Name: Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę testu uwrażliwienia cyklazy adenylowej w komórkach do przesiewowego badania małych cząsteczek i siRNA przy użyciu technologii HTRF oraz komórek kriokonserwowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Panu Richardowi Zinkowi i Toddowi Wiernickiemu za szkolenie metodologiczne i wskazówki dotyczące testów. Dziękujemy również Johnowi Paulowi Spence'owi za uważną lekturę i sugestie redakcyjne. Prace te były wspierane przez National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation oraz Eli Lilly and Company w ramach programu Lilly Research Award Program (LRAP).

1. Ekspansja i kriokonserwacja komórek gotowych do testów
<ol>
	<li>Hodowla komórek CHO-K1-DRD2L (CHO-D2L) na naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm2 w pożywce F12 Hama uzupełnionej 1,0 μM L-glutaminy, 800 μg/μl G418, 300 μg/μl higromycyny, 100 μg/μl penicyliny, 100 μg/μl streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 , aż komórki zlewają się w 90-95%. Przemyć komórki 10 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i zebrać komórki, dodając 3 μl buforu dysocjacji komórek na 5 minut w temperaturze 37 °C. Ponownie zawiesić komórki przy użyciu 12 μl pożywki hodowlanej i policzyć komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 μl pożywki do zamrażania (10% dimetylosulfotlenku, 90% FBS). Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek (np. 1-20 x 106 komórek/μl).</li>
	<li>Podwielokrotność 1,0 μl roztworu komórkowego do każdego kriowialu. Inkubować kriowiale w pojemniku do zamrażania komórek w temperaturze -80 °C przez noc. Przenieś kriowiale do zbiornika z płynnymN2 w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
2. Komórki gotowe do testu posiewu (i opcja odwrotnej transfekcji)
<ol>
	<li>Szybko rozmrozić zamrożony kriowial komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu komórek przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 μl zawierającej 9 μl Opti-MEM i wymieszaj, odwracając probówkę 3-5 razy.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 μl Opti-MEM.</li>
	<li>Policz komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego, aby określić żywotność komórek i w razie potrzeby rozcieńczyć żywe komórki (np. stężenie 3 x 105 komórek/μl) w Opti-MEM. Płytka 10 μl/basenik komórek w kulturze tkankowej na płytce 384-dołkowej poddanej działaniu pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Wykonaj seryjne rozcieńczenia cAMP w Opti-MEM, aby wygenerować standardową krzywą do oszacowania produkcji cAMP przez ogniwa (zgodnie z zaleceniami producenta - patrz rozdział 7). Dodać 10 μl/dołek wzorców cAMP do płytki. Uwaga: pojedynczą krzywą wzorcową można przygotować na oddzielnej płytce lub w studzienkach zerowych na jednej z płytek testowych.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 1 godzinę.</li>
</ol>
3. Opcja odwróconej transfekcji siRNA*
Ta sekcja jest opcjonalna i dotyczy rysunku 3.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór siRNA w wolnym od RNaz ddH2O (np. 0,4 pmol/μl). Dodać 5 μl do poszczególnych dołków na płytce 384-dołkowej i odwirować płytkę przy 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć Lipofectamine 2000 w Opti-MEM przez współczynnik 0,006 (np. dodać 6 μl Lipofectamine 2000 do 1 000 μl Opti-MEM) i mieszać pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować roztwór Lipofectamine 2000/Opti-MEM przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 5 μl rozcieńczonego roztworu Lipofectamine 2000/Opti-MEM do indywidualnych studzienek 384-dołkowej płytki, która zawiera już siRNA. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Komórki gotowe do przeprowadzenia testu na płytce, jak opisano powyżej (sekcja 2). Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Włożyć płytkę testową do nawilżonego inkubatora w temperaturze 37 °C (5% CO2) przez 48-96 godzin, zgodnie z ustaleniami dla docelowego knock down genu (patrz dyskusja).</li>
</ol>
4. Badania przesiewowe małych cząsteczek
<ol>
	<li>Rozcieńczyć interesujący Cię lek (np. inhibitory małocząsteczkowe) w Opti-MEM do 6-krotności pożądanych stężeń końcowych. Seryjne rozcieńczenia można wykonywać za pomocą pipet ręcznych lub stacji obsługi cieczy.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl/basenik badanego związku lub nośnika zawierającego bufor (np. DMSO) na bok studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej (inkubacja jest opcjonalna).</li>
</ol>
5. Leczenie uporczywym agonistą
<ol>
	<li>Przygotować roztwór chinpirolu o stężeniu 600 nM (tj. 6-krotność pożądanego stężenia końcowego wynoszącego 100 nM) w Opti-MEM.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl/studzienkę roztworu kwinpirolu o stężeniu 600 nM na bok studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 przez 2 godziny.</li>
</ol>
6. Stymulacja akumulacji cAMP
<ol>
	<li>Podczas 2-godzinnej inkubacji przygotuj roztwór stymulacyjny w Opti-MEM. Roztwór stymulacyjny składa się z 40 μM forskoliny, 2 μM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i 4 μM spiperonu (wszystkie stężenia w kroku 6 są 4x większe od pożądanego stężenia końcowego).</li>
	<li>Dodać 5 μl/studzienkę roztworu stymulującego na bok studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
</ol>
7. Wygaszanie i szacowanie akumulacji cAMP
<ol>
	<li>Produkcja cAMP przez ogniwa jest mierzona za pomocą zestawu cAMP dynamic 2 zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, rozpuść anty-cAMP-cryptate i cAMP-d2 w wodzie destylowanej. Zamrażać podwielokrotności w temperaturze -20 °C w celu krótkotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Rozcieńczyć oddzielnie jedną podwielokrotność anty-cAMP-krystatu i jedną podwielokrotność cAMP-d2 w buforze do lizy zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi sporządzania roztworów roboczych.</li>
	<li>Dodać 10 μl/basenik roztworu roboczego anty-cAMP-cryptate i 10 μl/basenik roztworu roboczego cAMP-d2 do płytki 384-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odczytaj płytkę w czytniku płytek fluorescencyjnych (automatyczne ustawienie skali czułości) przy wzbudzeniu 337 nm i zmierz emisje przy 620 nm i 665 nm zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Zastosuj analizę ratiometryczną, aby ocenić standardową krzywą cAMP zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając z otrzymanych wartości, ekstrapoluj szacowaną akumulację cAMP w studzienkach testowych za pomocą oprogramowania do analizy danych.</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha%28i%2Fo%29-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li>
<li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids%3A+tolerance%2C+withdrawal+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li>
<li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens%2Fstriatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li>
<li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m-Opioid+receptor+desensitization+by+%CE%B2-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li>
<li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms%3A+insights+from+knockout+and+overexpression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+type+5+%28AC5%29+is+an+essential+mediator+of+morphine+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li>
<li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets%3A+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Interv%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6%3A+A+progress+report%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li>
<li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%5BTitle%5D)+AND+%22Adenylyl+cyclase+isoform-specific+signaling+of+GPCRs.+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Structure%2C+Signaling%2C+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).</li>
<li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li>
<li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li>
<li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li>
<li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li>
<li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li>
<li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas%3A+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li>
<li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D%282%29+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).</li>
<li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+%28CAD%29-D2L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).</li>
<li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot%3A+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li>
<li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li>
<li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li>
<li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+dopamine+D2+receptor%2Fbeta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li>
<li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening%3A+a+paradigm+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg.+Focus%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Geneti%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li>
<li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22genome-to-lead%22+approach+for+insecticide+discovery%3A+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D%281%29-like+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Starając się ułatwić badania nad uczuleniem heterologicznym, znacznie zmodyfikowaliśmy naszą poprzednią metodę, uzyskując uproszczony format "mieszaj i czytaj", który można dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badania mechanizmu działania. Główne modyfikacje naszego protokołu można podsumować w następujący sposób: 1) zastosowanie komórek kriokonserwowanych jako odczynników "gotowych do testu"; 2) miniaturyzacja testu do formatu 384-dołkowego; oraz 3) wykorzystanie pomiaru cAMP za pomocą HTRF.
<p cl...

