Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Ogólnym celem tej procedury jest nieinwazyjne monitorowanie poziomu wewnątrzkomórkowej glukozy lub glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych biosensorów opartych na białkach. Osiąga się to poprzez najpierw transekcję komórek będących przedmiotem zainteresowania genem biosensora zawierającym plazmid i wybranie tych komórek, które wyrażają bioczujnik. W drugim etapie pobiera się próbki kultur komórkowych z hodowli okresowych lub karmionych wsadowo i mierzy się ich współczynniki progów.

Wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy lub glutaminy w próbkach można następnie określić za pomocą niezależnego testu. Ostatecznie stosunek progów próbek można wykorzystać do obliczenia wewnątrzkomórkowego stężenia glukozy lub glutaminy nieinwazyjnie i w czasie rzeczywistym. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku poprawy procesów biologicznych, ponieważ jest to niezawodna metoda uzyskiwania informacji metabolicznych w czasie rzeczywistym, które można wykorzystać do optymalizacji i kontroli online.

Chociaż metoda ta może być wykorzystana do zapewnienia wglądu w bioprzetwarzanie, może być również stosowana w innych systemach, w tym do wykrywania markerów chorobowych. Zacznij od ożywienia komórek CHO w dziewięciu mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej. Następnie odwiruj komórki, ponownie zawieś osad w 10 mililitrach świeżego wzrostu, pożywki i policz komórki według flaków w niebieskiej matrycy.

Następnie zainicjuj hodowlę przy gęstości wysiewu trzy razy 10 do piątej komórki na mililitr w 125 mililitrach. Wytrząsarka w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na orbitalnej platformie wytrząsającej. Przy rotacji 125 obr./min subkulturuj komórki co trzy do czterech dni w kompletnej pożywce wzrostowej o gęstości osadzenia dwa razy 10 do piątej komórki na mililitr w celu transfekcji komórek.

Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 12 do 24 godzin przed transfekcją, aby upewnić się, że komórki aktywnie się dzielą. Następnie po przygotowaniu plazmidowego DNA policz komórki przez wykluczenie flaków i niebieskiej matrycy i rozcieńcz komórki do objętości roboczej 20 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych. W 125 mililitrach wstrząsnąć kolbą w stężeniu jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr.

Należy użyć odpowiedniego zestawu do transfekcji dla używanej linii komórkowej, w tym co najmniej jednej studzienki kontroli ujemnej zawierającej komórki, ale bez DNA. Inkubować transfekowane komórki przez cztery dni w trybie statycznym. Teraz dodaj odpowiedni antybiotyk do selekcji plazmidu do odpowiedniego stężenia, zgodnie z krzywą zabijania.

Na przykład w tym badaniu zin dodano do końcowego stężenia 400 gramów na mililitr w celu selekcji transfekowanych komórek, a następnie przeniesiono kultury na platformę wytrząsającą obracającą się z prędkością 125 obr./min. Zmieniaj pożywkę w odpowiednich odstępach czasu dla linii komórkowej, dodając antybiotyk za każdym razem, aż komórki w studzience kontrolnej obumrą. Użyj najbardziej zlewających się studzienek, aby przejść do potrząsających kultur.

Następnie zamroź komórki w fiolkach kriogenicznych zawierających od jednego razy 10 do siódmego żywotnych komórek w jednym mililitrze mieszanki do zamrażania, aby wygenerować krzywe wzrostu partii i karmionej. Najpierw należy ustalić potrójne hodowle komórkowe transfekowanych komórek CHO w 250 mililitrowych kolbach Shake o objętości roboczej 50 mililitrów. Następnie umieść kultury w nawilżonym inkubatorze komórkowym z wytrząsaniem i usuń 4,1 mililitra próbek z każdej rosnącej kultury w odstępach 24-godzinnych W przypadku kultur wsadowych podawanych przez Fed uzupełnij komórki odpowiednią ilością glukozy lub glutaminy w szóstym dniu, aby przywrócić ich stężenia do wartości początkowych.

Karmiąc kultury kontrolne tą samą objętością czystej wody, użyj 100 mikrolitrów 4,1 mililitra próbek z 4,2 dziennie, aby policzyć komórki według tripu i wykluczenia niebieskiej matrycy, aż stężenie żywej komórki zostanie zmniejszone do zera. Aby określić stosunek progów Pomiary, odwirować dwa mililitry dziennych próbek i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach lodowatego PBS, przenieść połowę zawiesiny komórek na płytkę sześciodołkową i dodać ślepą próbkę nie zawierającą komórek do jednej. Cóż, natychmiast zmierz poziomy niebieskiej i żółtej fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 430 przy szerokości pasma 35 nanometrów i długości fali misji 465 przy szerokości pasma 35 nanometrów i 520 przy szerokości pasma 10 nanometrów odpowiednio dla niebieskiej i żółtej fluorescencji.

Oblicz stosunki progów, określając stosunek wykrytej fluorescencji żółtej do fluorescencji niebieskiej. Teraz odkręć ostatnie dwa mililitry dziennych próbek, a następnie umyj granulkę dwukrotnie w lodowatym PBS po drugim praniu. Poddaj próbkę działaniu sonifikacji pięć razy przez trzy minuty, za każdym razem przy impulsie 15 sekund włączonym i 15 sekund wyłączonym.

Na koniec należy przeprowadzić testy metabolitów zgodnie z instrukcją producenta i wykorzystać otrzymane krzywe wzorcowe do obliczenia wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy lub glutaminy, odpowiednio. W tym reprezentatywnym eksperymencie utrzymywano przerośnięte wsadowo kultury dwóch linii komórkowych, jak właśnie wykazano z codziennymi próbkami używanymi do kalibracji in vivo każdego fibs. Reprezentatywny żywotny profil wzrostu komórek dwóch linii komórkowych w odniesieniu do ich wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy lub glutaminy przedstawiono na tym wykresie, a odpowiednie pomiary progów i wewnątrzkomórkowe stężenia metabolitów określone za pomocą testów enzymatycznych przedstawiono w tej tabeli.

Ustalono, że niska liczba komórek obecna w pierwszych czterech dniach hodowli prowadziła do niewiarygodnego sygnału progowego. Podobnie, wysoki poziom lizatu komórkowego obecny po ósmym dniu hodowli powodował duże rozpraszanie światła. W związku z tym tylko dane z dni od czwartego do ósmego są wykorzystywane do konstruowania krzywych kalibracyjnych dla fibs glukozy i glutaminy.

Wyniki wskazują, że sygnał FIB wytwarza wiarygodną korelację ze stężeniami wewnątrzkomórkowymi między jednym a pięcioma milimolami dla glukozy oraz 0,3 i dwoma milimolami dla glutaminy. Aby potwierdzić wyniki fibs, przeprowadzono karmienie przerośniętymi kulturami dwóch linii komórkowych. Pasza zawierająca wysokie stężenie substratu została uzupełniona w szóstym dniu hodowli komórkowej w celu podniesienia stężenia zewnątrzkomórkowego substratu.

Jak pokazują przeszczepy, proporcje progów każdego dnia wykazują wyraźną reakcję na karmienie. Odwracając trend, obserwowali sytuację aż do szóstego dnia. Na przykład w kulturach karmionych glukozą stężenie glukozy zewnątrzkomórkowej wzrosło z powrotem do 36 milimolów.

Podczas gdy w kulturach karmionych glutaminą stężenie glutaminy wzrosło do czterech milimolów. W eksperymencie z glukozą stosunek progów dla linii komórkowej wybranej przez fibki glukozy zmniejszył się w siódmym dniu w odpowiedzi na dodanie glukozy. Ponieważ fibs glukozy podąża za APO w konfiguracji.

Podobnie, w eksperymencie z glutaminą, stosunek progów dla wybranej linii komórkowej glutaminy zwiększył się w odpowiedzi na dodanie glutaminy zgodnie z zasadą czujników wyłączania APO. Te pomiary progów zostały ostatecznie wykorzystane do obliczenia odpowiednich wewnątrzkomórkowych stężeń glukozy i glutaminy w oparciu o wyżej wymienione krzywe kalibracyjne. Są one porównywane z rzeczywistymi wewnątrzkomórkowymi stężeniami tych substratów, określonymi za pomocą testów enzymatycznych glukozy i glutaminy, i wykazują odpowiednią zgodność po jego opracowaniu.

Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się tą dziedziną do zbadania wpływu różnych preparatów pożywek na produktywność białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać genetycznie kodowanych bioczujników do monitorowania wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów.