Name: Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Odkryj kalibrację czujników FIBS do nieinwazyjnego profilowania metabolicznego. Ta metoda umożliwia pomiar stężenia glukozy i glutaminy w komórkach w czasie rzeczywistym, wspierając optymalizację bioprocesów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy profesorowi Wolfowi Frommerowi (Carnegie Institution for Science, Uniwersytet Stanforda) za uprzejme dostarczenie nam plazmidu glukozy FRET oraz dr Uwe Ludewig (Uniwersytet Hohenheim) za uprzejme dostarczenie konstruktu glutaminy FRET w wektorze ekspresji roślinnej pUTKan. AB jest finansowany przez program stypendiów BBSRC Targeted Priority Scholarships. Zarówno CK, jak i KP są wspierane przez RCUK Fellowships in Biopharmaceuticals Processing. CK pragnie również podziękować Lonza Biologics za wsparcie finansowe. Centrum Biologii Syntetycznej i Innowacji jest hojnie wspierane przez EPSRC.

1. Rewitalizacja i utrzymanie linii komórkowych
<ol>
	<li>Rewitalizować komórki CHO w 9 ml pożywki CD-CHO uzupełnionej o 8 mM L-Glutaminy oraz 10 ml/L 100x suplementu hypoksantyny/tymidyny (pełna pożywka wzrostowa).</li>
	<li>Wirować przy 100 x g przez 5 min.</li>
	<li>Resuspender komórki w 10 ml świeżej pełnej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Pobrać próbkę 1 ml i oznaczyć stężenie żywych komórek za pomocą mikroskopii świetlnej z wykorzystaniem metody wykluczania barwnika trypan blue w hemocytometrze.</li>
	<li>Inicjować hodowlę przy gęstości zasiewu 3 x 105 komórek/ml w kolbach inkubacyjnych o pojemności 125 ml.</li>
	<li>Utrzymywać hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, w nawilżonej atmosferze z 5% CO2, na platformie wytrząsowej obracającej się z prędkością 120 rpm.</li>
	<li>Przesiewać co 3-4 dni w pełnej pożywce wzrostowej przy gęstości zasiewu 2 x 105 komórek/ml.</li>
</ol>
2. Transfekcja linii komórkowej plazmidem zawierającym gen biosensora
<ol>
	<li>Przygotować plazmidowe DNA przy użyciu zestawu do wielkoskalowego oczyszczania plazmidów.</li>
	<li>Utrzymywać komórki w odpowiednich warunkach (37 °C, 5% CO2) przez 12-24 hr przed transfekcją, aby zapewnić, że komórki aktywnie się dzielą w momencie transfekcji.</li>
	<li>Policzyć komórki metodą wykluczania barwnika trypan blue, a następnie przygotować objętość roboczą 20 ml hodowli komórkowej w kolbie wytrząsowej o pojemności 125 ml przy stężeniu 1 x 106 cells/ml.</li>
	<li>Użyć odpowiedniego zestawu do transfekcji dla stosowanej linii komórkowej. Stosunek plazmidowego DNA do odczynników do transfekcji będzie zależał od linii komórkowej i wektora. Zaleca się optymalizację tego parametru poprzez przetestowanie zakresu stosunków określonych przez producenta przed przeprowadzeniem ostatecznych transfekcji. Należy również utrzymać co najmniej jedną kulturę kontrolną ujemną zawierającą komórki, ale bez DNA.</li>
	<li>Inkubować przez 4 dni w trybie statycznym, a następnie przenieść na platformę wytrząsową obracającą się z prędkością 125 rpm.</li>
	<li>Dodać odpowiedni antybiotyk do selekcji plazmidu w stężeniu ustalonym na podstawie krzywej przeżywalności (kill curve). W niniejszym badaniu zeocyn dodano do stężenia końcowego 400 μg/ml w celu selekcji komórek transfekowanych.</li>
	<li>Wymieniać medium w odpowiednich odstępach czasu dla danej linii komórkowej, za każdym razem dodając antybiotyk, aż do momentu obumarcia komórek w studni kontrolnej.</li>
	<li>Wybrać studnie o największej konfluencji w celu przejścia do hodowli wytrząsowych.</li>
	<li>Utworzyć bank komórek poprzez zamrożenie komórek w fiolkach kriogenicznych zawierających 107  żywych komórek w 1 ml mieszaniny do mrożenia. W niniejszej pracy mieszanina ta składa się z 92,5% medium wzrostowego i 7,5% dimetylosulfotlenku.</li>
</ol>
3. Krzywa wzrostu komórek w hodowli okresowej i w hodowli z dopływem
<ol>
	<li>Zgodnie z powyższymi instrukcjami dotyczącymi utrzymania komórek, przygotować potrójne hodowle transfekowanych komórek CHO w kolbach wytrząsowych o pojemności 250 ml, przy objętości roboczej 50 ml.</li>
