym dekstransem).

<table><tbody><tr><td>Wiertło</td><td>Dremel (Niemcy)</td><td>398</td><td>wystarczy każda wysokiej jakości chirurgiczna wiertarka do kości</td></tr><tr><td>Frez wiertarski (#1/4 Frez okrągły z węglika spiekanego)</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>501860 (#1/4)</td><td>sprzedawane również przez Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>14395</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont M5S</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>GACD (USA)</td><td>12-565 & 12-568</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan</td><td>Eleco-EFD (Francja)</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary bez włókna</td><td>Clark Electromedical Instruments (Wielka Brytania)</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa (25 &mikro; l)</td><td>Hamilton (USA)</td><td>702</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>Wyprowadzenie T (3-drożny kran - Luer lock)</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>14035-10</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna (adapter myszy)</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Warner Instruments (USA)</td><td>CS-5R (64-0700)</td><td></td></tr><tr><td>Usieciowany żel dekstranowy (Sephadex) G50 Gruboziarnisty 100-300 &mikro; Koraliki m</td><td>Dostępne u różnych dostawców, w tym Sigma (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>TVM (Francja)</td><td>Makroskop fluorescencji w żelu Ocry-gel</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica MZFLIII (Niemcy)</td><td></td><td>również sprzedawane przez inne firmy</td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Zeiss LSM 7MP (Niemcy)</td><td></td><td>również sprzedawane przez inne firmy (Nikon, &hellip;)</td></tr><tr><td>Przestrajalny laser femtosekundowy na podczerwień (Ma&iuml;-Ta&iuml;)</td><td>Spectra Physics (USA)sprzedawane</td><td></td> <td>również przez inne firmy</td></tr></tbody></table>

ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najbardziej agresywną formą guza mózgu, na którą do tej pory nie było dostępnych metod leczenia.
Mysie modele tej patologii polegają na wstrzyknięciu zawiesiny komórek glejaka do miąższu mózgu po nacięciu opony twardej. Podczas gdy komórki muszą być wstrzykiwane powierzchownie, aby były dostępne dla przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, powierzchowne wstrzyknięcia nie są w stanie odtworzyć stanów fizjologicznych. Rzeczywiście, uciekając przez drogę iniekcyjną, większość komórek nowotworowych dociera do przestrzeni zewnątrzoponowej, gdzie rozszerzają się nienormalnie szybko przy braku mechanicznych ograniczeń ze strony miąższu.
Nasze ulepszenia polegają nie tylko na ogniskowym wszczepieniu sferoidu glejaka, zamiast wstrzykiwania zawiesiny komórek glejaka w powierzchowne warstwy kory mózgowej, ale także na zatkaniu miejsca wstrzyknięcia przez usieciowany hemi-kulkę żelu dekstranowego, który jest przyklejony do otaczającego miąższu i uszczelniony do opony twardej cyjanoakrylanem. W sumie środki te wymuszają fizjologiczną ekspansję i infiltrację komórek nowotworowych wewnątrz miąższu mózgu. Kraniotomia została ostatecznie zamknięta szklanym oknem przyklejonym do czaszki, aby umożliwić przewlekłe obrazowanie przez wiele tygodni przy braku rozwoju tkanki bliznowatej.
Korzystając z fluorescencyjnych transgenicznych zwierząt wszczepionych fluorescencyjnymi komórkami nowotworowymi, wykazaliśmy, że dynamika interakcji zachodzących między komórkami glejaka, neuronami (np. myszy Thy1-CFP) i naczyniową (uwydatniona przez dożylne wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego) może być uwidoczniona za pomocą przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej podczas postępu choroby.
Możliwość obrazowania guza w mikroskopowej rozdzielczości w minimalnie upośledzonym środowisku mózgowym stanowi ulepszenie obecnych modeli zwierzęcych GBM, co powinno przynieść korzyści w dziedzinie neuroonkologii i testowania leków.

Po wykonaniu protokołu chirurgicznego (Rysunek 1), zwierzęta można obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez wiele tygodni aż do momentu uśmiercenia. Po operacji może wystąpić reakcja zapalna, która ustępuje w ciągu jednego lub dwóch tygodni. Wzrost guza można obserwować za pomocą różnych technik mikroskopowych, w tym makroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii dwufotonowej (Rysunek 2). Przedstawione tutaj przykładowe obrazy zostały wykonane przy użyciu makroskopu fluorescen...

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego, odpowiedniego do obrazowania optycznego in vivo w korze mózgowej myszy. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wykonanie okna czaszkowego nad korą ciemieniową. Następnym krokiem procedury jest implantacja sferoidy nowotworowej glejaka S w powierzchowne warstwy mózgu.Miąższ następnie uszczelnia obszar i blokuje miejsce wstrzyknięcia. Śledzi on siły rozwoju guza w obrębie miąższu i utrzymuje ograniczenia biofizyczne. Ostatnim krokiem jest uszczelnienie szklanego okienka w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią mózgu, aby zapobiec tworzeniu się tkanki bliznowatej, zapewniając tym samym optymalną przejrzystość podczas obrazowania.W ostateczności wyniki mogą wykazać progresję guza glejaka, przebudowę naczyniową oraz mikrośrodowisko komórkowe w rozdzielczości pojedynczej komórki dzięki intravitalnej mikroskopii dwufotonowej. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy próbowaliśmy przeszczepić zawiesinę steroidową bez bariery fizycznej, aby zapobiec ucieczce komórek, co skutkowało głównie niefizjologicznym wzrostem nadmiarowym, przypominającym warunki in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluc

an-orthotopic-glioblastoma-mouse-model-maintaining-brain-parenchymal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ortotopowy model mysiego glioblastoma zachowujący ograniczenia fizyczne parenchymy mózgowej i nadający się do mikroskopii dwufotonowej in vivo

Celem niniejszego artykułu jest opis zastosowania ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego w badaniach nad chemoradioterapią. Artykuł ten obejmuje procesy przetwarzania komórek, implantację oraz radioterapię myszy z wykorzystaniem modelu wewnątrzczaszkowego.

Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Ten film demonstruje wszczepianie komórek nowotworowych do mózgu myszy poprzez wykonanie iniekcji wewnątrzczaszkowej.

Wewnątrzczaszkowy model ortotopowy: procedura wszczepienia komórek rakowych do mózgu myszy

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Glejak jest wyniszczającą formą pierwotnego raka mózgu, a laserowa śródmiąższowa terapia termiczna staje się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej chirurgicznej resekcji nieoperacyjnego glejaka. Protokół ten opisuje zoptymalizowany przedkliniczny model myszy, który można wykorzystać do badania efektów leczenia lub leczenia uzupełniającego i skojarzonego.

Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego u myszy z oknem czaszkowym do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia długoterminową obserwację dynamiki nowotworu i mikrośrodowiska komórkowego.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej (Wideo) | JoVE Journal

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Przeglądaj więcej filmów