Adaptacyjna odpowiedź sygnalizacyjna cyklazy adenylowej (AC) znana jako heterologiczna lub super-uczulenie została po raz pierwszy odkryta w laboratorium laureata Nagrody Nobla, dr Marshalla Nirenberga. Dr Nirenberg zaproponował, że obserwowana zwiększona reakcja AC po przewlekłej aktywacji receptora opioidowego δ była mechanizmem związanym z tolerancją i uzależnieniem od opiatów1. Oprócz przewlekłej aktywacji receptora opioidowego δ, ta neuroadaptacyjna odpowiedź sygnalizacji AC występuje również po trwałej aktywacji kilku innych receptorów sprzężonych z Gαi/o2. Warto zauważyć, że wiele z tych receptorów jest związanych z bólem, zaburzeniami neuropsychiatrycznymi i neurologicznymi i obejmują opioid μ/κ, dopaminę D2/4, 5HT1A i receptory muskarynoweM2/4 2. Oprócz odkryć dr Nirenberga, istnieje wiele dowodów łączących uwrażliwienie na sygnalizację AC z przewlekłą aktywacją receptorów opioidowych zarówno in vitro, jak i in vivo3-7. Uczulenie na AC jest również związane z różnymi chorobami obejmującymi receptory dopaminowe podobne doD2, w tym ze schizofrenią i chorobą Parkinsona (przegląd patrz odniesienie2). Pomimo potencjalnego znaczenia uczulenia, dokładny mechanizm (mechanizmy) związany z trwałą aktywacją receptora sprzężonego z Gαi/o, która prowadzi do zwiększonej odpowiedzi na prąd przemienny, pozostaje w dużej mierze nieznany.
Te badania dostarczają uzasadnienia do zbadania mechanizmów uwrażliwienia cyklazy adenylowej jako ważnego celu neurobiologicznego. Podobnie, należy również uznać fizjologiczne znaczenie sygnalizacji AC8 oraz znaczenie, jakie poszczególne izoformy AC odgrywają w tej odpowiedzi adaptacyjnej2,9,10. W kontekście naszych badań, ogólne cechy związane z heterologicznym uczuleniem rekombinowanych izoform AC są równoległe do cech opisanych dla badania endogennych izoform AC. W szczególności wcześniejsze badania wykazały, że aktywacja białek Gαi / o, a następnie uwalnianie / rearanżacja podjednostek βγ są ważnymi wymaganiami dla indukowanej receptorem uczulenia wszystkich izoform AC. Ponadto kilka badań sugeruje, że sygnalizacja z kinaz białkowych i podjednostek Gβγ jest zaangażowana w uczulenie2,11-13. Poszczególne AC wykazują również unikalne i wyraźne wzorce uczulania12. Na przykład utrzymująca się ekspozycja receptorów D2 na agonistów wiąże się z uczuleniem AC1 i AC8 na stymulację Ca2 + / kalmoduliną14,15, podczas gdy blisko spokrewniony AC3 nie jest uczulony2. AC2, AC4 i AC7 są blisko spokrewnione, jednak tylko stymulowana przez PKC aktywność AC2 jest silnie uwrażliwiona po długotrwałej ekspozycji receptorów D2 na agonistów7,14,16,17. Dodatkowo, AC5 i AC6 wykazują wyraźny stopień heterologicznego uczulenia na akumulację cAMP stymulowaną gazem i forskoliną po aktywacji receptorów D2 14,18-20, ale wydają się różnić pod względem wymagań dotyczących interakcji podjednostki Gβγ z AC21. Chociaż większość badań nad uczuleniem na prąd przemienny wykorzystywała modelowe linie komórkowe (np. komórki HEK293 wykazujące ekspresję poszczególnych izoform AC), wydaje się, że wyniki te przekładają się na natywne modele komórek neuronalnych4,22. Ostatnio efekty selektywnych inhibitorów małych cząsteczek izoform AC zidentyfikowanych w komórkach HEK293 eksprymujących izoformy AC można również przełożyć na badania behawioralne in vivo 23.