	<li>Hodowle utrzymywać w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2, na platformie wytrząsowej z obrotem 125 rpm, pobierając próbki o objętości 4,1 ml z każdej rosnącej hodowli w odstępach 24-godzinnych.</li>
	<li>Wykorzystać 100 μl próbki do oznaczenia stężenia żywych komórek oraz żywotności komórek metodą wykluczania barwnika trypan blue.</li>
	<li>Powtarzać procedurę do momentu, aż stężenie żywych komórek spadnie do zera.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę dla hodowli komórkowych w systemie fed-batch, uzupełniając w 6. dniu odpowiednią ilość glukozy lub glutaminy, aby przywrócić ich stężenia do wartości początkowych, odpowiednio 36 mM i 4 mM. Zaleca się prowadzenie dodatkowych hodowli kontrolnych, do których należy dodawać taką samą objętość (w tym przypadku 12 ml) czystej wody.</li>
</ol>
4. Pomiary stosunku FRET
<ol>
	<li>Odmierz 2 ml próbek pobranych codziennie w kroku 3.2 powyżej i wiruj przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Resuspenduj osad komórkowy w 2 ml lodowatego roztworu soli fosforanowo-buforowanego (PBS). Przenieś zawiesinę do płytki 6-dołkowej i do jednego z dołków dodaj próbkę ślepą niezawierającą komórek.</li>
	<li>Niezwłocznie zmierz poziomy fluorescencji niebieskiej i żółtej przy długości fali wzbudzenia 430/435 nm oraz długościach fali emisji 465/435 nm (niebieska) i 520/510 nm (żółta).</li>
	<li>Oblicz stosunki FRET (stosunek wykrytej fluorescencji żółtej do wykrytej fluorescencji niebieskiej).</li>
</ol>
5. Analizy metabolitów
<ol>
	<li>Pobrać 2 ml próbek dziennych pobranych w kroku 3.2 powyżej i wirować przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz.</li>
	<li>Resuspender osad komórkowy w 3 ml lodowatego PBS i ponownie wirować przy 100 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i resuspender osad komórkowy w 3 ml lodowatego PBS jak opisano powyżej. Sonicować próbkę 5x przez 3 min każdorazowo, stosując impulsy 15 s włączony i 15 s wyłączony. Na tym etapie ekstrakty komórkowe można zamrozić, jeśli jest to pożądane.</li>
	<li>Zastosować odpowiedni zestaw do oznaczania glukozy zgodnie z instrukcją producenta na próbkach ekstraktów komórkowych, aby określić wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy (patrz tabela materiałów). 
	Uwaga: Użyć odpowiednich wzorców do sporządzenia krzywej wzorcowej. W niniejszej pracy stężenie wzorców mieściło się w zakresie 0-100 mM.</li>
	<li>Wykorzystując odczyty dla wzorców, sporządzić krzywą wzorcową i wyznaczyć liniowe równanie regresji (w tym przypadku: y = 1310,51x - 723,43, gdzie y to odczyt absorbancji, a x to stężenie glukozy).</li>
	<li>Obliczyć stężenia glukozy, korzystając z krzywej wzorcowej i uwzględniając rozcieńczenie. Wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy można następnie obliczyć za pomocą następującego równania: 
	<img alt="Wzór na stężenie wewnątrzkomórkowe; metoda obliczania stężenia; proces analizy biochemicznej." fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	Dla komórek CHO objętość pojedynczej komórki obliczono, przyjmując średnicę komórki wynoszącą 12 μM 12.</li>
	<li>Zastosować odpowiedni zestaw do oznaczania glutaminy zgodnie z instrukcją producenta na próbkach ekstraktów komórkowych, aby określić wewnątrzkomórkowe stężenie glutaminy (patrz tabela materiałów). 
	Uwaga: Użyć odpowiednich wzorców do sporządzenia krzywej wzorcowej. W niniejszej pracy stężenie wzorców mieściło się w zakresie 0-2 mM.</li>
	<li>Analogicznie do punktu 5.5 powyżej, sporządzić krzywą kalibracyjną (w tym przypadku y = 203,1x + 17,1, gdzie y to odczyt absorbancji, a x to stężenie glukozy)</li>
	<li>Korzystając z krzywej wzorcowej, obliczyć stężenie glutaminy w próbkach, uwzględniając rozcieńczenie. Wewnątrzkomórkowe stężenie glutaminy można obliczyć za pomocą powyższego Równania 1.</li>
</ol>

