Name: Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Poznaj szybką analizę obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu platformy PhenoRipper. Ta metoda umożliwia efektywne generowanie profili fenotypowych z danych wysokoprzepustowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Adamowi Costerowi i wszystkim innym członkom laboratoriów Altschuler i Wu za pomocne opinie i dyskusje. Badania te były wspierane przez National Institute of Health granty R01 GM085442 i CA133253 (S.J.A.), R01 GM081549 (L.F.W.), CPRIT RP10900 (L.F.W) oraz Welch Foundation I-1619 (S.J.A.) i I-1644 (L.F.W.).

1. Przygotowanie próbek i obrazowanie
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Rutynowo dziel kultury i utrzymuj zbieżność na poziomie 20-70%. Na dzień przed eksperymentem hoduj komórki HeLa w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, patrz Tabela Materiałów) i uzupełnione 10% FBS (Płodowa Surowica Bydlęca) i 1x penicylina/streptomycyna.</li>
		<li>W dniu eksperymentu rozszczepione komórki rosnące w kulturze (około 50% zlewających się).</li>
		<li>Umyj komórki PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), wystawić na działanie około 2 ml trypsyny/EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) przez kilka sekund. Odessać nadmiar trypsyny/EDTA i utrzymywać komórki skąpane w cienkiej warstwie trypsyny/EDTA w kapturze przy temperaturze pokojowej przez ~3 min.</li>
		<li>Dwukrotnie wstrząsnąć mechanicznie kolbami i odłączyć komórki za pomocą pożywki z dodatkiem surowicy. Policz komórki i rozcieńcz do 5 000 komórek/50 μl pożywki i natychmiast nałóż 50 μl/dołek na 384-dołkową szklaną płytkę dolną za pomocą automatycznego robota do obsługi cieczy (tutaj używa się tylko 30 dołków płytki).</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zminimalizować efekty krawędzi w studzienkach5. Po inkubacji RT umieścić na noc płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
		<li>Każdy lek zostanie oceniony w dwóch egzemplarzach. Dodać 25 μl leku do odpowiednich studzienek na płytce już zawierającej pożywkę.</li>
		<li>Utrwalić płytkę z 4% roztworem paraformaldehydu w PBS po 24 godzinach od leczenia farmakologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie 
	Specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie i inne barwniki fluorescencyjne, które zostały tutaj użyte, są wymienione w Tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Utrwalone komórki przepuszczać 0,2% roztworem Triton X-100 w TBS (sola fizjologiczna buforowana przez Tris) przez 3 minuty i przemywać TBST (sól fizjologiczna buforowana Tris + Tween 20) 3x. Dodać 5% roztwór BSA (albuminy surowicy bydlęcej) w TBST w celu zablokowania.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie przemyć TBST 3x.</li>
		<li>Wykonać pierwszorzędowe rozcieńczenia przeciwciał w 5% BSA w TBST (patrz tabela materiałów) i dodać 10 μl/basenik. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie przemyć 3x TBST.</li>
		<li>Wykonać wtórne rozcieńczenie przeciwciał w 5% BSA w TBST (patrz tabela materiałów) i dodać 10 μl/basenik.</li>
		<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie dwukrotnie przemyć TBST.</li>
		<li>Przygotować rozcieńczenia dla Hoechst i falloidyny (patrz Tabela Materiałów) w PBS i dodać 10 μl/basenik.</li>
		<li>Inkubować płytkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po 2 praniach TBST przykryć płyty folią i przechowywać w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie 
	Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 20X z binowaniem kamery 1x1. Uzyskaj szesnaście obrazów dla każdej studzienki, co daje w sumie 480 obrazów (x3 kanały).</li>
</ol>
2. Analizowanie obrazów
Pobierz i zainstaluj PhenoRipper z phenoripper.org, a następnie uruchom PhenoRipper, aby rozpocząć analizę obrazów. PhenoRipper obecnie obsługuje formaty TIFF, PNG i JPEG oraz wszystkie inne formaty obsługiwane przez MATLAB (oprogramowanie mikroskopowe zazwyczaj obsługuje eksport do TIFF).
2.1 Ładowanie danych
<ol>
