Name: Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę indukcji zapalenia jelita grubego DNBS u myszy i szczurów jako alternatywę dla badań nad nieswoistymi zapaleniami jelit. Ta technika umożliwia analizę wpływu olejów w diecie na przebieg choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty operacyjne dla KJ od Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) oraz Fundacji Leśniowskiego-Crohna i Zapalenia Jelita Grubego Kanady (CCFC). VM jest wspierany przez stypendium CFRI Fellowship, a GB stypendium dla absolwentów z Canadian Institutes for Health Research (CIHR). BAV jest Przewodniczącym Badań nad Pediatrycznymi Zaburzeniami Jelit i Wątroby Fundacji (CHILD) oraz Kanadyjskim Kierownikiem Badań nad Gastroenterologią Dziecięcą, a KJ jest starszym klinicystą naukowcem wspieranym przez CHILD i Child and Family Research Institute (CFRI) Clinician Scientists Award Program, University of British Columbia.

Procedury z udziałem zwierząt są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami określonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej.
Procedury wymienione w tym protokole zostaną opisane zarówno dla szczurów, jak i myszy, natomiast reprezentatywne wyniki zostaną przedstawione na szczurach Sprague-Dawley.
1. Przygotowanie DNBS i podawanie doodbytnicze
<ol>
	<li>Do doodbytniczego wkraplania DNBS szczurom należy przygotować świeżo 15-30 mg DNBS/250 μl 50% etanolu. Dla myszy przygotuj 2-6 mg DNBS/100 μl 50% etanolu. Uwaga: Zoptymalizuj dokładne stężenie DNBS, które ma być podawane w każdym obiekcie. Samce szczurów Sprague-Dawley i myszy C57BL / 6 są preferowane do indukcji zapalenia jelita grubego DNBS, jednak można użyć innych szczepów myszy i szczurów. Myszy i szczury leczone tylko 50% etanolem mogą być używane jako grupy kontrolne, jednak biorąc pod uwagę, że działanie etanolu jest łagodne lub nie ma go wcale, można pominąć włączenie tej grupy do badania12.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml do igły 19 G, która ma cewnik polietylenowy (PE-90 - szczury lub PE-50 - myszy) przymocowany do końca.</li>
	<li>Lekko znieczulij szczura lub mysz odpoczywającego na poduszce grzewczej (np. podając 1,5% izofluranu przez stożek nosowy, zwierzęta powinny nadal mieć odruchy mrugania i połykania oraz wykazywać regularne oddychanie). Nałóż żel łzowy na oczy, aby uniknąć wysuszenia oczu.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij opuszkami palców tylny koniec zwierzęcia, aby usunąć stolec, który może być obecny w dalszej części okrężnicy.</li>
	<li>Delikatnie wprowadzić cewnik doodbytniczo, przy czym cewnik sięga około 8 cm proksymalnie do odbytu w przypadku szczurów lub 3-4 cm w przypadku myszy. Wstrzyknąć niewielką ilość roztworu podczas wprowadzania cewnika w celu nasmarowania, co ułatwia wprowadzanie. Uwaga: Jeśli podczas wprowadzania cewnika odczuwalny jest jakikolwiek opór, nie należy kontynuować wkładania, ponieważ może to doprowadzić do perforacji ściany jelita. Wyjmij cewnik i spróbuj delikatnie włożyć go ponownie, ponownie smarując okrężnicę w miarę postępu.</li>
	<li>Powoli wstrzyknij 250 (szczury) lub 100 (myszy) μl DNBS lub równą objętość lub 50% etanolu do kontroli. Po wstrzyknięciu DNBS należy ułożyć zwierzę głową w dół na 90 sekund, aby uniknąć utraty DNBS.</li>
	<li>Po podaniu DNBS należy podawać zwierzętom 8% wody z sacharozą w 0,2% soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu w pierwszym tygodniu.</li>
	<li>Uważnie obserwuj zwierzęta, z codziennym monitorowaniem utraty wagi i oznak odwodnienia lub niepokoju przez cały czas trwania eksperymentu. Uwaga: Utrata masy ciała może szybko zbliżyć się do zaleceń CCAC dotyczących maksymalnej dopuszczalnej utraty wagi. Ponieważ wynika to głównie z odwodnienia, utrata masy ciała powinna być stosowana jako wskaźnik do podawania roztworu Ringera z mleczanami w celu ograniczenia odwodnienia. W razie potrzeby należy skonsultować się z weterynarzem placówki w kwestiach zdrowotnych.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanek i ocena uszkodzeń histologicznych u myszy z prowizją DNBS
<ol>
	<li>W pożądanym punkcie czasowym po prowokacji DNBS poddać zwierzęta eutanazji poprzez przedawkowanie izofluranu w komorze anestezjologicznej uzupełnionej wystarczającą ilością tlenu. Obserwuj zwierzę, aż nie będzie widać unoszenia się ani opadania klatki piersiowej i nie będzie wyczuwalnego bicia serca. Upewnij się, że zwierzę zostało prawidłowo uśpione przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi lub dotknięcie rogówki, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną i usuń całe jelito grube. Otwórz jelito wzdłużnie; Makroskopowe owrzodzenia błony śluzowej należy obserwować około 5-6 cm proksymalnie od dystalnego końca jelita grubego u szczurów (2-3 cm u myszy). Uwaga: Po usunięciu jelita grubego w razie potrzeby oceń makroskopowe oceny uszkodzeń. Pobrać segmenty okrężnicy z odpowiedniej lokalizacji anatomicznej od zwierząt kontrolnych. Uwaga: Osoby, które oceniają tkankę pod kątem makroskopowych ocen uszkodzeń, powinny być ślepe na tożsamość grup poddanych zabiegowi. Oceń skrawki tkanek za pomocą następujących lub podobnych kryteriów: nasilenie i rozległość owrzodzenia (0-10), zsumowane z punktami za brak lub obecność biegunki (0 lub 1), zrosty (0, 1 lub 2) i maksymalna grubość ściany okrężnicy w milimetrach11.</li>
	<li>Zbierz 0,5 cm odcinki proksymalnie do miejsca maksymalnego uszkodzenia makroskopowego. Zamroź jeden 0,5 cm odcinek w ciekłym azocie, aby później ocenić aktywność mieloperoksydazy (MPO) (miara infiltracji neutrofili), a drugą sekcję umieść w 10% obojętnej buforowanej formalinie do analizy histologicznej. Uwaga: Zamrożone tkanki do testu mieloperoksydazy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Pozostawić tkanki pobrane do analizy histologicznej w kroku 2.3 na utrwalenie się w formalinie przez noc, a następnie przemyć 70% etanolem. Zanurzyć tkanki w parafinie i przyciąć do żądanej grubości (3-5 μm), wybarwić hemotoksyliną i eozyną (HE) w celu oceny histologicznej.</li>
	<li>Niech dwóch obserwatorów oceni co najmniej trzy skrawki tkanek od każdego zwierzęcia pod mikroskopem świetlnym, aby określić wyniki uszkodzeń histologicznych dla każdej grupy. Uwaga: Osoby, które oceniają tkankę pod kątem oceny uszkodzeń histologicznych, powinny być ślepe na tożsamość grup poddanych zabiegowi. Oceń skrawki tkanek przy użyciu następujących lub podobnych kryteriów: stopień nacieku komórek zapalnych (0 = brak, 3 = przezścienny), utrata architektury błony śluzowej (0 = brak, 3 = ciężki), obecność lub brak ropni krypty (0-1) i zubożenie komórek kubkowych (0-3). Określ wynik uszkodzeń histologicznych jako sumę tych wyników11.</li>
</ol>
3. Wykonywanie testu mieloperoksydazy (MPO) na tkance jelitowej z prowokacją DNBS
<ol>
	<li>Oznaczyć aktywność MPO w 0,5 cm odcinkach okrężnicy otrzymanych w kroku 2.3. Homogenizować tkanki w buforze homogenizacyjnym MPO (0,5% bromku heksadecylotrimetyloamoniowego w 50 mM buforze fosforanu potasu (pH 6,0)) w celu uzyskania 50 mg segmentu okrężnicy/ml zawiesiny buforu homogenizacyjnego.</li>
	<li>Podwielokrotność homogenizowanego roztworu podzielić na porcje o objętości 1 ml i odwirować w temperaturze 4 °C przez 2 minuty przy 10 000 x g.</li>
	<li>Zmieszać 100 μl każdej podwielokrotności z 2,9 ml 50 mM buforu fosforanowego (pH 6,0) zawierającego 0,167 mg/ml chlorowodorku o-dianizydyny i 0,0005% nadtlenku wodoru w kuwecie.</li>
	<li>Zmierzyć szybkość absorbancji za pomocą spektrofotometru przy długości fali 460 nm. Uwaga: Aktywność MPO definiuje się jako ilość enzymu rozkładającego 1 μmol/minH2O2doH2Ow temperaturze pokojowej i jest wyrażona w jednostkach na mg tkanki.</li>
</ol>

