Name: Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną metodę podwójnej torakotomii u szczurów z zawałem mięśnia sercowego. Technika obejmuje wiązanie LAD i implantację komórek z biomatrycą, co poprawia przeżycie i funkcję serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. Hendrikowi Tevaearai i Departamentowi Chirurgii Sercowo-Naczyniowej za wsparcie finansowe dla początkowej części badania.

UWAGA: Samce i samice szczurów Lewis, 200-220 g były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych (12-godzinny cykl światła i ciemności, woda i jedzenie ad libitum, klatka IVC). Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z zaleceniami FELASA i szwajcarskiej ustawy o ochronie zwierząt.
1. Przygotowanie komórek: Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego
<ol>
	<li>Znieczulić szczury izofluranem 5% i O2 5 l/min w komorze indukcyjnej przez 5 minut. Umieść pysk zwierzęcia w stożku nosowym podłączonym do systemu znieczulającego. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, aby potwierdzić sedację.</li>
	<li>Usuń skórę z nogi nożyczkami, przecinając skórę od kostki do biodra. Usuń mięśnie i przetnij tętnicę udową w celu wykrwawienia zwierzęcia. Odsłoń staw biodrowy i zwichnij głowę kości udowej. Ważne jest, aby nie uszkodzić głowy kości udowej. Umieść kości w sterylnym PBS w plastikowej tubie o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Usuń wszystkie mięśnie i więzadła z kości, nie łamiąc ich. UWAGA: Ważne jest, aby kość pozostała nienaruszona, aby uniknąć połączenia roztworu płuczącego lub zanieczyszczenia etanolem. Opłucz obrane kości w 70% etanolu przez 5 min.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym odetnij oba końce kości nożyczkami. Przepłukać szpik kostny, wstrzykując sterylny PBS z kończyny kostnej. Pobrać szpik do probówki o pojemności 15 ml. Wirować 7 min przy 300 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować zawiesinę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie wirować przez 7 minut w temperaturze 300 x g. Do kolby hodowlanej o pojemności 150 ml dodać sterylną pożywkę do hodowli komórkowych (395 ml pożywki IMDM, 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca, 100 ml FBS) i zasiać komórki. </li>
	<li>Zmień pożywkę na drugi dzień, aby usunąć nieprzylegające komórki.
	<ol>
		<li>Wykonuj zmiany pożywki co drugi dzień przez 2-3 tygodnie, aż do uzyskania pożądanej ilości komórek.</li>
		<li>Alternatywnie, przygotuj biograft, umieszczając komórki na stałej matrycy w razie potrzeby i opisanej w innym miejscu3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu implantacji serca należy przygotować komórki lub pobrać biogram tuż przed aplikacją nasierdzia.
	<ol>
		<li>Zebrać komórki za pomocą roztworu do odrywania komórek Accutase. Policz komórki. Napełnij probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml objętością zawiesiny komórek obliczoną w celu uzyskania pożądanej ilości komórek. Wirować przez 7 minut przy 300 x g i usunąć supernatant.</li>
		<li>Alternatywnie, należy zebrać biograft z pożywki do hodowli komórkowych, wypłukać w sterylnym PBS i przechowywać w świeżej pożywce hodowlanej bez surowicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pierwsza torakotomia i podwiązanie LAD
<ol>
	<li>Zważ szczura. Włączyć poduszkę grzewczą w temperaturze 37 °C. Znieczulić szczura 5% izofluranem i 5 l/min 100%O2 w komorze indukcyjnej przez 5-7 minut. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, aby potwierdzić sedację. Umieść szczura na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Zaintubować zwierzę za pomocą cewnika dożylnego o stężeniu 14 g. Podłączyć cewnik intubacyjny do respiratora dla gryzoni zaprogramowanego na 2,5 l/min tlenu, 2,5% izofluranu, objętość oddechową 2 ml i częstotliwość oddychania 90 oddechów/min.</li>
	<li>Przygotować roztwór buprenorfiny w stężeniu 0,1 mg/kg. Wstrzyknąć podskórnie jedną trzecią roztworu. Ogol lewą część klatki piersiowej. Zdezynfekować 1% roztworem betadyny.</li>
	<li>Naciąć skórę prostopadle do mostka w czwartej przestrzeni międzyżebrowej. Oddziel 3 warstwy mięśnia piersiowego (mięsień piersiowy większy, rosnący mięsień piersiowy i zewnętrzny skośny mięsień piersiowy). Otwórz czwartą przestrzeń międzyżebrową (między żebrami 4 i 5).</li>
	<li>Użyj małego retraktora, aby rozłożyć żebra i odsłonić serce. Ostrożnie otwórz osierdzie. Zlokalizuj i podwiązaj lewą przednią zstępującą tętnicę wieńcową (LAD) za pomocą szwu 7,0 4 mm poniżej przedsionka.</li>
	<li>Zamknij przestrzeń międzyżebrową dwoma szwami za pomocą szwów 3,0. Ustaw oba szwy proksymalnie i dystalnie od mostka. Najpierw dokręć szew dystalny. Zaciśnij rurkę odprowadzającą wentylator na 2 sekundy, aby napompować klatkę piersiową i uniknąć odmy opłucnowej. Dokręć drugi szew. Ułóż warstwy mięśni z powrotem na miejscu (nie są potrzebne szwy). Zamknij skórę szwem 5.0.</li>
	<li>Zdezynfekuj szew 1% roztworem betadyny. Wstrzyknąć pozostałą część roztworu buprenorfiny. Wyłącz system znieczulający. Usunąć cewnik do intubacji.</li>
	<li>Trzymaj szczura w klatce pod ciepłą lampą przez 1-2 godziny. Trzymaj termometr w klatce i kontroluj odległość między ciepłą lampą a klatką, aby uniknąć przegrzania. Zwróć szczura do jednostki IVC. Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie w dawce 0,05-0,1 mg/kg po operacji co 6-12 godzin przez 48 godzin.</li>
</ol>
3. Leczenie nasierdziowe za pomocą drugiej torakotomii
<ol>
	<li>Powtórz kroki 2.1-2.3.</li>
	<li>Naciąć skórę prostopadle do mostka w piątej przestrzeni międzyżebrowej. Oddziel 3 warstwy mięśnia piersiowego (mięsień piersiowy większy, pierścień wstępujący i mięsień piersiowy skośny zewnętrzny). Otwórz piątą przestrzeń międzyżebrową (między żebrami 5 i 6).</li>
	<li>Użyj małego retraktora, aby rozłożyć żebra i odsłonić serce. Jeśli jest trochę przylegania, ostrożnie usuń je drobnymi kleszkami.</li>
	<li>Zlokalizuj obszar zawału, który pojawia się jako blady obszar poniżej ligatury. UWAGA: W razie potrzeby użyj 10-centymetrowego szwu (7,0) wprowadzonego na wierzchołku, aby lepiej uwidocznić lewą komorę. Delikatnie pociągnij za szew luźno utrzymywany przez zacisk, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Zastosuj jeden z następujących zabiegów:
	<ol>
		<li>Umieść biograft na powierzchni serca. Użyj ampułkostrzykawki z uszczelniaczem fibrynowym podgrzanej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Nanieść kroplę (50-100 μl) uszczelniacza fibrynowego pod biograft za pomocą igły Luer 25 G. Sprawdź, czy biograft jest idealnie uszczelniony.</li>
		<li>Alternatywnie, nałóż osad komórkowy zebrany końcówką pipety na powierzchni serca na blady obszar poniżej ligatury. Nanieś kroplę (50-100 μl) fibrynowego uszczelniacza na osad komórkowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń kawałek szwu z wierzchołka.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.6-2.8.</li>
</ol>

<ol><li>Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling+at+the+population+level--risk+factors%2C+screening%2C+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes.</a> Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).</li>
<li>Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+functional+heart+tissue+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regenerating functional heart tissue for myocardial repair.</a> Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).</li>
<li>Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Protocol+for+the+Culture+of+Cells+on+Plasma-Coated+Electrospun+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds.</a> Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).</li>
<li>Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+techniques+for+the+surgical+occlusion+of+coronary+vessels+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Angiology%22%5BJournal%5D)">Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat.</a> Angiology. 11, 398-407 (1960).</li>
<li>Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+heart+failure%3A+an+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rodent models of heart failure: an updated review.</a> Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).</li>
<li>Horstick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+procedure+affects+physiological+parameters+in+rat+myocardial+ischemia%3A+need+for+mechanical+ventilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).</li>
<li>Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+and+Hemodynamic-Effects+of+Lateral+Thoracotomy+or+Sternotomy+in+Mechanically+Ventilated+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats.</a> Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).</li>
<li>Giraud, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-based+engineered+skeletal+muscle+grafts+normalize+heart+function+early+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction.</a> Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).</li>
<li>Siepe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast-seeded+biodegradable+scaffolds+to+prevent+post-myocardial+infarction+evolution+toward+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiov.+Sur%22%5BJournal%5D)">Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure.</a> J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).</li>
<li>Guex, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-functionalized+electrospun+matrix+for+biograft+development+and+cardiac+function+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization.</a> Acta Biomater. 10, (2014).</li>
<li>Terrovitis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Quantification+and+Optimization+of+Acute+Cell+Retention+by+In+Vivo+Positron+Emission+Tomography+After+Intramyocardial+Cardiac-Derived+Stem+Cell+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).</li>
<li>Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+marrow-derived+cardiac+stem+cells+carried+in+fibrin+improves+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).</li>
<li>Qiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+Proliferation+Time+Course+of+Stem+Cells+Transplanted+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium.</a> Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).</li>
<li>Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging+for+Assessment+of+Immune+Responses+Following+Implantation+of+Engineered+Heart+Tissue+%28EHT%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT).</a> J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Trwałe podwiązanie LAD powoduje nieodwracalne uszkodzenie mięśnia sercowego. Pierwszy model zwierzęcy został opisany w 1960 roku4. Od tego czasu jest uważany za standardowy i odpowiedni model dla przewlekłego zawału mięśnia sercowego. Jego stabilność i powtarzalność pozwoliły na eksperymentalną ocenę terapii MI5. Ulepszone procedury zgodnie z początkowym opisem wykazały śmiertelność operacyjną na poziomie 35-13%6.
Zgodnie z oczekiwaniami, podwiązanie LAD spowod...

