Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa
6 listopada 2013
Tutaj opisujemy sposób na wyrażenie prawidłowo złożonych i funkcjonalnych antygenów powierzchniowych wirusa grypy pochodzących z nowego chińskiego wirusa H7N9 w komórkach owadów. Technikę tę można dostosować do ekspresji ektodomen dowolnych wirusowych lub komórkowych białek powierzchniowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie prawidłowo złożonej, oczyszczonej glikoproteiny powierzchniowej grypy, hemaglutyniny i neuraminidazy do testów immunologicznych i eksperymentów ze szczepieniami. Osiąga się to najpierw poprzez klonowanie rekombinowanego BMid przenoszącego geny grypy, a następnie generowanie rekombinowanych wirusów baula. Drugim krokiem jest wykorzystanie tych rekombinowanych wirusów baula do ekspresji białek hemaglutyniny i neuraminidazy w komórkach owadów.
Następnie rekombinowane białka są oczyszczane z supernatantu hodowli komórkowej za pomocą chromatografii powinowactwa. Ostatnim krokiem jest scharakteryzowanie tych białek w celu zapewnienia dobrej jakości i funkcjonalności biologicznej. Ostatecznie rekombinowane białka są wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznej na glikoproteiny powierzchniowe wirusa grypy.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak na przykład bakteryjna ekspresja HA, jest to, że oczyszczone antygeny są korygująco pofałdowane i pozostają również biologicznie aktywne, w przeciwieństwie do stosowania całych preparatów wirusowych do testów immunologicznych. Odczynniki te pozwalają na pomiar odpowiedzi immunologicznej przeciwko hemaglutyniny i białkom nieneuraminidazowym. Rozpocznij ten protokół tylko od wytworzenia rekombinowanego wirusa baula, jak opisano w protokole tekstowym, działającego aseptycznie w płytce okapu z przepływem laminarnym, SF dziewięć komórek owadów w sześciu płytkach dołkowych o gęstości 200 000 komórek na centymetr kwadratowy.
I posiedź przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza bez CO2. Następnie wymieszaj dwa mikrogramy rekombinowanego środka z 100 mikrolitrami preparatu Trico Leia knee medium HINK lub TNM fh. Następnie zmieszać sześć mikrolitrów środka do transfekcji ze 100 mikrolitrami pożywki dla owadów TNM FH.
Połącz dwie objętości, delikatnie wymieszaj i pozostaw mieszaninę transfekcji na 20 minut. W temperaturze pokojowej należy włączyć jedną próbną transfekcję jako kontrolę, która zawiera odczynnik do transfekcji, ale nie zawiera DNA. Usuń SNAT z posianych dziewięciu komórek SF i zastąp dwoma mililitrami wolnej od surowicy pożywki TNM FH zawierającej 1% roztwór streptomycyny penicyliny.
Dodać pełną objętość mieszaniny transfekcji do komórek i ostrożnie kołysać płytką sześciodołkową przez pięć sekund. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza bez CO2 przez sześć godzin. Zastąp pożywkę nową, pełną pożywką TNM FH przed inkubacją płytki w tych samych warunkach przez sześć dni.
Od czasu do czasu sprawdzaj komórki pod mikroskopem. Zainfekowane komórki zwykle wydają się większe. Okrągłe mają powiększone jądra i zaczynają się odłączać.
Zebrać komórki sześć dni po transfekcji przez odwirowanie w temperaturze 2000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Supernatant zawiera rekombinowany wirus baula i zostanie wykorzystany do natychmiastowego wytworzenia zapasów roboczych lub może być przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez lata. Sprawdź ekspresję białka za pomocą karty charakterystyki i western blot i przygotuj zapasy robocze zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Dziewięć komórek SF bardzo dobrze wspomaga wzrost wirusa plamki żółtej. Jednak ich zdolność do wydzielania dużych ilości rekombinowanego białka jest ograniczona. Dlatego używamy innej linii komórkowej owadów.