<ol><li>Perše, M., Cerar, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPer%C5%A1e%2C+M+%22Dextran+sodium+sulphate+colitis+mouse+model%3A+traps+and+tricks%22">Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks</a>. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).</li>
<li>Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+inflammatory+bowel+disease+in+a+mouse+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression.</a> Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).</li>
<li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+animal+models+of+inflammatory+bowel+disease-an+update+on+the+role+of+the+hypothalamo-pituitary-adrenal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).</li>
<li>Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CD4%2B+lymphocytes+in+the+susceptibility+of+mice+to+stress-induced+reactivation+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis.</a> Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).</li>
<li>Boyer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myenteric+plexus+injury+and+apoptosis+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Auto.+Neurosci.+Basic+Clin%22%5BJournal%5D)">Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis.</a> Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).</li>
<li>Saunders, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+and+cholinergic+neural+pathways+mediate+stress-induced+reactivation+of+colitis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Auto.+Neurosci.+Basic+Clin%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat.</a> Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).</li>
<li>Cuzzocrea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+inhibitor+I+reduces+colon+injury+caused+by+dinitrobenzene+sulphonic+acid+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat.</a> Gut. 48 (4), 478-488 (2001).</li>
<li>Cuzzocrea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+reduces+dinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis.</a> J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).</li>
<li>Innis, S., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+lipids+in+early+development+and+intestinal+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease.</a> Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).</li>
<li>Innis, S. M., de La Presa Owens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fatty+acid+composition+in+pregnancy+alters+neurite+membrane+fatty+acids+and+dopamine+in+newborn+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain.</a> J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).</li>
<li>Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mundra+H.%2CInnis+S.M.+Intestinal+responsiveness+to+experimental+colitis+in+young+rats+is+altered+by+maternal+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).</li>
<li>Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+enteric+nervous+system+in+experimentalcolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis.</a> Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).</li>
<li>Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fish+oil+reduces+progression+of+chronic+inflammatory+lesions+in+a+rat+model+of+granulomatous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis.</a> Gut. 31, 539-544 (1990).</li>
<li>N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Int.+J.+Mol.+Med%22">Int. J. Mol. Med</a>. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).</li>
<li>Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+and+fish+oil+mixture+increases+IL-10%2C+protects+against+DNA+damage+and+decreases+colonic+inflammation+in+rats+with+dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis.</a> Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).</li>
<li>Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+oils+modify+the+host+immune+response+and+colonic+tissue+damage+following+Citrobacter+rodentium+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).</li>
<li>Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+lipid+nutrition+alters+early+intestinal+development+and+programs+the+response+to+experimental+colitis+in+young+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Model DNBS opisany w tym protokole jest cennym, niedrogim i powtarzalnym modelem zapalenia jelita grubego, który można wykorzystać do badania różnych aspektów IBD. Po podaniu doreodbytniczym szczurom lub myszom, DNBS wywołuje znaczny stopień stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek w okrężnicy, przypominając ludzką chorobę Leśniowskiego-Crohna pod względem różnych cech histologicznych, w tym przezściennego naciekania komórek wielojądrzastych i dominującej aktywacji Th1 zależnej od NF-κB.
Model ten...

