Zastosowanie chromatografii gazowej do analizy zmian składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby szczura w czasie ciąży

Ogólnym celem tej procedury jest analiza składu kwasów tłuszczowych w wątrobie. Osiąga się to poprzez najpierw odważenie próbki wątroby i jej homogenizację. Drugim krokiem jest ekstrakcja wszystkich lipidów z homogenizowanej próbki wątroby.

Następnie poszczególne klasy lipidów, takie jak estry cholesterolu, są rozdzielane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej. Ostatnim etapem jest ifikacja i wyprowadzenie klas lipidów do estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Ostatecznie chromatografia gazowa służy do pokazania, w jaki sposób skład kwasów tłuszczowych w tkankach może się zmienić po interwencji żywieniowej lub pod wpływem zmian stanu fizjologicznego, takich jak ciąża.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w skład kwasów tłuszczowych w tkankach, można ją również zastosować do innych typów próbek, takich jak olej, nasiona i żywność. Ogólnie rzecz biorąc, użytkownicy nowi w tej technice mogą mieć problemy, ponieważ niektóre części protokołu wymagają zręczności manualnej i wymagają praktyki, takie jak powtarzalne zbieranie górnych i dolnych faz. Procedurę zademonstrują Hena, Fisk i Annette West, technik i doktorant z naszego laboratorium.

Najpierw wytnij około 100 miligramów zamrożonej wątroby i zważ tkankę. Umieść chusteczkę w plastikowej tubie w wiaderku z lodem i dodaj 0,5 mililitra lodowatego 0,9% chlorku sodu. Następnie homogenizuj tkankę i przenieś do szklanej rurki z nakrętką.

Użyj kolejnych 0,3 mililitra 0,9% chlorku sodu, aby przenieść pozostałą tkankę do szklanej rurki z nakrętką. Następnie dodać 100 mikrogramów cholesterolu heta dechen standard rozpuszczony w dwóch do jednego, suchy chloroform do metanolu do probówki, a następnie dodatkowe pięć mililitrów tego samego roztworu rozpuszczalnika zawierającego 50 miligramów na litr butylowanego hydroksytoluenu. Po dodaniu jednego mililitra jednego molowego chlorku sodu, zakryj probówkę i dokładnie wymieszaj próbkę, wirując, aż będzie wyglądać na jednolitą.

Następnie odwirować próbkę w temperaturze 1000 razy G przez 10 minut z małą przerwą w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu zbierz dolną fazę za pomocą szklanki obok pipety i przenieś ją do nowej szklanej rurki z zakrętką. Następnie wysuszyć próbkę pod azotem w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

W tym momencie podłącz zbiornik SPE do pompy próżniowej i umieść wkład SPE z aminokrzemionką propylową na zbiorniku. Umieść nową szklaną rurkę z zakrętką oznaczoną TAG i CCE w stojaku na zbiornik pod kolumną, aby zebrać pierwszą frakcję. Rozpuść całkowity ekstrakt lipidowy w jednym mililitrze suchego chloroformu i wymieszaj próbkę przez wirowanie.

Następnie przenieść próbkę do kolumny za pomocą pipety z pastą szklaną i pozwolić, aby ciecz kapała do rurki z nakrętką pod wpływem grawitacji. Gdy ciecz nie kapie już z kolumny, usuń pozostałą ciecz za pomocą próżni. Następnie wymyj frakcję TAG i CE, przemłukując kolumnę dwukrotnie jednym mililitrem suchego chloroformu w próżni.

Gdy cała ciecz wypłynie z kolumny, wysusz frakcję TAG i CE pod azotem w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Umieść nowy wkład SPE z krzemionką aminową propylu na zbiorniku SPE i umieść szklaną rurkę z zakrętką w tacy zbiornika pod wkładem, aby zebrać odpady. Umyj kolumnę jednym mililitrem suchego heksanu trzy razy w próżni.

Po wyłączeniu próżni umyj kolumnę ostatnim mililitrem heksanu H pod wpływem grawitacji. Po wymianie rurki odpadowej na nową szklaną rurkę z nakrętką oznaczoną ce, rozpuść wysuszoną frakcję TAG i CE w jednym mililitrze suchego heksanu i wymieszaj próbkę przez wirowanie. Następnie przenieś próbkę do kolumny za pomocą szklanego przejścia lub pipety i pozwól, aby ciecz przeciekała przez kolumnę pod wpływem grawitacji.

Gdy ciecz nie kapie już z kolumny, usuń pozostałą ciecz pod próżnią pod próżnią. Przemyć kolumnę dwukrotnie jednym mililitrem suchego heksanu w celu wymycia CE i wysuszyć zebraną frakcję pod azotem w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 0,5 mililitra suchego toluenu do oddzielonej frakcji CE i wymieszaj próbkę przez wirowanie.

Dodać jeden mililitr wcześniej przygotowanego odczynnika do metylacji do próbki rozpuszczonej w suchym toluenie. Następnie szczelnie zakryj probówkę i wymieszaj Delikatnie podgrzewaj próbkę przez dwie godziny w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Gdy próbki ostygną do temperatury pokojowej, dodaj jeden mililitr roztworu neutralizującego.

Następnie dodać jeden z suchych heksanów do próbki Po wirteksie odwirować próbki w temperaturze 250 razy G przez dwie minuty z małą przerwą w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu zbierz górną fazę sławy i przenieś ją do nowej jednorazowej szklanej rurki bez zakrętki. Pobraną próbkę wysuszyć pod azotem w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

Po umieszczeniu rurki odpływowej w zbiorniku SPE i żelu krzemionkowego, wkładu SPE na zbiorniku, należy przemyć kolumnę trzykrotnie jednym mililitrem suchego heksanu w próżni i jednym mililitrem suchego heksanu pod grawitacją. Po usunięciu odpadów należy je umyć. Dodaj nową rurkę odpływową do zbiornika, a następnie rozpuść próbkę CE fame w jednym mililitrze suchego heksanu.

Po wymieszaniu próbki przez wirowanie przenieść ją do kolumny za pomocą szklanego pasa lub pipety. Gdy ciecz przepłynie przez kolumnę pod wpływem grawitacji, umyj kolumnę trzykrotnie jednym mililitrem heksanu w próżni. Następnie usuń myjki odpadowe i umieść w zbiorniku nową rurkę bez zakrętki oznaczoną CE fame.

Eluować frakcję sławy CE za pomocą dwóch mililitrów od 95 do pięciu suchych heksanów do eteru etylowego. Następnie wysuszyć zebraną frakcję pod azotem w temperaturze 40 stopni Celsjusza, wysuszoną frakcję rozpuścić w 75 mikrolitrach suchego heksanu i wymieszać próbkę przez wirowanie po wymieszaniu próbki przez wirowanie. Przenieść go do fiolki z automatyczną próbką GC po powtórzeniu poprzedniego kroku.

Przeanalizować próbkę na chromatografie gazowym, jeśli protokół jest przestrzegany prawidłowo. Należy uzyskać chromatogram z wyraźnymi symetrycznymi, dobrze zdefiniowanymi pikami i minimalnym szumem tła, jak pokazano poniżej. Jeśli doszło do zanieczyszczenia, chromatogram pokaże dodatkowe piki i wykaże piki niesymetryczne lub skośne, jak pokazano tutaj.

Zanieczyszczenie wolnym cholesterolem wystąpi podczas biegania sławy pochodzącej z CE, chyba że cholesterol zostanie usunięty. Zastosowanie przygotowanej mieszanki kalibracyjnej pozwala na identyfikację sławy w próbce. Mieszankę kalibracyjną przeprowadza się przy użyciu tych samych ustawień przyrządu, co próbki, tak aby chromatogram mógł być porównany z próbką i pikami zidentyfikowanymi na podstawie ich czasów retencji, jak pokazano poniżej.

Pik zerowy 16 jest tutaj wyróżniony w celu zilustrowania porównania czasów retencji z mieszanki kalibracyjnej w górnym chromatogramie do kwasów tłuszczowych. W dolnej próbce ślad, umożliwiający prawidłowe oznakowanie powierzchni piku kwasów tłuszczowych, wykorzystuje się do obliczenia procentowej zawartości określonych kwasów tłuszczowych w całości. Po zebraniu danych warto sprawdzić je pod kątem wartości odstających, jak pokazano poniżej.

Próbki odstające mogą być następnie dalej badane, a ekstrakcja i/lub analiza powtórzone w razie potrzeby. Jak pokazano tutaj, sława w wątrobie szczura CE jest opisana jako procent całkowitych kwasów tłuszczowych w wątrobie CE. Dane te opisują kwasy tłuszczowe CE w wątrobie dziewiczych lub ciężarnych szczurów karmionych przez 20 dni na jednej z trzech różnych diet.

Analiza statystyczna z wykorzystaniem dwuczynnikowego preparatu Innova ujawnia istotny wpływ diety i ciąży na proporcję kilku kwasów tłuszczowych, a także istotny wpływ diety na poszczególne ciąże. Na przykład zawartość kwasu onowego w wątrobie CE u ciężarnych szczurów jest bardziej zależna od diety niż u dziewiczych samic. Technika ta pozwala na wykonanie 20 próbek dziennie od początku do końca, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po opanowaniu, porcjowanie próbek może zwiększyć przepustowość i podwoić ilość przetwarzaną w ciągu tygodnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować skład kwasów tłuszczowych poszczególnych klas lipidów za pomocą ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w dygestoriach i noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.