Przybij pięć komórek do ekspresji wydzielanych rekombinowanych białek. Komórki te nie wspierają wzrostu wirusa balo do wysokich mian, ale mają bardzo wysoką zdolność wydzielniczą. Hoduj komórki przybij pięć w pożywce do hodowli komórek owadów SFX w kolbach T 175 centymetrów kwadratowych co drugi dzień.
Dzieląc je w stosunku jeden do trzech. Wyhoduj pięć zlewających się kolb, aby uzyskać 200-mililitrową kulturę ekspresyjną, aby zebrać i zainfekować pięć komórek. Najpierw odłącz komórki przybijające piątkę, stukając w kolby.
Zebrać zawiesinę komórkową i przenieść do 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Wirować probówki o masie 1200 G przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez dekantację i zjednoczyć granulki za pomocą resus, zawieszając je w 15 mililitrach bulionu P trzy.
Pozostaw komórki na 15 minut w okapie przepływowym. Przenieść 200 mililitrów pożywki hodowlanej SFX o wysokim sklonowaniu do czystej, sterylnej kolby wytrząsającej o pojemności 1000 mililitrów. Następnie przenieść zawiesinę trzykomórkową P do uszczelki kolby wytrząsarki ze sterylną folią aluminiową przed wytrząsaniem z prędkością 70 obr./min i 28 stopni Celsjusza przez 72 do 96 godzin.
Zbieranie rekombinowanego białka z supernatantów o wysokiej ekspresji komórkowej w ciągu 72 do 96 godzin po zakażeniu. Przenieść supernatanty hodowlane do wiader wirujących o pojemności 500 mililitrów. Wirować w temperaturze 5 500 G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza.
W międzyczasie przepłukać kolbę trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. Następna pipeta. Trzy mililitry zawiesiny żywicy niklowej do 50-mililitrowej probówki z 45 mililitrami PBS na 200 mililitrów kultury.
Wstrząsnąć dobrze przed wirowaniem przez 10 minut w temperaturze 3000 G i temperaturze pokojowej po odwirowaniu. Zdekantować PBS i zatrzymać osad. Zmieszać supernatant z komórek owadów z osadem żywicy niklowej i przenieść do już wypłukanych kolb wytrząsarki.
Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin, wstrząsając. Następnie zamontuj 10-mililitrową kolumnę polipropylenową na zacisku do stojaka wsporczego. Zdejmij obie nasadki i umieść zlewkę pod kolumną, aby zebrać przepływ.
Po inkubacji kolby wytrząsającej należy rozpocząć przenoszenie mieszaniny zawiesiny sklarowanej nad osadem na kolumnę. Zachowa żywicę niklową i tylko supernatant będzie przez nią przepływał. Przełóż cały wolumin przez kolumnę.
Umyj żywicę czterokrotnie 15 mililitrami buforu myjącego. Pozwól, aby bufor myjący spłynął z kolumny i zamknij dolną stronę nasadką. Dodaj dwa mililitry buforu elucjańskiego i usiądźmy na pięć minut.
Otwórz kolumnę i zbierz eit, trzymając go na mokrym lodzie, gdy tylko jest to możliwe. Powtórz to jeszcze trzy razy. EIT, który zawiera wysokie stężenia białka, zazwyczaj pokazuje pianę po wstrząśnięciu w celu wymiany buforu i zagęszczenia białka, 15-mililitrowe ultrafiltracyjne jednostki wirujące ze swobodnym wirowaniem z PBS przy 3000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.
Odrzuć przepływ i załaduj EIT na kolumnę wirową. Napełnij kolumnę pięcioma mililitrami sterylnego, lodowatego PBS przed wirowaniem w tych samych warunkach przez 60 minut. Ponownie przepuść przepływ, napełnij 15 mililitrami lodowatego PBS i wiruj przez dodatkowe 60 minut.
Powtórzyć tę procedurę jeszcze raz, a następnie zebrać bufor wymieniony koncentratem, który reprezentuje wysoce skoncentrowane białko rekombinowane. Przez cały czas utrzymuj koncentrat na lodzie. Przepłukać kolumnę wirową 400 mikrolitrami sterylnego lodowatego PBS i dodać go do koncentratu.
