Name: Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Poznaj metodę ekspresji funkcjonalnych białek hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa H7N9 w komórkach owadzich przy użyciu systemu bakulowirusowego. Technika ta umożliwia uzyskanie prawidłowo zwiniętych antygenów do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Patrickowi C. Wilsonowi za przeciwciało monoklonalne CR9114. Dziękujemy również Jennifer Debeauchamp i Richardowi Webby'emu za oryginalne plazmidy A/Anhui/1/13. Częściowe wsparcie dla tych prac zostało zapewnione przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (National Institute for Allergy and Infectious Diseases) Program Project Grant AI097092-01A1 oraz CEIRS (Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance, HHSN26620070010C). FK był wspierany przez stypendium Erwina Schrödingera (J 3232) z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF).

1. Generacja rekombinowanego bakulowirusa
<ol>
	<li>Klonowanie do plazmidów transferowych bakulowirusa
	<ol>
		<li>Sklonuj ektodomenę H7 HA i N9 NA (lub dowolny inny gen HA lub NA) do zmodyfikowanych plazmidów transferowych pFastBac (patrz wprowadzenie). Wektory dla HA zawierające C-końcową domenę trimeryzacji i znacznik heksahistydyny, a także dla NA zawierające N-końcową domenę tetrameryzacji i znacznik heksahistydyny, zostały opisane1,10,11,22 (Figura 1) i można je uzyskać od autorów. 
		Wyjaśniającą: Ektodomeny HA wyrażane bez domeny trimeryzacji będą nieprawidłowo fałdowane, co prowadzi do utraty konformacyjnych epitopów neutralizujących, szczególnie w domenie łodygi. Podobnie funkcja enzymatyczna NA opiera się na prawidłowej tetrameryzacji.</li>
		<li>Generacja bakterii 
		Przekształć plazmidy transferowe bakulowirusa zawierające geny HA i NA w bakterie DH10Bac zgodnie z systemem ekspresji bakulowirusa zgodnie z instrukcjami producenta. Wyizoluj i oczyść bakterie za pomocą zestawu Midiprep zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ratowanie rekombinowanego bakulowirusa i weryfikacja ekspresji białka 
	Wyjaśniającą: Poniższe czynności należy wykonywać aseptycznie w okapie z przepływem laminarnym. Wykonaj tę procedurę niezależnie dla HA i NA (lub dowolnego innego genu będącego przedmiotem zainteresowania). Komórki owadów są zwykle hodowane w temperaturze 28 °C bez CO2 . Komórki Sf9 dla tego protokołu są hodowane w pełnych pożywkach z komórek owadów TNM-FH uzupełnionych 10% FBS, 1% Pen-Strep* i 0,1% roztworem Pluronic F68, jeśli nie wskazano inaczej, i pasażowane 1:4 dwa razy w tygodniu. Komórki High Five są hodowane w pożywce wolnej od surowicy SFX i pasażowane w stosunku 1:15 dwa razy w tygodniu. 
	* Dodawanie antybiotyków powinno być traktowane jako opcjonalne w całym protokole i dostosowane do praktyk stosowanych w każdym laboratorium.
	<ol>
		<li>Umieścić komórki owadów Sf9 na płytkach 6-dołkowych o gęstości 2 x 105 komórek/cm2 i odstawić na 20 minut w inkubatorze o temperaturze 28 °C (bez CO2 ).</li>
		<li>Zmieszać 2 μg (stężenie 0,5-2 μg/ul) rekombinowanego bakcydu ze 100 μl pożywki TNM-FH (bez surowicy, 1% Pen-Strep). Zmieszać 6 μl środka do transfekcji ze 100 μl pożywki TNM-FH (bez surowicy, Pen-Strep). Połącz dwie objętości, delikatnie wymieszaj i odstaw na 20 minut w temperaturze pokojowej (mieszanina transfekcyjna). Dołącz jedną próbną transfekcję jako kontrolę (ryc. 3). </li>
		<li>Usuń supernatant z posianych komórek Sf9 (komórki będą teraz przyklejać się do płytki) i zastąp 2 ml wolnej od surowicy pożywki TNM-FH zawierającej Pen-Strep (1%). Dodać pełną objętość mieszaniny transfekcyjnej (z kroku 1.2.2) i ostrożnie kołysać płytkę 6-dołkową przez 5 sekund. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 28 °C bez CO2 przez 6 godzin (rysunek 3).</li>
		<li>Zastąp pożywkę nową, pełną pożywką TNM-FH (zawierającą 10% FBS, 1% Pen-Strep i 0,1% Pluronic F68). Inkubować w inkubatorze w temperaturze 28 °C bez CO2 przez 6 dni. Od czasu do czasu sprawdzaj komórki pod mikroskopem. Zainfekowane komórki zwykle wydają się większe, bardziej okrągłe, mają powiększone jądra i zaczynają się odrywać (ryc. 4). </li>