Od końcaXIX wieku, choroby układu krążenia pozostają numerem jeden wśród seryjnych morderców w krajach uprzemysłowionych. Wśród nich główną etiologię stanowi choroba wieńcowa. Ostra faza prowadzi do zawału mięśnia sercowego (MI), po którym następuje nieadaptacyjna przebudowa, która stopniowo rozwija się w kierunku fazy przewlekłej i ciężkiej niewydolności serca. Pomimo ostatnich znaczących postępów technologicznych i terapeutycznych, zachorowalność i śmiertelność z powodu progresji niewydolności serca wciąż rośnie1. W tym kontekście terapia komórkowa cieszy się coraz większym zainteresowaniem jako nowa opcja terapeutyczna mająca na celu zatrzymanie postępu choroby w kierunku niewydolności serca i stymulowanie niedawno zidentyfikowanej zdolności regeneracyjnej mięśnia sercowego. Badania eksperymentalne i kliniczne dostarczyły przekonujących dowodów na korzystne efekty uzyskiwane po przeszczepieniu serca różnych typów komórek. Główne wyniki obejmowały poprawę funkcji skurczowej serca, zmniejszenie przebudowy lewej komory, zmniejszenie rozmiaru zawału i zwiększenie gęstości naczyń w obszarze zawału. Jednak niska retencja liczby komórek po wstrzyknięciu komórek pozostała istotną wadą. Powiązanie komórek z biomatrycą w celu poprawy dostarczania komórek2 przyczyniło się ostatnio do rozwoju zainteresowań badawczych i klinicznych.
Podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) jest metodą referencyjną dla MI w małym modelu zwierzęcym, która skutkuje przezściennym zawałem i dojrzałą blizną. Terapia komórkowa stosowana w przewlekłej fazie zawału mięśnia sercowego wymaga drugiej interwencji chirurgicznej. Środkowa sternotomia jest zwykle wykonywana, aby umożliwić wstrzyknięcie komórek do mięśnia sercowego lub implantację nasierdzia biorentów. Takie inwazyjne zabiegi chirurgiczne zwiększają śmiertelność, czas rekonwalescencji pooperacyjnej, ból i ryzyko infekcji. Przedstawione tutaj minimalnie inwazyjne podejście nie tylko zapobiega takim odchyleniom, ale także zapewnia optymalną dostępność serca do zastosowania w leczeniu. Implantacja mięśnia sercowego i nasierdzia komórek związanych z biomatrycą typu żelowego jest wykonywana na bijącym sercu za pomocą torakotomii międzyżebrowej lewej strony.