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) charakteryzuje się przewlekłym, nawracającym stanem zapalnym w przewodzie pokarmowym (GI), powodującym objawy biegunki, utraty wagi i bólu brzucha. Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) to dwie główne formy IBD, które można rozróżnić na podstawie lokalizacji stanu zapalnego w przewodzie pokarmowym. U pacjentów z WZJG stan zapalny zazwyczaj obejmuje odbytnicę i rozciąga się w dół okrężnicy w różnym stopniu, wpływając tylko na powierzchowną błonę śluzową. W przeciwieństwie do tego, CD może wpływać na dowolną część przewodu pokarmowego, chociaż głównie wpływa na jelito kręte i jelito ślepe. CD często objawia się przezściennym stanem zapalnym, często związanym z ziarniniakami i prowadzącym do choroby zwężającej (włóknisto-włóknistej) i/lub penetrującej (przetokowej). Chociaż etiologia IBD pozostaje nieuchwytna, powszechnie przyjmuje się, że IBD jest wieloczynnikowe, obejmujące interakcje między układem odpornościowym gospodarza, podatność genetyczną i reakcje na czynniki środowiskowe i mikrobiologiczne.
Do tej pory zaproponowano różne modele IBD, które wykazują różne reakcje kliniczne, histologiczne i immunologiczne charakterystyczne dla UC i CD. Do najczęściej stosowanych modeli należą myszy modyfikowane genetycznie (IL-2, IL-10, SAMP/Yit), modele indukowane infekcją (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptywne modele transferu (CD45+ RB High, CD62L+ transfer komórek do myszy SCID) oraz chemicznie indukowane modele zapalenia jelita grubego (siarczan sodu dekstranu (DSS), kwas trinitrobenzenosulfonowy (TNBS) i kwas dinitrobenzenosulfonowy (DNBS)). Ze względu na niski koszt i szybki początek choroby, modele chemiczne są uważane za nieocenione w badaniu różnych aspektów IBD. Każdy z wymienionych modeli chemicznego zapalenia jelita grubego ma zalety, ale także ograniczenia w niektórych aspektach ich klinicznego, immunologicznego i histopatologicznego znaczenia dla IBD. DSS jest jedną z najczęstszych metod chemicznych stosowanych do wywoływania zapalenia jelita grubego u gryzoni1. Podawanie 3-10% DSS (MW: 42 kDa) przez 7-10 dni w wodzie pitnej myszy może wywołać objawy i oznaki zapalenia jelita grubego, w tym utratę masy ciała, biegunkę z krwią, skrócenie jelita grubego, owrzodzenie błony śluzowej i naciek neutrofili. Model ten jest szczególnie przydatny w badaniach przesiewowych leków, a także w badaniu mechanizmów regeneracji nabłonka, wpływu odporności wrodzonej na homeostazę błony śluzowej oraz roli stanu zapalnego w promowaniu dysplazji jelitowej i rozwoju gruczolakoraka. Istnieją jednak pewne wady modelu DSS, w tym różnice w stężeniu DSS potrzebnym do wywołania zapalenia jelita grubego w różnych obiektach zwierzęcych, a także niespójne pobieranie wody przez myszy, a tym samym niespójne narażenie na DSS, co skutkuje różnicami w stopniu, zakresie i rozmieszczeniu uszkodzenia błony śluzowej i owrzodzenia jelita grubego. Wszystkie te cechy prowadzą do niejednorodności wyników i ograniczają możliwość porównywania wyników między badaniami z różnych grup badawczych.
Alternatywą dla modelu DSS są indukowane haptenami modele DNBS lub TNBS zapalenia jelita grubego. Model ten wykorzystuje doodbytnicze wkraplanie środków uczulających błonę śluzową DNBS lub TNBS, rozcieńczonych w różnych stężeniach etanolu. Podanie etanolu jest warunkiem wstępnym do przerwania bariery błony śluzowej okrężnicy, aby umożliwić przenikanie DNBS lub TNBS do blaszki właściwej. DNBS/TNBS będzie następnie haptenizować zlokalizowane białka mikrobiologiczne okrężnicy i jelit, aby stały się immunogenne, wywołując w ten sposób wrodzoną i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną gospodarza. Ogólnie rzecz biorąc, model ten wiąże się z ciężką, a czasem krwawą biegunką, utratą masy ciała i pogrubieniem ścian jelit, jednak objawy różnią się w zależności od rodzaju użytego gryzonia, a także czasu, dawki i stopnia ekspozycji na DNBS lub TNBS zastosowany w badaniu. Należy zwrócić uwagę na istotne różnice między szczurami a myszami, z korzyściami wynikającymi z niższych kosztów zakupu i wyżywienia, a także niższej masy ciała w celu zmniejszenia kosztów leczenia in vivo w przeliczeniu na zwierzę. Należy to zestawić z szybszym i cięższym przebiegiem zapalenia jelita grubego u myszy, gdzie bardziej delikatne i wrażliwe zwierzęta mogą szybko osiągnąć humanitarny punkt końcowy.
Zapalenie jelit początkowo wynika z wywołanego etanolem uszkodzenia komórek nabłonka jelitowego, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności nabłonka, penetracji mikrobiologicznej do błony śluzowej, haptenizacji białek gospodarza, wszystko to powoduje infiltrację neutrofili, makrofagów i limfocytów T Th1 do uszkodzonej błony śluzowej. W porównaniu z DNBS, TNBS jest uważany za niebezpieczną substancję chemiczną ze względu na swoje silne właściwości utleniające, które mogą stwarzać ryzyko wybuchu w kontakcie z zasadami, takimi jak wodorotlenek sodu i potasu. Dlatego DNBS jest obecnie uważany za preferowany wybór substancji chemicznej w stosunku do TNBS w celu wywołania zapalenia jelita grubego. U gryzoni zapalenie jelita grubego DNBS jest uważane za jedną z najwygodniejszych metod badania następujących modyfikatorów choroby związanych z IBD:
<ol>
	<li>Depresja i reaktywacja zapalenia jelita grubego: Wykazano, że stres, lęk i depresja u pacjentów z IBD są często związane z nawrotem choroby. Zapalenie jelita grubego DNBS jest odpowiednim modelem do badania roli depresji i jej konsekwencji dla reaktywacji zapalenia jelita grubego u myszy. Metoda zazwyczaj polega na początkowej indukcji zapalenia jelita grubego przez DNBS, a następnie ustąpieniu zapalenia jelita grubego poprzez pozostawienie myszy na 6-8 tygodni. Myszom podaje się następnie środki powodujące depresję, takie jak rezerpina lub bulbektomię węchową w celu wywołania depresji, a następnie testuje się je pod kątem reaktywacji zapalenia jelita grubego poprzez prowokację subkolityczną dawką DNBS2.</li>
	<li>Stres i reaktywacja zapalenia jelita grubego: Stres jest kolejnym powszechnym czynnikiem środowiskowym, który został powiązany z patogenezą IBD. Istnieje coraz więcej dowodów sugerujących silny związek między przewlekłym stresem a wystąpieniem objawów UC i CD u gryzoni, a także u ludzi i naczelnych3. Zapalenie jelita grubego DNBS jest dobrym modelem do badania związanej ze stresem reaktywacji zapalenia jelita grubego zarówno u myszy, jak i szczurów. Metoda jest zwykle stosowana w podobny sposób, jak wspomniano powyżej w przypadku depresji, z wyjątkiem tego, że zamiast depresji zwierzęta są narażone na stresory, takie jak stres dźwiękowy i powściągliwość4.</li>
	<li>Zapalenie neurogenne: W wielu badaniach opisano przejściowe lub trwałe zmiany w strukturze i funkcji jelitowego układu nerwowego (ENS), co zaobserwowano w próbkach tkanek z modeli zwierzęcych i od pacjentów z IBD. DNBS jest dobrym modelem do badania wpływu stanu zapalnego na ENS5 oraz do badania zarówno noradrenergicznych, jak i cholinergicznych ścieżek nerwowych6.</li>
	<li>Mechanizmy naprawy urazów: Podczas patogenezy IBD wykazano, że mediatory uszkodzeń pochodzące od gospodarza, takie jak reaktywne formy tlenu (ROS), tlenek azotu (NO), międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 3 (ICAM-3) i selektyna P, odgrywają rolę w zaburzeniu nabłonka jelitowego. DNBS jest doskonałym modelem do badania urazów spowodowanych regulacją w górę tych mediatorów, a także mechanizmów naprawczych, które są regulowane przez stosowanie selektywnych leków lub inhibitorów7,8.</li>
	<li>Zapalenie przezścienne: Oprócz wyżej wymienionych zastosowań DNBS, model może być również stosowany do badania przezściennego zapalenia jelit, klasycznej cechy występującej u pacjentów z CD. Zarówno zapalenie jelita grubego wywołane przez DNBS, jak i TNBS są związane ze znacznym naciekaniem limfocytów do błony śluzowej okrężnicy, co czyni te modele szczególnie przydatnymi do badania mechanizmów odpornościowych zależnych od limfocytów T.</li>
</ol>