Brak zidentyfikowanego molekularnego mechanizmu heterologicznego uczulenia prawdopodobnie odzwierciedla złożoność odpowiedzi adaptacyjnej, jak również unikalne właściwości regulacyjne poszczególnych izoform AC12. Rozwikłanie takiej złożoności jest dodatkowo skomplikowane ze względu na zastosowanie uciążliwej metodologii, która ograniczyła badaczy akademickich w stosowaniu bezstronnych podejść. Na przykład nasze poprzednie badania mechanistyczne obejmowały wykorzystanie modeli komórkowych hodowanych w sposób ciągły przy użyciu 24- i 48-dołkowych kultur tkankowychw formacie 15. Hodowane komórki były zwykle hodowane przez 48 godzin, a następnie poddawane agonistycznemu leczeniu farmakologicznemu (2-18 godzin), po którym następowała seria płukania komórek i inkubacji (ryc. 1). Następnie zastosowano protokoły akumulacji cAMP specyficzne dla izoformy AC, a następnie dokonano pomiaru akumulacji cAMP przy użyciu pracochłonnej i czasochłonnej metodologii wiązania [3H]cAMP15,24. Czas trwania od początku do końca każdego testu wymagał na ogół od czterech do pięciu dni od posiewu komórek do analizy danych (ryc. 1). Zastosowanie nowych technologii i automatyzacji doprowadziło do znacznego ulepszenia badań nad uczuleniem w warunkach przemysłowych i ośrodków HTS. Na przykład grupa współpracująca z National Center for Chemical Genomics poinformowała o dwudniowej procedurze testu HTS w celu identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów μ uczulenia wywołanego receptorem opioidowym w formacie 1536-dołkowym25.
Niniejszy artykuł opisuje nasze wysiłki zmierzające do opracowania testu HTS do badań nad heterologicznym uczulenictwem przy użyciu technologii, które są dostępne w większości akademickich instytucji badawczych. Strategia ta została osiągnięta poprzez włączenie kriokonserwowanych komórek z modeli komórkowych heterologicznie eksprymujących receptor dopaminyD2 w połączeniu z endogennymi lub indywidualnymi rekombinowanymi izoformami cyklazy adenylowej (CHO-D2L lub HEK-AC6 / D2L). Aby poprawić naszą przepustowość, przeprojektowaliśmy nasz 48-dołkowy test uwrażliwiający (ok. >20 kroków w ciągu 4-5 dni) na pięcioetapowy, jednodniowy test w formacie 384-dołkowym, który był zasadniczo "wymieszaj i przeczytaj". Nowy format wykorzystuje dostępny na rynku test jednorodnej fluorescencji rozdzielczej w czasie (HTRF) do pomiaru akumulacji cAMP w nienaruszonych komórkach za pomocą wielomodowego czytnika płytek. Test jest solidny i podatny na badania przesiewowe małych cząsteczek i może być skutecznie stosowany do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów uczulenia heterologicznego. Ponadto dostarczamy dane, które pozwalają na zastosowanie tego testu z odwrotną transfekcją siRNA do celowanych lub obejmujących cały genom badań przesiewowych biblioteki siRNA z niewielkimi modyfikacjami podejścia ogólnego.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L komórki</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Szynka' s F12 media</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia 15 cm</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Bufor dysocjacji komórek</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>Fosforany buforowane solą fizjologiczną</td> Life <td>Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Kriowialne</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe płytki</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw HTRF cAMP Dynamic 2</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Quinpirole</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperone</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapine</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Haloperidol</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-)Sulpiride</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologie</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Woda, DNazy i RNazy wolne od bioleków</td><td>MP</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>niestandardowa kontrola siRNA</td><td></td></tr><tr><td>Nieukierunkowana kontrola siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i sirna

