Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i oczyszczanie subpopulacji multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzących z ludzkich naczyń krwionośnych z pojedynczej biopsji mięśnia szkieletowego poprzez najpierw dysocjację biopsji mięśnia i trawienie kombinacją kolagenazy typu one, two oraz four. Następnie zawiesinę pojedynczych komórek znakuje się przeciwciałami koniugowanymi z fluorescencją, które rozpoznają kombinację wybranych markerów powierzchniowych komórek. W kolejnym kroku przeprowadza się sortowanie komórek aktywowane fluorescencją przy użyciu cytometrii przepływowej.

Obserwuj i namnażaj posortowane podtypy komórek w określonych warunkach hodowlanych przy optymalnych gęstościach. Ostatecznie analiza po sortowaniu oczyszczonych komórek, a także późniejsza cytometria przepływowa i analiza R-T-P-C-R hodowanych subpopulacji komórek są wykorzystywane do wykazania czystości tych homogenicznych subpopulacji BVSE. Ta metoda pozwala odpowiedzieć na pytanie o pochodzenie tych mezenchymalnych komórek macierzystych wielbłąda.

Warto zauważyć, że wielu badaczy zidentyfikowało różne typy komórek macierzystych w różnych tkankach. Uważam zatem, że może to pomóc w wyjaśnieniu pochodzenia tych komórek macierzystych, a także roli, jaką komórki okołynaczyniowe i inne komórki pochodzące z naczyń krwionośnych odgrywają w regeneracji i naprawie tkanek. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, podobnie jak w przypadku biopsji mięśnia.

Etapy dysocjacji mogą być trudne do opanowania. Szczegóły techniczne oraz optymalizacja trawienia kolagenazą mają krytyczne znaczenie dla wydajności i oczyszczania docelowych komórek. Biopsjat ludzkiego mięśnia szkieletowego należy transportować w lodzie.

W pożywce DM M uzupełnionej o 5% FBS i 1% penicyliny streptomycyny w warunkach sterylnych. Przemyć preparat dwukrotnie PBS zawierającym 2% antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, a następnie w dms uzupełnionym o 2% aa. Usunąć przylegającą tkankę tłuszczową i łączną.

Należy również usunąć duże naczynia krwionośne pod mikroskopem sekcyjnym. Następnie należy pociąć preparat mięśniowy na małe kawałki. Przenieść próbki do 20 milliliters pożywki konserwującej w celu przechowywania w temperaturze four degrees Celsius przez maksymalnie pięć dni.

W dniu izolacji komórek. Wyjąć fragmenty mięśni i przemyć je dwukrotnie w PBS zawierającym 2% pen strip. Aby przygotować roztwór do trawienia, dodać po 100 mg/mL kolagenazy typu 1, typu 2 i typu 4 do pm.

Na koniec posiekać i mechanicznie rozdrobić kawałki mięśnia z niewielką ilością pm. Przenieść roztwór za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 milliliter, monitorując, czy nie powstają skrzepy. W trakcie tego procesu usunąć pozostałości tkanki tłuszczowej i łącznej.

Następnie przenieś połowę próbki dorosłej do 20 ml lub całą próbkę płodową do 10 ml roztworu trawiennego. Trawienie próbki prowadź przez 50–60 minut w temperaturze 37°C na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 70–80 RPM. Kontroluj stopień trawienia co 15–20 minut.

Zoptymalizuj wydajność komórek i zachowanie antygenów powierzchniowych, odpowiednio dostosowując czas trawienia i/lub prędkość mieszania w zależności od ilości tkanki; gdy zmętnienie prawie ustąpi, energicznie pipetuj trawioną tkankę od trzech do pięciu razy. Dodaj równą ilość PM, aby zatrzymać reakcję, a następnie odwiruj przy 400 Gs. Przez cztery minuty ostrożnie usuwaj nadsącz, aby wyprać osad, a następnie zawieś go ponownie w 10 ml PM. Przefiltruj przez sitko komórkowe 100 µm, odwiruj przy 400 Gs przez cztery minuty i ostrożnie usuń nadsącz.

Następnie w zawiesinie, zawiesić osad w buforze do lizy erytrocytów i przefiltrować przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm, aby uzyskać suspensję pojedynczych komórek. Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej przefiltrować suspensję przez sitko komórkowe 70 µm. W przypadku zaobserwowania osadu, odwirować komórki w celu uzyskania osadu resus.

Resuspender w 0,5 ml PBS i policzyć liczbę komórek do barwienia. Rozcieńczyć zawiesinę pojedynczych komórek do stężenia poniżej 5 milionów komórek na ml za pomocą alikwotu PBS, odmierzyć od 50 do 100 µL zawiesiny komórkowej i rozdzielić ją do 11 probówek dla kontroli niebarwionej, kontroli negatywnych oraz kontroli pozytywnych jednobarwnych. W razie potrzeby blokować zawiesinę pojedynczych komórek przez 10 minut w temperaturze 4 °C w surowicy mysiej.