<ol><li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose%2C+lactate%2C+glutamate%2C+and+glutamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li>
<li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li>
<li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li>
<li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+J.+Sel.+Top.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels%E2%80%94the+Holy+Grail+in+muTAS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li>
<li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li>
<li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li>
<li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li>
<li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li>
<li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li>
<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li>
<li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+binding+proteins%3A+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

FIBS umożliwiają ilościowe oznaczanie in vivo i in situ kluczowych cząsteczek, w tym przypadku składników odżywczych ograniczających wzrost, usuwając niepewności wynikające z metod hartowania i ekstrakcji. Wyniki sugerują, że istnieje dobra korelacja między sygnałem FIBS a stężeniami wewnątrzkomórkowymi w zakresie 1-5 mM dla glukozy i 0,3-2 mM dla glutaminy. W okresowej hodowli komórkowej CHO stężenia te występują w fazie wykładniczej, stacjonarnej i wczesnego zaniku. Faza wykładnicza i stacjonarna są n...

Monitorowanie metabolitów ma różne zastosowania w bioprzetwarzaniu, w tym w rozwoju procesów, projektowaniu mediów i pasz oraz inżynierii metabolicznej. Dostępne są różne metody pomiaru stężenia przy użyciu testów enzymatycznych1, chemicznych2 lub wiążących3. Ciekawą opcją jest wykorzystanie fluorescencyjnych, białkowych czujników biologicznych in vivo jako reporterów wewnątrzkomórkowego stężenia kluczowych metabolitów. W testach o bardzo małej objętości fluorescencja jest wygodnym narzędziem, ponieważ miniaturyzacja faktycznie poprawia stosunek sygnału do szumu4,5, a czujniki oparte na białkach mogą być kodowane genetycznie, co oznacza, że do analizy metabolitów nie są potrzebne żadne odczynniki egzogenne. Biosensory Förster Resonance Energy Transfer (FRET) składają się z dwóch białek fluorescencyjnych połączonych domeną wiążącą ligand. FRET to niepromieniste przeniesienie energii z fotowzbudzonego donora do akceptorowej cząsteczki fluorescencyjnej znajdującej się w bliskiej odległości (<100). Rozszczepienie lub wiązanie liganda powoduje zmianę konformacyjną w czujniku, która z kolei indukuje zmianę w pobliżu fluoroforów, prowadząc do zmiany wydajności FRET mierzonej zmianą widma emisyjnego. Zintegrowane czujniki biologiczne FRET (FIBS) są wytwarzane konstytutywnie w linii komórkowej, a ich charakterystyka widmowa zmienia się w zależności od stężenia metabolitu w komórce. FIBS mają krótkie czasy reakcji, dzięki czemu idealnie nadają się do wykonywania pomiarów dla modeli dynamicznych6. Wcześniejsze zastosowania obejmowały monitorowanie pojedynczych7-9 i wielumetabolitów 10 oraz dostarczanie danych na temat dystrybucji czasoprzestrzennej11. FIBS można tworzyć w dwóch konfiguracjach: Apo-Max, gdzie wiązanie ligandów zakłóca bliskość fluoroforów, obniżając transfer energii i Apo-Min, gdzie wiązanie ligandów zbliża dwa fluorofory do bliższego kontaktu (ryc. 1).
W tej pracy przedstawiono protokół budowy linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO), które konstytutywnie wyrażają FIBS dla metabolitu, glukozy lub glutaminy. Ustanowiono metodologię kalibracji czujnika in vivo, aby umożliwić przyszłe pomiary ilościowe stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych, jak pokazano na rysunku 2. Na tej podstawie można określić wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy lub glutaminy w hodowlach komórkowych CHO podawanych partiowo, do których dodano dwa składniki odżywcze w wysokich stężeniach w procesie. Wyniki pokazują, że przy użyciu sygnału fluorescencyjnego z FIBS i wcześniej skonstruowanej krzywej kalibracyjnej możliwe jest dokładne przewidywanie stężenia wewnątrzkomórkowego, co potwierdza niezależny test enzymatyczny. Metoda ta oferuje znaczne korzyści w porównaniu z obecnymi technologiami analitycznymi, ponieważ jest nieinwazyjna, tania i szybka, dając sygnał FIBS w czasie rzeczywistym, który można monitorować w całej hodowli.

<table><tbody><tr><td>CHO-S Cells</td><td>Life Tecnologies</td><td>11619-012</td><td>Linia komórkowa będzie się różnić w zależności od celów badania wektora</td></tr><tr><td>pCDNA4/DO&nbsp;</td><td>Life Tecnologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TransIT-PRO</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 5700</td><td>Transfekcje można wykonać przy użyciu dowolnej metody odpowiedniej dla badanej linii komórkowej</td></tr><tr><td>Pożywka Zeocin</td><td>Invivogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-CHO</td><td>Life Technologies</td><td>10743-011</td><td>Pożywka do wzrostu komórek zależy od badanych komórek</td></tr><tr><td>100x HT Suplement</td><td>Żywotność Technologie</td><td>11067-030</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek InfinitePRO 200</td><td>Tecan</td><td>FLx800TBI</td><td>Każdy 96-dołkowy czytnik płytek fluorescencyjnych, który ma dostęp do wymaganych długości fal, może zostać zastąpiony</td></tr><tr><td>Filtry do czytnika płytek</td><td>Tecan</td><td>30000463</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Zestaw do oczyszczania plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Każdy odpowiedni zestaw może zostać zastąpiony</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania glukozy/oksydazy glukozowo-glukozowej Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A22189</td><td>Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić</td></tr><tr><td>EnzyChrom&nbsp; Zestaw do oznaczania glutaminy Systemy</td><td>testów biologicznych</td><td>EOAC-100</td><td>Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić</td></tr><tr><td>Ulepszony hemocytometr Neubauer</td><td>Inkubator Fisher Scientific</td><td>MNK-420-010N</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr></tbody></table>

nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem fibs

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

W erze biologii obliczeniowej, nowe systemy eksperymentalne o wysokiej przepustowości są niezbędne do wypełniania i udoskonalania modeli, tak aby można je było walidować do celów predykcyjnych. Idealnie byłoby, gdyby takie systemy były niskoobjętościowe, co wyklucza pobieranie próbek i analizy niszczące, gdy mają być uzyskane dane dotyczące przebiegu w czasie. Potrzebne jest narzędzie do monitorowania in situ, które może przekazywać niezbędne informacje w czasie rzeczywistym i w sposób nieinwazyjny. Ciekawą opcją jest zastosowanie fluorescencyjnych, opartych na białkach czujników biologicznych in vivo jako reporterów stężeń wewnątrzkomórkowych. Jedna szczególna klasa biosensorów in vivo, która znalazła zastosowanie w kwantyfikacji metabolitów, opiera się na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) między dwoma białkami fluorescencyjnymi połączonymi domeną wiążącą ligand. Zintegrowane czujniki biologiczne FRET (FIBS) są wytwarzane konstytutywnie w linii komórkowej, mają krótkie czasy reakcji, a ich charakterystyka widmowa zmienia się w zależności od stężenia metabolitu w komórce. W pracy opisano metodę konstruowania linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO), które konstytutywnie wyrażają FIBS dla glukozy i glutaminy oraz kalibracji FIBS in vivo w okresowej hodowli komórkowej w celu umożliwienia przyszłej kwantyfikacji stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych. Dane z hodowli komórkowych CHO podawanych partiami pokazują, że FIBS był w stanie w każdym przypadku wykryć wynikającą z tego zmianę stężenia wewnątrzkomórkowego. Wykorzystując sygnał fluorescencyjny z FIBS i wcześniej skonstruowaną krzywą kalibracyjną, dokładnie określono stężenie wewnątrzkomórkowe, co zostało potwierdzone niezależnym testem enzymatycznym.

Przegląd metodologii przedstawiono na Rysunku 2. W niniejszej pracy komórki CHO przetransfekowano wektorem FIBS, a stabilne linie komórkowe wyselekcjonowano przy ciśnieniu antybiotykowym 400 μg/ml zeocyny. W ten sposób stworzono dwie oddzielne stabilne linie komórkowe konstytutywnie ekspresujące sensory glukozy i glutaminy. Rysunek 1 przedstawia konfiguracje dwóch biosensorów użytych w tym badaniu. Sensor glukozy opiera się na zasadzie Apo-Max, a odpowiadający mu plazmid to pRSET-FLIPglu...

