Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Ogólnym celem tej procedury jest zaoferowanie alternatywnej i niedrogiej metody badania nieswoistego zapalenia jelit lub IBD przy użyciu kwasu strefowego nitro benzenu DY lub DNBS. Osiąga się to poprzez pierwsze doodbytnicze podanie DNBS poprzez delikatne wprowadzenie do odbytu. W drugim etapie pobierane są skrawki tkanki jelita grubego do histologicznych badań przesiewowych i oceny aktywności peroksydazy mielo w tkankach zagrożonych DNBS, ostatecznie wpływ olejów dietetycznych na utratę wagi i zapalenie jelita grubego można ocenić zarówno metodami makroskopowymi, jak i mikroskopowymi.

Główną przewagą tej materii nad istniejącą metodą siarczanu sodu dekstronu jest to, że metoda DNBS jest łatwa do wykonania, tańsza i wysoce odtwarzalna. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad IBD, takie jak jakie są role stresu i depresji w nawrocie IBD lub jakie są mechanizmy leżące u podstaw uszkodzenia i naprawy jelit W przypadku instalacji DNBS doodbytniczo u myszy zacznij od podłączenia strzykawki o pojemności jednego mililitra do igły o rozmiarze 19. Wyposażony w cewnik z polietylenu 50, a następnie odessać świeżo przygotowany DNBS do cewnika.

Następnie nałóż żel łzowy na znieczuloną mysz i delikatnie dociśnij opuszkami palców do tylnego końca zwierzęcia, aby usunąć stolec obecny w dystalnej części okrężnicy. Teraz wstrzyknij niewielką ilość roztworu DNBS, aby nasmarować okrężnicę w celu łatwiejszego wprowadzenia, jednocześnie delikatnie wprowadzając cewnik doodbytniczy na około trzy do czterech centymetrów. Po umieszczeniu cewnika wstrzyknąć 100 mikrolitrów DNBS lub równą objętość 50% etanolu dla zwierząt kontrolnych.

Następnie połóż głowę zwierzęcia w dół na 90 sekund, aby uniknąć utraty odczynników. Po podaniu DNBS należy podawać zwierzętom 8% wody z sacharozą w 0,2% soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu w pierwszym tygodniu. Uważne monitorowanie dziennego zwierzęcia pod kątem utraty wagi, odwodnienia lub stresu przez czas trwania eksperymentu w pożądanym punkcie czasowym.

Po prowokacji DNBS otwórz jamę brzuszną zwierzęcia poddanego eutanazji i usuń całe jelito grube. Następnie otwórz jelito wzdłużnie. Makroskopowe owrzodzenia błony śluzowej należy obserwować około dwóch do trzech centymetrów proksymalnie od dystalnego końca jelita grubego.

Pobrać 0,5-centymetrowe odcinki proksymalnie do miejsca maksymalnego uszkodzenia makroskopowego u zwierząt doświadczalnych i segmenty jelita grubego z odpowiednich lokalizacji anatomicznych od zwierząt kontrolnych. Następnie zamrozić 0,5 centymetra od jednej sekcji kontrolnej i 1D poddanej działaniu NBS w ciekłym azocie w celu oceny aktywności peroksydazy mielo i utrwalić pozostałe sekcje w 10% neutralnej buforowanej forminie przez noc lub w analizie histologicznej. Następnego ranka umyj utrwalone tkanki formaliną 70% etanolem i umieść w kasecie, aby wysłać do zakładu histologicznego, gdzie zostaną zatopione w parafinie i zabarwione hematyną i eoiną w celu oceny histologicznej.