W porównaniu z modelem DSS, zalety zapalenia jelita grubego wywołanego przez DNBS i TNBS obejmują niski koszt, szybki rozwój zapalenia jelita grubego (zwykle potrzeba 1-3 dni, aby wykazać powtarzalne owrzodzenie i stan zapalny) oraz stałe miejscowe uszkodzenie dystalnej części jelita grubego. Jednak wadami są wymóg wyższego poziomu wiedzy technicznej, optymalizacja dawki DNBS/TNBS oraz potrzeba znieczulenia do podawania doodbytniczego.
W tym artykule metodologicznym badaliśmy wpływ różnych stężeń wielonienasyconych kwasów tłuszczowych n-6 i n-3 na zmianę odpowiedzi błony śluzowej okrężnicy na zapalenie jelita grubego wywołane DNBS u szczurów za pomocą olejów roślinnych, oleju szafranowego (SO) i oleju rzepakowego (CO) oraz oleju rybnego (FO). Wykazano, że kwasy tłuszczowe n-6 i n-3 są ważnymi mediatorami zapalenia jelit poprzez ich rolę jako ugrupowania acylowe fosfolipidów błony komórkowej9. W przeciwieństwie do potencjału prozapalnego kwasów tłuszczowych n-6, kwasy tłuszczowe n-3 przy odpowiednio wysokim spożyciu są potencjalnie silnymi środkami przeciwzapalnymi. Przeciwzapalne działanie kwasów tłuszczowych n-3 odbywa się bezpośrednio poprzez zastąpienie kwasu arachidonowego jako substratu eikozanoidowego, hamując metabolizm kwasu arachidonowego oraz pośrednio poprzez zmianę prozapalnej ekspresji genów i sygnalizacji komórkowej. Kwasy tłuszczowe n-3 dają również początek rezolwinom, rodzinie mediatorów przeciwzapalnych. Wysokie spożycie kwasów tłuszczowych n-3 wiąże się ze spadkiem produkcji prozapalnych eikozanoidów, cytokin, chemokin, reaktywnych form tlenu i ekspresji cząsteczek adhezyjnych. W tym badaniu szczury były karmione dietą ad libitum identyczną pod względem wszystkich składników odżywczych z wyjątkiem kwasów tłuszczowych, z procentem energii z tłuszczu, 20% SO, 20% CO lub 18% oleju rybnego plus 2% oleju szafranowego (FO)10-11. Jako procent dziennej energii dieta SO dostarczała 15% kwasu linolowego (LA), z <0,06% kwasu α-linolenowego (ALA) i bez kwasu eikozapentaenowego (EPA) lub kwasu dokozaheksaenowego (DHA), dieta CO zawierała 4,2% LA i 1,9% ALA bez EPA lub DHA, a dieta FO dostarczała 1,4% EPA, 4,9% DHA, 0,32% LA, i 0,12% ALA. Trzy tygodnie po rozpoczęciu diety lipidowej myszom podawano doodbytniczy DNBS lub 50% etanol i uśmiercano 5 dni później. Odpowiedź zapalną oceniano na podstawie oceny utraty masy ciała, oceny uszkodzeń histologicznych i aktywności mieloperoksydazy tkankowej.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Igła 19 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305187</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa PE-50</td><td>BD Biosciences</td><td>427517</td><td>do podawania doodbytniczego u myszy</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa PE-90</td><td>BD Biosciences</td><td>427519</td><td>do podawania doodbytniczego u szczurów</td></tr><tr><td>DNBS</td><td>MP Bio</td><td>150959</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Żel przeciwłzowy</td><td>Novartis</td><td>63601662596</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Fisher</td><td>5F93-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Podkładka rozgrzewająca</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>A-962.4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromek heksadecylotrimetyloamonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor fosforanu potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79628-</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>dichlorowodorek o-dianizydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3252</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>30% spektrofotometr <td>nadtlenku wodoru</td> <td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31642</td></tr><tr><td>spektrofotometr</td> nadtlenku wodoru <td>BioRad</td><td>Benchmarker Plus</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Image.Z1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Program do analizy danych&nbsp;</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>Oprogramowanie GraphPad Prism w wersji 4.00</td><td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td></tr></tbody></table>

modele zapalenia jelita grubego dnbs/tnbs: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Choroby zapalne jelit (IBD), w tym choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, od dawna są związane z podłożem genetycznym, a ostatnio z reakcją immunologiczną gospodarza na czynniki mikrobiologiczne i środowiskowe. Zapalenie jelita grubego wywołane kwasem dinitrobenzenosulfonowym (DNBS) pozwala badać patogenezę czynników środowiskowych związanych z IBD, takich jak stres i dieta, skutków potencjalnych terapii oraz mechanizmów leżących u podstaw zapalenia jelit i uszkodzenia błony śluzowej. W tym artykule zbadaliśmy wpływ dietetycznych kwasów tłuszczowych n-3 i n-6 na odpowiedź zapalną błony śluzowej okrężnicy na zapalenie jelita grubego wywołane DNBS u szczurów. Wszystkie szczury były karmione identyczną dietą, z wyjątkiem różnych rodzajów kwasów tłuszczowych [olej szafranowy (SO), olej rzepakowy (CO) lub olej rybny (FO)] przez trzy tygodnie przed ekspozycją na DNBS doodbytniczy. Szczury kontrolne, którym podawano etanol doodbytniczy, nadal przybierały na wadze w ciągu 5-dniowego badania, podczas gdy szczury leczone DNBS karmione dietami lipidowymi straciły na wadze, a szczury karmione FO i CO wykazały znaczną utratę masy ciała po 48 godzinach, a szczury karmione SO o 72 godziny. Przyrost masy ciała powrócił po 72 godzinach po DNBS, a po 5 dniach od DNBS grupa FO miała wyższą masę ciała niż grupy SO lub CO. Wycinki jelita grubego pobrane 5 dni po leczeniu DNBS wykazały owrzodzenie ogniskowe, zniszczenie krypty, wyczerpanie komórek kubkowych i naciekanie błony śluzowej zarówno ostrych, jak i przewlekłych komórek zapalnych, które różniły się nasileniem w zależności od grupy dietetycznej. Grupa karmiona SO wykazała najpoważniejsze uszkodzenia, a następnie grupy karmione FO, a grupy karmione FO wykazały najłagodniejszy stopień uszkodzenia tkanek. Podobnie, aktywność mieloperoksydazy okrężnicy (MPO), marker aktywności neutrofili, była znacznie wyższa w SO, a następnie u szczurów karmionych CO, przy czym szczury karmione FO miały znacznie niższą aktywność MPO. Wyniki te pokazują zastosowanie zapalenia jelita grubego wywołanego przez DNBS, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, w celu określenia wpływu diety na patogenezę IBD.

Wprowadzenie DNBS u szczurów (Sprague-Dawley) lub myszy (C57BL/6) zazwyczaj prowadzi do przejściowej utraty masy ciała i biegunki, niekiedy z obecnością krwi w stolcu. Jednak czynniki takie jak genetyka, dieta i mikrobiota jelitowa mogą modyfikować podatność na zapalenie jelita grubego indukowane DNBS. Dlatego zwierzęta włączone do eksperymentów powinny pochodzić z tej samej instytucji, będąc albo hodowlą lokalną, albo zamówionymi od jednego dostawcy zwierząt. Wszystkie zwierzęta powinny być dokładnie monitorowane pod ką...

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie alternatywnej i niedrogiej metody badania nieswoistej zapalnej choroby jelit (IBD) z wykorzystaniem kwasu dinitrobenzenosulfonowego (DNBS). Cel ten osiąga się poprzez podanie DNBS drogą doodbytniczą za pomocą delikatnego wprowadzenia do odbytu. W drugim kroku pobiera się fragmenty tkanki jelita grubego do badania histologicznego oraz w celu oceny aktywności mieloperoksydazy w tkankach poddanych działaniu DNBS; w końcowej fazie efekty stosowania olejów dietetycznych w kontekście utraty masy ciała i zapalenia jelit można ocenić zarówno metodami makroskopowymi, jak i mikroskopowymi.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącą metodą z użyciem dekstranu siarczanu sodu jest to, że metoda DNBS jest łatwa do przeprowadzenia, mniej kosztowna i wysoce powtarzalna. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad IBD, takie jak rola stresu i depresji w nawrotach IBD lub mechanizmy leżące u podstaw uszkodzenia i naprawy jelit. W celu podania DNBS do odbytnicy myszy, należy rozpocząć od przymocowania strzykawki o pojemności 1 mL do igły o rozmiarze 19 G. Po wyposażeniu w cewnik polietylenowy 50, należy zas