Białko można następnie scharakteryzować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Białka HA i NA eksprymowane przez szczepy ENUE i Shanghai wykazywały umiarkowane poziomy ekspresji w zakresie od 0,2 miligrama na litr kultury grypy A zebranej w Szanghaju do 0,7 miligrama na litr w przypadku grypy. A zebrane w cząsteczkach enue, neuraminidazy lub NA obu szczepów wykazały umiarkowane poziomy ekspresji w zakresie od 0,2 miligrama na litr kultury grypy A zebranej w Szanghaju do 0,7 miligrama na litr w przypadku grypy A zebranej w enue.
Wszystkie cztery preparaty białkowe zawierały bardzo mało zanieczyszczeń lub nie zawierały ich wcale, przy czym ha miały wyższą czystość niż nas, co można wytłumaczyć poziomem ekspresji. Grypa A zebrana w Szanghaju HA była dalej analizowana przy użyciu ELI SA z szeroko neutralizującym ludzkim przeciwciałem monoklonalnym reaktywnym łodygą CR 9 1 1 4. Jak pokazano tutaj na niebiesko, to przeciwciało monoklonalne wiąże się z wrażliwym epitopem potwierdzającym w domenie podstawowej i jest tutaj używane jako sonda do prawidłowego fałdowania tej domeny.
Przeciwciało wykazuje dobre wiązanie, o czym świadczy zwiększona absorbancja przy 490 nanometrach, co daje pewność, że kwas hialuronowy jest rzeczywiście prawidłowo złożony. Drugą, Elizę z antyhemaglutyniną mysiej surowicy poliklonalnej podtypu siódmego przeprowadzono w celu potwierdzenia tożsamości otrzymanego białka jako hemaglutyniny pochodzenia podtypu siódmego. Po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak wyrażać rekombinowany wirus grypy, hemaglutyninę i białka neuraminidazy w swoim laboratorium.
Proces ten może być również przydatny do ekspresji innych białek błony wirusowej lub komórkowej. Życzę powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę ekspresji prawidłowo sfałdowanych i funkcjonalnych antygenów powierzchniowych wirusa grypy pochodzących z wirusa H7N9 w komórkach owadów. Podejście to można zaadaptować do ekspresji różnych wirusowych lub komórkowych białek powierzchniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Immunologia
- Inżynieria białek
Wprowadzenie
- Glikoproteiny powierzchniowe wirusa grypy mają kluczowe znaczenie dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.
- Prawidłowe fałdowanie i funkcjonalność tych białek są niezbędne do ich wykorzystania w testach.
- Wirus H7N9 stwarza unikalne wyzwania i możliwości badawcze.
- Systemy komórek owadzie stanowią odpowiednią platformę do ekspresji białek.
Cel badania
- W celu otrzymania oczyszczonych białek hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy.
- W celu umożliwienia przeprowadzenia testów immunologicznych i eksperymentów z wakcynacją.
- W celu zbadania odpowiedzi immunologicznej na glikoproteiny powierzchniowe wirusa grypy.
Zastosowane metody
- Klonowanie rekombinowanego BMid niosącego geny grypy.
- Generowanie rekombinowanych wirusów baula.
- Ekspresja hemaglutyniny i neuraminidazy w komórkach owadów.
- Oczyszczanie białek przy użyciu chromatografii powinowactwa.
Główne wyniki
- Pomyślnie wyekspresowano i oczyszczono glikoproteiny powierzchniowe wirusa grypy.
- Charakterystyka potwierdziła jakość i funkcjonalność białek.
- Białka zostały wykorzystane do skutecznego badania odpowiedzi immunologicznych.
- Metodę można dostosować do innych białek wirusowych lub komórkowych.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w produkcji funkcjonalnych antygenów grypy.
- Stanowi ona podstawę do dalszych badań immunologicznych.
- Podejście to można zastosować w przypadku różnych białek powierzchniowych, nie tylko tych pochodzących z wirusa grypy.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rekombinowane białka hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy są kluczowymi odczynnikami w testach immunologicznych, standaryzacji szczepionek oraz przesiewowych badaniach nad lekami przeciwwirusowymi. System ekspresji bakulowirusowej umożliwia produkcję prawidłowo sfałdowanych i glikozylowanych antygenów, które zachowują funkcję biologiczną, co wspiera wiarygodną walidację celów oraz identyfikację wiodących związków w terapii grypy. Podejście to zmniejsza zależność od preparatów zawierających całe wirusy i przyspiesza przedkliniczną ocenę ryzyka w przypadku kandydatów na przeciwciała oraz inhibitorów małocząsteczkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zapewnienie prawidłowo sfałdowanych antygenów HA i NA do badań wiązania przeciwciał oraz mapowania epitopów.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez testy mierzące inhibicję hemaglutynacji oraz aktywność enzymatyczną neuraminidazy.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez generowanie odczynników do oceny reaktywności krzyżowej i szerokości neutralizacji przeciwciał monoklonalnych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Wartość naukowa: Umożliwia otrzymywanie standaryzowanych antygenów do testów ELISA i ELISPOT w celu ilościowego oznaczenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko glikoproteinom powierzchniowym wirusa grypy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie inhibitorów małocząsteczkowych z wykorzystaniem rekombinowanej neuraminidazy w testach aktywności enzymatycznej.
- Skalowalność: Wspiera wielkoskalową produkcję białek na potrzeby zaopatrzenia w odczynniki w procesach odkrywania przeciwciał i standaryzacji szczepionek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia antygeny istotne dla przebiegu choroby do oceny preklinicznej kandydatów na szczepionki i przeciwciał terapeutycznych w modelach zwierzęcych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza prawidłowe fałdowanie i glikozylację HA, co redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w odczytach immunologicznych.
- Spójność z modelami preklinicznymi: Umożliwia stałe dostawy antygenów na etapach odkrywania i badań preklinicznych w celu profilowania odpowiedzi immunologicznej.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – dostarczając antygenów rekombinowanych, które wspierają profilowanie immunologiczne oraz badania nad mechanizmem działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez dostarczanie funkcjonalnych białek HA i NA do analiz interferencji immunologicznej i wiązania z receptorami.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie analiz dzięki oczyszczonej, aktywnej neuraminidazie do badań wrażliwości na leki przeciwwirusowe oraz hemaglutyninie do analiz wychwytywania przeciwciał.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty, takie jak absorbancja w teście ELISA i miana hemaglutynacji, w celu porównania odpowiedzi immunologicznych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczanie antygenów wykorzystywanych w badaniach skuteczności szczepionek i ochrony przeciwciał w modelach zwierzęcych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do ekspresji białek powierzchniowych grypy i innych wirusów w wielu projektach i sezonach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenach antygenowości poprzez zapewnienie prawidłowo sfałdowanych, zmodyfikowanych potranslacyjnie glikoprotein grypy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i skalowalność produkcji antygenów z wykorzystaniem systemów komórek owadziech z określonymi protokołami oczyszczania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w optymalizacji wiodących przeciwciał poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w danych dotyczących wiązania i neutralizacji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie ryzyka w rozwoju kandydatów na szczepionki i leki terapeutyczne dzięki zestandaryzowanym dostawom antygenów dla zespołów międzyfunkcyjnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie klonowania molekularnego, generowania baculowirusów oraz technik hodowli komórek owadów.
- Zależne od dostępu do odczynników do transfekcji, systemów chromatografii powinowactwa do niklu oraz sprzętu do wirowania w celu oczyszczania białek.
- Wymaga standaryzacji w ramach zespołów w celu zapewnienia spójnej wydajności białka, jego czystości oraz testowania aktywności funkcjonalnej.
- Kwestie adaptacyjne obejmują optymalizację wielokrotności infekcji (MOI) oraz czasu zbioru dla różnych szczepów grypy lub docelowych białek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienne poziomy ekspresji w zależności od szczepu oraz konieczność walidacji funkcjonalnej wykraczającej poza SDS-PAGE i Western blot.