	<li>Nie istnieje standardowa konwencja nazewnictwa/organizacji obrazów mikroskopowych, co może sprawić, że ładowanie obrazów i kojarzenie metadanych (tj. adnotacji eksperymentalnych, takich jak rodzaj zabiegu, numer studzienki itp.) będzie najtrudniejszą częścią przepływu pracy. Wybierz jedną z przedstawionych metod (opisaną poniżej).
	<ol>
		<li>PhenoLoader: Wybierz tę opcję, aby półautomatycznie wczytywać dane, gdy nazwa pliku i/lub struktura katalogów zawierają wystarczającą ilość informacji, aby pogrupować obrazy zgodnie z potrzebami (np. B16\HeLa_Drug5-DAPI.png może wskazywać, że obraz pochodzi ze studni B16, komórki są traktowane lekiem o ID wynosi 5, a obraz przechwytuje jądrową plamę DAPI - z tą konwencją nazewnictwa, wszystkie obrazy ze studni A1 lub leczone lekiem 5 można łatwo pogrupować). Kreator poprowadzi użytkownika krok po kroku, aby skojarzyć metadane z grupami obrazów i zdefiniować znaczniki w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Kliknij "Struktura plików", aby uzyskać dostęp do okna PhenoLoader.</li>
			<li>Kliknij "Zdefiniuj katalog główny", aby wybrać katalog zawierający zestaw danych obrazu. Następnie przefiltruj pliki, które nie są używane (Nieużywane pliki) do analizy (opcjonalnie, można pozostawić puste).</li>
			<li>Kliknij "Zdefiniuj markery", aby określić biomarkery użyte w eksperymencie i powiązać je z obrazami. W szczególności kliknij plik obrazu, a następnie wybierz część nazwy pliku, która jednoznacznie identyfikuje biomarkery. Na koniec wprowadź nazwę każdego biomarkera.</li>
			<li>Kliknij "Zdefiniuj metadane", aby powiązać informacje z każdym obrazem. W szczególności kliknij plik obrazu, a następnie wybierz część nazwy pliku identyfikującą informacje o obrazie (np. "B16" dla nazwy studni). Pojawi się okno z prośbą o nazwę grupy (np. "Cóż"), wprowadź nazwę. Członkowie grupy wyodrębnieni z nazwy pliku zostaną wyświetleni w tabeli grup (np. pełna lista nazw studni). Aby dodać dodatkowe informacje, których nie ma w nazwie pliku, kliknij przycisk "(opcjonalnie) Dalej". Kliknij "Dodaj grupę metadanych", wprowadź dodatkową nazwę grupy (np. "Lek") i dla każdej wartości predefiniowanej grupy (np. "Well") wprowadź jej wartość (np. "Taxol"). Nie ma ograniczeń co do liczby dodatkowych grup, które można dodać.</li>
			<li>Na koniec kliknij "Utwórz plik metadanych", aby wygenerować plik metadanych i kontynuować analizę. Jeśli plik metadanych został wcześniej wygenerowany, powyższych kroków można uniknąć, ładując plik bezpośrednio za pomocą opcji "Plik metadanych" (opisanej w punkcie 3 poniżej).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Szablony oparte na wyrażeniach regularnych: Wyrażenia regularne są standardowym podejściem do dopasowywania wzorców w tekście. Wybierz tę opcję, jeśli nazwa pliku i/lub struktura katalogów zawierają wystarczającą ilość informacji do grupowania obrazów, a konwencja nazewnictwa jest zgodna z jednym z wcześniej istniejących szablonów. Szablony niestandardowe oparte na wyrażeniach regularnych mogą być również definiowane ręcznie i ponownie wykorzystywane. Ta opcja zaawansowana jest zalecana tylko dla użytkowników zaznajomionych z wyrażeniami regularnymi.</li>
		<li>Plik metadanych: Wybierz tę opcję, aby uzyskać maksymalne możliwości dostosowywania. Zdefiniuj i załaduj plik z wartościami rozdzielanymi przecinkami (CSV) zawierający nazwy plików i metadane skojarzone z każdym obrazem. Przykładowy format pliku jest dostępny w części do pobrania na stronie internetowej (phenoripper.org). Wystarczy załadować plik przez interfejs, aby wyświetlić zawarte w nim informacje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz pole metadanych, które definiuje repliki w eksperymencie, aby uniknąć nadmiarowego próbkowania. W przypadku zestawów danych, które zawierają powtórzenia (np. wszystkie obrazy w studni powinny być podobne), grupowanie ich razem (np. według studni) może poprawić wydajność. W większości przypadków rozsądne jest wybranie domyślnej opcji "Losowy (nie wiem)", która wybiera losowy podzbiór.</li>
</ol>
2.2 Ustawianie parametrów analizy
Kliknij na "Ustaw parametry", aby zdefiniować parametry wymagane do przetworzenia zestawu danych. Parametry do zdefiniowania znajdują się w lewym panelu. W prawym panelu zostanie wyświetlona scalona próbka zestawu danych. Kliknij strzałki w lewo/w prawo, aby przełączać się między różnymi obrazami.
<ol>
	<li>Intensywność progowa: Wybierz odpowiednią wartość progową, aby z grubsza zidentyfikować części komórkowe (a nie tło, obszary niekomórkowe) obrazów. Próg jest wstępnie obliczany przez PhenoRipper, ale można go dostosować, aby poprawić podświetlanie regionów komórkowych za pomocą paska przewijania dostępnego na górze obrazu. Jeśli wybrany próg nie działa na wszystkich obrazach, obniż próg, aby uwzględnić regiony niekomórkowe, a nie pominąć regiony komórkowe.</li>
	<li>Rozmiar bloku: Wybierz odpowiedni rozmiar bloku (w pikselach), aby utworzyć siatkę obrazu. Bloki o określonym rozmiarze zostaną nałożone na obraz. Dostosuj rozmiar bloku, aby uzyskać średnio 20-30 bloków/komórkę. Aby nałożyć siatkę na obraz, kliknij pole wyboru przed polem "Rozmiar bloku".</li>
	<li>Parametry opcjonalne: Jeśli automatycznie skalowane obrazy nie wyświetlają znaczników o pożądanej intensywności względnej (np. jeden kolor jest nasycony) lub jeśli znaczniki muszą zostać usunięte z analizy, użyj opcji "Dostosuj intensywność kanału". Aby zidentyfikować regiony komórkowe w podzbiorze znaczników, użyj opcji "Kanały używane dla progu". Domyślne wybory innych parametrów są zwykle wystarczające, ale w razie potrzeby dostosuj je za pomocą "Zaawansowanych opcji analizy".</li>
	<li>Uruchom analizę, naciskając "PhenoRip" na głównym panelu aplikacji. PhenoRipper automatycznie zidentyfikuje powtarzające się typy bloków na obrazach. Profile fenotypowe zostaną wygenerowane dla każdego obrazu na podstawie frakcji różnych typów bloków w nim zawartych.</li>
</ol>
3. Eksplorowanie wyników
<ol>
	<li>Zbadaj relacje między profilami fenotypowymi obrazów za pomocą przeglądarki PhenoBrowser (Rysunek 1). Interfejs PhenoBrowser składa się z czterech paneli: lewy górny panel jest graficzną reprezentacją (wykres punktowy) względnego podobieństwa między różnymi obrazami/warunkami, dwa panele po prawej stronie wyświetlają przykładowe obrazy wybranych warunków, a ostatni panel (wykres słupkowy) porównuje ich profile fenotypowe.</li>
	<li>"Odrzuć puste ramki" za pomocą menu "Przetwarzanie danych".</li>
	<li>Usuń obrazy o niskiej jakości: Po pierwsze, aby przestudiować pojedyncze obrazy, wyłącz grupowanie w menu "Przetwarzanie danych". Następnie klikaj punkty odstające na wykresie punktowym i odrzucaj obrazy o niskiej jakości (np. nieostre, plamiące artefakty).</li>
	<li>Eksplorowanie danych: Zdecyduj, które pole metadanych definiuje podstawową jednostkę porównania (np. aby porównać leki, obrazy o tej samej wartości pola metadanych "lek" muszą być zgrupowane razem). Zwiń wszystkie obrazy o tej samej wartości tego pola metadanych do jednego punktu danych za pomocą opcji "Grupuj według". Na przykład grupowanie według leku spowoduje uśrednienie obrazów w każdym leku, aby uzyskać jeden punkt dla każdego leku. Pobliskie (lub odległe) punkty na wykresie punktowym odzwierciedlają warunki, które wywołują podobne (lub różne) fenotypy komórkowe. Punkty koloru lub etykiety (menu wyświetlania danych) na podstawie dostępnych metadanych, aby ułatwić interpretację. Wykres 3D można obracać, klikając pole wyboru "obracany" oraz klikając lewy przycisk i przeciągając nad nim myszką.</li>
	<li>Wybierz dwa różne punkty, aby porównać je bezpośrednio. Panele obrazów będą wyświetlać przykładowe obrazy dla każdego punktu, a panel wykresu słupkowego będzie pokazywał typy bloków, których częstość występowania jest najbardziej różna między tymi dwoma punktami.</li>
	<li>Uruchom clustergram z menu "Clustergram", aby zapewnić bardziej globalny widok relacji między typami bloków a warunkami eksperymentalnymi. Grupując zarówno typy bloków, jak i warunki, reprezentacja ta podkreśla fenotypy komórkowe, które najlepiej odróżniają grupy schorzeń (ryc. 5).</li>
</ol>

<ol><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li>
<li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li>
<li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhenoRipper%3A+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li>
<li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li>
<li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li>
<li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+calibration+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li>
<li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13(2008).</li>
<li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94(2009).</li>
<li>Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj przebieg pracy umożliwia szybką i łatwą charakteryzację i porównywanie obrazów mikroskopowych. Najpierw pokazaliśmy, w jaki sposób ten przepływ pracy może pomóc w optymalizacji eksperymentów, na przykład poprzez szybkie przeprowadzanie kontroli jakości obrazów mikroskopowych. Następnie wykazaliśmy jego potencjał w zakresie analizy danych z wysokoprzepustowych badań przesiewowych: byliśmy w stanie pogrupować leki na podstawie ich mechanizmu działania. Grupowanie leków było porównywalne do tego, które stwierd...

W ciągu ostatniej dekady, szybki postęp w technologii obrazowania dał wielu laboratoriom możliwość wykonywania mikroskopii o wysokiej przepustowości. Obecnie wyzwanie przeniosło się z obrazowania na wyzwanie związane z analizą. W jaki sposób możemy scharakteryzować, porównać i zbadać potok złożonych, ale subtelnych fenotypów generowanych przez typowy ekran obrazowania o wysokiej przepustowości?
Wiele platform do analizy obrazów i informatyki dało użytkownikom zaawansowane zestawy narzędzi1-3 do wydobywania informacji biologicznych z dużych zbiorów obrazów. Nadal jednak istnieje wiele istotnych przeszkód w analizie danych z wysokoprzepustowych ekranów opartych na obrazie. Trudności związane z doborem odpowiednich charakterystyk obrazów i dostrojeniem parametrów algorytmicznych (do interesującego nas systemu) często skutkują długim czasem konfiguracji, szczególnie dla użytkowników bez doświadczenia w analizie obrazu. W szczególności segmentacja komórek, czyli proces identyfikacji pojedynczych komórek na obrazie, jest głównym wąskim gardłem w tym zakresie. Segmentacja może być bardzo wrażliwa na parametry eksperymentalne, takie jak typ komórki, gęstość komórek i biomarkery, i często wymaga wielokrotnych korekt dla dużego zestawu danych. Z tych powodów analiza obrazu jest często niezależnym, końcowym etapem wykonywanym przez specjalistów, a nie integralną częścią eksperymentalnego przepływu pracy. Wyklucza to szybki cykl sprzężenia zwrotnego między analizą a eksperymentem, który jest kluczową częścią opracowywania testu.
Tutaj opisujemy alternatywny przepływ pracy, który jest zoptymalizowany pod kątem wysokoprzepustowej mikroskopii fluorescencyjnej i pozwala uniknąć wielu z wyżej wymienionych trudności. W tym celu korzystamy z PhenoRipper4, platformy oprogramowania typu open source do szybkiej eksploracji i analizy obrazów mikroskopowych. Co istotne, PhenoRipper pozwala uniknąć wielu wyzwań związanych z segmentacją komórek, nie próbując identyfikować pojedynczych komórek. Zamiast tego PhenoRipper dzieli obrazy na bloki pikseli o rozmiarze subkomórkowym i charakteryzuje obrazy pod względem zawartych w nich bloków. W szczególności PhenoRipper profiluje bloki pod względem funkcji opartych na kolokalizacji markerów i automatycznie identyfikuje4 najbardziej reprezentatywne typy bloków na obrazach treningowych. Następnie PhenoRipper przypisuje każdemu blokowi najbardziej podobny reprezentatywny typ bloku, a na koniec charakteryzuje obrazy na podstawie typów bloków, które zawierają.
W porównaniu do bardziej tradycyjnych podejść opartych na pojedynczych komórkach, to podejście wymaga minimalnego dostrajania i specjalistycznej wiedzy. W związku z tym użytkownicy muszą ustawić tylko dwa parametry: rozmiar bloku i intensywność progową (aby odrzucić niekomórkowe części obrazu), z których oba są ustawiane za pomocą graficznej informacji zwrotnej. Co ważne, opisany tutaj przepływ pracy został pokazany4 w celu łatwego skalowania do znacznie większych zestawów danych, gdzie szybkość i minimalne dostrajanie zapewniają duży przyrost czasu i niezawodności. W praktyce okazuje się, że takie podejście skraca czas wymagany zarówno do konfiguracji, jak i uruchomienia o wiele rzędów wielkości4.
Podstawowym wyjściem PhenoRipper jest wizualna reprezentacja podobieństwa obrazu, która umożliwia użytkownikowi zidentyfikowanie grup warunków eksperymentalnych, które powodują, że komórki wykazują podobne fenotypy. Grupowania, które odkrywa PhenoRipper, zazwyczaj mają porównywalną "biologiczną interpretowalność" do tych generowanych przez bardziej czasochłonne metody oparte na komórkach4. W praktyce oznacza to, że często, w ciągu pół godziny od przeprowadzenia typowego eksperymentu z 96-dołkową mikroskopią fluorescencyjną, eksperymentator bez wcześniejszego doświadczenia w analizie obrazu może uzyskać wiarygodny odczyt wydajności swojego eksperymentu. Eksperymentator może następnie rozpocząć badanie relacji między różnymi warunkami eksperymentalnymi i powiązać te relacje z fenotypami obrazu.
Pokazujemy ten przebieg pracy, analizując wpływ leków w różnych klasach mechanistycznych na komórki HeLa barwione na DNA i markery cytoszkieletu. Obrazy komórek leczonych tą samą klasą leków zostały zgrupowane razem, a obrazy o niskiej jakości (artefakty barwienia, komórki poza ostrością i tak dalej) pojawiły się jako wartości odstające, co ułatwiało ich identyfikację i potencjalne odrzucenie.
Chociaż ten przepływ pracy jest przydatny dla dużej liczby testów opartych na obrazach, istnieje oczywiście wiele sytuacji, w których inne podejście mogłoby być potencjalnie bardziej pouczające. Na przykład wynik projektu PhenoRipper to przede wszystkim względne porównanie wzorców fluorescencji w różnych warunkach eksperymentalnych. Gdyby zamiast tego wymagana była bezwzględna charakterystyka określonej cechy pojedynczej komórki (na przykład liczby plamek w komórce), wymagana byłaby analiza oparta na pojedynczej komórce. Niemniej jednak, nawet w tego typu sytuacji, PhenoRipper prawdopodobnie wykryje zmiany w tych fenotypach jednokomórkowych, a tym samym będzie użytecznym narzędziem do optymalizacji testów.

<table><tbody><tr><td>DMEM, Wysoka zawartość glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>Wysoka glukoza, marker L-glutaminy</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>Barwienie DNA, rozcieńczenie 1:2,000 5 mg / ml zapasu</td></tr><tr><td>Marker falloidyna-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Sprzężona fallotoksyna, rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne &alfa;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Pierwotne Ab, mysz monoklonalne, rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Wtórne Antivody anty-mysie TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Sprzężone wtórne Ab, 0,5 mg w 1 ml PBS + 1 ml glicerolu</td></tr><tr>Stężenie<td>aldosteronu</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Zastosowane stężenie apicydyny</td><td></td><td></td><td>: 20 &mu; M</td></tr><tr>Zastosowane stężenie<td>kolchicyny</td><td></td><td></td><td>: 0,16 &mu; M</td></tr><tr>Zastosowane stężenie<td>kortyzolu</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr>Zastosowane<td>stężenie deksametazonu</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr>Zastosowane stężenie<td>docetakselu</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; Zastosowane stężenie M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>: 20 &mu; Zastosowane stężenie M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>: 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Stężenie zastosowanego nokodazolu</td><td></td><td></td><td>: 0,3 &mu; M</td></tr><tr>Zastosowane stężenie<td>prednizolonu</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; Zastosowane stężenie M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Użyte stężenie Scriptaid</td><td></td><td></td><td>: 70 &mu; M</td></tr><tr><td>Zastosowane stężenie taksolu</td><td></td><td></td><td>: 0,3 &mu; Stosowane stężenie</td></tr><tr><td>M trichostatyny A</td><td></td><td></td><td>: 0,2 &mu; M</td></tr><tr>Stężenie<td>winorelbiny</td><td></td><td></td><td>: 0,3 &mu; M</td></tr></tbody></table>

szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Pomimo szybkiego postępu w mikroskopii wysokoprzepustowej, ilościowe testy oparte na obrazach nadal stanowią poważne wyzwanie. Chociaż dostępnych jest wiele specjalistycznych narzędzi do analizy obrazu, większość tradycyjnych procesów pracy opartych na analizie obrazów ma strome krzywe uczenia się (w celu precyzyjnego dostrojenia parametrów analizy) i skutkuje długimi czasami realizacji między obrazowaniem a analizą. W szczególności segmentacja komórek, czyli proces identyfikacji pojedynczych komórek na obrazie, jest głównym wąskim gardłem w tym zakresie.
Tutaj prezentujemy alternatywny, wolny od segmentacji komórek przepływ pracy oparty na PhenoRipper, platformie oprogramowania open source przeznaczonej do szybkiej analizy i eksploracji obrazów mikroskopowych. Przedstawiony tutaj potok jest zoptymalizowany pod kątem obrazów mikroskopii immunofluorescencyjnej kultur komórkowych i wymaga minimalnej interwencji użytkownika. W ciągu pół godziny PhenoRipper może przeanalizować dane z typowego eksperymentu z 96 odwiertami i wygenerować profile obrazu. Użytkownicy mogą następnie wizualnie eksplorować swoje dane, przeprowadzać kontrolę jakości eksperymentu, zapewniać reakcję na perturbacje i sprawdzać odtwarzalność powtórzeń. Ułatwia to szybki cykl sprzężenia zwrotnego między analizą a eksperymentem, co ma kluczowe znaczenie podczas optymalizacji testu. Protokół ten jest przydatny nie tylko jako analiza pierwszego przejścia do kontroli jakości, ale może być również stosowany jako kompleksowe rozwiązanie, zwłaszcza do badań przesiewowych. Opisany tutaj przepływ pracy skaluje się do dużych zestawów danych, takich jak te generowane przez badania przesiewowe o wysokiej przepustowości, i wykazano, że dokładnie grupuje warunki eksperymentalne według fenotypu w szerokim zakresie systemów biologicznych. Interfejs PhenoBrowser zapewnia intuicyjną platformę do eksploracji przestrzeni fenotypowej i powiązania właściwości obrazu z adnotacjami biologicznymi. Podsumowując, opisany tutaj protokół obniży bariery w stosowaniu analizy ilościowej ekranów opartych na obrazie.

W niniejszym badaniu przetestowano zdolność tego przepływu pracy do grupowania leków na podstawie ich mechanizmu działania. Komórki HeLa wysiano do 30 studzienek płytki 384-dołkowej, a następnie zabarwiono na obecność DNA/aktyny/α-tubuliny. Specyficzne przeciwciała pierwotne, fluorescencyjnie znakowane przeciwciała wtórne oraz inne zastosowane barwniki fluorescencyjne wymieniono w Tabeli materiałów. Studzienki poddano działaniu 15 leków należących do trzech klas mechanistycznych (inhibitory deacetylazy histonowej, leki c...

Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.

Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie platformy do analizy obrazu w celu szybkiej analizy i badania obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej. Osiąga się to poprzez uprzednie wysianie komórek na płytkę, dodanie czynników zaburzających do każdej studni i inkubację płytki. Następnie obrazy są pozyskiwane za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie półautomatycznie wczytywane na platformę do analizy obrazu pheno ripper za pomocą narzędzia pheno loader.Po ustawieniu parametrów analizy, program pheno ripper automatycznie identyfikuje powtarzające się typy bloków na obrazach i generuje profile fenotypowe dla każdego obrazu, które można analizować za pomocą przeglądarki pheno browser. Ostatecznie finalny wykres skupień (cluster gram) pokazuje zależności między różnymi warunkami a cechami obrazu, co pozwala na porównanie złożonych, a jednocześnie subtelnych fenotypów uzyskanych w ramach wysokoprzepustowego przesiewu obrazowego. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod wymagających automatycznej identyfikacji pojedynczych komórek jest to, że jest ona znacznie szybsza i łatwiejsza w obsłudze.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biomedycznej, takie jak wpływ różnych leków na procesy komórkowe. Procedura rozpoczyna się od hodowli komórkowej i utrwalania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, następnie utrwalone komórki barwi się, używając specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych, fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał drugorzędowych oraz innych barwników fluorescencyjnych wymienionych w protokole tekstowym. Po zabarwieniu komórek należy wykonać obrazowanie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z oświetleniem epifokalnym.W tym przykładzie zastosowano 20-krotne powiększenie z kamerą one by one firmy Benning. Pozyskano 16 obrazów dla każdej studni, co dało łącznie 480 obrazów. Aby przeanalizować obrazy, należy najpierw pobrać i zainstalować program pheno ripper ze strony pheno ripper.organizację i uruchom Pheno Ripper. Aby rozpocząć analizę obrazów poprzez półautomatyczne ładowanie obrazów i powiązanych z nimi metadanych, kliknij „file structure”, aby uzyskać dostęp do Pheno Loader w Pheno Loader. Wybierz katalog zawierający zestaw danych obrazowych i, jeśli jest to wymagane, określ rozszerzenie plików obrazów.Ofiltruj pliki, które nie są wykorzystywane do analizy. Kliknij Define Markers, aby określić biomarkery użyte w doświadczeniu i przypisać je do obrazów. W szczególności kliknij plik obrazu, a następnie wybierz część ścieżki pliku, która jednoznacznie identyfikuje biomarkery.Na koniec wprowadź nazwę dla każdego biomarkera. Następnym krokiem jest kliknięcie opcji zdefiniuj metadane. Aby powiązać informacje z każdym obrazem, kliknij plik obrazu, a następnie zaznacz część ścieżki pliku identyfikującą informacje o obrazie.Pojawi się okno z prośbą o podanie nazwy grupy. Wprowadź nazwę. Członkowie grupy wyodrębnieni z nazwy pliku zostaną wyświetleni w tabeli grupy.Informacje te mogą zostać wykorzystane podczas wizualizacji wyników analizy. Aby dodać dodatkowe informacje, których nie ma w nazwie pliku, należy kliknąć przycisk dodawania dodatkowych informacji, wybrać opcję Dodaj grupę metadanych, a następnie wprowadzić nazwę dodatkowej grupy. Po tym należy podać każdą wartość dla zdefiniowanej grupy; liczba dodatkowych grup, które można dodać, nie jest ograniczona.Na koniec kliknij przycisk create metadata file, aby wygenerować adnotację danych czytelną dla programu pheno ripper, a następnie wybierz pole metadanych definiujące powtórzenia w eksperymencie, aby uniknąć nadmiarowego próbkowania. W przypadku zestawu danych zawierającego powtórzenia, ich grupowanie może poprawić wydajność. Następnie kliknij set parameters, aby zdefiniować parametry niezbędne do przetworzenia zestawu danych.Parametry do zdefiniowania znajdują się w lewym panelu. Prawy panel wyświetla wyniki. Próbka zestawu danych.Kliknij lewą lub prawą strzałkę, aby przełączać obrazy i wybrać odpowiednią wartość progu, która pozwoli wstępnie zidentyfikować fragmenty komórkowe na obrazach. Próg jest wstępnie obliczany przez program pheno ripper, ale można go dostosować za pomocą paska przewijania znajdującego się nad obrazem, aby lepiej wyróżnić obszary komórkowe.Jeśli wybrany próg nie sprawdza się we wszystkich obrazach, należy go obniżyć tak, aby uwzględnić obszary niekomórkowe, zamiast odrzucać obszary komórkowe. Następnie należy wybrać odpowiedni rozmiar bloku wyrażony w pikselach, aby podzielić obraz na siatkę bloków. Dostosuj rozmiar bloku tak, aby uzyskać średnio od 20 do 30 bloków na komórkę po nałożeniu siatki na obraz.Zaznacz pole wyboru znajdujące się przed polem rozmiaru bloku. Jeśli obrazy skalowane automatycznie nie wyświetlają markerów o pożądanej intensywności względnej lub jeśli niektóre markery muszą zostać usunięte z analizy, użyj opcji dostosowania intensywności kanału, aby zidentyfikować regiony komórkowe na podzbiorze markerów. Wybierz domyślną opcję kanałów używanych do progowania.Wybór pozostałych parametrów jest zazwyczaj odpowiedni, jednak w razie potrzeby należy je dostosować. Korzystając z zaawansowanych opcji analizy, uruchom analizę, klikając pheno rip w głównym panelu aplikacji. Pheno ripper automatycznie zidentyfikuje powtarzające się typy bloków na obrazach.Profile fenotypowe zostaną wygenerowane dla każdego obrazu na podstawie udziałów różnych typów bloków w nim zawartych. Przeanalizuj zależności między profilami fenotypowymi obrazów za pomocą przeglądarki fenotypów. Interfejs przeglądarki fenotypów składa się z czterech paneli.Górny lewy panel stanowi graficzną reprezentację względnego podobieństwa między różnymi obrazami i warunkami eksperymentalnymi. Dwa panele po prawej stronie wyświetlają przykładowe obrazy dla wybranych warunków. Ostatni panel porównuje profile fenotypowe wybranych warunków.Najpierw wyłącz grupowanie w menu przetwarzania danych, aby przeanalizować poszczególne obrazy. Następnie klikaj w punkty odstające na wykresie rozrzutu i odrzuć obrazy niskiej jakości. Zdecyduj, które pole metadanych definiuje podstawową jednostkę porównania.Na przykład, aby porównać leki, należy pogrupować obrazy o tej samej wartości pola metadanych drug. Każdy punkt reprezentuje teraz pojedynczy lek; korzystając z menu wyświetlania danych, można pokolorować lub etykietować punkty na podstawie dostępnych metadanych w celu ułatwienia interpretacji. Odległość między punktami odzwierciedla względne podobieństwo fenotypowe odpowiadających im warunków eksperymentalnych.Punkty znajdujące się bliżej siebie sugerują większe podobieństwo. Wykres trójwymiarowy można obracać, zaznaczając pole wyboru rotacji. Przesuń myszką nad wykresem, trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy.Wybierz dwa różne punkty, aby porównać je bezpośrednio. Panele obrazów wyświetlą obrazy próbkowe dla każdego z nich, a panel wykresu słupkowego wskaże typy bloków, które najlepiej rozróżniają te dwa punkty. Uruchom gram klastrowy z menu gramu klastrowego, aby uzyskać bardziej globalny widok relacji między typami bloków a warunkami eksperymentalnymi poprzez grupowanie zarówno typów bloków, jak i warunków.Ta reprezentacja podkreśla fenotypy komórkowe, które najlepiej rozróżniają grupy warunków. Do analizy komórek HeLa, które wybarwiono fluorescencyjnie w celu uwidocznienia DNA, aktyny i alfa-tubuliny, a następnie obrazowano po zastosowaniu inhibitorów deacetylazy histonowej, leków celujących w mikrotubule oraz leków uszkadzających DNA, wykorzystano program Pheno ripper. Próg pierwszego planu dla tych obrazów ustawiono na 5%, a rozmiar bloku na 20 pikseli; analiza tego zbioru danych zajęła około 10 minut na standardowym komputerze stacjonarnym.Do analizy wyników wykorzystano interfejs przeglądarki pheno. Względne podobieństwa fenotypowe między obrazami zostały zwizualizowane za pomocą wielowymiarowego skalowania. Każdy punkt reprezentuje pojedynczy obraz, a jego kolor odpowiada mechanizmowi działania zastosowanego leku.Wykres ten pokazuje, że profile fenotypowe mogą być wykorzystywane do grupowania leków według ich mechanizmu działania. Artefakty obrazowania, takie jak barwienie porów i puste klatki, były łatwe do zidentyfikowania, ponieważ wyraźnie odróżniały się jako wartości odstające. Clustergram danych wiąże to grupowanie z przedstawionymi tutaj profilami fenotypowymi.Każdy wiersz reprezentuje pojedynczy lek, a każda kolumna typ bloku. Wartości skali szarości odzwierciedlają profile fenotypowe. Jaśniejsza wartość wskazuje na większą frakcję danego typu bloku; klasteryzacja hierarchiczna w dużej mierze rozdziela poszczególne leki według klasy leku.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w 10 minut. Po zastosowaniu tej procedury możliwe jest wykonanie innych metod, takich jak profilowanie IRA. Pomoże to w odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób różne geny wpływają na podobne szlaki.

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka analiza i eksploracja obrazów mikroskopii fluorescencyjnej

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Tutaj opisujemy protokół automatycznej segmentacji fluorescencyjnie znakowanych tkanek na szkiełkach przy użyciu systemu analizy o wysokiej zawartości (WHCAS) o szerokim polu. Protokół ten ma szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach, które obejmują ilościowe oznaczanie markerów fluorescencyjnych w tkankach biologicznych, w tym w naukach biologicznych, inżynierii medycznej i naukach o zdrowiu.

Zautomatyzowane skanowanie i segmentacja szkiełek w tkankach znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu szerokokątnego systemu analizy o wysokiej zawartości

Obrazowanie spektralne stało się niezawodnym rozwiązaniem do identyfikacji i separacji wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce i może łatwo odróżnić interesujące sygnały od tła lub autofluorescencji. Obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia ulepsza tę technikę, skracając niezbędny czas akwizycji obrazu przy jednoczesnym zwiększeniu stosunku sygnału do szumu.

Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.

Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.

Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Poznaj szybką analizę obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu platformy PhenoRipper. Ta metoda umożliwia efektywne generowanie profili fenotypowych z danych wysokoprzepustowych.

Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów