Name: Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj mikroskopię PALM do badania organizacji pęcherzyków w neuronach hipokampalnych. Ta metoda superrozdzielcza ujawnia szczegóły strukturalne niewidoczne w konwencjonalnej fluorescencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health 2 R15 GM061539-02 (dla B.A.S.), 2 R15 NS40425-03 (dla J.E.L.), MH 66179 (dla Dr. Gary'ego Bankera z Oregon Health & Science University/OHSU) oraz P30 NS061800 (dla Dr. Sue Aicher z OHSU). Dziękujemy Barbarze Smoody za szerokie wsparcie w hodowli neuronów hipokampa oraz doktorom Brianowi Longowi i Jamesowi Abneyowi za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotowanie DNA kodującego fotokonwertowalną lub fotoaktywowaną chimerę ukierunkowaną na DCV, przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. 
	Uwaga: Jedną z możliwości jest DNA kodujące tkankowy aktywator plazminogenu - chimerę Dendra2 (tPA-Dendra2). Dendra2 jest białkiem fotokonwertowalnym, które zmienia emisję z zielonej na czerwoną po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego12.</li>
	<li>Hodowla neuronów hipokampa na wysokowydajnych szkiełkach nakrywkowych #1.5 przez ~ 5-10 dni, zgodnie ze standardowymi protokołami13.</li>
	<li>Transfekcja rozwijających się neuronów hipokampa za pomocą kationowego odczynnika lipidowego. 
	Uwaga: Infekcja za pośrednictwem wirusa jest bardziej skuteczna w przypadku dojrzałych neuronów. To alternatywne podejście zostało szczegółowo opisane w innym miejscu14.
	<ol>
		<li>Przygotować probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą ~1 μg DNA i 250 μl minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) oraz drugą probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 4 μl kationowego odczynnika lipidowego i 250 μl MEM.</li>
		<li>Inkubować roztwory przez 5 minut.</li>
		<li>Połącz oba roztwory i inkubuj powstałą mieszaninę przez dodatkowe 30 minut.</li>
		<li>Podczas inkubacji przygotować naczynie zawierające kilka ml pożywki hodowlanej podgrzanej do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Delikatnie przenieś szkiełka nakrywkowe zawierające neurony do naczynia zawierającego ciepłe podłoże i dodaj mieszaninę transfekcji.</li>
		<li>Delikatnie przechylić naczynie, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 90 minut.</li>
		<li>Wróć neurony do ich "domowego dania" i poczekaj ~12-18 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalaj komórki przez 45 minut w 4% paraformaldehydzie/4% sacharozie w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS, pH 7,4) podgrzanym do 37 °C. 
	Uwaga: W eksperymentach PALM ważne jest osiągnięcie dobrego zachowania ultrastruktury, a standardowe protokoły utrwalania formaldehydu stosowane do barwienia immunofluorescencyjnego zazwyczaj nie są wystarczające15. Jedną z ważnych przyczyn słabego zachowania struktury jest niewystarczający czas wiązania, ponieważ wiązanie formaldehydu obejmuje tworzenie adduktów i sieciowanie białek, a ten ostatni proces jest dość powolny16. 45-minutowa fiksacja pomaga złagodzić ten problem bez wykrywalnej utraty fluorescencji spowodowanej nadmierną fiksacją.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe ~10x z filtrowanym PBS. 
	Uwaga: Zmniejsza to zanieczyszczenia fluorescencyjne. Próbki obrazu są pobierane stosunkowo szybko po utrwaleniu. Do tego czasu przechowywać komórki w temperaturze 4 °C w przefiltrowanym PBS w światłoszczelnym pojemniku.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe zawierające neurony w komorze w przefiltrowanym PBS. 
	Uwaga: Próbka musi być umieszczona w środowisku wodnym, takim jak PBS, o współczynniku załamania światła niższym niż szkło, aby zapewnić oświetlenie oparte na fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Oświetlenie oparte na TIRF jest bardzo przydatne, ponieważ wzbudzane są tylko fluorofory proksymalne szkiełka osłonowego i występuje duży związany z tym spadek fluorescencji tła17.</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Włącz system obrazowania w wysokiej rozdzielczości.
	<ol>
		<li>Włącz lampę łukową.</li>
		<li>Przestaw przełączniki "system/pc" i "komponent" (na przełączniku zdalnego sterowania zasilaniem) na "włączony".</li>
		<li>Włącz komputer (po włączeniu tabletu sterującego/stacji dokującej mikroskopu). 
		Uwaga: Stacja dokująca może być używana do sterowania i monitorowania wielu atrybutów optyki i ścieżki światła, w szczególności wyboru obiektywu i ostrości.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania i wybierz opcję "uruchom system" w oknie dialogowym logowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj próbkę.
	<ol>
		<li>Otwórz przedni i górny panel dostępu w szafie bezpieczeństwa lasera.</li>
		<li>Przechyl ramię światła przechodzącego, aby uzyskać dostęp do sceny i celów.</li>
		<li>Nałóż olej na obiektyw z aperturą numeryczną alfa planapochromatu 100x/NA = 1,46 (TIRF). 
		Uwaga: Zamiast 100X można użyć obiektywu 63X high-NA.</li>
		<li>Zamontuj próbkę na stoliku i podnieś obiektyw w kierunku próbki.</li>
		<li>Monitoruj położenie obiektywu za pomocą funkcji XYZ stacji dokującej. Zatrzymaj się, gdy obiektyw znajdzie się w polu ostrości (np. z ~2.50 mm).</li>
		<li>Całkowicie zamknij panele dostępu. 
		Uwaga: Aby włączyć bezpiecznik laserowy.</li>
		<li>Dostosuj ostrość za pomocą okularów i przycisków w zakładce lokalizacji. 
		Uwaga: Zakładka lokalizacji zapewnia dostęp do przycisków, które wytwarzają oświetlenie oparte na lampie łukowej i ułatwiają bezpośrednią obserwację próbki za pomocą okularów. Podobnie zakładka akwizycji zapewnia dostęp do narzędzi, które wytwarzają oświetlenie laserowe i ułatwiają przechwytywanie obrazu przez kamerę.
		<ol>
			<li>Przejdź do zakładki lokalizacji, wybierz "Trans On".</li>
			<li>Kliknij symbol rozszerzenia gałki ocznej. 
			Uwaga: Spowoduje to wyświetlenie schematu ścieżki światła. Atrybuty ścieżki światła można zmieniać poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy na odpowiednie ikony na schemacie lub za pomocą ekranu dotykowego na stacji dokującej. Na przykład, filtr odpowiedni do oglądania emisji z Dendra2 można wybrać za pomocą ikony rewolweru reflektora.</li>
			<li>Spójrz w okulary i ustaw ostrość komórek, używając stacji dokującej jako przewodnika. 
			Uwaga: Próbka będzie bardzo słabo wypełniona komórkami fluorescencyjnymi, ponieważ neurony hipokampa są trudne do transfekcji, a zatem ustawienie ostrości przy użyciu odbitego oświetlenia może być nieco trudne. W takim przypadku jako wskazówkę należy kierować się oświetleniem przechodzącym i odczytem z stacji dokującej.</li>
			<li>Wyłącz światło po ustawieniu ostrości.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj komórkę, która jest dość jasna, wykazuje punktową fluorescencję i ma klasyczną morfologię, która wskazuje na dobre zdrowie.
	<ol>
		<li>Wybierz światło odbite i filtr odpowiedni do oglądania zielonej emisji z Dendra2.</li>
		<li>Zeskanuj szkiełko nakrywkowe w poszukiwaniu komórek wykazujących ekspresję chimer Dendra2 przy użyciu światła wzbudzającego o niskiej intensywności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do zakładki pozyskiwania.
	<ol>
		<li>Użyj "menedżera eksperymentów", aby załadować konfigurację akwizycji PALM, która jest odpowiednio zaprojektowana lub łatwo modyfikowana. 
		Uwaga: Jeśli taki eksperyment nie istnieje, zaprojektuj początkową konfigurację eksperymentalną, korzystając z następujących ustawień jako przewodnika: Suwaki mocy lasera: 405 nm (~0,01% dla lasera 50 mW); 488 nm (~3% dla lasera o mocy 100 mW); 561 nm (~40% dla lasera o mocy 100 mW); Czas naświetlania: ~50 msek; Wzmocnienie kamery: ~200; Akwizycja wielowymiarowa: szeregi czasowe (cykle = 30 000, interwał = 0); Ścieżki: 488 nm z oświetleniem epi i 561 nm z oświetleniem opartym na TIRF (zob. krok 2.5.1); Obiektyw: 100X (NA = 1,46); Suwak kąta TIRF: kąt padania ~67-72°; Rozmiar piksela: 100 nm; Pole widzenia: TIRF (alternatywne opcje dają wyższą intensywność lasera i są używane do fluoroforów, które są trudniejsze do wybielenia).</li>
		<li>Kliknij "tak", gdy pojawi się wyskakujące menu z zapytaniem o włączenie laserów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw ostrość obrazu komórki na płaszczyźnie aparatu.
	<ol>
		<li>Wybierz ścieżkę laserową z oświetleniem epi 488 nm. 
		Uwaga: Ścieżki to konfiguracje wiązki używane podczas obrazowania. W tym przypadku nazwy ścieżek są określane przez długość fali wzbudzenia, która wytwarza emisję przekazywaną do kamery. Na przykład ścieżka 561 nm wykorzystuje zarówno linie laserowe 405, jak i 561 nm, ale sześcian filtra przekazuje do kamery tylko emisję z fotokonwertowanej Dendry2 wzbudzonej światłem o długości fali 561 nm.</li>
		<li>Ustaw ostrość obrazu komórki na kamerze za pomocą przycisku "ciągłej" akwizycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz konwencjonalny obraz szerokokątny.
	<ol>
		<li>Użyj przycisku "Snap".</li>
		<li>Zapisz obraz, przechodząc do menu "Plik" i wybierając "zapisz/zapisz jako".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj oświetlenie oparte na TIRF.
	<ol>
		<li>Wybierz ścieżkę 488 i przełącz się na "TIRF" za pomocą przycisku EPI/TIRF.</li>
		<li>Wybierz "ciągłe" pozyskiwanie.</li>
		<li>Dostosuj suwak oświetlenia oparty na TIRF. 
		Uwaga: TIRF osiąga się, gdy następuje nagłe ciemnienie tła ORAZ próbka może być skupiona w JEDNEJ płaszczyźnie18. Jeśli nowe cechy stają się widoczne poprzez skupienie się w próbce, kąt padania jest zbyt niski, ponieważ w TIRF istnieje tylko jedna płaszczyzna ostrości.</li>
		<li>Dokładnie sprawdź kąt TIRF za pomocą ścieżki 561 z wyłączonym laserem 405 nm.</li>
		<li>Włącz z powrotem laser 405 nm przed rozpoczęciem eksperymentu PALM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj dane PALM.
	<ol>
		<li>Kliknij "rozpocznij eksperyment"." 
		Uwaga: W razie potrzeby otwórz zakładkę "opcje przetwarzania online" i zaznacz "przetwarzanie online PALM" i "Dopasuj Gauss2D" (przed rozpoczęciem eksperymentu), aby monitorować zrekonstruowany obraz PALM podczas zbierania surowych danych. Ułatwi to ocenę jakości danych, a tym samym wartość kontynuowania stosunkowo czasochłonnego procesu gromadzenia danych.</li>
		<li>Wizualnie monitoruj fotokonwersję.</li>
		<li>Zwiększ intensywność lasera 405 nm (fotokonwertującego), gdy fotokonwersja Dendra2 zmniejsza się (zwykle po uzyskaniu ~10 000 surowych obrazów).</li>
		<li>Kontynuuj eksperyment, jeśli fotokonwersja wzrośnie. W przeciwnym razie zatrzymaj eksperyment (bez utraty danych), naciskając przycisk "zatrzymaj" bieżący krok.</li>
		<li>Zapisz obrazy po zakończeniu zbierania danych (po ~15 minutach).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie, wyświetlanie i analiza obrazu
<ol>
	<li>W przypadku braku przetwarzania w trybie online przetwarzaj nieprzetworzone obrazy, które zostały zapisane na dysku.
	<ol>
		<li>Kliknij kartę przetwarzania, otwórz kartę metody i wybierz "PALM".</li>
		<li>Wybierz ponownie "PALM" z czterech podopcji.</li>
		<li>Przejdź do menu plików, otwórz i wyświetl interesujący Cię plik, a następnie naciśnij "wybierz".</li>
		<li>Naciśnij "zastosuj." 
		Uwaga: Spowoduje to zainicjowanie znajdowania pików/fluoroforów i lokalizacji pików z domyślnymi opcjami. W razie potrzeby szczyty można również grupować za pomocą zakładki "PAL-Group". Grupowanie przypisuje piki, które pojawiają się w kilku kolejnych ramkach, do pojedynczej cząsteczki, jeśli współrzędne pików są wystarczająco podobne. Ponadto dane można skorygować pod kątem dryftu próbki za pomocą opcji wyrównania dryftu opartej na modelu oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odfiltruj słabo zlokalizowane i słabo próbkowane składniki w danych zlokalizowanych w szczytach.
	<ol>
		<li>Odrzuć fluorofory z precyzją lokalizacji, σ, >35 nm za pomocą narzędzia "PAL-Filter".</li>
		<li>Wyrzuć fluorofory w obszarach, w których średnia odległość między pikami, d, jest zbyt duża, aby rozdzielić pęcherzyki o średnicy, D.
		<ol>
			<li>Wyodrębnij średnią precyzję lokalizacji (σ) z histogramu precyzji lokalizacji.</li>
			<li>Oblicz maksymalną akceptowalną wartość d na podstawie σ i kryterium Shannona-Nyquista19, zgodnie z przybliżeniem rozdzielczości20 R = D = [(2,35σ)2 + (2d)2]1/2.</li>
			<li>Ustaw próg w narzędziu "Usuń wartości odstające PALM", aby usunąć piki otoczone sąsiadami mniejszymi niż πD2/(4d2) w okręgu o promieniu D/2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przekonwertuj przetworzone dane PALM na obraz PALM za pomocą narzędzia "PAL-Rendering"; patrz Rysunek 1.</li>
		<li>Określ ilościowo rozmiary i separacje, wybierając funkcję "Profil".
		<ol>
			<li>Sprawdź skojarzone opcje linii i tabeli, a następnie narysuj linię wzdłuż żądanego kierunku na obrazie.</li>
			<li>Określ ilościowo średnice, określając pełne szerokości przy połowie maksymalnej intensywności.</li>
			<li>Ilościowe określanie separacji poprzez określanie odstępów między szczytami profili intensywności.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+a+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li>
<li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li>
<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , Garland Science Publishing. (2007).</li>
<li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li>
<li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li>
<li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+the+presynaptic+active+zone%3A+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li>
<li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li>
<li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li>
<li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li>
<li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney%3A+A+kinetic+study+of+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+in+the+presence+of+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IRE%22%5BJournal%5D)">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li>
<li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+localization+microscopy+%28PALM%29%3A+an+optical+technique+for+achieving+%7E10-nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li>
<li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

