Name: Zastosowanie chromatografii gazowej do analizy zmian składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby szczura w czasie ciąży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj analizę składu kwasów tłuszczowych w wątrobie szczura podczas ciąży przy użyciu chromatografii gazowej. Ta metoda pozwala badać zmiany metaboliczne i wpływ diety na tkanki matczyne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wkład Meritxell Romeu-Nadal w badania na szczurach.

1. Procedury na zwierzętach
<ol>
	<li>Wszystkie prace ze zwierzętami powinny być wykonywane zgodnie z ustawą Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986).</li>
	<li>Mate Wistar szczury w wieku 10 tygodni przez hodowlę monogamiczną i potwierdzają ciążę przez pojawienie się czopa dopochwowego. Zapisz to jako 1 dzień ciąży i rozpocznij eksperymentalną dietę. W przypadku dziewiczych samic trzymaj każdego szczura indywidualnie i rozpocznij eksperymentalną dietę.</li>
	<li>Po karmieniu eksperymentalnymi dietami przez 20 dni poddaj szczury eutanazji przez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Użyj kleszczy preparacyjnych i nożyczek, aby odsłonić jamę brzuszną i wyciąć wątrobę poprzez przecięcie więzadeł, które łączą wątrobę z przeponą, przednią ścianą brzucha, żołądkiem i dwunastnicą. Umyć wątrobę w PBS i zamrozić w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie całkowitego ekstraktu lipidowego9
<ol>
	<li>Dodaj sita molekularne (aby napełnić 1/10 pojemnika z rozpuszczalnikiem) do wszystkich rozpuszczalników, aby uzyskać "suche" rozpuszczalniki. Wszystkie prace związane z rozpuszczalnikiem należy wykonywać w dygestorium.</li>
	<li>Pokrój około 100 mg mrożonej wątroby i zważ. Umieść chusteczkę w probówce w wiaderku z lodem i dodaj 0,8 ml lodowatego 0,9% NaCl. Homogenizuj tkankę.</li>
	<li>Dodać wzorce wewnętrzne rozpuszczone w 1 ml/mg suchego chloroformu: metanol (2:1, v/v) zawierający butylowany hydroksytoluen (BHT; 50 mg/l) jako przeciwutleniacz. Na 100 mg wątroby szczura dodać 100 μg wzorca CE (heptadekanian cholesrylu 17:0). Uwaga: Chloroform i BHT są niebezpieczne.</li>
	<li>Dodać 5,0 ml suchego chloroformu: metanolu (2:1, v/v) zawierającego BHT (50 mg/l).</li>
	<li>Dodać 1,0 ml 1 M NaCl, dokładnie wymieszać przez wirowanie, aż mieszanina będzie jednolita. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 10 minut, przy niskim hamowaniu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać dolną fazę za pomocą szklanej pipety Pasteura, przenieść do nowej szklanej probówki z nakrętką i wysuszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
</ol>
3. Rozdzielanie klas lipidów przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE)10
<ol>
	<li>Podłącz zbiornik SPE do pompy próżniowej i umieść wkład SPE z krzemionką aminopropylową na zbiorniku.</li>
	<li>Umieść nową szklaną rurkę z nakrętką oznaczoną TAG i CE w stojaku na zbiornik pod kolumną, aby zebrać pierwszą frakcję.</li>
	<li>Całkowity ekstrakt lipidowy rozpuścić w 1,0 ml suchego chloroformu i zawirować.</li>
	<li>Nanieść próbkę do kolumny za pomocą szklanej pipety Pasteura i pozostawić do przesączenia się do rurki z nakrętką pod wpływem grawitacji. Gdy nie spadną już żadne krople, usuń pozostałą ciecz za pomocą próżni.</li>
	<li>Eluować frakcję TAG i CE w próżni, przemyć kolumnę 2 x 1,0 ml popłuczyny suchego chloroformu.</li>
	<li>Po usunięciu całej cieczy wysuszyć frakcję TAG i CE pod azotem w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
	<li>Umieść nową szklaną rurkę z zakrętką oznaczoną jako PC w tacy zbiornika pod kolumną.</li>
	<li>Eluować frakcję PC w próżni z dodatkiem 2 x 1,0 ml suchego chloroformu: metanolu (60:40, v/v) aż do usunięcia całej cieczy z kolumny.</li>
	<li>Usunąć i wysuszyć frakcję PC w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
	<li>Umieścić nową szklaną rurkę z nakrętką z oznaczeniem PE w tacy zbiornika i wymyć frakcję PE z dodatkiem 1,0 ml suchego metanolu w próżni.</li>
	<li>Usunąć i wysuszyć frakcję PE w azocie w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
	<li>Umieścić nową szklaną rurkę z zakrętką oznaczoną NEFA w tacy zbiornika i wymyć frakcję NEFA w próżni przez dodanie 2 x 1,0 ml płukania suchego chloroformu: metanol: lodowaty kwas octowy (100:2:2, v/v/v). Uwaga: Lodowaty kwas octowy jest niebezpieczny. </li>
	<li>Pobraną frakcję NEFA usunąć i wysuszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
	<li>Umieść nowy wkład SPE z krzemionką aminopropylową na zbiorniku SPE i umieść szklaną rurkę z zakrętką w tacy zbiornika pod wkładem, aby zebrać odpady.</li>
	<li>Umyj kolumnę 3 płuczkami suchego heksanu w próżni, a następnie ostatnim 1,0 ml płukaniem grawitacyjnym. Nie dopuścić do wyschnięcia wkładu (przekręć kanały kolumny wkładu do pozycji zamkniętej, gdy poziom heksanu jest zbliżony do matrycy wkładu). Uwaga: Heksan jest niebezpieczny.</li>
	<li>Wymień rurkę odpływową na nową szklaną rurkę z nakrętką oznaczoną CE.</li>
	<li>Rozpuścić wysuszoną frakcję TAG i CE (przygotowane w kroku 3.6) w 1,0 ml suchego heksanu i odwirować. Nanieść to na kolumnę za pomocą szklanej pipety Pasteura i pozostawić do przesączenia pod wpływem grawitacji.</li>
	<li>Gdy nie spadnie już żadne krople, usuń pozostałą ciecz pod próżnią.</li>
	<li>W próżni przemyć kolumnę 2 x 1,0 ml płukania suchego heksanu w celu wymycia CE i suchej zebranej frakcji pod azotem w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
	<li>Umieścić nową szklaną rurkę z nakrętką oznaczoną TAG w tacy zbiornika i wymyć TAG z dodatkiem 2 x 1,0 ml płukania suchego heksanu: metanolu: octanu etylu (100:5:5) w próżni.</li>
	<li>Pobraną frakcję na sucho pod azotem w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia. Uwaga: Octan etylu jest niebezpieczny.</li>
</ol>
4. Przygotowanie FAME z CE10
<ol>
	<li>Dodać 0,5 ml suchego toluenu do oddzielonej frakcji CE (zebranej w kroku 3.19) i odwirować. Uwaga: Toluen jest niebezpieczny.</li>
	<li>Przygotować odczynnik metylacyjny (suchy metanol o zawartości 2% (v/v)H2SO4), którego ilość wymagana jest 1,0 ml na próbkę. Dozować objętość suchego metanolu do szklanego lub odpowiedniego plastikowego pojemnika z pokrywką i dodawać kroplami wymaganą ilość H2SO4, a następnie mieszać przez inwersję. Uwaga: Kwas siarkowy jest niebezpieczny.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml odczynnika metylującego do próbek rozpuszczonych w suchym toluenie, szczelnie zakryć probówki i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Podgrzewać próbki przez 2 godziny w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Po 2 godzinach zdejmij probówki z ognia. Po ostygnięciu dodać 1,0 ml roztworu neutralizującego (0,25 M KHCO3 0,5 MK 2CO3 ). Uwaga: Wodorowęglan potasu i węglan potasu są niebezpieczne.</li>
	<li>Dodaj 1,0 ml suchego heksanu i odwiruj.</li>
	<li>Wirować przy 250 x g przez 2 min, hamowanie przy niskim poziomie w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zbierz górną fazę, która zawiera FAME, i przenieś do nowej jednorazowej szklanej rurki bez zakrętki.</li>
	<li>Pobrany FAME należy wysuszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.</li>
</ol>
5. Usuwanie zanieczyszczenia wolnym cholesterolem z CE FAME14
(Wolny cholesterol może zanieczyścić próbkę; zobacz na rysunku 1 na przykład ślady chromatografu z usuwaniem wolnego cholesterolu i bez niego).
<ol>
	<li>Umieść rurkę odpływową w zbiorniku SPE i umieść wkład SPE z żelem krzemionkowym na zbiorniku.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 3 x 1 ml przepłuczyny suchego heksanu w próżni i 1 x 1 ml pod wpływem grawitacji.</li>
	<li>Usuń mycie odpadów i wlej nową rurkę odpływową do zbiornika.</li>
	<li>Rozpuść CE FAME w 1 ml suchego heksanu, wiruj.</li>
	<li>Nanieść na kolumnę za pomocą szklanej pipety Pasteura i pozostawić do przepuszczenia pod wpływem grawitacji.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 3 x 1 ml popłuczyny heksanu w próżni.</li>
	<li>Usuń myte odpady i umieść nową rurkę bez zakrętki w zbiorniku oznaczonym CE FAME.</li>
	<li>Eluować CE FAME za pomocą 2 x 1 ml suchego heksanu: eter dietylowy (95:5 v/v) przemywa.</li>
	<li>Suszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia. Uwaga: Eter dietylowy jest niebezpieczny.</li>
</ol>
6. Przeniesienie FAME do fiolki GC Auto Sampler
<ol>
	<li>Dodać 75 μl suchego heksanu do próbki, odwirować i przenieść do fiolki z automatyczną próbką GC.</li>
	<li>Dodać kolejne 75 μl suchego heksanu do próbki, odwirować i przenieść do tej samej fiolki z automatyczną próbką GC. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.</li>
</ol>
7. Analiza za pomocą chromatografu gazowego14
<ol>
	<li>Analizuj FAME na chromatografie gazowym. Przykładowa konfiguracja: 30 m x 0,25 μm x 0,25 mm BPX-70 kolumna kapilarna z topionej krzemionki z protokołem temperatury: 
	Temperatura początkowa 115 °C, przytrzymaj 2 min, rampa 10 °C/min do 200 °C, przytrzymaj 18,5 min, rampa 60 °C/min do 245 °C, przytrzymaj 4 min. 
	Kolumna: hel gazowy, natężenie przepływu 1,0, ciśnienie 14,6 i prędkość 29, 
	Wtryskiwacz: Temperatura = 300 °C. 
	Detektor: przepływ wodoru 40,0, przepływ powietrza 184,0, gaz uzupełniający Hel, przepływ 45,0, temperatura = 300 °C.</li>
	<li>Ustaw odpowiedni współczynnik podziału (np. 25:1 dla analizy CE FAME).</li>
	<li>Określ obszar pod każdym pikiem za pomocą odpowiedniego oprogramowania i zidentyfikuj FAME w porównaniu ze standardami. Patrz rysunek 2 dla przykładu chromatogramów.</li>
	<li>Użyj obszaru pod danymi piku, aby obliczyć udział poszczególnych kwasów tłuszczowych jako procent całkowitych kwasów tłuszczowych.</li>
	<li>Obliczyć bezwzględne stężenia kwasów tłuszczowych, dzieląc powierzchnię wzorca wewnętrznego przez dodaną ilość. Podziel powierzchnię każdego kwasu tłuszczowego przez ten wynik, aby uzyskać bezwzględne stężenia każdego kwasu tłuszczowego w ilości użytej tkanki.</li>
</ol>

<ol><li>Browning, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+eicosapentaenoic+and+docosahexaenoic+acids+into+lipid+pools+when+given+as+supplements+providing+doses+equivalent+to+typical+intakes+of+oily+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish.</a> Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).</li>
<li>Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+and+clearance+of+omega-3+fattyacids+in+erythrocyte+membranes+and+plasma+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids.</a> Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).</li>
<li>Lauritzen, L., Carlson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+fatty+acid+status+during+pregnancy+andlactation+and+relation+to+newborn+and+infant+status%5BTitle%5D)+AND+%22Matern.+Child+Health%22%5BJournal%5D)">Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status.</a> Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).</li>
<li>Kelsall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dysfunction+induced+in+offspring+by+maternal+dietary+fat+involves+altered+arterial+polyunsaturated+fatty+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids%2C+obesity%2C+and+insulin+resistance%3A+time+for+a+re-evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation.</a> Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).</li>
<li>Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans+fat+labelling+and+levels+in+U.S.+foods%3A+assessment+of+gas+chromatographic+and+infrared+spectroscopic+techniques+for+regulatory+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance.</a> J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).</li>
<li>Chee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+content+of+marine+oil+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Fatty acid content of marine oil capsules.</a> Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).</li>
<li>American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://lipidlibrary.aocs.org">http://lipidlibrary.aocs.org</a> (2013).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+separation+of+phosphatidylcholine%2C+triacylglycerol%2C+non-esterified+fatty+acids+and+cholesterol+esters+from+plasma+by+solid-phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction.</a> Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).</li>
<li>Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fatty+acids+by+gas+chromatography%2C+and+its+relevance+to+research+on+health+and+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition.</a> Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).</li>
<li>Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeesley%2C+TE+%22Quantitative+chromatographic+analysis%22">Quantitative chromatographic analysis</a>. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).</li>
<li>Bartle, K. D., Myers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">History of gas chromatography.</a> Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).</li>
<li>Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from 
 
 <a target="_blank" href="eprints.soton.ac.uk">eprints.soton.ac.uk</a> 378 (2008).</li>
<li>Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+erythrocyte+membrane+Trans+and+marine+fatty+acids+between+1999+and+2006+in+older+Americans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans.</a> J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).</li>
<li>Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf">ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf</a> (2013).</li>
<li>Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+fat%3A+An+introduction+to+lipidomic+profiling+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method.</a> J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Chromatografia gazowa jest dokładną techniką do analizy kwasów tłuszczowych, a jej wysoka odtwarzalność sprawia, że technika ta jest odpowiednia do analiz klinicznych. Należy użyć odpowiednich kolumn GC w celu umożliwienia identyfikacji kwasów tłuszczowych będących przedmiotem zainteresowania, przy czym dostępne kolumny mają różnice w polarności fazy stacjonarnej, długości kolumny i średnicy wewnętrznej. Zastosowanie w tej metodzie analizy kolumny kapilarnej ze stopionej krzemionki zapewnia dobrą stabilność termiczną i w...

Chromatografia gazowa (GC) jest dobrze znaną techniką używaną do identyfikacji i ilościowego określania inkorporacji kwasów tłuszczowych do pul lipidowych i błon komórkowych1,2 podczas suplementacji lub stanów fizjologicznych, takich jak otyłość (i choroby pokrewne, takie jak cukrzyca) lub ciąża3-5. Nadaje się również do analizy rodzajów i ilości tłuszczów w żywności. Jest to przydatne przy charakteryzowaniu diet eksperymentalnych, a także przy zapewnianiu, że przemysł spożywczy przestrzega przepisów. Na przykład GC może być używany do potwierdzania tożsamości i ilości kwasów tłuszczowych w produkcie, takim jak suplement diety, w celu zapewnienia, że etykietowanie jest prawidłowe i przestrzegane są przepisy6,7. Analiza kwasów tłuszczowych może dostarczyć cennych informacji na temat metabolizmu lipidów w zdrowiu i chorobie, wpływu zmiany diety oraz wpływu zmian w stanie fizjologicznym8. Zastosowanie GC do badania próbek w czasie ciąży dostarczyło ważnych informacji na temat zmian w homeostazie kwasów tłuszczowych i złożonych lipidów3.

Przed chromatograficzną separacją, lipidy są zazwyczaj ekstrahowane z próbki przy użyciu rozpuszczalności lipidów w mieszaninach rozpuszczalników chloroformu i metanolu. Chlorek sodu dodaje się w celu ułatwienia rozdzielenia mieszaniny na wodne i organiczne fazy zawierające lipidy9,10. Złożone klasy lipidów, które są przedmiotem zainteresowania, można oddzielić od całkowitego ekstraktu lipidowego przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE). Ta technika separacji eluuje klasy lipidów na podstawie ich polarności lub powinowactwa wiązania. Triacyglicerole (TAG) i estry cholesterolu (CE) są najpierw eluowane jako frakcja złożona, kolejne klasy, fosfatydylocholina (PC), fosfatydyloetanoloamina (PE) i nieestryfikowane kwasy tłuszczowe (NEFA) są eluowane przez zwiększenie polarności rozpuszczalnika elującego. Oddzielenie TAG od CE wykorzystuje wiązanie TAG tylko ze świeżym wkładem SPE, co pozwala na elucję CE. TAG można następnie eluować poprzez zwiększenie polarności rozpuszczalnika eluującego9,10. Metoda ta pozwala na jednoczesne rozdzielanie wielu próbek z większą wydajnością niż w przypadku chromatografii cienkowarstwowej, co oznacza, że można analizować próbki o stosunkowo małych rozmiarach (np. <100 μl osocza lub surowicy, <100 mg tkanki)11,12.

GC to sprawdzona technika, opisana po raz pierwszy w latach 50.; zasugerowano, że faza ruchoma w ówczesnych układach ciecz-ciecz może zostać zastąpiona parą. Początkowo był używany do analizy ropy naftowej, ale szybko rozszerzył się na inne obszary, takie jak analiza aminokwasów i biochemia lipidów, która nadal cieszy się dużym zainteresowaniem. Postęp w sprzęcie i technologii GC, taki jak opracowanie kolumn kapilarnych z wcześniej stosowanych kolumn z wypełnieniem, doprowadził do naszych obecnych technik, w których kwasy tłuszczowe są w stanie być bardziej efektywnie oddzielane w niższych temperaturach, co powoduje, że GC jest rutynowo stosowana do identyfikacji i ilościowego oznaczania kwasów tłuszczowych w szerokim zakresie badań13.

GC wymaga derywatyzacji kwasów tłuszczowych, aby mogły stać się wystarczająco lotne, aby mogły być eluowane w rozsądnych temperaturach bez termicznego rozkładu. Zwykle wiąże się to z podstawieniem grupy funkcyjnej zawierającej wodór w celu utworzenia estrów, tioestrów lub amidów do analizy. Estry metylowe są powszechnie badanymi pochodnymi, które są wytwarzane w procesie metylacji. W tej metodzie wiązania estrowe w złożonych lipidach są hydrolizowane w celu uwolnienia wolnych kwasów tłuszczowych, które są transmetylowane w celu wytworzenia estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME). Otrzymany profil FAME, określony za pomocą GC, jest określany jako skład kwasów tłuszczowych i może być łatwo porównany między różnymi grupami doświadczalnymi9,10. Technika ta pozwala na pomiar zarówno proporcji poszczególnych kwasów tłuszczowych, jak i ich stężeń.

Oprócz wykorzystania GC do analizy kwasów tłuszczowych w badaniach żywieniowych i w przemyśle spożywczym, technika ta może być stosowana w szerokim zakresie dziedzin analitycznych. Na przykład analizy środowiskowe z wykorzystaniem GC obejmują pomiar zanieczyszczenia wody środkami owadobójczymi, a analizy gleby mierzą zawartość chlorobenzenu. W toksykologii GC był również używany do identyfikacji nielegalnych substancji w próbkach moczu i krwi osób; Taki wzmacniacz osiągów sportowych12 i zdolność do rozdzielania złożonych mieszanin węglowodorów sprawia, że technika ta jest popularna w przemyśle naftowym do analizy petrochemicznej12.

Ciąża wiąże się ze znaczącymi zmianami w składzie kwasów tłuszczowych w tkankach matki, szczególnie w zawartości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych omega-3 (n-3) i omega-6 (n-6) (PUFA)3. W obecnym badaniu pokazujemy zastosowanie GC w pomiarze kwasów tłuszczowych, opisując jego zastosowanie w analizie składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby pobranej od dziewiczych i ciężarnych szczurów karmionych dietami nisko- i wysokotłuszczowymi o różnych źródeł ropy naftowej. Przedstawione tutaj diety eksperymentalne to dieta niskotłuszczowa oparta na oleju sojowym, dieta oparta na wysokotłuszczowym oleju sojowym (130,9 g tłuszczu całkowitego/kg tłuszczu całkowitego) lub dieta oparta na wysokotłuszczowym oleju lnianym (dieta 130,9 g tłuszczu całkowitego/kg), podawana przez 20 dni. Pełny skład składników odżywczych i kwasów tłuszczowych tych diet został opisany wcześniej14. Dieta oparta na oleju sojowym jest bogata w kwas linolowy (18:2n-6) i zawiera pewną ilość kwasu α-linolenowego (18:3n-3), podczas gdy dieta oparta na oleju lnianym jest bogata w kwas α-linolenowy. Te diety wysokotłuszczowe reprezentują różne proporcje kwasu linolowego do α-linolenowego (odpowiednio proporcje 8:1 i 1:1). Metoda izolacji poszczególnych klas lipidów i analizy za pomocą GC jest dobrze ugruntowana i zwalidowana i została opublikowana wcześniej10, ale bez szczegółowego opisu technicznego, który znajduje się w niniejszym dokumencie.

<table><tbody><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17'CAUTION</td><td>' Opary - Chloroform klasy HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4966/17'UWAGA</td><td>' Opary - HPLC Grade</td></tr><tr><td>BHT</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>W218405</td> <td>CAUTION' Pyły - Bezwodny</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S9888</td><td>Bezwodny</td></tr><tr><td>heksan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/0406/17'CAUTION</td><td>' Opary - HPLC Grade</td></tr><tr><td>Lodowcowy kwas octowy</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>695084</td> <td>UWAGA' Oparzenia - 99.85%</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>339741</td> <td>CAUTION' Burns - 99.999%</td></tr><tr><td>Węglan potasu</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>209619</td><td>99% ACS Odczynnik klasy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>237205</td><td>99,7% octan</td></tr><tr><td>etylu</td> klasy ACS <td>Fisher Scientific</td><td>10204340</td> <td>CAUTION" Opary - 99+% GLC SpeciFied</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Fisher Scientific</td><td>T/2300/15'CAUTION</td><td>' Opary</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>309966</td> <td>CAUTION' Opary</td></tr><tr><td>Azot (beztlenowy) butla</td><td>BOC</td><td>44-w</td><td>'UWAGA' Gaz sprężony - ryzyko wybuchu</td></tr><tr><td>Wkłady SPE z krzemionki aminopropylowej</td><td>Agilent</td><td>12102014</td><td>Wkład - Masa kulki 100 mg</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy Kartridże SPE</td><td>Agilent</td><td>14102010</td><td>Cartridge - Masa kulek 100 mg</td></tr><tr><td>Sejwy molekularne</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>334324</td><td>Granulki, AW-300, 1,6 mm</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50251</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie chromatografii gazowej do analizy zmian składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby szczura w czasie ciąży

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Chromatografia gazowa (GC) jest bardzo czułą metodą używaną do identyfikacji i ilościowego oznaczania zawartości kwasów tłuszczowych w lipidach z tkanek, komórek i osocza/surowicy, dając wyniki z dużą dokładnością i wysoką powtarzalnością. W badaniach metabolicznych i żywieniowych GC umożliwia ocenę zmian stężeń kwasów tłuszczowych po interwencjach lub podczas zmian stanu fizjologicznego, takich jak ciąża. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) przy użyciu wkładów aminopropylowo-krzemionkowych umożliwia oddzielenie głównych klas lipidów, w tym triacylogliceroli, różnych fosfolipidów i estrów cholesterolu (CE). GC w połączeniu z SPE wykorzystano do analizy zmian w składzie kwasów tłuszczowych frakcji CE w wątrobach dziewiczych i ciężarnych szczurów, które były karmione różnymi dietami o wysokiej i niskiej zawartości tłuszczu. Istnieje znaczący wpływ interakcji między dietą a ciążą na zawartość kwasów tłuszczowych omega-3 i omega-6 w wątrobie CE, co wskazuje, że ciężarne samice mają inną reakcję na manipulację dietą niż obserwuje się to wśród dziewiczych samic.

