Name: Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metodę CCMS do identyfikacji białek wiążących cykliczny di-GMP w bakteriach. Technika wykorzystuje spektrometrię mas i pozwala na precyzyjne przechwytywanie efektorów drugiego przekaźnika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alberto Reindersowi za jego pracę nad optymalizacją warunków CCMS dla P. aeruginosa. Dziękujemy również Pablo Manfredi za adnotację białek P. aeruginosa. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNF) w ramach grantu Sinergia CRSII3_127433.

1. Przygotowanie lizatu
<ol>
	<li>Hoduj komórki P. aeruginosa w LB do pożądanego OD. 
	UWAGA: Dla wskazówek: należy użyć ≈ 100 ml kultury/próbkę dla kultur w fazie stacjonarnej i ≈ 500 ml kultury / próbkę dla kultur w fazie logarytmicznej (OD600nm = 0,5).</li>
	<li>Osad przez odwirowanie przez 20 minut przy 5,000 x g.</li>
	<li>Zawiesić 0,5-1 g osadu w 1 ml buforu do lizy (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAc, DDT 1 mM, pH 7,5) i dodać inhibitor proteazy (kompletny mini, wolny od EDTA) oraz DNaseI.</li>
	<li>Lizuj komórki przez 3 przejścia przez francuską komórkę ciśnieniową pod ciśnieniem 20 000 psi (patrz Lista materiałów).</li>
	<li>Ultra-odwirować lizat komórkowy przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zachowaj supernatant (przejdź do kroku 2).</li>
	<li>Przemyć osad 1 ml 1x buforu do lizy, pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Ultrawirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesiny należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia do wychwytywania białek błonowych (patrz krok 3).</li>
</ol>
2. Usuwanie wolnych c-di-GMP i innych nukleotydów (tylko frakcja rozpuszczalna)
<ol>
	<li>Przemyć kolumnę odsalającą PD10 (patrz Wykaz materiałów) 10 ml buforu do lizy na zimno.</li>
	<li>Wlać supernatant (≈ 1 ml) na PD10 w celu usunięcia nukleotydów.</li>
	<li>Eluować za pomocą 4 ml zimnego buforu do lizy (co 500 μl).</li>
	<li>Wybierz najbardziej skoncentrowane frakcje określone za pomocą testu Bradforda i połącz je.</li>
</ol>
3. Ponowne zawieszenie i solubilizacja granulek (tylko frakcja membranowa)
<ol>
	<li>Zawiesić osad w 500 do 1 000 μl 1x bufora wychwytującego (bez detergentu) (patrz tabela 1). 
	UWAGA: Granulka jest trudna do ponownego zawieszenia. Zaleca się, aby najpierw pipetować w górę i w dół za pomocą pipety, aby z grubsza zawiesić osad, a następnie użyć strzykawki 27 G, aby dobrze zhomogenizować roztwór.</li>
	<li>Dodać 1% (w/v) n-dodecylo-β-D-maltopyranozydu (DDM).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny (lub O/N) na obracającym się kole.</li>
	<li>Ultrawirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierz supernatant.</li>
</ol>
4. Pomiar stężenia białka
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda (za pomocą testu BCA dla frakcji błonowej).</li>
	<li>Ustaw całkowite stężenie białka na 10 mg/ml.</li>
</ol>
5. Przechwytywanie
<ol>
	<li>Wymieszaj 300 μg białka z 1 mM GDP, GTP, ATP, CTP i 20 μl 5x buforu wychwytującego (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% glicerolu, pH 7,5) (Tabela 1). Dostosować objętość reakcji do 100 μl za pomocą H2O. 
	UWAGA: całkowita objętość obejmuje objętość cdG-CC i c-di-GMP w przypadku kontroli konkurencji (patrz krok 5.3 i tabela 2). 
	UWAGA: wszystkie eksperymenty przeprowadzono w 200 μl 12-probówkowych paskach PCR (Thermo Scientific). 
	UWAGA: w przypadku frakcji membranowej należy zawsze utrzymywać stężenie DDM powyżej krytycznego stężenia miceli (0,01% w/v) aż do etapu solubilizacji białka w 8 M moczniku (krok 7.1).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut na obracającym się kołu.</li>
	<li>Dodać 10 μM cdG-CC (stężenie końcowe). 
	UWAGA: obejmują kontrolę bez cdG-CC (określaną jako "kontrola kulek") oraz kontrolę uzupełnioną o 1 mM c-di-GMP ("kontrola konkurencji") (patrz Tabela 2). 