Następnie oceń co najmniej trzy skrawki tkanek od każdego zwierzęcia pod mikroskopem świetlnym, aby określić wyniki uszkodzeń histologicznych dla każdej grupy Aby oznaczyć aktywność peroksydazy mielo w tkankach zakwestionowanych DNBS. Najpierw homogenizuj zatrzaskowo zamrożone tkanki kontrolne i eksperymentalne w buforze homogenizacyjnym peroksydazy mielo, aby uzyskać 50-miligramowy segment okrężnicy na mililitr zawiesiny buforu homogenizacyjnego. Następnie podzielić homogenizowany roztwór na jednomililitrowe porcje i odwirować je przez dwie minuty w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie przenieś 100 mikrolitrów każdej podwielokrotności do poszczególnych kuwet i dodaj 2,9 mililitra PBS uzupełnionego IDE, dichlorowodorkiem i nadtlenkiem wodoru, energicznie mieszając. Na koniec zmierz szybkość absorbancji za pomocą spektrofotometru o długości 460 nanometrów. Po prowokacji doodbytniczej z DNBS, jak właśnie pokazano.

Znaczną utratę masy ciała obserwuje się po 48 godzinach u szczurów suplementowanych olejem rybnym lub rzepakowym oraz po 72 godzinach u szczurów suplementowanych olejem szafranowym. Maksymalna obserwowana utrata masy ciała występuje po 48 godzinach w przypadku oleju rybnego, suplementacji szczurów i po 72 godzinach u szczurów. Uzupełniony olejem rzepakowym lub szafranowym.

Przyrost masy ciała powrócił po 72 godzinach, a po pięciu dniach od podania DNBS grupy leczone olejem rybnym i olejem szafranowym wykazywały masę ciała podobną do wartości wyjściowych. Szczury kontrolne, którym podawano oleje dietetyczne i prowokowano podawanie etanolu doodbytniczego, stale przybierały na wadze przez cały pięciodniowy okres badania. Uszkodzenia jelit spowodowane przez DNBS mogą być rozległe.

Jednak obszar maksymalnego uszkodzenia jest na ogół zlokalizowany w dystalnej części jelita grubego na sześciu centymetrach u szczurów i na dystalnych trzech centymetrach u myszy. Po dokładniejszej ocenie histologicznej obserwuje się rozległe uszkodzenie nabłonka, w tym powstawanie wrzodów, naciek neutrofili i limfocytów, ubytek śluzu i obrzęk. Chociaż te histologiczne objawy stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek są widoczne we wszystkich trzech grupach suplementowanych olejem dietetycznym po prowokacji DNBS, najpoważniejsze uszkodzenia obserwuje się w grupie oleju szafranowego, a następnie w grupie oleju rzepakowego.

Natomiast szczury z grupy otrzymującej olej rybny wykazują minimalne uszkodzenie nabłonka i ograniczoną infiltrację komórek zapalnych do błony śluzowej. Różnice w uszkodzeniach histologicznych między próbkami można określić ilościowo, aby umożliwić lepsze porównanie między grupami. Wykres ilustruje wyniki uszkodzeń histologicznych dla trzech grup olejów dietetycznych podczas zapalenia jelita grubego DNBS.

Jak zaobserwowano w sekcjach barwionych olejem krzyżowym i krzyżowym, grupa suplementowana olejem szafranowym wykazuje największy zakres uszkodzeń, a następnie grupa oleju rzepakowego. Podczas gdy grupa oleju rybnego wykazuje najmniejsze uszkodzenia, zakres nacieku komórek zapalnych, zwłaszcza neutrofili, można dalej badać, wykonując test aktywności peroksydazy mielo. Zgodnie z oczekiwaniami na podstawie wyników uszkodzeń histologicznych.

Ocena aktywności peroksydazy mielologicznej w okrężnicy szczura w piątym dniu po ekspozycji na DNBS ujawnia wzrost aktywności we wszystkich trzech grupach, przy czym największą aktywność peroksydazy mielo zaobserwowano w grupie oleju szafranowego, a następnie w grupie oleju rzepakowego i grupy oleju rybnego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o lekkim znieczuleniu myszy i optymalizacji dawek DNBS po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nieswoistymi zapaleniami jelit do zbadania mechanizmów kontrolujących zapalenie jelit w zwierzęcych modelach IBD.

Nie zapominaj, że praca z DNBS może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przygotowywania roztworu należy zawsze nosić środki ostrożności, takie jak odzież ochronna, rękawice, okulary i maseczki.