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest nieinwazyjne monitorowanie poziomu wewnątrzkomórkowej glukozy lub glutaminy przy użyciu genetycznie kodowanych biosensorów białkowych. Osiąga się to poprzez uprzednią transfekcję interesujących komórek plazmidem zawierającym gen biosensora i wyselekcjonowanie komórek wykazujących ekspresję biosensora. W drugim kroku pobiera się próbki hodowli komórkowych z hodowli okresowych lub hodowli z dożywianiem, a następnie mierzy się ich stosunki FRET.Wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy lub glutaminy w próbkach można następnie oznaczyć za pomocą niezależnego testu. Ostatecznie stosunek FRET w próbkach może posłużyć do nieinwazyjnego obliczania wewnątrzkomórkowego stężenia glukozy lub glutaminy w czasie rzeczywistym. Zastosowania tej techniki obejmują usprawnianie bioprocesów, ponieważ jest to niezawodna metoda pozyskiwania metabolicznych informacji w czasie rzeczywistym, które mogą być wykorzystane do optymalizacji i sterowania online.Choć metoda ta może służyć do analizy bioprocesów, może być również stosowana w innych układach, w tym do wykrywania markerów chorobowych. Rozpocznij od rewitalizacji komórek CHO w 9 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Następnie odwiruj komórki, zawiesić osad w 10 ml świeżej pożywki wzrostowej i policz komórki metodą wykluczania barwnika trypanyleowego.Następnie należy zainicjować hodowlę przy gęstości zasiewu 3 × 10⁵ komórek na ml w kolbach shakerach o pojemności 125 ml w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na platformie wytrząsowej. Przy prędkości obrotowej 125 RPM należy przeprowadzać pasażowanie komórek co trzy do czterech dni w pełnej pożywce wzrostowej przy gęstości zasiewu 2 × 10⁵ komórek na ml w celu przeprowadzenia transfekcji komórek.Przechowuj komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 12 do 24 godzin przed transfekcją, aby upewnić się, że komórki aktywnie się dzielą. Następnie po przygotowaniu plazmidowego DNA, policz komórki metodą wykluczania barwnika trypanowego i rozcieńcz komórki do objętości roboczej 20 ml pożywki hodowlanej. W kolbie wytrząsowej o pojemności 125 ml zastosuj stężenie 1 × 10⁶ komórek na ml.Należy użyć odpowiedniego zestawu do transfekcji dla stosowanej linii komórkowej, uwzględniając co najmniej jedną kontrolną studnię negatywną zawierającą komórki, ale bez dodatku DNA. Przeniesione komórki należy inkubować przez cztery dni w trybie statycznym. Następnie należy dodać odpowiedni antybiotyk do selekcji plazmidu w stężeniu ustalonym na podstawie krzywej przeżywalności.Na przykład w niniejszym badaniu, w celu selekcji przetransfekowanych komórek, dodano zin do stężenia końcowego 400 g/ml, a następnie przeniesiono hodowle na platformę wytrząsową obracającą się z prędkością 125 RPM. Po odpowiednich dla danej linii komórkowej odstępach czasu wymieniano pożywkę, za każdym razem dodając antybiotyk, aż do momentu obumarcia komórek w studzience kontrolnej. Do hodowli wytrząsanych wybrano studzienki o najwyższym stopniu konfluencji.Następnie zamrozić komórki w fiolkach kriogenicznych zawierających 1×10⁷ żywych komórek w 1 mL mieszaniny do zamrażania w celu wygenerowania krzywych wzrostu w hodowli okresowej i hodowli z dożywianiem. Najpierw przygotować potrójne kultury transfektowanych komórek CHO w kolbach wytrząsowych o pojemności 250 mL, przy objętości roboczej 50 mL. Następnie umieścić kultury w wilgotnym inkubatorze do komórek z wytrząsaniem i pobierać próbki o objętości 4,1 mL z każdej rosnącej kultury w odstępach 24-godzinnych. W przypadku hodowli z dożywianiem, w szóstym dniu uzupełnić komórki odpowiednią ilością glukozy lub glutaminy, aby przywrócić ich stężenia do wartości początkowych.W celu zasilenia kultur kontrolnych taką samą objętością czystej wody, należy pobrać 100 µL z próbek o objętości 4,1 mL z punktu 4.2 codziennie, aby przeprowadzić zliczanie komórek metodą wykluczania barwnika trypan blue, aż do momentu, gdy stężenie żywych komórek spadnie do zera. Aby wyznaczyć pomiary stosunku FRET, odwiruj 2 mL codziennych próbek i resuspenduj osad w 2 mL lodowatego PBS; przenieś połowę zawiesiny komórkowej na płytkę 6-dołkową i dodaj próbkę ślepą, niezawierającą komórek, do jednego z dołków. Następnie niezwłocznie zmierz poziomy fluorescencji niebieskiej i żółtej przy długości fali wzbudzenia 430 nm z szerokością pasma 35 nm oraz długościach fali emisji odpowiednio 465 nm z szerokością pasma 35 nm dla fluorescencji niebieskiej i 520 nm z szerokością pasma 10 nm dla fluorescencji żółtej.Oblicz