	UWAGA: stężenie cdG-CC można regulować w zakresie od 1 do 10 μM.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny (O/N dla frakcji membranowej) na obracającym się kole, w ciemności.</li>
	<li>Po krótkim wirowaniu sieciować poprzez aktywację ugrupowania reaktywnego cdG-CC światłem UV przez 4 minuty, za pomocą CaproBox (patrz Lista materiałów, λ = 310 nm, natężenie promieniowania ≥10 mW/cm², odległość od źródła = 2 cm). UWAGA: zdejmij pokrywę pasków przed usieciowaniem.</li>
	<li>Dodać 25 μl 5x bufor do płukania (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) i 50 μl dobrze zawieszonych kulek magnetycznych streptawidyny, delikatnie homogenizować.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę na obracającym się kole.</li>
</ol>
6. Kroki mycia
UWAGA: (Magnes: patrz Lista materiałów). Zacznij od uchwycenia kulek magnetycznych w wieczku paska PCR za pomocą magnesu. Następnie wymień pasek PCR na nowy zawierający kolejny roztwór myjący. Usuń magnes i ponownie zawieś koraliki, a następnie inkubuj 2 minuty. Zakręć i załóż pokrywkę na nową pokrywkę.
<ol>
	<li>Etapy mycia (tylko frakcja rozpuszczalna)
	<ol>
		<li>Umyć 6 razy w 200 μl 1x bufor do mycia.</li>
		<li>Umyć raz w 200 μl HPLC klasy H2O.</li>
		<li>Umyć 6 razy w 200 μl 80% acetonitrylu.</li>
		<li>Przemyć 2 razy w 200 μl HPLC klasyH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etapy mycia (tylko frakcja membranowa)
	<ol>
		<li>Umyć 5 razy w 200 μl 1x bufor myjący + 0,1% DDM.</li>
		<li>Umyć 2 razy w 200 μl 1x bufor myjący + 0,05% DDM.</li>
		<li>Prać raz w 200 μl 1x bufor myjący + 0,025% DDM.</li>
		<li>Prać raz w 200 μl 1x bufor myjący + 0,0125% DDM.</li>
		<li>Umyć 3 razy w 200 μl 100 mM ABC (wodorowęglan amonu, NH4CO3) + 2 M mocznika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przygotowanie próbki MS
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić kulki (bezpośrednio w pokrywie) w 20 μl 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M mocznika dla frakcji membranowej) i przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Tylko frakcja membranowa: inkubować w temperaturze 60 °C przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 500 obr./min.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl 200 mM TCEP (tris(2-karboksyetylo)fosfiny) i inkubować w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 500 obr./min. Schłodzić do 25 °C.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl świeżo przygotowanego 400 mM jodoacetamidu i inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut, wstrząsając z prędkością 500 obr./min i w ciemności.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl 0,5 M N-acetylo-cysteiny i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 500 obr./min.</li>
	<li>Tylko frakcja membranowa: dodać 1 μl Lys-C i inkubować w temperaturze 37 °C, O/N.</li>
	<li>Dodać 2 μg trypsyny i inkubować O/N w temperaturze 37°C, wstrząsając z prędkością 500 obr./min (zawinąć w Parafilm, aby zapobiec wysuszeniu). 
	UWAGA: na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: tylko frakcja membranowa: dodać 100 mM ABC, aby dostosować stężenie mocznika do <2 M przed dodaniem trypsyny.</li>
	<li>Krótko zakręć rurki i zbierz koraliki za pomocą magnesu.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (powtórzyć ten krok, jeśli pozostały kulki).</li>
	<li>Dodać 5 μl 5% TFA (kwas trifluorooctowy) + 1 μl 2 M HCl (15 μl 5% TFA+ 5 μl 2 M HCl dla frakcji membranowej).</li>
	<li>Warunek C18 Kolumny MicroSpin (The Nest Group, MA, USA) ze 150 μl acetonitrylu (wirowanie 20 sekund przy 2,400 obr./min).</li>
	<li>Zrównoważyć kolumny C18 2 razy za pomocą 150 μl 0,1% TFA (wirowanie 20 sekund, 2,400 obr./min).</li>
	<li>Załadować próbkę i wirować 2 min, 2 000 obr./min.</li>
	<li>Ponownie załadować przepust na kolumnę i powtórzyć krok wirowania (2 min, 2 000 obr./min).</li>
	<li>Umyć 3 razy 150 μl 0,1% TFA, 5% acetonitrylu (20 sekund, 2 400 obr./min).</li>
	<li>Weź nową probówkę i wymyj dwukrotnie 150 μl 0,1% TFA, 50% acetonitrylu (2 min, 2,000 obr./min).</li>
	<li>Wysuszyć peptydy w speed-vac.</li>
	<li>Zawiesić w 40 μl 98% H2O, 2% acetonitrylu, 0,15% kwasu mrówkowego.</li>
	<li>Sonikacja przez 20 sekund (cykl impulsowy 0,5, amplituda 100%; patrz Lista materiałów) i odwirowanie w dół 5 sekund, 12 000 obr./min (wirówka stołowa). Wiruj 10 sekund i wiruj w dół 5 sekund, 12 000 obr./min. Przenieść do fiolki HPLC w celu analizy LC-MS/MS.</li>
	<li>Zamrażać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
8. Analiza LC-MS/MS
<ol>
	<li>Uruchom nano-LC (systemy nano-LC) wyposażone w kolumnę RP-HPLC (75 μm x 37 cm) wypełnioną żywicą C18 (Magic C18 AQ 3 μm) przy użyciu gradientu liniowego od 95% rozpuszczalnika A (0,15% kwasu mrówkowego, 2% acetonitrylu) i 5% rozpuszczalnika B (98% acetonitrylu, 0,15% kwasu mrówkowego) do 35% rozpuszczalnika B przez 60 minut przy natężeniu przepływu 0,2 μl/min.</li>
	<li>Analizować peptydy za pomocą LC-MS/MS (dwuciśnieniowy spektrometr masowy LTQ-Orbitrap Velos, podłączony do źródła jonów w postaci elektrorozpylania). 
	UWAGA: Tryb akwizycji danych został ustawiony tak, aby uzyskać jeden skan MS o wysokiej rozdzielczości w części FT spektrometru mas z rozdzielczością 60 000 FWHM, a następnie skany MS/MS w liniowej pułapce jonowej 20 najbardziej intensywnych jonów. Aby zwiększyć skuteczność prób MS/MS, włączono tryb ekranowania stanu naładowanego, aby wykluczyć jony nieprzypisane i naładowane pojedynczo. Dysocjacja wywołana zmową została wyzwolona, gdy prekursor przekroczył 100 liczb jonów. Czas trwania wykluczenia dynamicznego został ustawiony na 30 sekund. Czas akumulacji jonów ustalono na 300 ms (MS) i 50 ms (MS/MS).</li>
</ol>
9. Wyszukiwanie w bazie danych
<ol>
	<li>Pobierz bazę danych NCBI P. aeruginosa ze strony głównej NCBI (<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a>).</li>
	<li>Przekonwertuj surowe widma MS na ogólne pliki maskotki (mgf) za pomocą narzędzia do konwersji MassMatrix (<a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py</a>).</li>
	<li>Przeszukaj ten plik mgf za pomocą MASCOT w wersji 2.3 w bazie danych NCBI P. aeruginosa zawierającej wpisy białek wabiących w przód i w tył.</li>
	<li>Wykonaj trawienie trypsyny in silico po lizynie i argininie (chyba że po niej następuje prolina), tolerując dwa pominięte rozszczepienia w peptydach w pełni tryptycznych.</li>
	<li>Ustaw parametry wyszukiwania w bazie danych, aby umożliwić utlenione metioniny (+15,99491 Da) jako zmienne modyfikacje i karboksyamidometylację (+57,021464 Da) reszt cysteiny jako stałą modyfikację. W przypadku wyszukiwania MASCOT przy użyciu skanów o wysokiej rozdzielczości należy ustawić tolerancję masy prekursora na 15 p.p.m. i ustawić tolerancję masy fragmentu na 0,6 Da. Na koniec ustaw białko FDR na 1%.</li>
	<li>Zaimportuj wyszukiwania maskotki eksperymentów CCMS P. aeruginosa do Scaffold (Proteomesoftware, wersja 3), ustaw parametry, aby uzyskać białko FDR bliskie 1% i wyodrębnij całkowitą liczbę widmową.</li>
	<li>Aby uzyskać reprezentatywne wyniki przedstawione w tym artykule, użyliśmy sparowanego testu T do porównania eksperymentu z kontrolą konkurencji i uwzględniliśmy tylko trafienia o wartości p poniżej 0,1 i stosunku liczby widmowej powyżej 2 (zliczenia spektralne eksperymentu/zliczenia spektralne kontroli konkurencji).</li>
	<li>Dane można eksportować do dowolnego arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.</li>
</ol>
10. Kwantyfikacja bez etykiet
<ol>
	<li>Zaimportuj surowe pliki do oprogramowania Progenesis LC-MS (Nonlinear Dynamics, wersja 4.0).</li>
	<li>Wykonaj wyrównanie LC-MS i wykrywanie cech w ustawieniach domyślnych.</li>
	<li>Eksport danych w formacie mgf z Progenesis LC-MS.</li>
	<li>Przeszukaj widma MS/MS za pomocą MASCOT w bazie danych NCBI P. aeruginosa zawierającej wpisy białek wabika do przodu i do tyłu.</li>
	<li>Zaimportuj wyniki wyszukiwania w bazie danych do Progenesis LC-MS i zmapuj identyfikacje peptydów do cech MS1.</li>
	<li>Do oceny danych (obliczanie poziomów istotności, współczynników krotności-zmiany) wykorzystano skrypt ProteinSQAnalysis firmy SafeQuant (próg: wartość q poniżej 0,1, stosunek zliczania widmowego powyżej 2).</li>
</ol>

<ol><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+c-di-GMP+signalling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Principles of c-di-GMP signalling in bacteria.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).</li>
<li>Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((You%27ve+come+a+long+way%3A+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">You've come a long way: c-di-GMP signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).</li>
<li>Schirmer, T., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+mechanistic+determinants+of+c-di-GMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).</li>
<li>Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+their+options+open%3A+acute+versus+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li>
<li>Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+cyclic+di-GMP-specific+phosphodiesterase+and+its+allosteric+control+by+GTP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP.</a> J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).</li>
<li>Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP+signaling+in+bacteria%3A+recent+advances+and+new+puzzles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles.</a> J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).</li>
<li>Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+the+PilZ+domain+protein+PA4608+complex+with+cyclic+di-GMP+identifies+charge+clustering+as+molecular+readout%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout.</a> J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).</li>
<li>Fazli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRP%2FFNR+family+protein+Bcam1349+is+a+c-di-GMP+effector+that+regulates+biofilm+formation+in+the+respiratory+pathogen+Burkholderia+cenocepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia.</a> Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).</li>
<li>Hickman, J. W., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FleQ+from+Pseudomonas+aeruginosa+as+a+c-di-GMP-responsive+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor.</a> Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).</li>
<li>Sudarsan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitches+in+eubacteria+sense+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.</a> Science. 321, 411-413 (2008).</li>
<li>Lenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+methyltransferases+and+other+S-adenosyl-L-homocysteine-binding+Proteins+by+Capture+Compound+Mass+Spectrometry+%28CCMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Köster, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Düvel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+to+identify+c-di-GMP+binding+proteins+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).</li>
<li>Christen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+control+of+cyclic+di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Allosteric control of cyclic di-GMP signaling.</a> J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).</li>
<li>Balasubramanian, D., Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptome+analyses+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa.</a> Human genomics. 3, 349-361 (2009).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).</li>
<li>Baraquet, C., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+diguanosine+monophosphate+represses+bacterial+flagella+synthesis+by+interacting+with+the+Walker+A+motif+of+the+enhancer-binding+protein+FleQ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).</li>
<li>DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+as+a+high-throughput+assay+to+identify+nuclear+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+receptor+signaling%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands.</a> Nuclear receptor signaling. 10, e002(2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59, 301-315 (2013).</li>
<li>Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+messenger+bis-%283%E2%80%98-5%E2%80%99%29-cyclic-GMP+and+its+PilZ+domain-containing+receptor+Alg44+are+required+for+alginate+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cyclic+diguanylate+in+the+non-catalytic+EAL+domain+of+FimX+induces+a+long-range+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change.</a> J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczególną ostrożność należy zachować na kilku etapach protokołu. Stężenie białka jest parametrem krytycznym, przy czym stężenie 10 mg/ml jest trudne do osiągnięcia, gdy komórki są hodowane w określonych warunkach wzrostu (np. biofilmy lub małe warianty kolonii). W związku z tym ponowne zawieszenie osadów powinno być przeprowadzone w małej objętości buforu do lizy. Stężenie białka można zmniejszyć do 8 mg/ml. W porównaniu z metodą opublikowaną przez Nespera i wsp. 1, dodaliśmy różne nukleotyd...

c-di-GMP to kluczowy drugi przekaźnik używany przez większość bakterii do kontrolowania różnych aspektów ich wzrostu i zachowania. Na przykład c-di-GMP reguluje progresję cyklu komórkowego, ruchliwość oraz ekspresję egzopolisacharydów i adhezyn powierzchniowych2-4. Poprzez koordynację takich procesów c-di-GMP sprzyja tworzeniu biofilmu, procesowi, który jest związany z przewlekłymi infekcjami szeregu bakterii chorobotwórczych5. c-di-GMP jest syntetyzowany przez enzymy zwane cyklazami diguanylanowymi (DGC), które zawierają katalityczną domenęGGDEF 4. Niektóre DGC posiadają miejsce hamujące, które w dół reguluje aktywność cyklazy po związaniu c-di-GMP. Degradacja c-di-GMP jest katalizowana przez dwie odrębne klasy fosfodiesterazy (PDE) zawierające katalityczną domenę EAL lub HD-GYP6,7.
Większość znanych białek efektorowych, które bezpośrednio wiążą c-di-GMP, należy do jednej z trzech klas białek: katalitycznie nieaktywnych domen GGDEF lub EAL oraz domen PilZ, małych przełączników molekularnych, które ulegają zmianom konformacyjnym po związaniu c-di-GMP8. Białka DGC, PDE i PilZ są dobrze scharakteryzowane, a ich domeny można stosunkowo bezpiecznie przewidzieć in silico. Szczególne zainteresowanie skupia się obecnie na identyfikacji nowych klas efektorów c-di-GMP. Niedawno opisano niektóre efektory c-di-GMP o różnych motywach wiązania, takie jak rodzina białek CRP/FNR Bcam1349 u Burkholderia cenocepacia lub regulator transkrypcji FleQ u P. aeruginosa9,10. Ponadto niedawno zidentyfikowano ryboprzełączniki specyficzne dla c-di-GMP i wykazano, że kontrolują ekspresję genów w sposób zależny od c-di-GMP11. Motywy wiążące c-di-GMP różnych efektorów są słabo zachowane, co utrudnia bioinformatyczne przewidywania takich białek. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy metodę biochemiczną, która opiera się na zastosowaniu specyficznego dla c-di-GMP związku wychwytującego w połączeniu ze spektrometrią mas 1,12,13.
Niedawno opracowaliśmy nowatorski trójwartościowy związek wychwytujący c-di-GMP (cdG-CC, Rysunek 1)1. To rusztowanie chemiczne składa się z: 1) ugrupowania c-di-GMP używanego jako przynęta do wychwytywania białek wiążących c-di-GMP, 2) fotoaktywowanej grupy reaktywnej UV używanej do sieciowania cdG-CC z białkami związanymi oraz 3) biotyny do izolowania wychwyconych białek za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. cdG-CC może być stosowany do bezpośredniego i specyficznego wychwytywania efektorów c-di-GMP ze złożonej mieszaniny makrocząsteczek w postaci lizatów komórkowych. Wcześniej donoszono, że podejścia oparte na związkach i proteomice chemicznej mają zastosowanie do szerokiego zakresu organizmów, np. Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serowar typhimurium i P. aeruginosa1,14.
W tym artykule metodologicznym szczegółowo opisujemy procedurę CCMS, używając jako przykładu ekstraktów z P. aeruginosa. Badanie to dowodzi, że CCMS jest potężnym i wszechstronnym narzędziem do biochemicznej identyfikacji nowych składników zaangażowanych w sygnalizację małocząsteczkową.