		<li>Pobieranie komórek i potwierdzenie ekspresji białka
		<ol>
			<li>Zebrać komórki 6 dni po transfekcji przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant zawiera rekombinowany bakulowirus - zostanie on wykorzystany do natychmiastowego wytworzenia zapasów roboczych lub może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez lata.</li>
			<li>Aby sprawdzić ekspresję białka, należy zebrać granulki i ponownie zawiesić w 500 μl PBS. Zmieszać 50 μl zawiesiny z 50 μl buforu ładującego SDS-PAGE (zawierającego środek redukujący). Uruchom SDS-PAGE i wykonaj analizę Western blot z przeciwciałem anty-heksahistydyny, aby potwierdzić ekspresję genu. Uwzględnij komórki z próbnej transfekcji jako kontrole ujemne (ryc. 3).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie zapasów obrotowych
		<ol>
			<li>Umieść 5 x 10 5 komórek Sf9/cm2 w kolbie T175 cm2 i odstaw na 20 minut, aby przymocowały się do naczynia. Zastąp całe podłoża TNM-FH nośnikami TNM-FH zawierającymi 3% FBS (i 1% Pen-Strep, 0.1% Pluronic F68).</li>
			<li>Zainfekować komórki 100 μl ratunkowego supernatantu. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 28 °C bez CO2 przez 6 dni i od czasu do czasu sprawdzać, czy komórki nie uległy zakażeniu (zgodnie z opisem w kroku 1.2.5).</li>
			<li>Wirować w temperaturze 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i zebrać supernatant. To są teraz Twoje akcje P2. Materiał ten może być przechowywany przez czas nieokreślony w temperaturze 4 °C. Procedurę infekcji należy powtórzyć, używając 100 μl materiału P2 w celu zakażenia komórek. Otrzymany materiał nazywa się P3 lub zapasem roboczym, który może być przechowywany w temperaturze 4 °C lub używany bezpośrednio do ekspresji białka. Zapas P3 zawiera zwykle 10 jednostek tworzących płytkę nazębną7-10 9 / ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspresja i oczyszczanie białek
Uwaga wyjaśniająca: Komórki Sf9 bardzo dobrze wspierają wzrost bakulowirusa. Jednak ich zdolność do wydzielania dużych ilości rekombinowanego białka jest ograniczona. Dlatego używamy innej linii komórkowej owadów, komórek High Five, do ekspresji wydzielanych rekombinowanych białek. Komórki te nie wspierają replikacji bakulowirusa do bardzo wysokich mian13, ale mają wysoką zdolność wydzielniczą.
<ol>
	<li>Dorastanie w High Five cells 
	Wyhoduj komórki High Five w pożywce do hodowli komórek owadów SFX w kolbach T175 cm2. Przejście co drugi dzień 1:3. Aby uzyskać kulturę ekspresyjną o objętości 200 ml, należy wyhodować 5 zlewających się kolb.</li>
	<li>Zbieranie i infekowanie komórek przybijanej piątki
	<ol>
		<li>Odłącz komórki High Five od 5 kolb T175 cm2, stukając w kolby ręką. Zebrać zawiesinę komórkową i przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 1 200 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć sklarowany osad przez dekantację i zjednoczyć granulki, umieszczając je ponownie w 15 ml bulionu P3.</li>
		<li>Pozostaw na 15 minut w okapie przepływowym (Rysunek 5).</li>
		<li>Przenieść 200 ml pożywki Hyclone SFX do czystej, sterylnej kolby wytrząsającej o pojemności 1 000 ml (bez pęcherzy, uszczelnionej folią aluminiową przed autoklawowaniem, nie powinna być wcześniej używana do hodowli bakterii).</li>
		<li>Przenieść zawiesinę P3/ogniwa do kolby wytrząsającej. Uszczelnić sterylną folią aluminiową i przenieść kolbę do shakera. Wstrząsać przy 70 obr./min w temperaturze 28 °C przez 72-96 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie rekombinowanego białka z supernatantów o ekspresji komórkowej High Five
	<ol>
		<li>72-96 godzin po zakażeniu przenieść supernatanty hodowlane do wiader wirujących o pojemności 500 ml. Wirować z prędkością 5 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. W międzyczasie przepłukać kolby do wytrząsania 3x wodą podwójnie destylowaną (ddH2O).</li>
		<li>Przenieść 3 ml zawiesiny żywicy niklowej do probówki o pojemności 50 ml z 45 ml PBS (jedna potrzebna na 200 ml kultury). Dobrze wstrząsnąć i wirować w temperaturze pokojowej 3 000 x g przez 10 minut. Zdekantować PBS i zatrzymać osad. Wymieszać supernatant z komórek owadów z osadem z żywicy niklu i przenieść do już wypłukanych kolb wytrząsarki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 2-4 godziny, wytrząsając (ryc. 6). </li>
		<li>Zamontuj kolumnę polipropylenową o pojemności 10 ml na zacisku na stojaku nośnym. Zdjąć obie nakrętki i umieścić zlewkę pod kolumną, aby zebrać przepływ (odpady). Wyjąć kolbę wytrząsarki z wytrząsarki i rozpocząć przenoszenie mieszaniny supernatantu i zawiesiny na kolumnę; zachowa żywicę Ni i tylko supernatant będzie przez nią przepływał. Przełóż cały wolumin przez kolumnę (Rysunek 7).</li>
		<li>Przemyć żywicę 4x 15 ml buforu płuczącego (50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8). Pozwól, aby cały bufor myjący spłynął z kolumny i zamknij go nasadką (dolna strona).</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu elucyjnego (50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 300 mM imidazolu, pH 8) i odstawić na 5 minut. Otwórz kolumnę i zebrać eluat. Powtórzyć to jeszcze 3 razy (w sumie 8 ml buforu elucyjnego). Eluat, który zawiera wysokie stężenia białka, zazwyczaj pieni się po wstrząśnięciu (ryc. 7). Jeśli to możliwe, eluat należy przechowywać na mokrym lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymiana buforowa i koncentracja
	<ol>
		<li>Wirówki ultrafiltracyjne o pojemności 15 ml (odcięcie 30 kDa dla HA/NA, ale może się różnić w zależności od wielkości oczyszczonego białka) z PBS (pH 7,4-7,6) przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Odrzucić przepływ i załadować eluat do kolumny wirowej. Napełnij 5 ml sterylnego, lodowatego PBS i wiruj przez 60 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ponownie przepłynąć przez przepływ wyładowczy, napełnić 15 ml lodowatego PBS i wirować przez 60 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Powtórzyć tę procedurę jeszcze raz.</li>
		<li>Wyjąć kolumnę wirową z wirówki i zebrać koncentrat wymieniony w buforze (zwykle 200 μl). Jest to wysoce skoncentrowane białko rekombinowane. Przepłukać kolumnę wirową 400 μl sterylnego, lodowatego PBS i dodać go do koncentratu. Przez cały czas utrzymuj koncentrat na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka i kontrola jakości
<ol>
	<li>Pomiar stężenia białka 
	Weź podwielokrotność koncentratu i zmierz ją, korzystając z wybranej metody oznaczania ilościowego białka. Ustawić stężenie białka na 1 mg/ml poprzez dodanie PBS i zamrozić małe porcje do -80 °C. Cykle zamrażania i rozmrażania uszkadzają strukturę białka i mogą prowadzić do agregacji.</li>
	<li>SDS-PAGE i barwienie Coomassie 
	Uruchom 500 ng swojego białka na SDS-PAGE i wykonaj barwienie Coomassie. Do szybkiego i wygodnego barwienia użyj odczynnika Coomassie w połączeniu z protokołem mikrofalowym. Białka HA zwykle pojawiają się przy 64 kDa, podczas gdy białka NA powinny mieć rozmiar około 56 kDa (ryc. 8A i B). Korzystając z opisanego protokołu, nie powinieneś zobaczyć żadnych produktów degradacji. Jeśli dojdzie do degradacji, jest to zwykle oznaką zanieczyszczenia drożdżami/grzybami podczas odciągania. W takim przypadku powtórz procedurę i upewnij się, że wszystko jest sterylne.</li>
	<li>Western blot/ELISA 
	W celu zweryfikowania tożsamości białka zalecamy wykonanie testu Western blot lub ELISA ze specyficznym przeciwciałem. Idealnie byłoby, gdyby testy ELISA były wykonywane z przeciwciałem, które wiąże się z epitopami konformacyjnymi (np. przeciwciałami anty-HA1). Za pomocą takiego przeciwciała można potwierdzić prawidłowe fałdowanie białka (ryc. 8C).</li>
	<li>Pomiar aktywności NA 
	Prawidłowe fałdowanie wirusowego NA można również określić, mierząc aktywność NA. Zalecamy wykonanie tego testu przy użyciu dostępnego na rynku testu NA*STAR (wystarczy postępować zgodnie ze wskazówkami dla użytkownika).</li>
</ol>

<ol><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603(2012).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock%2C+ecuador%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li>
<li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li>
<li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li>
<li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li>
<li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li>
<li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li>
<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichoplusia+ni+cells+%28High+Five%29+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles%3A+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li>
<li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cells+for+antibody+production%3A+evaluation+of+an+efficient+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li>
<li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A%2FBrisbane%2F59%2F07+and+B%2FFlorida%2F04%2F06+when+produced+in+various+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li>
<li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li>
<li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+%28FluBlok%29+against+influenza+in+healthy+adults%3A+a+randomized%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li>
<li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li>
<li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+%28H7N9%29+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li>
<li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li>
<li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+A+virus+%28H7N7%29+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li>
<li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż ekspresja białek HA i NA wirusa grypy w komórkach owadów przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa jest na ogół prosta, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych punktów. Ważne jest, jak wskazano we wprowadzeniu, że ektodomeny HA i NA ulegają ekspresji w fuzji odpowiednio z domenami trimeryzacji lub tetrameryzacji. Domeny te zapewniają prawidłowe fałdowanie cząsteczek zwykle wspomagane przez domenę transbłonową, która nie jest obecna, jeśli ulega ekspresji tylko ektodomena. Na przykład ekspresja ektodomeny HA bez dom...

Jako pierwszą odpowiedź na niedawne pojawienie się nowego szczepu wirusa grypy H7N9 w Chinach, nabyliśmy plazmidy przenoszące sekwencje genomowe dla genów hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) pierwszych dwóch izolatów. Korzystając z tych plazmidów, byliśmy w stanie szybko skonstruować wektory ekspresyjne bakulowirusa do produkcji rekombinowanego HA i NA w komórkach owadów. Ten system odciągania pokarmu jest dobrze przyjęty w naszym laboratorium i okazał się kluczowy dla wielu naszych trwających projektów badawczych1-8. Komórki owadów są w stanie prawidłowo fałdować i modyfikować złożone białka po translacji. Modyfikacje te obejmują glikozylację sprzężoną z N, która jest ważna dla wielu glikoprotein wirusowych. W związku z tym nie jest zaskakujące, że system bakulowirusa jest dość dobrze przystosowany do ekspresji antygenów powierzchniowych wirusa grypy. W rzeczywistości wiele struktur krystalicznych HA i NA zostało rozwiązanych przy użyciu białek9-11 eksprymowanych w komórkach owadów. Kolejną zaletą systemu jest niezawodna wysoka wydajność białka do 30 mg hodowli komórkowej HA/L (w oparciu o nasze doświadczenie z ponad 50 różnymi białkami HA) - konsekwencja ekspresji silnego promotora poliedryny sterowanej infekcją wirusem.
Usunięcie transbłony i endodomeny białek HA i NA pozwala na ekspresję sekretnych, rozpuszczalnych wersji białek, a tym samym znacznie ułatwia proces oczyszczania. Ponadto te ektodomeny są znakowane heksahistydyną i dlatego można je oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa przy użyciu żywicy Ni2+. Domeny transbłonowe białek HA i NA przyczyniają się odpowiednio do tworzenia homotrimerów i homotetramerów. Aby zachować te oligomeryzacje, dodajemy C-końcową domenę trimeryzacji do HA- i N-końcową domenę tetrameryzacji do konstruktów NA (Rysunek 1). Wykazaliśmy niezbicie, że taka domena trimeryzacji stabilizuje funkcjonalne, konserwatywne epitopy konformacyjne na domenie łodygi HA1. Prawidłowa tetrameryzacja NA może również przyczyniać się do prawidłowego fałdowania i funkcji NA10. Sekwencje i wektory bakulotransferowe zawierające domeny trimeryzacji lub tetrameryzacji można uzyskać u autorów lub w innych laboratoriach w tej dziedzinie ,9,10,12.
Inną ważną kwestią dla ekspresji wydzielanych białek w komórkach owadów jest wybór właściwej linii komórkowej. Podczas gdy komórki Sf9 pochodzące z Spodoptera frugiperda bardzo dobrze wspierają replikację bakulowirusa i są zwykle wykorzystywane do ratowania i rozmnażania wirusów, mają ograniczoną zdolność do wydzielania dużych ilości białka. Komórki BTI-TN-5B1-4 pochodzące z Trichoplusia ni (powszechnie znane jako High Five) mają wyższą zdolność wydzielania i są linią komórkową z wyboru do ekspresji w tym protokole13,14. Ponadto pomocne jest zmniejszenie lub nawet usunięcie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) z kultur ekspresyjnych. W związku z tym używamy pożywek o obniżonej (3%) zawartości FBS do hodowli zapasów roboczych wirusa, a ekspresję białka przeprowadzamy w pożywkach wolnych od surowicy.
Rekombinowane białka HA i NA są używane w wielu technikach immunologicznych. Być może najczęstszym z nich są testy ELISA do pomiaru konwersji surowicy po szczepieniu u ludzi lub zwierząt4,6,7,15. HA i NA są również stosowane w testach ELISPOT zarówno jako cząsteczki stymulujące, jak i odczynniki wykrywające komórki wydzielające przeciwciała16. Ich zastosowanie jako przynęt molekularnych pozwala na specyficzne sortowanie plazmablastów lub innych typów limfocytów B, które można następnie wykorzystać do wyizolowania (terapeutycznych) przeciwciał monoklonalnych (mAb). Rekombinowane cząsteczki HA i NA są dalej wykorzystywane w charakterystyce tych mAb8. Inne przykłady obejmują badanie stabilności pH lub swoistości receptorowej HA wyrażanych przez różne izolaty wirusa lub ilościową ocenę specyficznej aktywności enzymatycznej NA lub oporności na inhibitory. Ponadto rekombinowany, oczyszczony kwas hialuronowy może być stosowany do standaryzacji zawartości kwasu hialuronowego w szczepionkach przeciwko inaktywowanemu wirusowi grypy.
Co ważne, kandydaci na szczepionki rHA (i do pewnego stopnia NA) są obecnie testowani na modelach zwierzęcych i ludziach, a jedna z nich została licencjonowana przez FDA w 2013 roku2,17-19. Zaletą tych nowych szczepionek jest to, że ze względu na rekombinowany charakter tych białek, można uniknąć pracochłonnego procesu wytwarzania wirusów reasortantów o wysokim wzroście. Być może jeszcze bardziej istotny jest fakt, że ich wydajność kwasu hialuronowego jest wysoka i powtarzalna w różnych odmianach. Ponadto, ponieważ szczepionki te są produkowane w systemie bezjajowym, nie zawierają zanieczyszczeń białkowych, które są problematyczne dla osób z alergią na jaja.
Tutaj zdecydowaliśmy się na ekspresję białek HA i NA z dwóch izolatów nowego chińskiego wirusa grypy H7N9, A/Anhui/1/13 i A/Shanghai/1/1320,21. Są to aktualne przykłady, ale opisany protokół może być stosowany do ekspresji dowolnych białek grypy A i B HA lub NA i może być przystosowany do ekspresji dowolnych innych wydzielanych białek wirusowych lub komórkowych. Trymeryczne lub tetrameryczne białka transbłonowe można klonować do kaset ekspresyjnych stosowanych odpowiednio dla HA i NA. Jednak większość rozpuszczalnych wydzielanych białek komórkowych, takich jak na przykład interferony, nie potrzebuje dodatkowej domeny do stabilizacji i może być wyrażana wyłącznie za pomocą C-końcowego znacznika heksahistydyny.

<table><tbody><tr><td>Nazwa materiału/urządzenia</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi/Opis System</td></tr><tr><td>ekspresji bakulowirusa Bac-to-Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>TNM-FH podłoże dla owadów</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Filtry odśrodkowe Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny polipropylenowe (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Maksymalna wydajność Bakterie DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210015</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>do elucji i płukania</td></tr><tr><td>Komórki Sf9</td><td>ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>High Five cells</td><td>Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy h7n9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

System ekspresji bakulowirusa jest potężnym narzędziem do ekspresji białek rekombinowanych. Tutaj używamy go do produkcji prawidłowo sfałdowanych i glikozylowanych wersji glikoprotein powierzchniowych wirusa grypy A - hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA). Jako przykład wybraliśmy białka HA i NA ulegające ekspresji przez nowego wirusa H7N9, który niedawno pojawił się w Chinach. Jednak protokół można łatwo dostosować do białek HA i NA ulegających ekspresji przez inne szczepy wirusa grypy A i B. Rekombinowane białka HA (rHA) i NA (rNA) są ważnymi odczynnikami do testów immunologicznych, takich jak ELISPOT i ELISA, a także są szeroko stosowane w standaryzacji szczepionek, odkrywaniu przeciwciał, izolacji i charakterystyce. Co więcej, rekombinowane cząsteczki NA mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów małych cząsteczek i są przydatne do charakteryzowania funkcji enzymatycznej NA, a także jej wrażliwości na leki przeciwwirusowe. Rekombinowane białka HA są również testowane jako szczepionki eksperymentalne na modelach zwierzęcych, a szczepionka oparta na rekombinowanym HA została niedawno dopuszczona przez FDA do stosowania u ludzi. Opisana przez nas metoda wytwarzania tych cząsteczek jest prosta i może ułatwić badania w laboratoriach grypy, ponieważ pozwala na szybką i tanią produkcję dużych ilości białek. Chociaż tutaj skupiamy się na glikoproteinach powierzchniowych wirusa grypy, metoda ta może być również stosowana do produkcji innych wirusowych i komórkowych białek powierzchniowych.

Cząsteczki HA z A/Shanghai/1/13 i A/Anhui/1/13 wykazały dobrą ekspresję z wydajnością około 20 mg/L hodowli. Cząsteczki NA obu szczepów wykazały umiarkowane poziomy ekspresji, od 0,2 mg/L hodowli dla A/Shanghai/1/13 do 0,7 mg/L dla A/Anhui/1/13. Wszystkie cztery preparaty białkowe charakteryzowały się bardzo małą ilością zanieczyszczeń lub ich brakiem (Rycina 8A i B), przy czym białka HA cechowały się wyższą czystością niż NA, co można wyjaśnić poziomem ekspresji. HA z A/Shanghai/1/13 po...

Tutaj opisujemy sposób na wyrażenie prawidłowo złożonych i funkcjonalnych antygenów powierzchniowych wirusa grypy pochodzących z nowego chińskiego wirusa H7N9 w komórkach owadów. Technikę tę można dostosować do ekspresji ektodomen dowolnych wirusowych lub komórkowych białek powierzchniowych.

Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie prawidłowo złożonej, oczyszczonej glikoproteiny powierzchniowej grypy, hemaglutyniny i neuraminidazy do testów immunologicznych i eksperymentów ze szczepieniami. Osiąga się to najpierw poprzez klonowanie rekombinowanego BMid przenoszącego geny grypy, a następnie generowanie rekombinowanych wirusów baula. Drugim krokiem jest wykorzystanie tych rekombinowanych wirusów baula do ekspresji białek hemaglutyniny i neuraminidazy w komórkach owadów.Następnie rekombinowane białka są oczyszczane z supernatantu hodowli komórkowej za pomocą chromatografii powinowactwa. Ostatnim krokiem jest scharakteryzowanie tych białek w celu zapewnienia dobrej jakości i funkcjonalności biologicznej. Ostatecznie rekombinowane białka są wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznej na glikoproteiny powierzchniowe wirusa grypy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak na przykład bakteryjna ekspresja HA, jest to, że oczyszczone antygeny są korygująco pofałdowane i pozostają również biologicznie aktywne, w przeciwieństwie do stosowania całych preparatów wirusowych do testów immunologicznych. Odczynniki te pozwalają na pomiar

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ekspresja funkcjonalnych białek rekombinowanego hemaglutynininy i neuraminidazy z nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu układu ekspresji wirusa Baculovirus

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Ten film opisuje technikę powierzchniowego rezonansu plazmonowego, czyli SPR, do badania interakcji między dwiema cząsteczkami za pomocą chipa czujnika. Zmiana kąta rezonansu i natężenie odbitego światła są wykrywane jako funkcja asocjacji i dysocjacji dwóch cząsteczek, a to dostarcza informacji o oddziaływaniach między dwiema cząsteczkami.

Powierzchniowy rezonans plazmonów do badania oddziaływań biomolekularnych za pomocą chipa czujnika

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

W tym protokole, bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidu bakulowirusa do komórek Sf9 i amplifikowany w kulturze zawiesinowej bez surowicy. Supernatant jest oczyszczany przez chromatografię powinowactwa heparyny i dalej zagęszczany przez ultrawirowanie. Protokół ten jest przydatny do produkcji i oczyszczania bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Tutaj opisujemy protokół pakowania pseudowirusów i pomiaru aktywności neutralizującej przeciwciała.

Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Poznaj metodę ekspresji funkcjonalnych białek hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa H7N9 w komórkach owadzich przy użyciu systemu bakulowirusowego. Technika ta umożliwia uzyskanie prawidłowo zwiniętych antygenów do badań immunologicznych.

Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa (Wideo) | JoVE Journal

Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa

Przeglądaj więcej filmów