Name: Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Naucz się transferu zarodka macicowo-jajowodowego w modelu mysim, wykorzystującego połączenie maciczno-jajowodowe do zapobiegania odpływowi zarodków. Ta technika pozwala ocenić przeżywalność zarodków przedimplantacyjnych na podstawie liczby urodzonych młodych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez fundusze z Departamentu Nauk o Zwierzętach i Ptakach dla BT.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt w Beltsville (BAACUC 11-015) zgodnie z wytycznymi USDA dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich używania.
1. Znieczulenie i analgezja (wspólne dla obu zabiegów chirurgicznych)
<ol>
	<li>Zważyć mysz i umieścić następujące środki znieczulające i przeciwbólowe w dwóch strzykawkach o pojemności 1 ml z igłami 27 G:
	<ol>
		<li>Ketamina (0,1 mg/g: 0,01 ml/g roztworu 10 mg/ml) i ksylazyna (0,01 mg/g: 0,005 ml/g roztworu 2 mg/ml).</li>
		<li>Buprenorfina (0,1 μg/g: 0,01 ml roztworu 0,01 mg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchom mysz, podnosząc kark jak najbliżej szczęk kciukiem i palcem wskazującym oraz trzymając ogon między małym i serdecznym palcem.</li>
	<li>Mieszaninę ketaminy i ksylazyny wstrzyknąć dootrzewnowo. Aby uniknąć przebicia narządów wewnętrznych, trzymaj mysz tak, aby jej głowa znajdowała się nieco poniżej poziomu bioder (Rysunek 1A)</li>
	<li>Wstrzyknąć buprenorfinę podskórnie w kark szyi, trzymając między kciukiem a palcem wskazującym (ryc. 1B).</li>
	<li>Pozostaw mysz w klatce (czystej i bez żadnego innego zwierzęcia) na ciepłym scenie.</li>
	<li>Po utracie przytomności sprawdź, czy nie ma odruchu tylnej stopy (sprawdzanego przez uszczypnięcie palca). Nałożyć maść do oczu, aby uniknąć suchości oka i sprawdzić, czy nie ma odruchu powiekowego (ryc. 1C).</li>
	<li>Protokół ten zapewnia znieczulenie chirurgiczne przez minimum 30 minut, co wystarcza do wykonania procedur opisanych poniżej (Protokoły 2 i 3). Jeśli wymagane są dłuższe czasy, po 30 minutach można zastosować dodatkowe wstrzyknięcie ketaminy + ksylazyny w połowie dawki opisanej w ppkt 1.1.1. Zmiana wzorca oddychania na szybszy i nieregularny świadczy o utracie właściwej płaszczyzny znieczulenia.</li>
</ol>
2. Wazektomia
<ol>
	<li>Użyj samca o sprawdzonej wydajności godowej.</li>
	<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, oczyść powierzchnie, na których zostanie wykonana operacja i przetrzyj je 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj znieczulenie zgodnie z wcześniejszymi szczegółami (Protokół 1), sprawdzając, czy nie ma utraty odruchów.</li>
	<li>Umieść mysz na ciepłym scenie, usuń sierść za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia z obszaru brzusznego między dwiema wyimaginowanymi liniami poprzecznymi umieszczonymi 0,5 cm i 2,5 cm nad penisem (ryc. 2A).</li>
	<li>Zdezynfekuj ogolony obszar, przecierając go sekwencyjnie 10% jodonem powidonu i 70% etanolem.</li>
	<li>Ułóż mysz w pozycji leżącej ogonem w kierunku chirurga i przykryj sterylnym ręcznikiem z otworem odsłaniającym ogolony obszar. Oświetl obszar operacyjny.</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości 10-15 mm w linii przyśrodkowej brzucha, około 1 cm powyżej penisa. Przytrzymaj skórę ząbkowanymi kleszczami opatrunkowymi, a następnie przetnij nożyczkami (ryc. 2A i 2B).</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie o długości 5-10 mm w kresie białej. Przytrzymaj mięsień za pomocą ząbkowanych kleszczyków do mikropreparowania i przetnij nożyczkami (ryc. 2C).</li>
	<li>Chwyć poduszkę tłuszczową jąder z jednej strony za pomocą mikro ząbkowanych kleszczy preparujących i pociągnij go, aby odsłonić jądra, nasieniowody i najądrza. Nasienica nasieniowa znajduje się przyśrodkowo do jądra i jest wyraźnie odróżnialną wolną rurką (nie przyczepioną do ściany jądra jak najądrza) z naczyniem krwionośnym biegnącym wzdłuż jednej strony (ryc. 2D).</li>
	<li>Trzymając nasieniowody za pomocą mikro ząbkowanych kleszczy preparujących, opatruj go płomieniem, aż zmienią kolor na czerwony (ryc. 2E), a następnie użyj ich do przecięcia i kauteryzacji nasieniowodów w dwóch punktach jednocześnie (ryc. 2F). Nacięcie powinno usunąć część około 5 mm i pozostawić dwa wyraźnie oddzielone kauteryzowane końce (ryc. 2G).</li>