PALM i pokrewne techniki mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości okazały się ostatnio cennym uzupełnieniem lepiej znanych form mikroskopii optycznej i mikroskopii elektronowej (EM)22-24. Do pozytywnych cech PALM należy stosunkowo proste przygotowanie próbki i minimalne zakłócenia próbki. Zasadniczo, PALM może być również używany do badania żywych komórek. Prawdopodobnie główną negatywną cechą PALM jest czasochłonne pozyskiwanie danych, co znacznie utrudnia badania nad szybszymi procesami dynamic...

Wiele procesów komórkowych zależy od dokładnego i skutecznego transportu biomolekuł za pośrednictwem pęcherzyków do określonych miejsc podkomórkowych. Jednym z wybitnych przykładów jest montaż synaptyczny, który jest poprzedzony długodystansowym, pośredniczącym w pęcherzykach dostarczaniem składników synaptycznych z miejsc biogenezy w somie neuronalnej do potencjalnie dystalnych miejsc pre- i postsynaptycznych1.
Mikroskopia fluorescencyjna to potężna i popularna metoda badania transportu pęcherzyków. Mocne strony tej techniki to jej czułość, swoistość i kompatybilność z obrazowaniem na żywo2. Niestety, do niedawna technika ta miała jedną poważną słabość, ograniczoną dyfrakcjąrozdzielczość 2, która utrudniała badania struktur o wymiarach mniejszych niż ~250 nm. Ostatnio rozdzielczość boczna w mikroskopii fluorescencyjnej przekroczyła barierę dyfrakcyjną dzięki wprowadzeniu technik mikroskopii fluorescencyjnej o superrozdzielczości, takich jak PALM3. Rozdzielczość boczna PALM, wynosząca dziesiątki nanometrów, idealnie nadaje się do badania pęcherzyków, które mają wymiary zwykle w zakresie ~50-250 nm4. W ten sposób możliwe jest teraz wykorzystanie fluorescencji, z jej niezliczonymi siłami, do wyjaśnienia spektrum wcześniej niedostępnych atrybutów pęcherzyków, w tym niektórych aspektów ich transportu do określonych miejsc subkomórkowych.
PALM nie jest trywialny do wdrożenia, a skuteczne strategie często muszą być dostosowane do typu badanego systemu. W tym miejscu opisujemy, jak przeprowadzić badania PALM struktur pęcherzykowych i pokazujemy skuteczność naszego podejścia w przypadku DCV w neuronach hipokampa. W szczególności używamy PALM, aby zająć się hipotezą, że w transporcie DCV do synaps w neuronach hipokampa pośredniczą klastry DCV5-8.
Ruch pęcherzyków do synaps w rozwijających się neuronach za pośrednictwem klastrów jest intrygującą możliwością, ponieważ może ułatwić szybką stabilizację i montaż synaps9,10. Zwolennicy grupowego handlu DCV powołują się na duży pozorny rozmiar pozasynaptycznych fluorescencyjnych punktów zawierających egzogenny ładunek DCV jako dowód na poparcie grupowania6. Jednak te punkty pojawiają się na obrazach generowanych przy użyciu technik mikroskopii fluorescencyjnej z ograniczoną dyfrakcją, które nie nadają się do odróżniania efektów wielkości wynikających z dyfrakcji od tych wynikających z grupowania.
Aby rozwiązać ten problem, zebraliśmy konwencjonalne obrazy fluorescencji szerokokątnej i PALM neuronów hipokampa wyrażających chimery skierowane do DCV. Analiza tych obrazów wykazała, że >92% przypuszczalnych pozasynaptycznych klastrów DCV na konwencjonalnych obrazach jest rozpoznawanych jako 80 nm (indywidualny rozmiar DCV)>11 puncta na obrazach PALM. W związku z tym dane te w dużej mierze unieważniają hipotezę grupowania w zastosowaniu do DCV w rozwoju neuronów hipokampa.

<table><tbody><tr><td>Zeiss PALM</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Elyra PS.1</td><td>z oprogramowaniem Zeiss Efficient Navigation (ZEN) i filtrem fluorescencyjnym Zestaw 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofektamina 2000 Technologie odczynnika transfekcji</td><td></td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Niezbędne technologie średniego</td><td>życia</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia</td> z<td>buforem fosforanowym soli</td><td>fizjologicznej 10010049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Nauki 19208</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8501</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 18 mm 1.5D</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0059095</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Wykrywanie fluorescencji stanowi podstawę dla wielu szeroko stosowanych i szybko rozwijających się technik mikroskopowych stosowanych w nowoczesnych zastosowaniach biologicznych i medycznych. Mocne strony fluorescencji to jej czułość, swoistość i kompatybilność z obrazowaniem na żywo. Niestety, konwencjonalne formy mikroskopii fluorescencyjnej mają jedną poważną słabość, ograniczoną dyfrakcją rozdzielczość w płaszczyźnie obrazowania, co utrudnia badania struktur o wymiarach mniejszych niż ~250 nm. Ostatnio to ograniczenie zostało przezwyciężone dzięki wprowadzeniu technik mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM). W przeciwieństwie do swoich konwencjonalnych odpowiedników, PALM może wytwarzać obrazy o rozdzielczości bocznej rzędu kilkudziesięciu nanometrów. W ten sposób możliwe jest teraz wykorzystanie fluorescencji, z jej niezliczonymi siłami, do wyjaśnienia spektrum wcześniej niedostępnych atrybutów struktury i organizacji komórkowej.
Niestety, PALM nie jest trywialny do wdrożenia, a skuteczne strategie często muszą być dostosowane do typu badanego systemu. W tym artykule pokazujemy, jak przeprowadzić jednokolorowe badania PALM struktur pęcherzykowych w stałych, hodowanych neuronach. PALM idealnie nadaje się do badania pęcherzyków, których wymiary zwykle wahają się w zakresie ~50-250 nm. Kluczowe kroki w naszym podejściu obejmują znakowanie neuronów fotokonwertowalnymi (z zielonego na czerwonego) chimerami ładunku pęcherzykowego, zbieranie rzadko próbkowanych surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu PALM o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy również skuteczność naszego podejścia, prezentując wyjątkowo dobrze rozdzielcze obrazy pęcherzyków o gęstym rdzeniu (DCV) w hodowanych neuronach hipokampa, które obalają hipotezę, że pozasynaptyczny transport DCV jest w dużej mierze pośredniczony przez klastry DCV.

