Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Ogólnym celem poniższej procedury jest uzyskanie obrazów fluorescencyjnych o superrozdzielczości, które wyjaśniają istotne aspekty organizacji pęcherzyków przy rozdzielczości nieosiągalnej w standardowej mikroskopii fluorescencyjnej. Osiąga się to najpierw poprzez transfekcję neuronów hipokampa DNA kodującym fotokonwertowalne chimery ładunku pęcherzykowego. W drugim kroku, za pomocą systemu mikroskopii superrozdzielczej, gromadzone są rzadko próbkowane obrazy surowe.

Następnie surowe obrazy są przetwarzane w celu uzyskania obrazu o superrozdzielczości. W ostatnim kroku dane są kwantyfikowane, aby wyjaśnić organizację pęcherzyków. Ostatecznie profile liniowe intensywności punktów mogą zostać wykorzystane do porównania odległości między pęcherzykami z ich szerokością, co pozwala określić, czy pęcherzyki znajdują się wystarczająco blisko siebie, aby tworzyć skupisko przy zastosowaniu tej procedury.

Mikroskopia lokalizacji aktywowanej fotochromowo w jednym kolorze (PALM) może być wykorzystywana do badania organizacji organelli w większości typów hodowli komórkowych. Aby uruchomić system obrazowania w superrozdzielczości do akwizycji obrazów, należy rozpocząć od włączenia zasilania lampy łukowej. Następnie należy przełączyć przełączniki komputera systemowego oraz komponentów na zdalnym sterowniku zasilania.

Po uruchomieniu tabletu sterującego mikroskopem przełącz przełącznik w pozycję on, włącz komputer i uruchom oprogramowanie. Rozwiń okno statusu bootowania, aby zweryfikować, czy system ładuje się prawidłowo, a następnie wybierz opcję start system w oknie logowania. Aby ustawić próbkę do wizualizacji, otwórz przedni i górny panel szafy bezpieczeństwa laserowego i odchyl ramię światła przechodzącego, aby uzyskać dostęp do stolika i obiektywów.

Następnie nałóż olej na obiektyw alpha plan APO Chromat 100 x do całkowitego wewnętrznego odbicia, fluorescencji lub turf. Następnie wybierz obiektyw o małym powiększeniu do wstępnego etapu ustawiania ostrości. Teraz zamocuj próbkę na stoliku i podnieś obiektyw w stronę próbki.

Monitorowanie pozycji obiektywu za pomocą funkcji X, Y, Z na tablecie sterującym. Należy zatrzymać proces, gdy obiektyw znajdzie się w przybliżeniu w punkcie ostrości. Następnie należy zwizualizować próbkę i precyzyjnie ustawić ostrość.

Opuść ramię oświetlenia i całkowicie zamknij panele dostępowe. Następnie w zakładce lokalizacji kliknij symbol rozszerzenia okularowego, aby wyświetlić schemat drogi światła; wybierz opcję trans on i upewnij się, że schemat pokazuje światło transmitowane z żarówki padające na próbkę. Spójrz przez okulary i ustaw ostrość komórek, korzystając z tabletu sterującego jako przewodnika.

Następnie, aby zidentyfikować komórki wykazujące ekspresję DRA two, należy wybrać światło odbite oraz filtr odpowiedni do obrazowania zielonej emisji z den two. Skanuj szkiełko nakrywkowe przy użyciu światła odbitego o niskim natężeniu, aż do znalezienia zdrowej, jasnej komórki, a następnie skonfiguruj oprogramowanie do pozyskiwania danych palm. Przejdź do karty akwizycji i użyj menedżera eksperymentów, aby załadować odpowiednią konfigurację akwizycji palm.

Gdy pojawi się okno pop-up z zapytaniem o włączenie laserów, kliknij „tak”, a następnie ustaw ostrość obrazu komórki w płaszczyźnie kamery. Wybierz wyłącznie kanał 488. Dostosuj parametry akwizycji, takie jak wzmocnienie E-M-C-C-D, a następnie wybierz akwizycję ciągłą.

Następnie dostosuj jasność wyświetlacza do pożądanego poziomu i przesuwaj obiektyw, aż obraz na ekranie zostanie wyostrzony. Aby zebrać konwencjonalny obraz w szerokim polu, kliknij przycisk snap i zapisz obraz. W celu skonfigurowania oświetlenia typu turf na ścieżce 488, wybierz opcję turf na przycisku epi turf.

Aby zoptymalizować oświetlenie typu turf, należy wybrać tryb ciągłego pozyskiwania obrazu i regulować kąt lampy turf, aż tło nagle pociemnieje, a próbkę będzie można ustawić w ostrości w jednej płaszczyźnie. Przełącz na kanał 561 przy wyłączonym laserze 405 nanometrów. Ustaw wzmocnienie E-M-C-C-D na około 200, a czas ekspozycji na około 50 milisekund.

Wybierz filtr emisyjny przepuszczający światło czerwone i ustaw intensywność lasera na około 40%. Ponownie sprawdź kąt turf dla ścieżki 561. Aby zmniejszyć tło, naświetlaj próbkę, aż tło zaniknie. Użyj ścieżki 561 przy aktywnym wyłącznie laserze 561.

Aby zebrać dane PALM, włącz laser 405 nanometr dla ścieżki 561 i ustaw natężenie lasera 405 na około 0,01%. Aby monitorować obliczony obraz PALM podczas akwizycji, rozwiń menu opcji przetwarzania online i zaznacz opcję online processing palm, aby przetwarzać dane z parametrami domyślnymi. Kliknij start experiment, aby rozpocząć akwizycję; podczas zbierania danych wizualnie monitoruj fotokonwersję, zwiększając natężenie fotokonwertującego lasera 405 nanometr. Gdy fotokonwersja zacznie słabnąć, przerwij proces.

Gdy konwersja foto nie zwiększa się już po zwiększeniu intensywności lasera, kliknij finish current step. Aby zakończyć eksperyment, zapisz plik. Aby przetworzyć zapisane obrazy, kliknij kartę processing, rozwiń menu method, a następnie rozwiń podmenu palm.

Ponownie wybierz dłoń z czterech dostępnych podopcji. Wybierz odpowiedni obraz, aby pojawił się on w oknie podglądu. Rozwiń parametry metody i kliknij select, aby wprowadzić obraz, a następnie rozwiń pole ustawień i wybierz default, aby wykonać wyszukiwanie i lokalizację pików z parametrami domyślnymi.

W karcie przetwarzania naciśnij przycisk apply, aby obliczyć obraz palm, który pojawi się w oddzielnej karcie okna podglądu w celu odfiltrowania słabo próbkowanych komponentów w danych. Skorzystaj z twierdzenia Nyquista-Shannona oraz narzędzia remove palm outliers, aby usunąć piki w obszarach, w których średni odstęp między pikami, małe D, jest zbyt duży, aby rozdzielić pęcherzyk o średnicy, duże D. Mając obraz palm w oknie podglądu, kliknij select, aby wprowadzić obraz, a następnie kliknij apply. Nowy obraz pojawi się w oddzielnej karcie okna podglądu, aby odfiltrować słabo zlokalizowane flora.Fours.

Przejdź do karty filtra PAL i ogranicz akceptowaną florę. Cztery precyzje lokalizacji do poziomu sigma poniżej 35 nanometrów. Aby wybrać tryb wyświetlania obrazu PAL, przejdź do karty renderowania PAL, wybierz rozdzielczość pikseli oraz pożądany tryb wyświetlania.

Na tym obrazie pokazany jest reprezentatywny produkt końcowy PALM z obrazowania i przetwarzania neuronalnej pęcherzyka o gęstym rdzeniu (DCV) zaznaczony na czerwono. Współrzędne boczne zlokalizowanych fluoroforów na biało są przedstawione w trybie wyświetlania Centro, a obraz superrozdzielczy powiązanego pęcherzyka jest pokazany w trybie wyświetlania Gaussa. Na tej drugiej rycinie przedstawiono analogiczne obrazy szerokopolowe w kolorze zielonym oraz PALM w kolorze czerwonym somy i proksymalnych wypustek neuronu hipokampa hodowanego in vitro przez 8 dni, wykazującego ekspresję tpa, a danger two.

Ważne cechy obrazów obejmują rozległą odpowiedniość jeden do jednego oraz nakładanie się (zaznaczone na żółto) punktów między obrazami konwencjonalnymi a obrazami palm. Zauważalna jest znacznie mniejsza wielkość punktów w obrazowaniu palm oraz sporadyczne rozdzielenie pojedynczego punktu z obrazowania szerokopolowego na wiele punktów palm. Tutaj przedstawiono obraz palm D cvs wzdłuż części wypustki drugiego neuronu hipokampa wykazującego ekspresję tpa.

Przedstawiono DENDRA two. Należy zwrócić uwagę na małą średnicę i jednorodny wygląd punktów oraz rzadką obserwację punktów położonych blisko siebie, które reprezentują domniemane skupiska DCV. Na tej końcowej rycinie przedstawiono prostą metodę ilościową służącą do określenia, czy dwie lub więcej CV znajdują się wystarczająco blisko, aby tworzyć skupisko.

Profile liniowe intensywności puncta są generowane w sposób przedstawiony na wykresach, co może następnie posłużyć do ilościowego określenia separacji DCV oraz szerokości DCV. Jeśli separacja znacznie przekracza szerokość, DCV nie stykają się ze sobą. Natomiast jeśli separacja jest w przybliżeniu taka sama jak szerokość, DCV mogą być w kontakcie na podstawie tych kryteriów; DCV na tym obrazie zostały sklasyfikowane jako niebędące w kontakcie, podczas gdy DCV na tym obrazie zostały sklasyfikowane jako będące w kontakcie zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak dwukolorowy PALM, mogą być wykorzystane do badania względnej lokalizacji odrębnych struktur.