	<li>Przenieś jądro, najądrze i nasieniowody z powrotem do jamy brzusznej.</li>
	<li>Przejdź od kroku 9 w drugim jądrze.</li>
	<li>Zszyj mięsień jednym lub dwoma poziomymi szwami materaca wykonanymi z wchłanialnego szwu 5/0 (ryc. 2H).</li>
	<li>Zszyj skórę jednym lub dwoma obcinaczami do ran (ryc. 2I).</li>
	<li>Zidentyfikuj samca poddanego wazektomii (kolczyk w uchu, tatuaż na palcu...), przesuń go w klatce umieszczonej na ciepłym etapie i obserwuj, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu (przytomny i utrzymuj leżącą mostek). Podskórne wstrzyknięcie 0,5-1 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej poprawia regenerację. Zapisz możliwe przypadki wystąpienia podczas transferu wazektomii, dodaj antybiotyk do wody pitnej.</li>
	<li>Klipsy do ran można usunąć 10 dni po wazektomii za pomocą narzędzia do usuwania ran, obcinacza lub kleszczy do zębów. Samiec poddany wazektomii będzie gotowy do krycia 2 tygodnie po zabiegu.</li>
	<li>Przetestuj niepłodność samca poddanego wazektomii, kryjąc się z płodnymi samicami przed użyciem go w celu uzyskania biorców.</li>
</ol>
3. Transfer zarodków macicowo-jajowodowych
<ol>
	<li>Mysie morule lub blastocysty mogą być przenoszone tą techniką do kobiety biorczyni w ciąży rzekomej w temperaturze 2,5 dpc.</li>
	<li>Przygotuj szklaną pipetę do manipulacji zarodkami:
	<ol>
		<li>Wypoleruj końcówki szklanych kapilarn, aby uniknąć uszkodzenia uchwytu na pipety.</li>
		<li>Zmiękcz środkową część szklanej kapilary, ogrzewając drobnym płomieniem, jednocześnie lekko obracając kapilarnę obiema rękami synchronicznie. Gdy odcinek kapilarny stanie się miękki i plastyczny (jasnoczerwony kolor), należy go szybko wycofać z płomienia i pociągnąć oba końce, aby zawęzić jego średnicę zewnętrzną do 130-150 μm.</li>
		<li>Poczekaj, aż szkło ostygnie, a następnie przytnij je, lekko nacinając wąską część ołówkiem diamentowym, kamieniem ściernym lub pilnikiem do paznokci i ciągnąc z obu stron. Przerwa powinna być czysta i prostopadła</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypoleruj końcówkę, bardzo szybko paląc, pozostawiając otwór 100-130 μm. Pipety można przechowywać do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Ciepłe podłoża do manipulacji zarodkami (CZBH lub M2, patrz dyskusja).</li>
	<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, oczyść powierzchnie, na których zostanie wykonana operacja i przetrzyj je 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj znieczulenie zgodnie z wcześniejszymi szczegółami (Protokół 1), sprawdzając, czy nie ma utraty odruchów.</li>
	<li>Trzymając mysz w ciepłym scenie, usuń sierść za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia z obszaru grzbietowego między kolanami a dystalnymi żebrami (ryc. 3A i 3B).</li>
	<li>Zdezynfekuj ogolony obszar, przecierając go sekwencyjnie 10% jodonem powidonu i 70% etanolem.</li>
	<li>Przenieść zarodki z inkubatora do wstępnie podgrzanej pożywki do manipulacji zarodkami.</li>
	<li>Przenieś biorcę do ciepłego etapu pod mikroskopem stereoskopowym i umieść go w pozycji leżącej bokiem do chirurga (z głową skierowaną w prawą lub lewą stronę chirurga).</li>
	<li>Przykryj obszar sterylnym ręcznikiem z otworem odsłaniającym ogolony obszar i oświetl obszar operacyjny.</li>
	<li>Wykonaj 1 cm poprzeczne (pionowe) nacięcie skóry w miejscu znajdującym się na 1/3 linii czaszki między ostatnim żebrem a biodrami oraz na grzbietowej 1/3 linii między plecami a brzuchem (ryc. 3A i 3B). Przytrzymaj skórę za pomocą ząbkowanych kleszczyków opatrunkowych i przetnij nożyczkami (ryc. 3C).</li>
	<li>Po przecięciu skóry jajnik (czerwony/pomarańczowy) lub poduszeczka tłuszczowa otaczająca jajnik (biała) mogą być uwidocznione przez ścianę ciała. Wykonaj 0,3-0,5 cm poprzeczne (pionowe) nacięcie w ścianie ciała nad jajnikiem lub poduszeczką tłuszczową w miejscu, w którym nacięcie nie przecina żadnego dużego naczynia krwionośnego. Przytrzymaj mięsień za pomocą mikro ząbkowanych kleszczy preparacyjnych i przetnij nożyczkami (ryc. 3D).</li>
	<li>Przesuń mysz tak, aby jej głowa była skierowana w stronę chirurga.</li>
	<li>Załadować pipetę do manipulacji zarodkami (ryc. 3E):