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Uwrażliowanie na sygnalizację cyklazy adenylowej (AC) jest związane z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi i neurologicznymi, w tym nadużywaniem substancji i chorobą Parkinsona. Ostra aktywacja receptorów sprzężonych z Gαi/o hamuje aktywność AC, podczas gdy trwała aktywacja tych receptorów powoduje heterologiczne uczulenie AC i zwiększony poziom wewnątrzkomórkowego cAMP. Wcześniejsze badania wykazały, że to zwiększenie odpowiedzi na prąd przemienny obserwuje się zarówno in vitro, jak i in vivo po przewlekłej aktywacji kilku typów receptorów sprzężonych z Gαi/o, w tym receptorówD2, dopaminy i μ receptorów opioidowych. Chociaż heterologiczne uczulenie na AC zostało po raz pierwszy zgłoszone cztery dekady temu, mechanizm (mechanizmy) leżący u podstaw tego zjawiska pozostaje w dużej mierze nieznany. Brak danych mechanistycznych prawdopodobnie odzwierciedla złożoność związaną z tą reakcją adaptacyjną, co sugeruje, że bezstronne podejścia mogą pomóc w identyfikacji szlaków molekularnych zaangażowanych w heterologiczne uczulenie AC. Wcześniejsze badania sugerowały, że kinaza i sygnalizacja Gbγ są nakładającymi się składnikami, które regulują heterologiczne uczulenie AC. Aby zidentyfikować unikalne i dodatkowe nakładające się cele związane z uczuleniem na prąd przemienny, konieczne jest opracowanie i walidacja skalowalnego testu uczulającego na prąd przemienny w celu uzyskania większej przepustowości. Poprzednie podejścia do badania uczulenia były na ogół kłopotliwe, obejmując ciągłe utrzymywanie hodowli komórkowych, a także złożoną metodologię pomiaru akumulacji cAMP, która obejmuje wiele etapów mycia. W związku z tym opracowanie solidnego testu opartego na komórkach, który może być wykorzystany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) w formacie 384 dołków, ułatwiłoby przyszłe badania. Korzystając z dwóch modeli komórkowych receptora dopaminy D2 (tj. CHO-D2L i HEK-AC6 / D2L), przekształciliśmy nasz 48-dołkowy test uczulający (>20 kroków 4-5 dni) w pięcioetapowy, jednodniowy test w formacie 384-dołkowym. Ten nowy format jest podatny na badania przesiewowe małych cząsteczek i wykazujemy, że ten projekt testu może być również łatwo wykorzystany do odwrotnej transfekcji siRNA w oczekiwaniu na ukierunkowane badania przesiewowe biblioteki siRNA.

Część I. Opracowanie heterologicznego testu sensybilizacji w formacie 384 dołków do identyfikacji inhibitorów małocząsteczkowych z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego modelu komórkowego.
Aby zbadać sensytyzację heterologiczną w modelu komórkowym, wprowadziliśmy szereg ulepszeń, które pozwoliły nam zoptymalizować analizę do formatu typu „wymieszaj i odczytaj” (mix and read). Poniżej wyróżniono kilka kluczowych modyfikacji, które zostały szczegółowo opisane w dyskusji. Pierwsz...

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie jednodniowego testu sensybilizacji cAMP w oparciu o komórki do zastosowań w wysokoprzepustowym przesiewaniu, w tym w badaniach bibliotek związków chemicznych. Cel ten osiąga się poprzez rozmrożenie i wysianie wcześniej przygotowanych, gotowych do testowania kriokonserwowanych komórek. Drugim krokiem jest dodanie do komórek związków testowych lub antagonistów, a następnie dodanie leku sensybilizującego cyklazę adenylową.Następnie w obecności inhibitora fosfodiesterazy dodaje się aktywator cyklazy adenylowej, aby pobudzić akumulację cyklicznego AMP. Ostatnim krokiem jest zatrzymanie reakcji za pomocą odczynników do detekcji cyklicznego AMP metodą jednorodnej fluorescencji rozdzielonej w czasie (HTRF) w buforze lizującym, a następnie pomiar fluorescencji. W ostateczności zastosowanie kriokonserwowanych komórek oraz technologii HTRF do oznaczania cyklicznego AMP umożliwia przeprowadzenie jednodniowego testu sensytyzacji w celu przesiewania małych cząsteczek.Pomysł na to podejście pojawił się, gdy zainteresowaliśmy się wykorzystaniem przesiewania wysokoprzepustowego do badania receptorowej heterologicznej sensytyzacji cyklazy w tkankach stomatologicznych. Dwie kluczowe techniki zastosowane w tej metodzie obejmują wykorzystanie kriokonserwowanych komórek jako gotowych odczynników oraz homogenicznych testów czasowo rozdzielonych (HTRF), w tym zestawów do pomiaru cyklicznego AMP. Podstawowe metodologie tutaj zastosowane mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu sygnalizacji komórkowej i odkrywania leków z wykorzystaniem testów komórkowych. Aby rozpocząć, należy hodować komórki CHO D2L w 15-centymetrowej szalce hodowlanej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, inkubując komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 do momentu uzyskania 90–95% konfluencji. Następnie komórki należy przemyć 10 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a następnie zebrać komórki w 3 mL buforu do dysocjacji komórek po pięciominutowej inkubacji w temperaturze 37 °C.Po resuspensji komórek w 12 ml pożywki hodowlanej, należy policzyć komórki metodą wykluczania błękitu trypanu, a następnie odwirować zawiesinę komórkową z prędkością 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać nadosad i resuspendować osad komórkowy w pięciu ml medium do zamrażania. Po rozcieńczeniu zawiesiny komórkowej w celu uzyskania pożądanej koncentracji komórek, odmierzyć po 1 ml roztworu komórek do każdej fiolki krioprezwencyjnej. Fiolki krioprezwencyjne inkubować w pojemniku do zamrażania komórek w temperaturze -80 °C przez noc.Następnego dnia przenieś fiolki kriogeniczne do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania. Aby przygotować komórki do testu na płytce, najpierw szybko rozmroź zamrożoną fiolkę kriogeniczną z komórkami w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Po rozmrożeniu przenieś komórki do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml OptiMEM i wymieszaj, odwracając probówkę trzy do pięciu razy. Następnie odwiruj komórki przy 500 g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej odessij supernatant i resuspenduj komórki w 1 ml OptiMEM.Policz komórki metodą wykluczania błękitu trypanowego, aby określić żywotność komórek przed ich ewentualnym rozcieńczeniem. Następnie naniesienie optymalnie 10 µL zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę 384-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, używając pipety wielokanałowej.Przygotuj rozcieńczenia szeregowe cyklicznego AMP oraz optymalnego roztworu w celu wygenerowania krzywej wzorcowej do szacowania produkcji cyklicznego AMP przez komórki. Do każdego dołka płytki dodaj 10 µL standardów cyklicznego AMP. Wiruj płytkę z prędkością 100 g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 przez jedną godzinę.W celu przeprowadzenia przesiewu małych cząsteczek, najpierw należy rozcieńczyć badany lek w optimum do sześciokrotności pożądanych stężeń końcowych. Rozcieńczanie seryjne można wykonać za pomocą pipet ręcznych lub stacji do obsługi cieczy. Do każdego dołka należy dodać 2,5 µL związku testowego, substancji badanej lub buforu zawierającego nośnik.Nanieś roztwór na ścianki studzienek za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie wiruj płytkę z prędkością 100 g przez 15 sekund. W temperaturze pokojowej, w celu przeprowadzenia leczenia agonistą trwałym, przygotuj 600 nM roztwór Quinparolu, a następnie nanieś 2,5 µL 600 nM roztworu Quinparolu na ścianki studzienek. Używając pipety wielokanałowej, ponownie wiruj płytkę przed inkubacją w temperaturze 37 °C w inkubatorze wilgotnościowym z 5% CO2 przez dwie godziny.Podczas dwugodzinnej inkubacji przygotować roztwór stymulujący w optium zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po odwirowaniu płytki dodać za pomocą pipety wielokanałowej pięć mikrolitrów roztworu stymulującego na ściankę każdej studni, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Produkcję cyklicznego AMP przez komórki mierzy się przy użyciu zestawu cyclic AMP dynamic two zgodnie z instrukcją producenta; w skrócie: zrekonstytuować anti-cyclical AMPK crypt oraz cyclic AMPD two w wodzie destylowanej, a następnie rozcieńczyć jedną porcję anti-cyclical AMPK crypt i jedną porcję cyclic AMPD two osobno w buforze lizującym, zgodnie z instrukcją producenta, w celu przygotowania roztworów roboczych. Aby zatrzymać akumulację cyklicznego AMP w płytce 384-dołkowej, dodać 10 mikrolitrów roztworu roboczego