współczynniki FRET, wyznaczając stosunek wykrytej fluorescencji żółtej do fluorescencji niebieskiej. Następnie odwiruj ostatnie 2 mL próbek dziennych, a po drugim przemyciu dwukrotnie opłucz osad w lodowatym PBS. Poddaj próbkę sonikacji pięciokrotnie, po 3 minuty za razem, stosując impulsy: 15 sekund włączony i 15 sekund wyłączony.Na koniec należy przeprowadzić analizy metabolitów zgodnie z instrukcją producenta i wykorzystać otrzymane krzywe wzorcowe do obliczenia wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy lub glutaminy, w zależności od potrzeb. W tym reprezentatywnym eksperymencie utrzymywano hodowle seryjne dwóch linii komórkowych w sposób przedstawiony powyżej, pobierając codzienne próbki do kalibracji in vivo każdego czujnika FRET. Reprezentatywny profil wzrostu żywych komórek dla dwóch linii komórkowych w relacji do wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy lub glutaminy przedstawiono na tym wykresie, a odpowiadające im pomiary FRET oraz stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych oznaczone za pomocą testów enzymatycznych zaprezentowano w tej tabeli.Ustalono, że niska liczba komórek obecna w ciągu pierwszych czterech dni hodowli prowadziła do niewiarygodnego sygnału FRET. Podobnie, wysoki poziom lizatu komórkowego obecny po ósmym dniu hodowli powodował znaczne rozpraszanie światła. W związku z tym do konstrukcji krzywych kalibracyjnych dla czujników glukozy i glutaminy wykorzystano dane wyłącznie z dni od czwartego do ósmego.Wyniki wskazują, że sygnał FIB wykazuje wiarygodną korelację z wewnątrzkomórkowymi stężeniami od 1 do 5 mM dla glukozy oraz od 0,3 do 2 mM dla glutaminy. W celu walidacji wyników FIB przeprowadzono hodowlę typu fed-batch dla obu linii komórkowych. W szóstym dniu hodowli komórkowej dodano pożywkę zawierającą wysokie stężenie substratu, aby zwiększyć jego stężenie zewnątrzkomórkowe.Jak pokazują wykresy, stosunki fret w każdym dniu wykazują wyraźną odpowiedź na karmienie. Odwrócono trend obserwowany do szóstego dnia. Na przykład w kulturach karmionych glukozą stężenie glukozy zewnątrzkomórkowej wzrosło ponownie do 36 millimolar.Podczas gdy w kulturach zasilanych glutaminą stężenie glutaminy wzrosło do 4 mM. W eksperymentzie z glukozą stosunek FRET dla linii komórkowej glucose fibs spadł w siódmym dniu w odpowiedzi na dodanie glukozy. Wynika to z faktu, że glucose fibs wykazuje konfigurację APO on.Podobnie w eksperymencie z glutaminą, stosunek FRET dla linii komórkowej z sensorem glutaminy wzrastał w odpowiedzi na dodanie glutaminy, zgodnie z zasadą działania sensorów typu APO off. Pomiary FRET zostały ostatecznie wykorzystane do obliczenia odpowiadających im wewnątrzkomórkowych stężeń glukozy i glutaminy na podstawie wspomnianych wcześniej krzywych kalibracyjnych. Porównano je z rzeczywistymi stężeniami wewnątrzkomórkowymi tych substratów, wyznaczonymi za pomocą enzymatycznych testów glukozy i glutaminy, co wykazało odpowiednią zgodność po przeprowadzeniu optymalizacji metody.Technika ta utorowuje drogę badaczom w tej dziedzinie do eksploracji wpływu różnych składów pożywek na wydajność produkcji białek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania genetycznie kodowanych biosensorów do monitorowania wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów.

fibs-enabled-noninvasive-metabolic-profiling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Profile metaboliczne bezinwazyjne z funkcją FIBS

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Ta praca demonstruje wykonalność techniki spektroskopii rezonansu magnetycznego in vivo fosforu-31 (31PMRS) do ilościowego określenia zdolności mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w ludzkich mięśniach szkieletowych.

Spektroskopia rezonansu magnetycznego Phosphorus-31: narzędzie do pomiaru zdolności ultrautleniającej fosforylacji mitochondrialnej in vivo w ludzkich mięśniach szkieletowych

To badanie opisuje protokół, który wykorzystuje obrazowanie 18F-FDG i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT), wraz z modelowaniem kinetycznym, do ilościowego określenia in vivo, w czasie rzeczywistym wychwytu 18F-FDG do tkanek.

Określanie kinetyki metabolizmu glukozy za pomocą 18F-FDG Micro-PET/CT

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Odkryj kalibrację czujników FIBS do nieinwazyjnego profilowania metabolicznego. Ta metoda umożliwia pomiar stężenia glukozy i glutaminy w komórkach w czasie rzeczywistym, wspierając optymalizację bioprocesów.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Przeglądaj więcej filmów