Sukces tej metody zależy od precyzyjnego przestrzegania protokołu oraz stosowania czystych rozpuszczalników i odczynników w celu zminimalizowania „szumu” i zanieczyszczeń, które mogą pojawić się na chromatogramie. Zanieczyszczone próbki są trudniejsze do analizy, co obniża dokładność obliczeń pola pod krzywą. W przypadku prawidłowego wykonania protokołu powinien zostać uzyskany chromatogram z wyraźnymi, symetrycznymi i dobrze zdefiniowanymi pikami oraz minimalnym szumem tła, jak przedstawiono na Rysunku 3</strong...

Ciąża prowadzi do znaczących zmian w składzie kwasów tłuszczowych w tkankach matki. Profile lipidowe można uzyskać za pomocą chromatografii gazowej, aby umożliwić identyfikację i ilościowe określenie kwasów tłuszczowych w poszczególnych klasach lipidów wśród szczurów karmionych różnymi dietami wysoko- i niskotłuszczowymi w czasie ciąży.

Zastosowanie chromatografii gazowej do analizy zmian składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby szczura w czasie ciąży

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza składu kwasów tłuszczowych w wątrobie. Jest to realizowane poprzez odważenie próbki wątroby i jej homogenizację, a następnie ekstrakcję wszystkich lipidów z homogenizowanego homogenatu wątroby.Następnie poszczególne klasy lipidów, takie jak estry cholesterolu, są rozdzielane przy użyciu ekstrakcji do fazy stałej. Końcowym etapem jest oczyszczanie i derywatyzacja klas lipidów do estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Ostatecznie wykorzystuje się chromatografię gazową, aby wykazać, w jaki sposób skład kwasów tłuszczowych w tkankach może ulec zmianie pod wpływem interwencji żywieniowej lub być modyfikowany przez zmiany w stanie fizjologicznym, np. ciążę.Choć metoda ta pozwala na poznanie składu kwasów tłuszczowych w tkankach, może być ona również stosowana do innych rodzajów próbek, takich jak oleje, nasiona i produkty spożywcze. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice mogą napotkać trudności, ponieważ niektóre etapy protokołu wymagają sprawności manualnej i wprawy, np. powtarzalne pobieranie fazy górnej i dolnej. Procedurę zaprezentują Hena, Fisk oraz Annette West, technik i doktorantka z naszego laboratorium.Najpierw odetnij około

the-use-gas-chromatography-to-analyze-compositional-changes-fatty

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Zastosowanie chromatografii gazowej do analizy zmian składu kwasów tłuszczowych w tkankach wątroby szczurów podczas ciąży

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Opisano metodę oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach na podstawie mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji oraz kwantyfikacji i identyfikacji kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej. Wewnętrzny wzorzec tripentadekaniny służy do kompensacji ewentualnych strat podczas ekstrakcji i niepełnej transestryfikacji.

Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Tutaj prezentujemy tanią metodę ilościową wykorzystującą spektrometrię mas z tlenkiem deuteru i chromatografią gazową (GCMS) do analizy całkowitej lipogenezy de novo kwasów tłuszczowych w brunatnej tkance tłuszczowej in vivo.

Ilościowe oznaczanie syntezy kwasów tłuszczowych de novo w brunatnej tkance tłuszczowej przy użyciu tlenku deuteru

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Opisano metodę oznaczenia kwasowości w fazie gazowej oligopeptydów zawierających cysteinę. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu potrójnego spektrometru mas kwadrupolowego. Względną kwasowość peptydów zmierzono za pomocą eksperymentów dysocjacji indukowanej zderzeniowo, natomiast kwasowość ilościową wyznaczono z zastosowaniem rozszerzonej kinetycznej metody Cooksa.

Oznaczanie kwasowości w fazie gazowej oligopeptydów

Poznaj analizę składu kwasów tłuszczowych w wątrobie szczura podczas ciąży przy użyciu chromatografii gazowej. Ta metoda pozwala badać zmiany metaboliczne i wpływ diety na tkanki matczyne.

Zastosowanie chromatografii gazowej do analizy zmian składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby szczura w czasie ciąży

Przeglądaj więcej filmów