Rysunek 1 przedstawia jeden z końcowych produktów obrazowania i przetwarzania. Na tym obrazie PALM współrzędne boczne zlokalizowanych fluoroforów są wyświetlane w trybie centroid, a obraz super-rozdzielczy powiązanego DCV jest przedstawiony w trybie Gaussa.
Rycina 2A przedstawia analogiczne obrazy w szerokim polu oraz obrazy PALM somy i wypustek proksymalnych neuronu hipokampa hodowanego in vitro przez osiem dni, wykazującego ekspresję tPA-Dendra2. Is...

Opisujemy, jak przeprowadzić badania oparte na fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) pęcherzyków w stałych, hodowanych neuronach. Kluczowe elementy naszego protokołu obejmują znakowanie pęcherzyków za pomocą chimer fotokonwertowalnych, zbieranie rzadkich próbek surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu o super rozdzielczości.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest uzyskanie obrazów fluorescencyjnych o superrozdzielczości, które wyjaśniają istotne aspekty organizacji pęcherzyków przy rozdzielczości nieosiągalnej w standardowej mikroskopii fluorescencyjnej. Osiąga się to najpierw poprzez transfekcję neuronów hipokampa DNA kodującym fotokonwertowalne chimery ładunku pęcherzykowego. W drugim kroku, za pomocą systemu mikroskopii superrozdzielczej, gromadzone są rzadko próbkowane obrazy surowe.Następnie surowe obrazy są przetwarzane w celu uzyskania obrazu o superrozdzielczości. W ostatnim kroku dane są kwantyfikowane, aby wyjaśnić organizację pęcherzyków. Ostatecznie profile liniowe intensywności punktów mogą zostać wykorzystane do porównania odległości między pęcherzykami z ich szerokością, co pozwala określić, czy pęcherzyki znajdują się wystarczająco blisko siebie, aby tworzyć skupisko przy zastosowaniu tej procedury.Mikroskopia lokalizacji aktywowanej fotochromowo w jednym kolorze (PALM) może być wykorzystywana do badania organizacji organelli w większości typów hodowli komórkowych. Aby uruchomić system obrazowania w superrozdzielczości do akwizycji obrazów, należy rozpocząć od włączenia zasilania lampy

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Superrozdzielcze obrazowanie pęcherzyków gęsto rdzeniowych neuronów

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mikroskopii do obrazowania w wysokiej rozdzielczości oraz trójwymiarową rekonstrukcję mysiego układu nerwowo-naczyniowego i bariery krew-mózg za pomocą swobodnie pływających odcinków mózgu. Metoda ta pozwala na wizualizację, analizę i kwantyfikację organelli wewnątrzkomórkowych w BBB.

Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy

Objętość jest ważnym parametrem dotyczącym fizjologicznych i patologicznych cech komórek. Opisujemy metodę wykluczenia fluorescencyjnego pozwalającą na pomiar objętości neuronów in vitro w pełnym polu z submikrometryczną rozdzielczością osiową wymaganą do analizy neurytów i dynamicznych struktur implikowanych we wzroście neuronów.

Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM) służy do ominięcia typowego limitu dyfrakcji mikroskopii świetlnej i do oglądania egzosomów w skali nanometrów. Może być stosowany zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach do charakteryzowania egzosomów.

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Poznaj mikroskopię PALM do badania organizacji pęcherzyków w neuronach hipokampalnych. Ta metoda superrozdzielcza ujawnia szczegóły strukturalne niewidoczne w konwencjonalnej fluorescencji.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Przeglądaj więcej filmów