	<ol>
		<li>Pozwolić, aby pożywka CZBH wznosiła się kapilarnie przez wąską część pipety manipulacyjnej do około 5 mm szerszej części.</li>
		<li>Weź mały pęcherzyk powietrza (0,2-0,5 mm).</li>
		<li>Wprowadzić zarodki (5-10) w minimalnej ilości pożywki (2-4 mm).</li>
		<li>Weź kolejny mały pęcherzyk powietrza (0,2-0,5 mm) i niewielką ilość pożywki (0,5-1 mm).</li>
		<li>Pozostaw szklaną pipetę przymocowaną do uchwytu aspiratora do ust lub do urządzenia obsługiwanego ręcznie, gotową do wykonania kroku 3.17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chwyć poduszkę tłuszczową otaczającą jajnik za pomocą mikro ząbkowanych kleszczyków preparacyjnych i pociągnij ją w kierunku głowy myszy, aby odsłonić jajnik, jajowód i niewielką część górnej macicy z jamy brzusznej (ryc. 3F i 3G).</li>
	<li>Trzymając w ustach ustnik aspiratora, gotowy do użycia, chwyć poduszkę tłuszczową za pomocą ząbkowanych kleszczyków do mikropreparowania, aby przesunąć jajowód i odsłonić połączenie maciczowo-jajowodowe (tj. w miejscu, w którym jajowód styka się z macicą).</li>
	<li>Utrzymując połączenie maciczowo-jajowodowe w miejscu, weź lekko zakrzywione kleszcze do mikropreparowania lewą ręką (jeśli jesteś praworęczny) i umieść je tuż poniżej połączenia maciczno-jajowodowego, chwytając jajowód około 2 mm powyżej tej części.</li>
	<li>Trzymając połączenie maciczowo-jajowodowe lekko zakrzywionymi kleszczami do mikropreparacji, nakłuj odcinek jajowodu blisko kleszczy igłą 27 G (ryc. 3H).</li>
	<li>Wprowadzić pipetę do manipulacji zarodkami do otworu wykonanego za pomocą igły i przejść do macicy przez połączenie macicowo-jajowodowe (ryc. 3I i 3J). Gdy pipeta przejdzie przez połączenie maciczowo-jajowodowe (ryc. 3K), łatwo się przesuwa. Nie należy wchodzić zbyt głęboko w głąb macicy, aby zapobiec uszkodzeniu endometrium (nie więcej niż 3 mm) i zablokowaniu pipety przez zanieczyszczenia.</li>
	<li>Uwolnij zarodki do macicy, delikatnie (ryc. 3L). Oba pęcherzyki powietrza muszą przejść przez macicę. Część pożywki znajdującej się powyżej pierwszego pęcherzyka może również zostać uwolniona do macicy, ale należy unikać wprowadzania większej ilości powietrza, ponieważ może to utrudnić zagnieżdżenie się.</li>
	<li>Wyjmuje pipetę zaraz po uwolnieniu zarodków do macicy.</li>
	<li>Przesuń jajowód i jajnik z powrotem do jamy brzusznej, chwytając za poduszkę tłuszczową.</li>
	<li>Zszyj mięsień poziomym ściegiem materacowym z wchłanialnym szwem 5/0 (ryc. 3M).</li>
	<li>Zszyj skórę maszynką do strzyżenia ran (ryc. 3N).</li>
	<li>W razie potrzeby przejdź od kroku 10 po drugiej stronie.</li>
	<li>Zidentyfikuj biorcę (kolczyk w uchu, tatuaż na palcu...), przenieś go do klatki (umieszczonej na ciepłym etapie) i obserwuj, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu (przytomny i utrzymuj leżącą mostek).</li>
	<li>Opisz możliwe przypadki wystąpienia podczas transferu zarodków i dodaj antybiotyk do wody pitnej. Podskórne wstrzyknięcie 0,5-1 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej poprawia regenerację.</li>
	<li>Klipsy do ran można usunąć 10 dni po transferze zarodków za pomocą narzędzia do usuwania obcinania ran lub dwóch par kleszczy (ryc. 3O). Biorca może zostać zważony w tym dniu w celu oceny ciąży i oszacowania liczby młodych. Materiał do wylęgu należy dostarczyć biorcy 15 dni po transferze zarodków.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effect+of+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+with+serum+on+mRNA+expression+of+imprinting+genes%2C+development%2C+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).</li>
<li>Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucose+concentration+during+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+on+development+to+blastocyst%2C+success+of+embryo+transfer%2C+and+litter+sex+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio.</a> 79, 329-336 (2012).</li>
<li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+isolated+blastomers+of+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs.</a> Nature. 184, 1286-1287 (1959).</li>
<li>Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+mouse+eggs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilization of mouse eggs in vitro.</a> Nature. 220, 592-593 (1968).</li>
