Name: Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Poznaj nowoczesne modyfikacje klasycznej metody Western blot, które zwiększają rozdzielczość i czułość detekcji białek. Wykorzystaj system Bis-Tris oraz fluorescencyjne obrazowanie w podczerwieni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium McMahon za ich pomoc i wsparcie. Badania te były wspierane przez granty od NIH/NCI R01 CA176839-01 (do MM) oraz Nagrodę za Badania Instytucjonalne i Rozwój Kariery Akademickiej (IRACDA dla JS).

1. Przygotowanie lizatów całych komórek z hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Umieścić szalki do hodowli komórkowych na lodzie i dodać zimny PBS z 5 mM EDTA (np. 5 ml PBS z 5 mM EDTA/10cm2 płytka). Usunąć przylegające komórki z naczynia za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieść zawiesinę komórek do zimnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	Zawiesiny komórek osadzać przez <li>wirowanie z niską prędkością przy 1 000 obr./min (230 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umieścić stożkowe rurki na lodzie i ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Przepłukać osad 1 ml PBS z 5 mM EDTA i przenieść zawiesinę komórek do zimnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zawieszenie szybkoobrotowe przy 13 000 obr./min (13 226 x g) przez 10 sekund do ogniw pelletu. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu i umieścić probówki na lodzie.</li>
	<li>Zawiesić osad w 25-200 μl (w zależności od wielkości osadu; tj. dla 3 x 106 komórek dodać ~150 μl buforu RIPA ) w buforze RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% deoksycholanu sodu, 1% NP-40) zawierającym świeżo dodane inhibitory proteazy i fosfatazy w 2x końcowym stężeniu. Krótko zwiruj każdą probówkę i inkubuj zawiesinę przez 20-30 minut na lodzie. Uwaga: istnieje kilka do lizy, które można wykorzystać do ekstrakcji białek, które różnią się zdolnością do rozpuszczania białek i siłą detergentu denaturującego (np. SDS, Triton X-100 lub NP-40). Bufor RIPA jest przydatny do przygotowywania lizatów całokomórkowych i zakłócania interakcji białko-białko.</li>
	<li>Aby wytworzyć frakcję pojądrową, odwirować lizaty z prędkością 14 000 obr./min (15 339 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki bez naruszania osadu wzbogaconego jądrowo i umieścić probówki na lodzie. Uwaga: osad wzbogacony jądrowo może również odłączyć się od probówki podczas ekstrakcji supernatantu. Aby uniknąć gromadzenia się osadu wzbogaconego jądrowo, należy umieścić końcówkę pipety bezpośrednio w lepkiej osadzie wzbogaconej jądrowo i wyciągnąć ją wraz z pipetą w celu wyrzucenia.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w każdej próbce zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z takich testów kwantyfikacji białka, jak BCA lub Bradford.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki i elektroforeza
<ol>
	<li>Przygotuj każdą próbkę zgodnie z poniższą tabelą przedstawioną poniżej. Alternatywnie można również stosować β-merkaptoetanol w stężeniu końcowym 2,5%. Jednak środek redukujący należy dodać do każdej próbki do godziny przed załadowaniem żelu. Całkowita objętość odpowiada wariacjom pipetowania, przy czym do jednego dołka załadowano tylko 20 μl każdej przygotowanej próbki.
	<obramowanie tabeli="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td>Odczynnik</td>
				<td>ZREDUKOWANA PRÓBKA</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Próbka białka</td>
				<td>X μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>4x Bufor do próbek LDS</td>
				<td>6 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Środek redukujący 500 nM DTT</td>
				<td>2,4 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Dejonizowana</td>
				<td>Do 15,6 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Całkowita objętość</td>
				<td>24 μl</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Podczas podgrzewania próbek przygotuj 1 000 ml 1x MES lub MOPS Running Buffer (50 ml 20x MES lub MOPS Running Buffer plus 950 ml wody dejonizowanej). MOPS Running Buffer rozwiązuje białka średniej wielkości w zakresie 14-200 kDa, podczas gdy MES Running Buffer rozwiązuje białka o mniejszej masie cząsteczkowej w zakresie 2-200 kDa o niższym pKa, co pozwala MES Running Buffer działać szybciej niż MOPS4. Tak więc te dwa mają kontrastujący wpływ na migrację jonów w żelu do układania w stos, co prowadzi do różnic w separacji prążków białkowych4. Odłóż na bok i połącz 200 ml 1x buforu do biegania MES lub MOPS z 500 μl przeciwutleniacza, który zostanie użyty do wypełnienia górnej komory buforowej jednostki elektroforezy Mini-Cell.</li>
	<li>Po zakończeniu podgrzewania próbek należy je szybko odwirować przed umieszczeniem ich na lodzie.</li>
	<li>W przypadku montażu prefabrykowanych żeli Bis-Tris w jednostce Mini-Cell do elektroforezy należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: upewnij się, że każdy żel jest zorientowany w taki sposób, że krótsza (mniejsza) kaseta każdego żelu jest skierowana do wewnątrz w kierunku rdzenia buforowego, a żele są wypoziomowane i mocno dociśnięte do rdzenia buforowego, aby uniknąć wycieku z górnej komory buforowej.</li>
	<li>Napełnij górną komorę buforową 200 ml 1x buforu do pracy MES lub MOPS zawierającego przeciwutleniacz, a dolną komorę buforową jednostki Mini-Cell około 600 ml 1x buforu do pracy MES lub MOPS. Dodatkowe 200-300 ml buforu do biegania można zachować do późniejszego wykorzystania. Nie zaleca się jednak recyklingu buforu używanego podczas elektroforezy, ponieważ pH i jakość buforu mogą ulec zmianie.</li>
	<li>Załaduj 20 μl każdej próbki białka do każdej studzienki. W przypadku dzielenia błony na różne paski w celu sondowania wielu przeciwciał (tj. więcej niż 2), zdecydowanie zaleca się załadowanie 2-5 μl wstępnie wybarwionego wzorca białka do pierwszego i ostatniego dołka każdego żelu, ponieważ posłuży to jako prowadnice tnące do oddzielania różnych odcinków błony bez wpływu na obrazowanie prążków białkowych.</li>
	<li>Uruchom żele przy stałym napięciu 200 V przez 35 minut z oczekiwanym prądem 110-125 mA/żel na początku i 70-80 mA na żel na końcu. Elektroforeza jest zakończona, gdy barwnik śledzący migruje do drutu platynowego wzdłuż rdzenia buforowego.</li>
</ol>
3. Transfer białka za pomocą systemu iBlot Dry Blotting
<ol>
	<li>Całkowicie oddziel mini-żele, łamiąc połączone boki kasety (może to powodować trzaski). Wyrzuć krótszą (mniejszą) płytkę i ostrożnie przenieś żel z dłuższej (szczelinowej) płytki do pojemnika z wodą dejonizowaną i usuń grubą część żelu znajdującą się na dole. Uwaga: w rzadkich przypadkach żel może przyczepić się do krótszej płytki zamiast do dłuższej, szczelinowej płytki. W takim przypadku Wyrzuć dłuższą, szczelinową płytkę i usuń grubą część żelu znajdującą się na dole. Następnie ostrożnie przenieś żel z krótszej płytki do wody dejonizowanej.</li>
	<li>Zmontuj stosy transferowe anody i katody zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: zarówno membrany nitrocelulozowe, jak i PVDF zapewniają wysokiej jakości i wydajny transfer białek i są kompatybilne z detekcją fluorescencyjną8. Jednak membrana PVDF ma wyższą zdolność wiązania (240 μg/cm3) niż nitroceluloza (200 μg/cm3)8.</li>
	<li>Ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki lub powietrze uwięzione między żelem a membraną, ponieważ zapobiegnie to zniekształceniu prążków białkowych podczas przenoszenia. Uwaga: nie przycinaj membrany ani stosu transferowego tak, aby pasowały do rozmiaru żelu, ponieważ spowoduje to bezpośredni kontakt między stosami anod i katod.</li>
	<li>Po prawidłowym zmontowaniu stosów transferowych na urządzeniu do bibułowania na sucho należy wybrać odpowiedni program napięciowy (tj. Program 3: 20 V przez 7 min) i rozpocząć transfer. Uwaga: białka o masie większej niż 150 kDa mają tendencję do wolniejszej migracji i mogą wymagać dłuższego czasu transferu wynoszącego 8-10 minut. Ponadto wcześniejsza inkubacja żelu w 20% etanolu przez 5-10 minut również pomoże poprawić wydajność przenoszenia tych dużych białek. Po zakończeniu programu przesyłania urządzenie automatycznie wyłączy prąd. Najlepiej jest natychmiast usunąć membranę i kontynuować procedurę blokowania, aby zapewnić lepsze wykrywanie białka i uniknąć wysuszenia membrany.</li>
</ol>
4. Wykrywanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni
<ol>
	<li>Umieść membranę (błony) w co najmniej 0,8 ml/cm2 buforu blokującego Odyssey (nie dodawaj Tween-20) na 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C. Membrana (membrany) może być również zablokowana przez beztłuszczowe mleko w proszku, jednak może to powodować wyższe tło i zakłócać wykrywanie białek.</li>
	<li>Inkubować błonę (błony) w pierwotnym przeciwciałie o pożądanym stężeniu w buforze blokującym Odyssey z 0,1% Tween-20 przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku detekcji dwukolorowej, w której dwa różne antygeny są wizualizowane na tej samej plamie, dwa pierwszorzędowe przeciwciała muszą pochodzić od różnych gatunków gospodarzy i zostać dodane jednocześnie do błony (błon). Uwaga: przed inkubacją błony (błon) w przeciwciałie pierwotnym, błonę (błony) można podzielić na różne części w celu zbadania wielu przeciwciał (tj. więcej niż 2) na tej samej błonie.</li>
	<li>Pierz membranę (membrany) 3x przez 10 minut w TBS plus 0,1% Tween-20 delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Inkubować błonę (błony) z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczeniu 1:20 000 dla kanału 700 nm i 1:6 000-1:10 000 dla kanału 800 nm w buforze blokującym Odyssey z 0,1% Tween-20 przez 30-60 min (inkubacja błony (błon) dłużej niż 1 godzina może zwiększyć tło). Chronić membranę (błony) przed światłem. Uwaga: przeciwciała drugorzędowe muszą pochodzić od tego samego gatunku gospodarza, co każde z przeciwciał pierwszorzędowych i być znakowane różnymi fluoroforami.</li>
	<li>Pierz membranę (membrany) 3x przez 10 minut w TBS plus 0,1% Tween-20 delikatnie wstrząsając. Chronić membranę (membrany) przed światłem.</li>
	<li>Membrana (membrany) może być suszona lub przechowywana w TBS lub PBS bez Tween-20 w temperaturze 4 °C do czasu zeskanowania i zobrazowania za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni. Sygnał fluorescencyjny pozostanie stabilny przez kilka miesięcy, jeśli będzie odpowiednio chroniony przed światłem.</li>
</ol>

<ol><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li>
<li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iBlot+Dry+Blotting+System%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Technologies+Corporation%22%5BJournal%5D)">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22LI-COR+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030%5BTitle%5D)+AND+%22LI-COR+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li>
<li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Milk+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li>
<li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe etapy generowania wysokiej jakości, ilościowych Western blot zgodnie z tym protokołem są następujące: 1) pomiar stężeń białka; 2) przygotowanie próbki; 3) blokowanie membrany i; 4) jakość i kaliber przeciwciała pierwszorzędowego.
Dokładność pomiaru całkowitych stężeń białek może mieć duży wpływ na ilościowe określanie prążków białkowych, ponieważ wyjątkowa czułość detekcji fluorescencyjnej w podczerwieni wzmocni wszelkie niewielkie różnice stwierdzone w stężeniu białka w próbkach. Aby...

Technika Western blotting została po raz pierwszy opracowana w latach 1977-1979 w celu stworzenia lepszej metody wykrywania białek za pomocą przeciwciał1-3. Procedura ta wykorzystywała elektroforetyczny transfer białek do błon z żeli SDS-PAGE z białkami docelowymi uwidocznionymi za pomocą przeciwciał drugorzędowych i wykrytymi za pomocą autoradiografii, światła UV lub produktu reakcji peroksydazy3. Tak więc, te same podstawowe zasady są nadal szeroko stosowane w dzisiejszych protokołach Western blot. Jednak ta klasyczna technika Western blot ma wiele wad, takich jak długi czas trwania elektroforezy, niska rozdzielczość i sztuczne pasma białkowe, podatność na degradację białek i ograniczona czułość, a także słaba jakość danych4. W związku z tym protokół ten opisuje znaczące postępy i ulepszenia standardowej procedury Western blot, która generuje dokładniejsze dane jakościowe i ilościowe.
System Laemmliego do rozdzielania szerokiej gamy białek za pomocą SDS-PAGE jest najczęściej używanym systemem żelowym do Western blotting5. Pomimo popularności tego zachodniego systemu blottingu, metoda ta może powodować zniekształcenia pasma, utratę rozdzielczości i fałszywe pasma4. Może to być konsekwencja deaminacji i alkilacji białek spowodowanej wysokim pH (9,5) żelu rozdzielającego, reoksydacji zredukowanych wiązań dwusiarczkowych spowodowanej zmiennym stopniem redoks żelu oraz rozszczepienia wiązań peptydowych aspartylo-prolilu w wyniku ogrzewania białka w buforze Laemmli (pH 5,2)4,6. System żelowy Bis-Tris, który działa przy neutralnym pH (7,0), zapewnia znaczące korzyści w porównaniu z systemem Lamemmli. System ten poprawia stabilność białek, minimalizuje modyfikacje białek, utrzymuje białka w ich zredukowanych stanach, zapobiega rozszczepieniu aspartylo-prolilu podczas elektroforezy, a co ważniejsze, czas trwania elektroforezy wynosi 35 min4,6,7. Ponadto system żelowy Bis-Tris zapewnia również ostrzejsze pasma, wyższą rozdzielczość i separację oraz zwiększoną czułość, co skutkuje bardziej wiarygodnymi danymi4.
W połączeniu z systemem żelowym Bis-Tris, system suchego blottingu iBlot wykorzystuje wysokie natężenie pola i prądy, aby znacznie skrócić czas transferu białek z żeli na błony w ciągu 7 minut8. Ten system przenoszenia opiera się na metodzie suchego blottingu, która generuje bardziej wydajny i niezawodny transfer białek8. Szczegółowe porównanie skuteczności systemu transferowego iBlot z konwencjonalnymi systemami transferowymi można znaleźć na następującej stronie internetowej: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html</a>. Wykorzystuje stos anody i katody, które składają się z matrycy żelowej zawierającej odpowiednie transferowe, które działają jak zbiorniki jonów8. Podczas transferu elektroliza wody pomaga zapobiegać wytwarzaniu tlenu z anody miedzianej, co skutkuje bardziej spójnym transferem białka bez powodowania zniekształceń pasma8. Co więcej, ten system transferu zwiększa również prędkość transferu poprzez zmniejszenie odległości między elektrodami8.
Chociaż chemiluminescencja jest najpowszechniejszą i najbardziej tradycyjną techniką wykrywania białek w analizach Western blot, dwukolorowa detekcja fluorescencyjna w podczerwieni znacznie poprawia czułość, jakość i dokładność danych Western blot. Ta metoda detekcji wykorzystuje wzbudzenie laserem w podczerwieni na dwóch optymalnych długościach fal, 700 nm i 800 nm, w celu wygenerowania wyraźnego obrazu danych o największym stosunku sygnału do szumu i najwyższej czułości9. W ten sposób dwa białka docelowe mogą być wizualizowane jednocześnie na tej samej błonie za pomocą fluorescencyjnych kanałów detekcyjnych 700 nm i 800 nm. Co ważniejsze, liniowość i dynamiczny zakres fluorescencji w podczerwieni pozwala na precyzyjną analizę ilościową zarówno silnych, jak i słabych prążków białkowych9. Co więcej, protokół ten zapewnia ogromne korzyści i ulepszenia w porównaniu z klasyczną techniką Western blotting poprzez skrócenie czasu elektroforezy i transferu w tym eksperymencie bez uszczerbku dla skuteczności tych procesów i wykorzystanie wykrywania białek fluorescencyjnych w podczerwieni w celu uzyskania lepszych jakościowych i ilościowych danych Western blot.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Scientific/Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4x NuPAGE LDS Bufor do próbek&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x Środek redukujący próbki NuPAGE&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>20x NuPAGE&reg; MES SDS Bufor do biegania</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE</td><td>Antioxidant Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,5 mm, 10-dołkowy&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,5 mm, 15-dołkowy</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Stos transferowy iBlot, PVDF Regular</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB4010-01</td><td></td></tr><tr><td>Stos transferowy iBlot, PVDF Mini</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB4010-02</td><td></td></tr><tr><td>Stos transferowy iBlot, Nitroceluloza</td><td>Regularna Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB3010-01</td><td></td></tr><tr><td>Stos transferowy iBlot, nitroceluloza Mini</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB3010-02</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do transferu żelu iBlot&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB1001</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin</td><td>Sigma</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-BIM (S69)</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Total BIM</td><td>Epitomics</td><td>1036-1</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4370</td><td></td></tr><tr>Całkowita <td>technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>ERK1/2</td><td>9107</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący Odyseję&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Koza anty-królicza IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT Koza anty-mysia IgG&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68020</td><td></td></tr><tr><td>Zachodnia skrzynka inkubacyjna, średnia&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>929-97205</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Klasyczny system obrazowania</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>aplikacyjne Odyssey V3.0.30</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy western blot

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Techniki Western blot, które zostały pierwotnie wprowadzone pod koniec lat siedemdziesiątych, są nadal aktywnie wykorzystywane. Jednak ta tradycyjna metoda Western blotting ma kilka wad, do których należą niska rozdzielczość, fałszywe prążki, zmniejszona czułość i słaba integralność białka. Ostatnie postępy drastycznie poprawiły wiele aspektów standardowego protokołu Western blot w celu uzyskania wyższych danych jakościowych i ilościowych. System żelowy Bis-Tris, alternatywa dla konwencjonalnego systemu Laemmli, generuje lepszą separację i rozdzielczość białek, utrzymuje integralność białek i skraca czas trwania elektroforezy do 35 minut. Co więcej, system suchego blottingu iBlot znacznie poprawia skuteczność i szybkość transferu białka do błony w ciągu 7 minut, co kontrastuje z tradycyjnymi metodami transferu białka, które są często mniej efektywne przy długim czasie transferu. W połączeniu z tymi wysoce innowacyjnymi modyfikacjami, detekcja białek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w podczerwieni skutkuje wyższą jakością, dokładniejszymi i spójniejszymi danymi w porównaniu ze standardową techniką chemiluminescencji Western blot. Technologia ta może jednocześnie wykrywać dwa różne antygeny na tej samej membranie, wykorzystując dwukolorowe barwniki bliskiej podczerwieni, które są wizualizowane w różnych kanałach fluorescencyjnych. Co więcej, liniowość i szeroki zakres dynamiki obrazowania fluorescencyjnego pozwalają na precyzyjne określenie ilościowe zarówno silnych, jak i słabych prążków białkowych. W związku z tym protokół ten opisuje kluczowe ulepszenia klasycznej metody Western blot, w której te postępy znacznie zwiększają jakość danych, jednocześnie znacznie skracając czas wykonania tego eksperymentu.

Dwukolorowa fluorescencja w podczerwieni pozwala na wykrycie zarówno silnych, jak i słabych prążków na tej samej membranie z zwiększoną czułością i najwyższym stosunkiem sygnału do szumu, co pozwala uzyskać wyraźne obrazy Western blot. Typowe wyniki generowane przez dwukolorową detekcję Western blot wizualizowane w kanałach fluorescencyjnych 700 nm i 800 nm przedstawiono na Ryc. 1 i 2. Górny Western blot na Ryc. 1 pokazuje jednoczesną detekcję (nałożenie) całkowitego bia...

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie kluczowych ulepszeń klasycznej techniki western blottingu w celu uzyskania lepszej rozdzielczości, jakości, czułości i dokładności danych z analizy Western. Jest to osiągane w pierwszej kolejności poprzez przygotowanie próbek z buforem zawierającym siarczan litu ESAL, aby zapewnić optymalne warunki do redukcji i alkilacji białek przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności. Drugim krokiem jest rozdzielenie białek przy użyciu systemu żeli BIS-tris, który umożliwia zakończenie elektroforezy w ciągu 35 minut.Następnie, w celu przeniesienia białek na membranę w czasie siedmiu minut, wykorzystuje się system do suchego transferu eye blot. Ostatnim etapem jest detekcja białek przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego w podczerwieni, które wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w dwóch różnych kanałach fluorescencyjnych, aby jednocześnie wizualizować dwa różne antygeny na tej samej membranie. W rezultacie te nowatorskie modyfikacje tradycyjnej metody western blotting pozwalają na uzyskanie dokładniejszych danych jakościowych i ilościowych, przy jednoczesnym znacznym skróceniu czasu wykonania tej techniki.Główną zaletą tej tech

the-fastest-western-town-contemporary-twist-on-classic-western-blot

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Najszybszy Western w mieście: Współczesny zwrot w klasycznej analizie Western Blot

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

V3 to procedura western blot z użyciem żeli bez plam. Technologia bezbarwna pozwala naukowcom na wizualizację jakości separacji białek, weryfikację wydajności transferu, a co najważniejsze, walidację zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kwantyfikacji białka jako niezawodnej kontroli obciążenia.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Technika ultra-szybkiego western blottingu jest rozwijana poprzez poprawę kinetyki wiązania antygen-przeciwciało poprzez technologię cyklicznego drenowania i uzupełniania (CDR) w połączeniu ze środkiem wzmacniającym immunoreakcję.

Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

Protokół przedstawia metodę izolowania lizatów białkowych całych komórek z wypreparowanych procesów twarzy zarodków myszy lub hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy zarodkowej i przeprowadzania następnie western blot w celu oceny poziomu fosforylowanego białka.

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

W niniejszym filmie pokazano, jak chirurgicznie zamknąć przewód endolimfatyczny świnki morskiej w celu wywołania wodniczki błony bębenkowej.

Chirurgiczna indukcja wodniaka błędnika poprzez obliterację kanału endolimfatycznego

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Poznaj nowoczesne modyfikacje klasycznej metody Western blot, które zwiększają rozdzielczość i czułość detekcji białek. Wykorzystaj system Bis-Tris oraz fluorescencyjne obrazowanie w podczerwieni.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Przeglądaj więcej filmów