<table><tbody><tr><td>Szew Polysorb 3-0</td><td>Szew Covidien</td><td>UL 204</td><td></td></tr><tr><td>Szew Polysorb 5-0 Szew</td><td>Covidien</td><td>UL 202</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 7-0 Szew</td><td>Covidien</td><td>VP904X</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik Insyte 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany respirator o kontrolowanej objętości</td><td>Inspira Aparat Harvard</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Kleszcze</td><td>FST Niemcy</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz fibrynowy</td><td>Baxter</td><td>1501441</td><td>Klej TISSEEL, Mrożony -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Castroviejo Eye Specula</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8925</td><td>zastosowanie jako zwijacz żeber</td></tr><tr><td>IMDM GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31980</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAA Clone</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do kości</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy czerwonych krwinek</td><td>Gentra Systems</td><td>D-50k1</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie do odłączania komórek Accutase</td><td>Technologia komórek macierzystych</td><td>7920</td><td></td></tr></tbody></table>

terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy

Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix

Terapia komórkowa serca zyskała coraz większe zainteresowanie, a wszczepianie biomateriałów związanych z komórkami stało się głównym problemem w celu optymalizacji dostarczania komórek mięśnia sercowego. Model zawału mięśnia sercowego (MI) u gryzoni składający się z podwiązania lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) był zwykle wykonywany za pomocą torakotomii; Druga operacja na otwartym sercu poprzez sternotomię jest tradycyjnie wykonywana w celu nasierdziowego zastosowania zabiegu. Od czasu opisania modelu podwiązania LAD śmiertelność pooperacyjna spadła z 35-13%, jednak druga operacja pozostała krytyczna. W celu poprawy rekonwalescencji pooperacyjnej oraz zmniejszenia bólu i infekcji przedstawiono małoinwazyjne zabiegi chirurgiczne. Wykonano dwie torakotomie, pierwszą do podwiązania LAD, a drugą do leczenia nasierdzia. Na obszar zawału nałożono bioleki składające się z komórek związanych z matrycami typu stałego lub żelowego. Podwiązanie LAD spowodowało utratę funkcji serca, co potwierdziła echokardiografia wykonana po 2 i 6 tygodniach. Barwienie trichromowe Goldnera przeprowadzone na wycinkach serca potwierdziło powstawanie blizn przezściennych. Pierwsza i druga operacja spowodowały mniej niż 10% śmiertelności pooperacyjnej.

Wszystkie zwierzęta doszły do siebie w ciągu 1 hr po torakotomiach. Gojenie ran przebiegało szybko. Nie zaobserwowano infekcji ani obrzęku.
Podwójna lewostronna torakotomia zapewniła optymalny dostęp do serca (Rycina 1). Ból oraz śmiertelność pooperacyjna były niskie. Zwierzęta szybko regenerowały się po zabiegu i przybierały na wadze (Rycina 2). Procent przeżywalności wg metody Kaplana-Meiera wyniósł 96% po pierwszej torakotomii. Cztery szczury ze 104 zmarły ...

Implantacja biogramu do leczenia zawału mięśnia sercowego wywołanego podwiązaniem LAD w modelu gryzoni tradycyjnie wymagała dwóch operacji na otwartym sercu. W celu zmniejszenia śmiertelności i zapewnienia optymalnych warunków do utrwalania stałych i galaretowatych biomatryc związanych z komórkami, opracowano procedury małoinwazyjne.

Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial ...

Celem niniejszej procedury jest wykonanie podwójnej torakotomii u szczurów w celu przeprowadzenia ligacji tętnicy wieńcowej oraz aplikacji epikardialnej. Realizuje się to poprzez wykonanie torakotomii w czwartej przestrzeni międzyżebrowej, a następnie ligację lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD).Następnie, dwa tygodnie później, wykonuje się drugą torakotomię w piątej przestrzeni międzyżebrowej. Na koniec komórki i macierz nanosi się na powierzchnię bijącego serca z obszarem zawału. Ostatecznie przeprowadza się echokardiografię w celu oceny funkcji serca oraz badanie histologiczne polegające na pomiarze wielkości zawału.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sternotomia, jest to, że stanowi ona podejście małoinwazyjne, wykazując, że procedura zostanie przeprowadzona przez Lopez i współpracowników z naszego laboratorium. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z zaleceniami F-E-L-A-S-A oraz szwajcarską ustawą o ochronie zwierząt. Po upuśczeniu krwi szczurowi oraz wyizolowaniu i oczyszczeniu kości udowych zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć nożyczek, aby odciąć oba końce kości.Następnie, aby wypłukać szpik kostny, wstrzyknij sterylny PBS do wnętrza kości i zbierz szpik do probówki o objętości 15 mililitrów. Odwiruj zebrany szpik kostny przez siedem minut przy 300 ×g. Usuń nadosad z trzech mililitrów buforu do lizy erytrocytów. Zzawiesz osad i inkubuj zawiesinę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie po ponownym zawieszeniu odwiruj przez siedem minut przy 300 ×g.Resuspensja osadu w sterylnym medium hodowlanym. Do kolby hodowlanej o pojemności 150 mililitrów dodać dodatkowe medium do hodowli komórek i zasiać komórki drugiego dnia inkubacji. Wymienić medium, aby usunąć komórki nieprzylegające, a następnie kontynuować wymianę medium co drugi dzień przez dwa do trzech tygodni, aż do uzyskania pożądanej gęstości komórek.Aby przeprowadzić pierwszą torakotomię typu T, należy zacząć od zważenia szczura i odpowiedniego ustawienia parametrów respiratora. Przepływ wydechowy wentylacji jest definiowany automatycznie. Następnie należy ogolić lewą część klatki piersiowej, włączyć podgrzewacz i ustawić go na 37 °C.Po znieczuleniu szczura zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadź próbę uszczypnięcia palca lub ogona przed umieszczeniem zwierzęcia w pozycji grzbietowej na podkładce grzewczej; używając cewnika dożylnego 14G, dokonaj intubacji zwierzęcia, a następnie podłącz cewnik intubacyjny do respiratora dla gryzoni. Urządzenie zaprogramuj na dopływ tlenu 2,5 litra na minutę, stężenie isofluranu 2,5%, objętość oddechową 2 ml oraz częstotliwość oddechów 90 na minutę. Po przygotowaniu strzykawki z buprenorfiną w dawce 0,1 mg/kg podawanej podskórnie, wstrzyknij jedną trzecią roztworu, a następnie odkaź obszar za pomocą 1% roztworu Betadine.Następnie wykonaj nacięcie skóry prostopadle do mostka na poziomie czwartej przestrzeni międzyżebrowej i rozdziel trzy warstwy mięśni klatki piersiowej. Następnie otwórz czwartą przestrzeń międzyżebrową pomiędzy czwartym a piątym żebrem. Użyj małego rozwieraka, aby rozsunąć żebra i odsłonić serce.Następnie ostrożnie otwórz osierdzie i zlokalizuj lewą przednią zstępującą tętnicę wieńcową (LAD), a następnie użyj nici 7.0 do jej podwiązania cztery milimetry poniżej przedsionka. Następnie kontroluj zmianę koloru obszaru niedokrwiennego za pomocą nici 3-0 umieszczonych przybliżeniu i dystalnie od mostka. Wykonaj dwa szwy, które posłużą do zamknięcia przestrzeni międzyżebrowej.Zaciśnij szew dystalny. Zaklemuj rurkę odpływową wentylatora na dwie sekundy, aby napompować klatkę piersiową i zapobiec odmie opłucnowej. Następnie zaciśnij drugi szew.Przywrócić warstwy mięśniowe na ich pierwotne miejsce. Następnie użyć nici chirurgicznej o rozmiarze 5-0 do zamknięcia skóry, stosując 1% roztwór Betadine. Zdezynfekować miejsce szwów i wstrzyknąć pozostały roztwór buprenorfiny.Wyłącz system anestezji i usuń cewnik intubacyjny. Przetrzymuj szczura w klatce pod ciepłą lampą przez jedną do dwóch godzin przed powrotem do klatki typu IVC. Dwa tygodnie po pierwszej torakotomii proces gojenia jest zakończony, a blizna jest ledwie widoczna.Zgodnie z procedurą przygotowania szczura do operacji, opisaną wcześniej w tym filmie, wykonaj nacięcie skóry prostopadle do mostka na poziomie piątej przestrzeni międzyżebrowej. Rozdziel trzy warstwy mięśni i otwórz piątą przestrzeń międzyżebrową między piątym a szóstym żebrem. Użyj małego rozwieraka, aby rozsunąć żebra i odsłonić serce.Jeśli występuje przyleganie, użyć precyzyjnych pincet, aby je ostrożnie usunąć. Następnie zlokalizować obszar zawału, który widoczny jest jako blady obszar poniżej podwiązania. W razie potrzeby wprowadzić 10 centymetrów nici chirurgicznej o rozmiarze 7/0 w miejscu wierzchołka i delikatnie pociągnąć, aby lepiej zwizualizować lewą komorę.Następnie należy nanieść komórki i macierz na powierzchnię obszaru niedokrwiennego serca. Po odwirowaniu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, osad z 4 × 10⁶ komórek nanosi się na serce, a następnie pokrywa go uszczelniaczem fibrynowym. Warstwa kleju utrwala komórki na powierzchni serca.Po usunięciu fragmentu szwu z pozycji wierzchołkowej, warstwy mięśniowe zszyto i zdezynfekowano zwierzę. Zostało to zaprezentowane wcześniej w filmie, jak pokazano tutaj. Po interwencji chirurgicznej zwierzęta straciły masę ciała i szybko doszły do siebie, zanim ponownie zaczęły przybierać na wadze niezależnie od zastosowanego leczenia. Jak pokazano na tym wykresie Kaplana, wskaźnik przeżywalności po pierwszej torakotomii T jest wysoki; zwierzęta leczone fibryną i/lub komórkami wykazały niższą przeżywalność niż pozostałe grupy, co widać na tym wykresie.Niemniej jednak, ogólne wskaźniki przeżywalności pozostały wysokie po drugiej torakotomii, a funkcję serca oceniono za pomocą echokardiografii. Te reprezentatywne obrazy w trybie M dla zwierząt zdrowych i z zawałem ilustrują, że kurczliwość ściany LV zostaje zniesiona dwa tygodnie po ligacji LAD. Skrócenie frakcyjne zarejestrowano dwa tygodnie po ligacji LAD u łącznie 104 zwierząt.Rozkład częstotliwości wykazuje dość powtarzalne metody z współczynnikiem zmienności wynoszącym 17%. Ten rysunek przedstawia graficzną reprezentację funkcji serca na podstawie zmierzonej frakcji wyrzutowej dwa i sześć tygodni po podwiązaniu LAD. Funkcja serca nadal spada w tym okresie. W tym czasie zachodzi również przebudowa serca, co zostało tutaj przedstawione poprzez wzrost objętości LV zarejestrowany zarówno w skurczu, jak i w rozkurczu. Wreszcie, barwienie złotem na przekrojach serca wykazało, że do szóstego tygodnia po podwiązaniu LAD rozwinęła się tkanka włóknista, a ostatecznie blizna transmuralna. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 do 40 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić małoinwazyjną podwójną torakotomię.

cell-based-therapy-for-heart-failure-rat-double-thoracotomy-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Terapia oparta na komórkach w niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w zawale mięśnia sercowego i nadsercowy implantat komórek i biomatrycy

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano sposób wykorzystania szybkiego i wiarygodnego modelu do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych niedokrwienia mięśnia sercowego.

Ligacja LAD: mysi model zawału mięśnia sercowego

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Tutaj prezentujemy protokół indukcji kriouszkodzenia lewej komory, po którym następuje wszczepienie łaty mięśnia sercowego, pochodzącej z ludzkich kardiomiocytów komórek iPS w modelu świnki morskiej.

Implantacja plastrów sercowo-mięśniowych pochodzących z hiPSC po urazie mięśnia sercowego w modelu świnki morskiej

Staraliśmy się stworzyć świński model niewydolności serca wywołanej zablokowaniem lewej tętnicy obwodowej i szybką stymulacją, aby przetestować efekt i bezpieczeństwo domięśniowego podawania komórek macierzystych w terapiach komórkowych.

Opracowanie świńskiego modelu niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego do leczenia komórkami macierzystymi

Komórki macierzyste są stale badane jako potencjalne metody leczenia osób z uszkodzeniem mięśnia sercowego, jednak ich zmniejszona żywotność i retencja w uszkodzonej tkance może wpłynąć na ich długoterminową skuteczność. W tym manuskrypcie opisujemy alternatywną metodę dostarczania komórek macierzystych w mysim modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.

Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Poznaj minimalnie inwazyjną metodę podwójnej torakotomii u szczurów z zawałem mięśnia sercowego. Technika obejmuje wiązanie LAD i implantację komórek z biomatrycą, co poprawia przeżycie i funkcję serca.

Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy (Wideo) | JoVE Journal

Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy

Przeglądaj więcej filmów