<li>McLaren, A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+development+and+birth+of+mice+cultivated+in+vitro+as+early+as+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos.</a> Nature. 182, 877-878 (1958).</li>
<li>McLaren, A., Michie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transfer+of+fertilized+mouse+eggs+to+uterine+foster-mothers.+I.+Factors+affecting+the+implantation+and+survival+of+native+and+transferred+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs.</a> J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).</li>
<li>Goto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+embryos+transferred+into+the+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assist.+Reprod.+Gen%22%5BJournal%5D)">The fate of embryos transferred into the uterus.</a> J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Chin, H. J., Wang, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utero-tubal+transfer+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Utero-tubal transfer of mouse embryos.</a> Genesis. 30, 77-81 (2001).</li>
<li>Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stem+cell+activation%2C+culture+media+of+manipulated+embryos%2C+and+site+of+embryo+transfer+in+the+production+of+F0+embryonic+stem+cell+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice.</a> Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).</li>
<li>Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+abdominal+and+scrotal+approach+methods+of+vasectomy+and+the+influence+of+analgesic+treatment+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice.</a> Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlecknell%2C+PA+%22Laboratory+Animal+Anaesthesia%22">Laboratory Animal Anaesthesia</a>. , Academic Press. Oxford, UK. (2009).</li>
<li>Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+with+various+anesthetics+in+mice+%28pentobarbitone+ketamine-xylazine%2Ccarfentanyl-etomidate%29%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate).</a> Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).</li>
<li>Tarin, D., Sturdee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anaesthesia+of+mice%3A+evaluation+of+tribromo-ethanol%2C+ether%2C+halothane+and+methoxyflurane+and+development+of+a+reliable+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique.</a> Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).</li>
<li>Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+tribromoethanol+as+used+in+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice.</a> Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).</li>
<li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+stored+and+newly+prepared+tribromoethanol+in+ICR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).</li>
<li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+preparation+methods+and+storage+conditions+of+tribromoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).</li>
<li>Meyer, R. E., Fish, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+tribromoethanol+anesthesia+for+production+of+genetically+engineered+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats.</a> Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).</li>
<li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).</li>
<li>Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+hamster+oocytes+to+assay+the+fertilizing+capacity+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa.</a> J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).</li>
<li>Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+development+of+mice+morulae+after+storage+in+non-frozen+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Wazektomia jest stosunkowo prostą techniką chirurgiczną, która nie wiąże się z poważnymi trudnościami. Podczas odkażania jodonem powidonu i etanolem należy upewnić się, że ostatnie mycie (etanolem) usuwa jod powidonu, ponieważ może on podrażniać otrzewną. Dostęp do nasieniowodów można również uzyskać przez mosznę lub wykonując poprzeczne nacięcie w jamie brzusznej8. Nacięcie moszny jest zalecane do poprzecznego nacięcia brzucha ze względu na stosunkowo mniejsze nacięcie i nieco lepsze zachowanie poope...