<table><tbody><tr><td>caproBox caprotec</td><td>bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td><td>Lampy UV sprzężone z 96-płytkowym blokiem chłodzącym chłodzącym, do fotoaktywacji</td></tr><tr><td>caproMag caprotec</td><td>bioanalytics</td><td>zawarte w zestawie startowym CCMS Do</td><td>łatwej obsługi cząstek magnetycznych bez pipetowania</td></tr><tr><td>c-di-GMP caproKit caprotec</td><td>bioanalytics</td><td>na życzenie</td><td>Zestaw zawiera związek wychwytujący c-di-GMP, c-di-GMP (do kontroli konkurencji), kulki magnetyczne pokryte streptawidyną, bufor wychwytujący i bufor myjący</td></tr><tr><td>Jednorazowe kolumny odsalające PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12-rurkowe paski PCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v sonikator z VialTweeter</td><td>, technologią ultradźwiękową Hielscher</td><td>UIS250v i VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowa francuska komórka ciśnieniowa</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-gmp

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w kierunku identyfikacji i charakterystyki enzymów biorących udział w syntezie (cyklazy diguanylowe) i degradacji (fosfodiesterazy) drugiego przekaźnika c-di-GMP. W przeciwieństwie do tego, dostępnych jest niewiele informacji na temat mechanizmów molekularnych i składników komórkowych, za pomocą których ta cząsteczka sygnałowa reguluje różnorodny zakres procesów komórkowych. Większość znanych białek efektorowych należy do rodziny PilZ lub są zdegenerowanymi cyklazami diguanylanowymi lub fosfodiesterazami, które zrezygnowały z katalizy i przyjęły funkcję efektorową. W związku z tym, aby lepiej zdefiniować komórkową sieć c-di-GMP w szerokim zakresie bakterii, potrzebne są metody eksperymentalne w celu identyfikacji i walidacji nowych efektorów, dla których wiarygodne prognozy in silico zawodzą.
Niedawno opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas (CCMS) jako potężne narzędzie do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP. Wcześniej informowano, że technika ta ma zastosowanie do szerokiego zakresu organizmów1. Tutaj podajemy szczegółowy opis protokołu, którego używamy do sondowania takich komponentów sygnalizacyjnych. Jako przykład używamy Pseudomonas aeruginosa, oportunistycznego patogenu, w którym c-di-GMP odgrywa kluczową rolę w zjadliwości i kontroli biofilmu. CCMS zidentyfikował 74% (38/51) znanych lub przewidywanych komponentów sieci c-di-GMP. Badanie to szczegółowo wyjaśnia procedurę CCMS i ustanawia ją jako potężne i wszechstronne narzędzie do identyfikacji nowych składników zaangażowanych w sygnalizację małocząsteczkową.

Aby zidentyfikować nowe efektory c-di-GMP u P. aeruginosa, systematycznie wykorzystano metodę CCMS do analizy frakcji rozpuszczalnych i błonowych szczepu PAO1 P. aeruginosa z hodowli w fazie logarytmicznej (OD600 = 0.5). Poniżej podsumowano i omówiono reprezentatywne wyniki tych poszukiwań. Wykorzystano cztery niezależne repliki biologiczne. W każdym doświadczeniu zastosowano dwa różne stężenia cdG-CC (5 µM oraz 10 µM). W celu sprawdzenia swoistości eksperymenty przeprowadzono w obecności lub...

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Ogólnym celem eksperymentu ze spektrometrią mas w celu wychwytywania związków chemicznych jest wychwycenie i identyfikacja białek wiążących GMP w cyklicznych matrycach. Osiąga się to poprzez frakcjonowanie, hodowlę komórkową za pomocą prasy francuskiej i usunięcie wolnej cyklicznej matrycy gmp. Używając kolumny PD 10 jako drugiego etapu, związek wychwytujący jest dodawany i aktywowany światłem UV w celu kowalencyjnego sieciowania białek wiążących GMP z cykliczną matrycą związanych ze związkiem wychwytywającym przy braku lub obecności nadmiaru wolnego cyklicznego GMP matrycy.Następnie wychwytywany związek jest wiązany z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną w celu intensywnego płukania wychwyconych białek. Na koniec wychwycone białka są trawione i przygotowywane do spektrometrii mas w celu identyfikacji wygenerowanych peptydów, a następnie wyniki są analizowane in silico. Główną zaletą CCMS w porównaniu z naszymi istniejącymi metodami, takimi jak współstrącanie, jest to, że związek wychwytujący poprawia specyficzne wychwytywanie bezpośrednich partnerów i umożliwia trudne warunki mycia dzięki kowalencyjnemu powiązaniu kosztów.Teraz ta metoda może dostarczyć informacji na tema

capture-compound-mass-spectrometry-powerful-tool-to-identify-novel-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zobrazení Compound Mass Spectrometry - Potężne Narzędzie do Identyfikacji Nowych Białek Efektorowych c-di-GMP

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Poznaj metodę CCMS do identyfikacji białek wiążących cykliczny di-GMP w bakteriach. Technika wykorzystuje spektrometrię mas i pozwala na precyzyjne przechwytywanie efektorów drugiego przekaźnika.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Przeglądaj więcej filmów