dnbstnbs-colitis-models-providing-insights-into-inflammatory-bowel

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modele zapalenia jelit DNBS/TNBS: Zapewnianie informacji na temat choroby zapalnej jelit i wpływu tłuszczu pokarmowego

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu unieważnienia genów związanych z degustacją na odpowiedzi immunologiczne w mysim modelu IBD wywołanym siarczanem dekstranu sodu (DSS).

Wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

Ten protokół opisuje mysi model zwłóknienia jelit wywołanego przez Salmonellę, który przypomina kluczowe patologiczne cechy choroby Leśniowskiego-Crohna, w tym przezścienne zapalenie i zwłóknienie. Metoda ta może być stosowana do oceny czynników gospodarza, które zmieniają wyniki zwłóknienia przy użyciu zmutowanych myszy utrzymywanych na tle genetycznym C57Bl/6.

Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

Protokół przedstawia kompletny, potwierdzony, indukowany przez TNBS mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna oraz metody wizualizacji receptorów estrogenowych za pomocą immunohistochemii przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych formaliną odcinków jelita grubego zanurzonych w parafinie.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

Obecny protokół opisuje rozwój podobnego do choroby Leśniowskiego-Crohna modelu zapalenia jelita grubego u gryzoni. Zapalenie przezścienne prowadzi do zwężenia w miejscu wkroplenia TNBS, a powiększenie mechaniczne obserwuje się w segmencie bliższym zwężeniu. Zmiany te pozwalają na badanie naprężeń mechanicznych w zapaleniu jelita grubego.

Model gryzoni indukowany przez TNBS do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna

Protokół ten pokazuje, jak model myszy zawierający domenę homologii 2 zawierający domenę 5'-inozytol fosfatazy (SHIP) niedoborowy dla zapalenia i włóknienia kości typu Leśniowskiego-Crohna (CD) podobnego do choroby Leśniowskiej (CD) może być wykorzystywany do testowania nowych terapii dla CD.

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

Poznaj metodę indukcji zapalenia jelita grubego DNBS u myszy i szczurów jako alternatywę dla badań nad nieswoistymi zapaleniami jelit. Ta technika umożliwia analizę wpływu olejów w diecie na przebieg choroby.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie (Wideo) | JoVE Journal

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Przeglądaj więcej filmów