anti-cyclical AMP crypt eight na studnię oraz 10 mikrolitrów roztworu roboczego cyclic AMPD two na studnię.Używając pipety wielokanałowej, ponownie odwiruj płytkę z prędkością 100 GS przez 15 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę; odczytaj wartości z płytek w czytniku płytek fluorescencyjnych, stosując wzbudzenie o długości 337 nanometrów i mierząc emisję przy 620 nanometrach oraz 665 nanometrach zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadź analizę ratiometryczną w celu oceny krzywej wzorcowej dla cyclic A MP zgodnie z instrukcjami producenta. Na podstawie uzyskanych wartości ekstrapoluj szacowaną akumulację cyclic A MP w dołkach testowych przy użyciu oprogramowania do analizy danych.Kriokonserwowane komórki CHO D two L wysiano bezpośrednio na płytki testowe z 384 dołkami, aby wykazać, że testy uwrażliwiania można przeprowadzać w formacie 384-dołkowym, co redukuje liczbę etapów z ponad 20 do pięciu. Badania wykazały, że dwugodzinna obróbka wstępna przy użyciu Quin Perol zwiększyła następującą po niej stymulowaną akumulację cyclic A MP w sposób zależny od dawki, co jest spójne z uwrażliwianiem heterologicznym. Druga seria eksperymentów miała na celu sprawdzenie, czy ten nowy, usprawniony test może zostać wykorzystany do oceny inhibitorów uwrażliwiania.Wstępne wyniki wykazały, że wstępne opracowanie haloperidolem lub perilonepem, prototypowymi antagonistami receptora D2, całkowicie zapobiegło wywołanej kwinaprylolem sensytyzacji akumulacji cAMP stymulowanej przez agonistę. Metodę tę wykorzystano następnie do oceny skuteczności serii antagonistów D2 w celu sprawdzenia, czy związki te hamują sensytyzację w sposób analogiczny do wcześniejszych wyników. Badania te wykazały, że antagoniści D2 hamowali indukowaną agonistą sensytyzację w sposób zależny od dawki.Kolejnym celem było opracowanie testu uwrażliwiającego w układzie 384 dołków, który mógłby zostać wykorzystany do skalowalnego przesiewu biblioteki siRNA metodą odwrotnej transfekcji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym; wyniki wykazały, że dwugodzinna ekspozycja komórek na agonistę Quinparol doprowadziła do wyraźnego wzmocnienia odpowiedzi oraz stymulowała akumulację cAMP. Zwiększona akumulacja cAMP przy stężeniach 100 nM i 300 nM Quinparolu była ponad 15-krotnie wyższa w porównaniu z komórkami traktowanymi nośnikiem. Odwrotna transfekcja siRNA przeciwko GSS do komórek wykazujących ekspresję receptora D2 blokuje indukowane agonistą uwrażliwienie cyklazy adenylanowej.Po dodaniu agonisty receptora D2, Quin Perol, stymulowano akumulację cAMP, którą zmierzono za pomocą HTRF. 15-krotna odpowiedź sensytyzacyjna została zredukowana o 94%. Po opanowaniu techniki cały ten test może zostać przeprowadzony w czasie krótszym niż osiem godzin, pod warunkiem właściwego zastosowania tej procedury. W celu zbadania dodatkowych szlaków sygnalizacyjnych receptora można zmierzyć również inne cząsteczki sygnałowe, takie jak IP1 i fosfoinosytol.

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wzmożona przez leki wrażliwość adenylocyklazy: ujednolicenie i miniaturyzacja testu do zastosowań w przesiewowym badaniu małych cząsteczek i siRNA

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Adsorpcja peptydów na plastikowych naczyniach podczas tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń na bazie końcówek może znacząco wpłynąć na określenie siły działania i zakłócić zrozumienie zależności struktura-aktywność używanych do identyfikacji ołowiu i optymalizacji ołowiu w fazach odkrywania leków. W tym miejscu opisano metody automatycznego akustycznego bezkontaktowego seryjnego rozcieńczania próbek peptydów.

Zautomatyzowane dozowanie akustyczne do seryjnego rozcieńczania agonistów peptydów w testach oznaczania siły działania

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Poznaj metodę testu uwrażliwienia cyklazy adenylowej w komórkach do przesiewowego badania małych cząsteczek i siRNA przy użyciu technologii HTRF oraz komórek kriokonserwowanych.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA (Wideo) | JoVE Journal

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Przeglądaj więcej filmów