Dodać roztwory przeciwciał zgodnie z planem eksperymentalnym i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4°C. Osadzić komórki poprzez wirowanie i przemyć każdy osad raz w rozcieńczonym PM przy końcowym stężeniu 5 milionów komórek na ml w celu wykluczenia martwych komórek przy rozcieńczeniu 1:100 z siedem a a d i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej dla kontroli negatywnej oraz pojedynczych kontrol pozytywnych. Resuspendować osady komórkowe w 0,5 ml rozcieńczonego pm.

Przenieś wszystkie zawiesiny komórkowe do polistyrenowych probówek do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem. Następnie przygotuj probówki do zbierania komórek, zawierające 500 µL odpowiedniego medium coer. Transportuj zawiesiny komórkowe w lodzie do komórki.

Przeprowadź sortowanie zawiesin komórkowych na sorterze komórek w kolejności: niebarwiona kontrola, kontrole negatywne, kontrole pozytywne dla pojedynczych barwników oraz główna zawiesina komórkowa, rygorystycznie dostosowując intensywność laserów, kompensację kanałów oraz bramkowanie populacji komórek w celu maksymalizacji czystości komórek. Zbierz pożądane populacje komórek do odpowiednich probówek zbiorczych. Przechowuj zebrane komórki w temperaturze 4 °C.

W przypadku braku możliwości natychmiastowego wysiewu, należy wysiać świeżo wyizolowane miogenne komórki śródbłonka w pożywce MPM na płytki uprzednio pokryte kolagenem typu I w celu późniejszego pakowania wysianych ECS.

Wysiać od 3 500 do 4 000 komórek na centymetr kwadratowy w medium MPM na płytki lub kolby uprzednio pokryte kolagenem typu I. Świeżo sortowane pasożyty w medium EGm2 wysiać na płytki świeżo pokryte 0,2% żelatyną w przypadku pierwszego i drugiego pasażu. Komórki przesiewać w stosunku 1:3 w medium PC na standardowe podłoże polistyrenowe.

Płytki od trzeciego pasażu (P3) wzwyż. Wysiać komórki w zagęszczeniu od 6 500 do 7 000 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce PC na standardowych polistyrenowych płytkach hodowlanych. W przypadku kolb, wysiać świeżo wyizolowane komórki tkanki zarodkowej w pożywce AC na standardowych polistyrenowych płytkach hodowlanych w celu późniejszego przygotowania komórek siewnych ACS w zagęszczeniu od 6 000 do 7 000 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce AC na standardowych polistyrenowych płytkach hodowlanych.

Parametry faktów kolb są najpierw korygowane na podstawie danych uzyskanych z kontroli niebarwionej, kontroli negatywnych oraz jednobarwnych kontrol pozytywnych; po wykluczeniu martwych komórek, zawiesina komórek znakowanych fluorescencyjnie jest poddawana serii selekcji negatywnych i pozytywnych markerów powierzchniowych komórek. W pierwszej kolejności odrzucane są komórki CD 45 dodatnie. Następnie z frakcji CD 45 ujemnej oddzielane są komórki CD 56 dodatnie oraz CD 56 ujemne.

Frakcję pozytywną pod kątem CD 56 poddaje się następnie selekcji CD 34 i CD 1 44, w której tylko komórki podwójnie pozytywne są znakowane jako miogenne komórki śródbłonka i następnie zbierane. Analogicznie, frakcję negatywną pod kątem CD 56 poddaje się selekcji CD 34 i CD 1 46, w której tylko komórki CD 34 negatywne i CD 1 46 pozytywne są znakowane jako pasożyty i następnie zbierane; frakcja CD 34 pozytywna i CD 1 46 negatywna jest poddawana dodatkowej selekcji negatywnej CD 31 w celu wykluczenia komórek śródbłonka, a tylko podzbiór CD 34 pozytywny i CD 31 negatywny jest znakowany jako komórki adv do zebrania. W tym przypadku CD 1 44 może zostać użyty jako zamiennik CD 31 do wykluczania EC.

Te subpopulacje H-P-V-S-C zostały oczyszczone z biopsji mięśni pojedynczego dawcy. W przeciwieństwie do typowych heterogennych komórek macierzystych mięśni, hodowle subpopulacji ludzkich komórek macierzystych pochodzących z naczyń krwionośnych pozostają homogeniczne nawet po długotrwałej ekspansji. Uważam, że dla badaczy jest bardzo ważne stosowanie tej samej techniki do izolacji tych komórek macierzystych pochodzących z naczyń krwionośnych, które opisaliśmy w naszych laboratoriach.

Wierzymy zatem, że zastosowanie tej techniki w sposób porównawczy pozwoli innym badaczom na odtworzenie naszych wyników oraz rzeczywiste porównanie rezultatów uzyskanych przez różne zespoły. Należy pamiętać, że praca ze świeżą tkanką ludzką może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek nitrylowych i ochrony oczu.