Transfer zarodków jest prawdopodobnie najczęstszym zabiegiem chirurgicznym wykonywanym w modelu mysim. Technika ta jest niezbędna do uzyskania potomstwa z zarodków poddanych technikom manipulacji in vitro, a zatem stanowi niezbędny krok do opracowania modeli modyfikowanych genetycznie poprzez wstrzyknięcie projądra, transdukcję lentiwirusową lub tworzenie chimer. Poza tym technika ta pozwala na badanie skutków rozwojowych różnych urazów występujących w trakcie rozwoju preimplantacyjnego. Stosowanie technik sztucznegorozrodu1 lub narażenie na nieprawidłowe stężenia różnych substancji lub metabolitów2 może wpływać na rozwój zarodka, powodując niepowodzenie implantacji lub łożyska oraz długoterminowe skutki dla potomstwa. Wiarygodna i powtarzalna technika transferu zarodków ma kluczowe znaczenie dla spójnego testowania ewentualnych negatywnych skutków eksperymentalnego leczenia na implantację i rozwój płodu.
Mysie zarodki preimplantacyjne mogą być przenoszone do samicy biorczyni albo do jajowodu przez bańki 0,5 dnia po stosunku (DPC) biorczyń pseudociężarnych (transfer jajowodów)3,4, albo do macicy biorczyni rzekomej ciąży 2,5 DPC (transfer macicy)5,6, w zależności od ich etapu rozwoju. Zarodki w stadium blastocysty, takie jak te używane do generowania chimerycznych myszy poprzez wstrzyknięcie embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, są zwykle przenoszone przez transfer macicy. Blastocysty mogą być również przenoszone do jajowodu biorcy 0,5 dpc, ale stanowi to mniej fizjologiczne badanie dla zaburzających rozwój, ponieważ zarodek przechodzi diapauzę i ma 2 dni na powrót do zdrowia po zniewadze, zanim dojdzie do implantacji. Transfer macicy polega na nakłuciu ściany macicy wąską igłą w celu wytworzenia otworu umożliwiającego dostęp pipety do manipulacji zarodkami do światła macicy. Chociaż technika ta może przynieść dobre wyniki, czas donoszenia ciąży (tj. odsetek przenoszonych zarodków, które rozwijają się u młodych) jest często niski i nieprzewidywalny7,8.
Nakłucie ściany macicy pociąga za sobą pewne szkodliwe skutki uboczne. Po pierwsze, mięśniówka macicy jest tkanką silnie unaczynioną, a jej nakłucie często skutkuje niewielkim krwotokiem. Krew może zablokować pipetę do transferu zarodków lub zaatakować światło macicy, powodując śmierć zarodka i/lub niepowodzenie implantacji. Jest to szczególnie istotne, gdy przenoszone są zarodki bez zone, ponieważ komórki krwi i szczątki mogą przyczepiać się do blastomerów. Po drugie, wykonany otwór nie uszczelnia się po przeniesieniu zarodków, więc mogą one przepłynąć z powrotem przez otwór i zostać wydalone do jamy brzusznej, gdy do macicy zostanie wprowadzona zbyt duża objętość. Opisany w niniejszym dokumencie transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie maciczkowo-jajowodowe w celu dostarczenia zarodków do macicy bez konieczności nakłuwania ściany macicy, a tym samym uniknięcia jego niekorzystnych konsekwencji9.
Pseudociężarne biorczynie używane do transferu zarodków są uzyskiwane przez naturalne krycie z samcami po wazektomii8. Wydzieliny nasienne wytwarzane przez bezpłodnego samca są niezbędne, aby macica stała się otwarta na przenoszone zarodki. Aby uzyskać biorcę, po południu umieszcza się maksymalnie 2 samice w wieku od 8 tygodni do 6 miesięcy z samcem poddanym wazektomii. Następnego ranka samice są sprawdzane pod kątem obecności czopa kopulacyjnego pochwy, grudki skrzepłych białek z męskiego płynu nasiennego. Ponieważ krycie odbywa się zwykle o północy, za dzień wykrycia czopa dopochwowego uważa się 0,5 dpc. Chociaż mężczyzn po wazektomii można kupić u niektórych sprzedawców, opisana tutaj procedura chirurgiczna jest stosunkowo łatwa i nie wymaga żadnych dodatkowych narzędzi niż wymagane do transferu zarodków.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>VEDCO</td><td>Ketaved ANADA 200-257</td><td>Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>Anased NADA #139-236</td><td>Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Generyczna</td><td>NDC 400-42-010-01</td><td>Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Maść do oczu:</td><td>Novartis</td><td>Genteal</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Pfizer</td><td>Clavamox NADA #55-101.</td><td>Dodany do wody pitnej (0,3 mg/ml trójwodnej amoksycyliny i 0,075 mg/ml klawulanianu potasu). Dodać 1,5 ml odtworzonej butelki o pojemności 15 ml do 250 ml wody.</td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe ząbkowane</td><td>ROBOZ</td><td>RS-8120</td><td>Sprawdzi się każde średniej wielkości proste kleszcze ze stali chirurgicznej.</td></tr><tr><td>Kleszczyki ząbkowane do mikropreparacji</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>Te są zakrzywione pod kątem 90&ordm;. W razie potrzeby można użyć kleszczy prostych.</td></tr><tr><td>Lekko zakrzywione kleszczyki do mikro rozwarstwiania</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>Ten model jest szczególnie przydatny do trzymania jajowodu.</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Sprawdzi się każde zwykłe małe proste nożyczki ze stali chirurgicznej.</td></tr><tr><td>Igły 27 G</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>305136</td><td>Można również użyć mniejszych igieł (30 G). 25 G może być trochę za duże.</td></tr><tr><td>Aplikator do klipsów</td><td>MiKRon</td><td>42763</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Klipsy</td><td>MiKRon</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do klipsów</td><td>MiKRon</td><td>7637</td><td>Zamiast tego można użyć dwóch par kleszczyków do zębów (ROBOZ RS-8160).</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę do szwów</td><td>ROBOZ</td><td>RS-7820</td><td></td></tr><tr><td>Dowist do szwów</td><td>Gell</td><td>5-0 Dexon S 7204-21</td><td>Można zastąpić dowolnym wchłanialnym szwem od 4-0 do 6-0 z wąską zakrzywioną igłą.</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Pipety kalibrowane VWR</td><td>100 ul 53432-921</td><td>Zawiera system aspiratora doustnego, który wymaga jedynie dołączenia 0,22 i #181; m filtr w wężyku, aby był gotowy do użycia. Więcej informacji można uzyskać w Nagy et al.8</td></tr><tr><td>Palnik</td><td>KISAG AG</td><td>Typ 2002</td><td>Palnik gazowy, może być ładowany za pomocą Kigas (CH-4512, od tego samego dostawcy). Można również stosować palniki alkoholowe, ale gaz zapewnia wyższą temperaturę, a ten palnik zapewnia mały i precyzyjny płomień.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Jest to drogi estereomikroskop z fluorescencją, który może być również używany do innych celów. Istnieją tańsze opcje, takie jak Leica MZ8 lub Nikon SMZ-10 lub SMZ-2B, żeby wymienić tylko kilka. Lepiej jest użyć dwóch mikroskopów stereoskopowych, jednego do pracy z zarodkami (który nie musi być bardzo ładny), a drugiego dla biorcy. Ten, który jest używany dla biorcy, powinien wyświetlać dużą odległość od płytki stolika do soczewki obiektywu, aby móc ustawić ostrość 3-4 cm nad płytką stolika (gdzie zostanie umieszczony jajowód) i nadal pozostawić trochę miejsca dla chirurga; Większość mikroskopów stereoskopowych może to zrobić, ale niektóre nie.</td></tr><tr><td>Oświetlenie światłowodowe</td><td>Dolan Jenner</td><td>Fiber lite</td><td>Do oświetlania obszaru operacyjnego. Dostępne są różne systemy.</td></tr><tr><td>Ciepłe etapy</td><td>amerykański scope</td><td><a href="https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx? C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.& URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html" target="_blank">http://store.amscope.com/tcs-100.html</a></td><td>Mogą być umieszczone nad płytką sceniczną stereomikroskopu. Pewne modyfikacje (włożenie drążka w celu wypoziomowania stolika) mogą być konieczne, jeśli jest on za krótki dla mikroskopu stereoskopowego. Do ogrzania klatki można użyć dużego ciepłego etapu, jeśli jest dostępny. Jeśli nie, można użyć zwykłej poduszki grzewczej, ale należy sprawdzić temperaturę.</td></tr><tr><td>Do manipulacji zarodkami</td> można również użyć szalek <td>hodowlanych Falcon</td><td>353001</td><td>351008, które wytwarzały węższe krople.</td></tr></tbody></table>

transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

Transfer embrionów preimplantacyjnych do surogatki jest niezbędnym krokiem do produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy lub do zbadania wpływu zmian epigenetycznych powstałych podczas rozwoju preimplantacyjnego na późniejszy rozwój płodu i zdrowie dorosłych. Zastosowanie skutecznej i spójnej techniki transferu zarodków ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia produkcji genetycznie zmodyfikowanych zwierząt oraz określenia wpływu różnych metod leczenia na wskaźniki implantacji i przeżycie do terminu. Zarodki w stadium blastocysty są zwykle przenoszone przez transfer macicy, wykonując nakłucie ściany macicy w celu wprowadzenia pipety do manipulacji zarodkami. Otwór wykonany w macicy nie zamyka się po wyjęciu pipety, a zarodki mogą odpływać do jamy brzusznej z powodu dodatniego ciśnienia macicy. Nakłucie może również spowodować krwotok, który upośledza implantację, blokuje pipetę transferową i może wpływać na rozwój zarodka, zwłaszcza gdy przenoszone są zarodki bez zoni. W związku z tym technika ta często skutkuje bardzo zmiennymi i ogólnie niskimi wskaźnikami przeżywalności zarodków. Aby uniknąć tych negatywnych skutków, transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako naturalną barierę, która utrudnia odpływ zarodków i pozwala uniknąć przebicia ściany macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są wymagani do uzyskania biorców pseudociąży. Technika wykonywania wazektomii jest opisywana jako uzupełnienie transferu zarodków macicowo-jajowodowych.

Przeszczep zarodków drogą maciczno-jajowodową umożliwia transfer zarodków do macicy, pozwalając uniknąć niektórych powikłań związanych z bezpośrednim transferem do macicy2,9,10. W Tabeli 1 przedstawiamy reprezentatywne wyniki uzyskane podczas przenoszenia blastocyst CD1 poddanych różnym rodzajom manipulacji do biorców CD1 zgodnie z opisanym protokołem. Przeżywalność do terminu (procent zarodków, z których rozwinęły się młode) lub przeżywalność do E15 (w przypadku ekspozycji na lentiwirusa) jes...

Transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako barierę zapobiegającą odpływowi zarodka, który może wystąpić podczas transferu macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są zobowiązani do pozyskania biorców pseudociężarnych do transferu zarodków. Omówiono obie techniki.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transfer embrionów przedimplantacyjnych do macicy biorcy w stanie pseudociąży w 2,5 DPC. Osiąga się to poprzez uprzednie odsłonięcie jajnika, ujścia trąbki jajowodowej (UCT) oraz pierwszego odcinka macicy. Następnie za pomocą igły nakłuwa się UCT.Następnie przez otwór wprowadza się szklaną pipetę kapilarną, przesuwając ją w głąb światła macicy. Na koniec embriony są uwalniane do macicy. Ostatecznie liczba urodzonych młodych służy do wykazania przeżywalności przeniesionych embrionów przedimplantacyjnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodą taką jak transfer zarodków do macicy jest brak konieczności nakłuwania ściany macicy, co pozwala uniknąć krwawienia i wypłynięcia zarodka. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitety ds. opieki i wykorzystania zwierząt w obszarze Beltsville, zgodnie z wytycznymi USDA dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt. Po podaniu znieczulenia i leków przeciwbólowych samcowi myszy o potwierdzonych zdolnościach kopulacyjnych oraz upewnieniu się, że zwierzę jest odpowiednio uspokojone, umieść mysz na ogrzewanym stole i za pomocą strzygarki elektrycznej usuń futro z obszaru brz

utero-tubal-embryo-transfer-and-vasectomy-in-the-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczepienie zarodków maciczo-jajowodowe i wazektomia na modelu myszym

Myszowy model transplantacji in utero jest wszechstronnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania potencjalnych zastosowań klinicznych transplantacji komórek macierzystych oraz terapii genowej u płodu. W niniejszym protokole przedstawiamy ogólne podejście do wykonania tej...

Model mysi transplantacji in utero

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Źródło: Lutz, D., et al. Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje transdukcję wirusa poprzez wstrzyknięcie do macicy w zarodkach myszy. Ciężarna mysz jest przygotowywana do operacji, a następnie wykonuje się nacięcie w linii środkowej w celu odsłonięcia rogów macicy. Mieszanina wirusa zawierającego pożądany gen i barwnika śledzącego jest wstrzykiwana do zarodków w...

Transdukcja wirusa w macicy u myszy

Opisujemy protokół przeprowadzania przeszczepu in utero (IUT) poprzez dożylne i dożylne drogi iniekcji w modelu mysim. Protokół ten może być stosowany do wprowadzania komórek, wektorów wirusowych i innych substancji do unikalnego środowiska płodu tolerancyjnego na odporność.

Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Różne modele zwierzęce wrodzonej przepukliny przeponowej i niedrożności tchawicy płodu prezentują zalety i wady dotyczące kwestii etycznych, kosztów, trudności chirurgicznych, rozmiaru, wskaźników przeżycia i dostępności narzędzi genetycznych. Model ten zapewnia nowe narzędzie do badania wpływu zarówno niedrożności tchawicy, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.

Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy

Ustanowienie ciąży to dynamiczny proces obejmujący skomplikowane przenikanie się zarodków i macicy. Dokładny wkład środowiska macicy matki w te procesy pozostaje aktywnym obszarem badań. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły, które mają pomóc w projektowaniu modeli zwierzęcych in vivo, aby odpowiedzieć na te pytania badawcze.

Metody badania wkładu macicy w powstanie ciąży w mysim modelu owariektomii

Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.

Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Tutaj prezentujemy protokół do ustanowienia mysiego modelu docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemnika (ICSI) i transferu zarodków (ET), co pozwala nam obserwować związane z wiekiem zmiany w metabolizmie glukozy, które mogą być przypisane ICSI, dostarczając wglądu w jego potencjalny długoterminowy wpływ na rozwój człowieka.

Monitorowanie stężenia glukozy we krwi u potomstwa myszy po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu plemnika

Naucz się transferu zarodka macicowo-jajowodowego w modelu mysim, wykorzystującego połączenie maciczno-jajowodowe do zapobiegania odpływowi zarodków. Ta technika pozwala ocenić przeżywalność zarodków przedimplantacyjnych na podstawie liczby urodzonych młodych.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów