Name: Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-20T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj metodę indukowania plastyczności receptorów GPCR w astrocytach myszy poprzez manipulację aktywnością neuronów. Protokół obejmuje preparat hipokampalny, mikroskopię konfokalną i analizę sygnałów wapniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Centrum Interakcji Glejowo-Neuronalnych Uniwersytetu Kalifornijskiego w Riverside za cenne omówienie protokołów skalowania i danych. Autorzy pragną również serdecznie podziękować firmie Abcam za sponsorowanie publikacji ich pracy.

<ol><li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2%2B+elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li>
<li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li>
<li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenoceptors+in+brain%3A+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Int%22%5BJournal%5D)">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li>
<li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li>
<li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li>
<li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca2%2B+signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li>
<li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li>
<li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li>
<li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li>
<li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li>
<li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2%2B+increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li>
<li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li>
<li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li>
<li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li>
<li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li>
<li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II%3A+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Funct%22%5BJournal%5D)">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li>
<li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2%2B-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li>
<li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors%3A+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li>
<li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cortex%22%5BJournal%5D)">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li>
<li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors%3A+%28patho%29physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li>
<li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade%3A+synaptic+scaling%2C+intrinsic+plasticity+and+age-dependence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li>
<li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer+1+and+layer+2%2F3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology%2C+pharmacology%2C+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li>
<li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li>
</ol>

Autorzy pragną ujawnić, że tetrodotoksyna użyta w tych badaniach została zakupiona od firmy Abcam. Abcam nie brał udziału w tworzeniu hipotez, projektowaniu ani gromadzeniu danych. Wszelka komunikacja dotycząca sponsorowania pracy przez Abcam miała miejsce po zakończeniu procesu wzajemnej oceny.

Opisane modele skalowania reprezentują praktyczne metody badania długoterminowej plastyczności astrocytarnej grupy I mGluRs. Obrazowanie spontanicznych i wywołanych zdarzeń Ca2 + zapewnia czuły test do pomiaru zmian w aktywności astrocytów Gq GPCR, ponieważ ustalono mocne dowody na to, że podwyższenie Ca2 + astrocytów następuje po uwolnieniu z wrażliwych na IP3magazynów po aktywacji Gq GPCR 10,12,17,18. Odsetek astrocytów w populacji reagujących na agonistę mGluR grupy I oraz wzorzec takich odpowiedzi Ca2+ wskazują na zmiany w mGluR grupy I przez astrocyty.
Specyficzna technika stosowana do ładowania astrocytów wskaźnikiem Ca2 + jest ważnym czynnikiem przy projektowaniu eksperymentów mających na celu poszukiwanie zmian w aktywności astrocytów Gq GPCR. Ładowanie Bolusem lub masowe ładowanie wielu astrocytów lub ładowanie patch-clamp pojedynczych astrocytów może być używane do obrazowania stanów przejściowych Ca2+ w astrocytach. Każde podejście ma pewne zalety i wady. Bezpośrednie napełnianie astrocytów wskaźnikiem Ca2+ za pomocą zacisku krosowego umożliwia jednoznaczną identyfikację komórki jako astrocytu bez konieczności stosowania markera wtórnego, takiego jak SR-101. Dostarczanie wskaźnika za pomocą zacisku krosowego umożliwia również rejestrację aktywności Ca2 + z małych przedziałów astrocytowych, w tym krzaczastych drobnych procesów, potencjalnie głębiej w warstwie, gdzie komórki są zdrowsze i mają bardziej nienaruszone interakcje z synapsami (w zależności od dostępnej mocy lasera). Jednak ładowanie patch-clamp cierpi z powodu niskiej przepustowości, ponieważ dane są zbierane pojedynczo komórka. Z kolei ładowanie zbiorcze pozwala na jednoczesne ładowanie dużej liczby astrocytów wskaźnikiem Ca2+ i obrazowanie. Jednak ładowane są tylko astrocyty w pobliżu powierzchni (<20 μm) wycinka, co wiąże się z obawami o zdrowie komórek i nienaruszone synapsy.
Przedstawiony tutaj protokół ładowania bolusem zwrotnego oferuje rozwiązanie pośrednie, ze stosunkowo wysoką przepustowością i możliwością monitorowania aktywności Ca2+ głębiej w warstwie (40-75 μm). Obserwuje się znaczny wzrost odsetka spontanicznie aktywnych astrocytów przy użyciu techniki ładowania bolusem w porównaniu z ładowaniem masowym, co sugeruje, że połączenia między synapsami neuronalnymi a procesami astrocytarnymi są bardziej kompletne15. Przy dobrym obciążeniu często można monitorować aktywnośćCa2+ w głównych procesach astrocytów (dane nie pokazane) lub potencjalnie nawet w mniejszych przedziałach za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Należy jednak zachować ostrożność przy przypisywaniu mniejszych procesów do konkretnego astrocytu, ponieważ granice wtapiają się w niespecyficzne barwienie tła. Dodatkowym problemem związanym ze stosowaniem procedur ładowania masowego lub bolusa jest potrzeba wtórnego markera do identyfikacji astrocytów. Chociaż od wielu lat wiadomo, że astrocyty preferencyjnie pobierają wskaźniki estru Ca2 + AM, wtórny marker SR-101 jest często używany do weryfikacji załadowanych komórek jako astrocytów. SR-101 sam w sobie może zmieniać wewnętrzną pobudliwość neuronów29. Zastosowanie SR-101 potwierdza potrzebę wykonania wszystkich pomiarów Ca2+ astrocytów w TTX w celu ograniczenia możliwego wpływu SR-101 na pobudliwość neuronów. Zakładając, że zarówno grupa kontrolna, jak i eksperymentalna zawiera SR-101, marker sam w sobie nie powinien uwzględniać efektów obserwowanych w sygnalizacji astrocytów Ca2 + po długotrwałej manipulacji neuronalnymi potencjałami czynnościowymi. SR-101 może być jednak większym problemem w eksperymentach o wysokim współczynniku K+ , ponieważ może zmniejszyć różnicę między 2,5 mM K+ a 5,0 mM K+ , jeśli podstawowa szybkość wypalania nie zostanie proporcjonalnie zmieniona.
Niedawno pojawiło się bardzo obiecujące podejście do dostarczania wskaźnika Ca2 + do astrocytów, które stanowi atrakcyjną alternatywę dla bardziej tradycyjnych metod wykorzystujących barwniki Ca2 + . W ciągu ostatnich kilku lat poczyniono znaczne postępy w zakresie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) ukierunkowanych na astrocyty30-32. GECI mogą być dostarczane do astrocytów poprzez mikrowstrzyknięcie in vivo wektorów wirusowych związanych z adenowirusem do obszaru mózgu, takiego jak hipokamp. Ekspresja GECI osiąga się po około dwóch tygodniach od infekcji wirusowej32. Istnieje wiele korzyści wynikających ze stosowania GECI w astrocytach. Po pierwsze, wektory są kierowane do astrocytów za pomocą promotora specyficznego dla astrocytów, więc znakowane komórki to astrocyty32. Po drugie, stosunek sygnału do szumu wydaje się teraz porównywalny do tego, co można uzyskać za pomocą dostarczania barwnika za pomocą patch-clamp, ale bez inwazyjności, jaką daje użycie pipety z plastrem na komórce32. Po trzecie, wskaźniki mogą być dostarczane i wyrażane w dorosłej tkance, co jest problematyczne przy użyciu metod dostarczania masowego. Co więcej, wyrażenie jest mozaikowe, oferując zdolność do różnicowania wielu astrocytów. W ten sposób kilka astrocytów może być potencjalnie obrazowanych jednocześnie, jednocześnie rejestrując je w somie i drobnych rozgałęzieniach. W związku z tym potencjalnie można zastosować jedną technikę zamiast trzech oddzielnych technik (ładowanie masowe, ładowanie bolusem i ładowanie zaciskiem krosowym) do rejestrowania aktywności skalowania astrocytarnych Gq GPCR, co znacznie zwiększyłoby wydajność.
Jedną z potencjalnych wad stosowania wskaźników Ca2 + do astrocytów za pośrednictwem wirusa jest możliwy wpływ na zdrowie plasterków32. Wykazano wcześniej, że wektory wirusowe związane z adenowirusem używane do dostarczania GECI powodują reaktywną glejozę astrocytów33. Przygotowanie wycinków mózgu w ogóle prawdopodobnie inicjuje wczesne etapy patologii, w tym uwalnianie cząsteczek zapalnych10. W związku z tym, w połączeniu z długimi czasami inkubacji wymaganymi do indukcji skalowania receptorów astrocytowych, zastosowanie GECI dostarczanych za pomocą wektorów wirusowych musiałoby zostać dodatkowo rozważone w kontekście zdrowia plasterków w tego typu eksperymentach.
Stosując ten protokół, ważne jest, aby pamiętać, że czas aplikacji agonisty w celu wytworzenia odpowiedzi będzie się różnił w zależności od dostępności receptora. Dla danego stężenia agonisty czas aplikacji będzie musiał być dłuższy, jeśli receptory zmniejszyły się, i krótszy, jeśli receptory zwiększyły się, aby lek osiągnął odpowiednie stężenie w tkance, aby aktywować receptory w stopniu wystarczającym do wytworzenia odpowiedzi Ca2+ . W związku z tym może zaistnieć potrzeba dostosowania czasu stosowania leków i potencjalnie ich stężeń w zależności od zamierzonego kierunku skalowania. Na przykład, stężenie agonisty może być konieczne obniżenie w przypadku TTX, aby uniknąć reakcji nasycenia, i zwiększenie po inkubacji plastrów w wysokim K+ , aby w ogóle zobaczyć odpowiedź. W szczególności stężenie DHPG przesunięto z 5-15 μM po leczeniu TTX do 30-50 μM po leczeniu 5,0 mM K+ w celu zbadania wzorców odpowiedzi Ca2+ , ponieważ 5-15 μM było często zbyt niskie, aby wytworzyć wiarygodne odpowiedzi w astrocytach po zmniejszeniu mGluR grupy I.
Rejestracja aktywności Ca2 + astrocytów nie dostarcza bezpośrednich dowodów na insercję lub internalizację receptora do lub z błony plazmatycznej. Jednak w oparciu o niezwykłe podobieństwo danych z danymi z poprzednich badań in vitro , w których badano bezpośredni związek między poziomami ekspresji Gq GPCR a spontanicznymi i wywołanymi stanami przejściowymi Ca2 + 21-24, najbardziej logiczną interpretacją zmian w sygnalizacji Ca2 + jest to, że zmieniły się poziomy ekspresji receptora na powierzchni astrocytów. Podejście uzupełniające może być ważnym czynnikiem, jeśli chce się dostarczyć dodatkowych dowodów na temat umiejscowienia wpływu na aktywność Ca2+ . Zastosowana przez nas strategia polegała na zbadaniu wpływu inkubacji TTX na wycinki hipokampa myszy astrocytarnych MrgA1R. Te transgeniczne myszy wyrażają obcy Gq GPCR (MrgA1R) tylko w astrocytach. Ponieważ receptor ten nie jest natywny dla mózgu, nie ma endogennego neuroprzekaźnika, który zmieniałby jego poziom aktywności. Wcześniejsze prace sugerowały, że receptor ten angażuje te same wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe, co endogenne grupy I mGluR w tych samych astrocytach34. Po długotrwałej inkubacji wycinków myszy MrgA1R w TTX, brak różnic w odpowiedziach MrgA1R wywołanych przez agonistów w porównaniu z inkubowanymi plastrami kontrolnymi z miotu stanowiłyby dowód na to, że wpływ na aktywność astrocytów Ca2 + jest spowodowany zmianami zlokalizowanymi w receptorze powierzchniowym, zwłaszcza jeśli odpowiedzi mGluR grupy I są nadal znacznie wzmocnione w tych samych astrocytach. Alternatywną, choć być może bardziej skomplikowaną strategią byłoby wyizolowanie astrocytów z wycinków w celu analizy Western blot, o ile frakcja błonowa mogłaby być analizowana pod kątem zmian w poziomach ekspresji receptorów powierzchniowych. Pomocne może być tutaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) lub cytometria przepływowa.
Możliwych zastosowań tej techniki do badania neuronów, astrocytów i interakcji astrocyta-neuron jest wiele. W naszych eksperymentach badano tylko wywołane przez DHPG odpowiedzi mGluR mGluR Ca2 + wywołane przez DHPG, w izolowanych ostrych wycinkach hipokampa od młodych myszy. Preparat ten posiada nie tylko nienaruszone aferenty (zabezpieczenia Schaffera), ale także neurony, które je wywołują (komórki piramidalne CA3), co umożliwia manipulowanie szybkością wypalania tych neuronów glutaminergicznego na komórki postsynaptyczne (komórki piramidalne CA1) i astrocyty w warstwie promienistej, których procesy wiążą się z tymi synapsami. Ostry wycinek hipokampa może nie być najlepszym przygotowaniem do manipulowania szybkością wypalania innych typów neuronów, jednak wiele aferentów jest odciętych od neuronów, które je powodują. Niemniej jednak, w niektórych preparatach plastrowych możliwe jest zaobserwowanie plastyczności innych astrocytarnych podtypów Gq GPCR. Na przykład plastry można przygotować z neuronami cholinergicznymi podstawy przodomózgowia i ich projekcjami do hipokampa w stanie nienaruszonym. Inkubacja tych wycinków w TTX lub podwyższonym K + wpłynęłaby na podstawowe tempo wypalania neuronów cholinergicznych, prowadząc do skalowania mAchR w astrocytach warstwy oriens, które otrzymują znaczną część cholinergicznego wejścia1. Alternatywnym, ale nieprzetestowanym podejściem do badania skalowania receptorów astrocytarnych w określonym obszarze mózgu, przy nienaruszonych wszystkich połączeniach podczas skalowania, może być użycie modelu in vivo , w którym przedłużone uwalnianie TTX uzyskuje się poprzez wszczepienie polimeru z tworzywa sztucznego Elvax o mocy 40 W powyżej obszaru zainteresowania35. Podejście to było już wcześniej stosowane w badaniach nad skalowaniem neuronalnym, ale powinno mieć również zastosowanie do skalowania astrocytów. Wreszcie, przy odpowiednim odczycie, przyszłe badania mogą dotyczyć innych rodzin GPCR, w tym zmian w Gs lub Gi GPCR. Można przewidzieć, że astrocytowe GABAB G i GPCR zostaną zakłócone po zahamowaniu wystrzeliwania w lokalnie rzutujących interneuronach GABA w dowolnym preparacie plasterków. Opracowanie nowych wskaźników ukierunkowanych na inne cząsteczki sygnałowe, takich jak wskaźnik w czasie rzeczywistym drugiego przekaźnika cAMP, otworzyłoby zupełnie nowy obszar badań nad komunikacją neuron-receptor astrocytów.
Dwukierunkowe skalowanie astrocytarnych mGluR poprzez manipulację szybkością wypalania neuronów bazowych stanowi miarę wrażliwości astrocytów na uwalnianie neuroprzekaźnika za pośrednictwem AP. Astrocyty mogą najwyraźniej wyczuwać spontaniczne AP i uwalnianie glutaminianu w synapsach komórek piramidowych Casaffera CA1, nawet jeśli zewnątrzkomórkowy K + znajduje się w zakresie fizjologicznym. Podczas gdy ostre zastosowanie TTX nie zmniejsza częstości spontanicznej aktywności Ca2 + astrocytów 18,36,37, aktywność Ca 2 + wśród astrocytów w populacji staje się związana z dekoracją36, dostarczając dowodów na to, że receptory astrocytarne są detektorami AP. Sugeruje to, że astrocyty wyczuwają spontaniczne neuronalne AP bez wpływu na ich ogólną aktywność Ca2 +. Powszechnie przyjmuje się, że wewnątrzkomórkowe stężenia IP3 muszą osiągnąć poziom progowy, aby stymulować IP3R wystarczająco, aby doprowadzić do wykrywalnego podwyższenia Ca2+. Czy spontaniczne neuronalne AP mogą aktywować astrocytarne GPCR bez wytwarzania mierzalnych wzrostów Ca2+? Przyszłe badania mogą wykorzystywać transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) lub podobną technikę (taką jak BRET) do zbadania związku między sprzężeniem białka G z receptorem (miara aktywacji receptora) a uwalnianiem Ca2 + z wewnętrznych magazynów. BRET był szeroko stosowany in vitro do wykrywania sprzężenia białka G z GPCR38, chociaż może minąć trochę czasu, zanim technologia ta stanie się dostępna do stosowania w nienaruszonych preparatach tkankowych. Możliwe, że astrocytowe Gq GPCR są aktywowane znacznie częściej, niż można to zarejestrować za pomocą obecnie dostępnych narzędzi do obrazowania Ca2+. Oprócz wykrywania potencjałów czynnościowych, astrocytarne Gq GPCR mogą być również w stanie wykryć miniaturowe kwantowe uwalnianie neuroprzekaźnika, jak podano w niedawnym badaniu39. Opisana tutaj metoda skalowania dwukierunkowego może być wykorzystana w przyszłych badaniach w celu określenia zakresu, w jakim astrocytowe Gq GPCR wykrywają ilościowe pęcherzykowe uwalnianie neuroprzekaźnika, poprzez włączenie bafilomycyny A1 do protokołu inkubacji.
Do tej pory protokoły skalowania były stosowane tylko w wycinkach hipokampa od młodych myszy (p12-p18). Dlatego obecnie nie wiadomo, czy skalowanie receptora astrocytarnego może być również indukowane w tkance uzyskanej od dorosłych myszy. Przekonujące ostatnie badanie sugeruje, że ekspresja mGluR grupy I w astrocytach znacznie zmniejsza się po pierwszym tygodniu życia i kontynuuje spadek aż do dorosłości, z bardzo niskimi poziomami ekspresji receptorów w dorosłych astrocytach40. Interesujące byłoby zatem ustalenie, czy astrocytarne mGluR zwiększają się po długotrwałym hamowaniu wypalania neuronów w wycinkach hipokampa dorosłych myszy do poziomów zbliżonych do tych obserwowanych w astrocytach od młodych myszy. Odkrycie to sugerowałoby, że ekspresja receptora astrocytarnego nie jest statyczna w danym wieku, ale może się szybko zmieniać w zależności od poziomu aktywności neuronalnej. W przeciwieństwie do zmniejszonej ekspresji mGluR grupy I u dorosłych myszy, pojawiają się dowody na to, że receptory adrenergiczne, w tym podtypy α1A, α2A i β1, są głównie wyrażane przez astrocyty w dorosłym mózgu 3,4. α1A adrenergiczny Gq GPCR może być atrakcyjnym celem dla przyszłych badań nad komunikacją neuron-astrocyty, w tym nad tym, czy receptory te są wrażliwe na zmiany w szybkości wypalania neuronów adrenergicznych.

Astrocyty reagują w ciągu kilku sekund na stymulację neuronów lub aksonów neuronalnych wzrostem cytoplazmatycznego Ca2+, wynikającym prawie wyłącznie z aktywacji astrocytarnych Gq GPCR. Na przykład receptory muskarynowe acetylocholiny1, receptory kannabinoidowe2, receptory adrenergiczneα 1A 3,4 i mGluR grupy I (patrz poniżej) są podtypami astrocytarnych Gq GPCR, które ostro reagują na aktywność neuronalną. Aktywacja mGluRs grupy astrocytarnej I została wykazana najszerzej, po stymulacji neuronalnych aferentów glutaminergiczny in situ (takich jak ostre wycinki hipokampa)5-7, a także w korze mięśniowej dorosłej myszy in vivo po stymulacji sensorycznej8. Wynik aktywacji astrocytarnej sygnalizacji Gq GPCR na biologię i fizjologię astrocytów, neuronów lub interakcji astrocyty-neuron był przedmiotem debaty9-12. Minie trochę czasu, zanim funkcja sygnalizacji receptora neuron-astrocyt zostanie w pełni doceniona. 
Chociaż jest jasne, że neurony mogą aktywować receptory astrocytowe za pomocą eksperymentalnych protokołów, istnieją aspekty komunikacji między neuronami a receptorami astrocytów, które pozostają słabo poznane. Po pierwsze, rzeczywista ilość aktywności neuronalnej wymaganej do aktywacji astrocytarnych Gq GPCR nie jest dobrze zdefiniowana, a po drugie, zdolność receptorów astrocytarnych do wykazywania plastyczności zależnej od użycia nie spotkała się z dużym zainteresowaniem. Aby zacząć odpowiadać na te pytania, niedawno opracowaliśmy protokół indukowania dwukierunkowego skalowania mGluR grupy astrocytów I w ostrych młodzieńczych wycinkach hipokampa w odpowiedzi na długoterminowe zmiany w aktywności synaptycznej zależnej od neuronalnego potencjału czynnościowego (AP). Podobnie jak odkryto dla dwukierunkowej plastyczności homeostatycznej neuronalnych jonotropowych receptorów glutaminianu13,14, mGluR grupy astrocytarnej I skalują się w górę po zablokowaniu neuronalnych potencjałów czynnościowych i zmniejszają się, gdy częstotliwość neuronalnego potencjału czynnościowego jest zwiększona15. Te kompensacyjne zmiany w receptorach astrocytarnych można zmierzyć, rejestrując spontaniczne i wywołane stany przejściowe astrocytów Ca2+ i porównując właściwości tych zdarzeń z tymi z astrocytów w warunkach kontrolnych. W tym manuskrypcie opisujemy pełną metodologię stosowania tego protokołu, w tym przygotowanie ostrych wycinków hipokampa, warunki inkubacji w celu wywołania skalowania receptora astrocytów, ładowanie barwnika wskaźnikowego Ca2 + astrocytów, techniki obrazowania Ca2 + przy użyciu mikroskopii konfokalnej oraz oczekiwany wpływ na aktywność Gq GPCR astrocytów. Przewidywalny wpływ na właściwości sygnalizacyjne astrocytów Ca2 + - które są zgodne z tymi zarejestrowanymi wcześniej w hodowanych komórkach transfekowanych różnymi poziomami ekspresji Gq GPCR - zapewnia "mapę drogową", która może być wykorzystana w przyszłych badaniach do oznaczania zmian w ekspresji astrocytarnej GPCR. Konsekwencje i potencjalne zastosowania tej techniki przyczynią się do naszego zrozumienia interakcji astrocytów-neuronów w zdrowym i chorym mózgu.

<table><tbody><tr><td>Chamber Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brinkmann pojemnik do przechowywania pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-491</td><td>Użyj części szuflady jako komory inkubacyjnej</td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td></td><td></td><td></td>elektryczna</tr><tr><td>Elastyczny wąż</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy uszczelniacz szwów&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Nazywany również uszczelniaczem szwów akwariowych</td></tr><tr><td>Zbiornik</td><td></td><td></td> gazu <td>95% tlenu, 5% dwutlenku węgla</td></tr><tr><td>Naturalna skośna końcówka pipety</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1000</td><td>Przycięte na wymiar do łączenia przewodów natleniających</td></tr><tr><td>Kolektor jedno- do sześciu linii</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0210 (MP-6)</td><td>Do aparatu do mikroładowarki z kolektorem</td></tr><tr><td>Mikroładowarka</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Do mikroładowarki z rozdzielaczem, przycięty na wymiar</td></tr><tr><td>Pływający stojak bąbelkowy</td><td>Bel Art Scienceware</td><td>F18875-0400</td><td>Do uchwytu na plastry</td></tr><tr><td>600 &micro; m Sefar Nitex Siatka nylonowa</td><td>ELKO Filtering Co.</td><td>06-600/51</td><td>Do uchwytu na plastry</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td><td>Do uchwytu na plastry</td></tr><tr><td><mocny>Odczynniki</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glukoza Fisher Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Kwas -6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (Trolox)</td><td>Acros Organics</td><td>53188-07-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian tetrodotoksyny (TTX)</td><td>Abcam</td><td>ab120055</td><td></td></tr><tr><td>Sulforodamina 101 (SR-101)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>284912</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy F-127</td><td>Invitrogen, Sondy molekularne</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *przepuszczalność komórek (opakowanie specjalne)</td><td>Invitrogen, sondy molekularne</td><td>O6807</td><td></td></tr><tr><td>(RS)-3,5-DHPG</td><td>Abcam</td><td>ab120020</td><td></td></tr><tr><td>Histamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Karbamoylcholina chlorek (Carbachol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 5'-ATP disodowy (Na-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia preparacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednokrawędziowa żyletka&nbsp;</td><td>GEM</td><td>62-0161</td><td>Do bisekcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Żyletka z podwójnym</td><td>ostrzem TED PELLA, INC.</td><td>121-6</td><td>Do krojenia plastrów</td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo, supercut</td><td>WPI</td><td>14010-15</td><td>Do dekapitacji</td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki, proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Do cięcia czaszki</td></tr><tr><td>Kleszcze do tęczówki, zakrzywione</td><td>WPI</td><td>15915</td><td>Do usuwania skóry i czaszki</td></tr><tr><td>Mała szpatułka</td><td></td><td></td><td>Aby usunąć/przenieść mózg</td></tr><tr><td>Dumostar Dumont #5 Biologia Szczypce do końcówek</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11295-10</td><td>Do rozwarstwiania hipokampa</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>Do przenoszenia wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Gumowa gruszka do pipet Pasteura</td><td>Fisher</td><td>03-448-22</td><td>Do przenoszenia wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Polistyren 100 mm Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>25020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Fisher</td><td>ISOTEMP 210</td><td>Do ciepłej inkubacji Ściągacz</td></tr><tr><td>do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Do pipety z bolusem</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>Olympus Fluoview 1000</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowa otwarta komora obrazowania w kąpieli diamentowej z platformą PM-1</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td>wanna diamentowa o niskim profilu</td></tr><tr><td>Pipeta ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Do pipety ładowanej bolusem</td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Instrument Sutter</td><td>ROE-200</td><td>Do pipety ładującej bolus</td></tr><tr><td>Filtr probówkowy wirówki Spin-X z 0,22 i mikro; m octan celulozy&nbsp;</td><td>Gwiazda</td><td>8161</td><td></td></tr></tbody></table>

indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Blisko dwie dekady badań wykazały, że astrocyty in situ i in vivo wyrażają liczne receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które mogą być stymulowane przez przekaźnik uwalniany przez neurony. Jednak zdolność receptorów astrocytarnych do wykazywania plastyczności w odpowiedzi na zmiany w aktywności neuronalnej spotkała się z niewielkim zainteresowaniem. Tutaj opisujemy system modelowy, który można wykorzystać do globalnego skalowania w górę lub w dół metabotropowych receptorów glutaminianu grupy I astrocytów (mGluR) w ostrych wycinkach mózgu. Uwzględniono metody przygotowania przystrzałkowych wycinków hipokampa, konstruowania komór odpowiednich do długotrwałej inkubacji plastrów, dwukierunkowego manipulowania częstotliwością neuronalnego potencjału czynnościowego, ładowania astrocytów i procesów astrocytowych fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca2 + oraz pomiaru zmian w aktywności astrocytarnej Gq GPCR poprzez rejestrowanie spontanicznych i wywołanych astrocytów Ca2+ zdarzenia za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zasadniczo przedstawiono "mapę drogową wapnia" dotyczącą sposobu pomiaru plastyczności astrocytarnych Gq GPCR. Omówiono zastosowania tej techniki do badania astrocytów. Zrozumienie, w jaki sposób zmiany w aktywności neuronalnej wpływają na sygnalizację receptora astrocytowego, ma ważne implikacje zarówno dla normalnej funkcji synaptycznej, jak i procesów leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych i chorób neurodegeneracyjnych.

Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 3 pokazują wpływ inkubacji ostrych skrawków hipokampa mysiego w TTX przez 4-6 h na aktywność Ca2+ astrocytów w s.r. Dane obejmują zarówno spontaniczne przejściowe wzrosty stężenia Ca2+, jak i odpowiedzi Ca2+ wywołane przez DHPG za pośrednictwem mGluR grupy I, ze skrawków inkubowanych w kontrolnym ACSF vs. ACSF z dodatkiem TTX. Poza podstawowymi cechami morfologicznymi, takimi jak gwieździste wypustki i niewielki rozmiar somy (~10 µm), astrocyty w s.r. identyfikowano poprzez nałożenie obrazu z wskaźnika Ca2+ OGB-1 AM na selektywny marker astrocytów SR-10119,20 (Rysunek 3A). Ponumerowane ramki nad ciałami komórek astrocytów odpowiadają ponumerowanym śladom fluorescencji w czasie przedstawionym na Rysunku 3B . Agonista mGluR grupy 1 (RS)-3.5-DHPG jest stosowany w celu określenia specyficznych efektów skalowania mGluR grupy 1 w astrocytach. Aby odróżnić fizjologię specyficzności efektu skalowania mGluR grupy 1 od innych GPCR sprzężonych z białkiem Gq, na koniec każdego eksperymentu stosuje się koktajl agonistów. W tym przypadku użyto po 10 µM agonistów GPCR Gq: histaminy, chlorku karbamylcholiny (karbacholu) oraz dwusodowego 5’-ATP adenozyny (Na-ATP). Koktajl agonistów służy również jako kontrola pozytywna do identyfikacji żywotnych, responsywnych astrocytów w przypadkach, gdy komórki nie reagują na DHPG, co prawdopodobnie wynika z faktu, że dane astrocyty nie wykazują wystarczającej ekspresji receptora, aby wywołać odpowiedź na DHPG.
W celu pomostowania zmian w astrocytarnych mGluR grupy I zastosowano różne stężenia DHPG, w tym 5 µM i 15 µM (Rysunek 3B) oraz 30 µM i 50 µM (Rysunek 4A). Zależność między komórkowymi odpowiedziami Ca2+ a poziomami ekspresji Gq GPCR była wcześniej badana in vitro21-24. Po pierwsze, próg odpowiedzi na określone stężenie agonisty zależy od gęstości receptorów wyrażanych przez każdą komórkę. W populacji komórek więcej z nich wykazuje wzrost poziomu Ca2+ w odpowiedzi na dane stężenie agonisty, gdy komórki są transfekowane przy wyższej gęstości receptorów. Po inkubacji skrawków w TTX odsetek astrocytów w populacji reagujących na stałe stężenie agonisty wzrasta (Rysunki 3B oraz 3C). Stwierdzono, że stężenia 5 µM i 15 µM DHPG ujawniają wyraźne różnice w odsetku reagujących astrocytów między komórkami kontrolnymi a komórkami traktowanymi TTX, natomiast stężenia 30 i 50 µM DHPG są niezbędne do porównania odpowiedzi mGluR grupy I w komórkach traktowanych 5.0 mM K+ w stosunku do komórek kontrolnych (Rysunek 4A).
Zależność między wzorcami odpowiedzi Ca2+ w astrocytach a stężeniem agonisty była badana również in situ. Zwiększenie stężenia agonisty zmienia wzorzec odpowiedzi Ca2+ w astrocytach z pojedynczych szczytów wzrostu poziomu Ca2+ na wieloszczytowe i plateau wzrosty Ca2+25-27. W oparciu o te wcześniejsze ustalenia przewidywaliśmy, że wzorzec odpowiedzi na pojedyncze stężenie agonisty ulegnie zmianie, jeśli wystąpią zmiany w poziomie ekspresji receptorów. Zatem, w zależności od tego, która z dwóch metod skalowania jest stosowana (hamowanie lub zwiększanie aktywności neuronalnej), stężenie agonisty niezbędne do wywołania konkretnego wzorca odpowiedzi wzrośnie lub zmaleje. Na przykład astrocyty inkubowane w TTX zmieniają wzorzec odpowiedzi Ca2+ wywołanej DHPG w kierunku wzrostów Ca2+ typu plateau i reagują na niższe stężenia agonisty w porównaniu z astrocytami kontrolnymi (Rycyna 3C). Biorąc pod uwagę wcześniejsze badania, obserwacje te sugerują, że poziom ekspresji receptorów mGluR grupy I w astrocytach wzrósł.
Wykazano również, że czas narastania oraz początek (latencja) wzrostów poziomu Ca2+ korelują bezpośrednio ze zmianami poziomów ekspresji GPCR Gq w hodowlach komórkowych22-24. Wyższe poziomy ekspresji receptorów skutkują krótszą latencją odpowiedzi i szybszym czasem narastania, podczas gdy zmniejszenie gęstości receptorów wywołuje efekt przeciwny. W przypadku astrocytów inkubowanych w TTX, przejściowe wzrosty Ca2+ wywołane aplikacją DHPG charakteryzują się znacznie szybszym czasem narastania w porównaniu z astrocytami inkubowanymi w kontrolnym ACSF (Rycina 3D). Jak wspomniano wcześniej, amplitudy odpowiedzi Ca2+ wywołanych agonistą pozostają niezmienione niezależnie od stężenia agonisty lub modelu skalowania15 (Rycina 3D).
Oprócz zmian zaobserwowanych podczas bezpośredniej aktywacji mGluRs grupy I za pomocą DHPG, manipulacja ta znacząco wpływa również na spontaniczną aktywność Ca2+ w astrocytach. Zaobserwowaliśmy 2,26-krotny wzrost odsetka spontanicznie aktywnych astrocytów inkubowanych w TTX w porównaniu z grupą kontrolną. Wzrost ten obejmował zwiększenie odsetka astrocytów wykazujących spontaniczną aktywność w somie z zaledwie 12,9% w grupie kontrolnej do 42,1% w astrocytach inkubowanych w TTX (Rycina 3E). Ponieważ wiadomo, że GPCR wykazują aktywność „wewnątrzpochodną” lub konstytutywną wobec braku agonisty21,26,28, a poziom tej aktywności wewnątrzpochodnej rośnie wraz ze wzrostem poziomu ekspresji receptorów, dane te sugerują, że gęstość astrocytarnych GPCR Gq zwiększa się po długotrwałym ograniczeniu częstotliwości wyładowań potencjałów czynnościowych neuronów. Podobnie jak w przypadku odpowiedzi wywołanych agonistą, zwiększony jest również czas narastania spontanicznych wzrostów poziomu Ca2+ (Rycina 3E).
Reprezentatywne dane uzyskane przy użyciu drugiego protokołu, polegającego na inkubacji w podwyższonym stężeniu potasu zewnątrzkomórkowego (5,0 mM), przedstawiono na Ryc. 4. Zwiększenie stężenia zewnątrzkomórkowego K+ z 2,5 do 5,0 mM skutkuje znacznym wzrostem podstawowej częstotliwości potencjałów czynnościowych neuronów CA315. W celu wywołania odpowiedzi Ca2+ zależnych od mGluR grupy I w astrocytach inkubowanych w wysokim stężeniu potasu niezbędne są wyższe stężenia DHPG (30 µM i 50 µM) (Ryc. 4A i 4B). Jest to zgodne z obniżonym poziomem reaktywności mGluR grupy I w astrocytach po długotrwałym wzroście liczby potencjałów czynnościowych neuronów. Ponadto wzorzec odpowiedzi wywołanej stałym stężeniem DHPG przesuwa się z odpowiedzi typu plateau w stronę słabszych odpowiedzi jednopieczowych (Ryc. 4B). Analiza odsetka spontanicznie aktywnych astrocytów w dwóch warunkach stężenia potasu wykazuje, że mniej astrocytów inkubowanych w wysokim K+ wykazuje aktywność spontaniczną w porównaniu z warunkiem kontrolnym (Ryc. 4C). Efekt ten jest przeciwny do obserwowanego w warunkach z TTX, w których odsetek astrocytów wykazujących spontaniczne wzrosty poziomu Ca2+ ulega zwiększeniu. Na koniec, zarówno wywołane, jak i spontaniczne wzrosty poziomu Ca2+ charakteryzują się wolniejszym czasem narastania w astrocytach inkubowanych w wysokim K+ w porównaniu z warunkiem kontrolnym (Ryc. 4C i 4D). Ogólnie dane te sugerują, że poziomy ekspresji astrocytarnych receptorów Gq GPCR skalują się dwukierunkowo w zależności od poziomu aktywności potencjałów czynnościowych neuronów w dłuższym okresie czasu.
<img alt="Schemat komponentów aparatury do mikrodializy, w tym konfiguracja komory do analizy substancji rozpuszczonych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Konstrukcja i konfiguracja komory inkubacyjnej do skrawków tkanki. (A) Do konstrukcji komory inkubacyjnej wykorzystuje się szufladę pojemnika do przechowywania pipet Brinkmann wraz ze szczelną pokrywką. (B) Należy wywiercić otwór w boku pojemnika w odległości około 1¼ in od góry i ¼ in od boku. Następnie należy dopasować fragment elastycznego wężyka. (C) Połącz aparaturę rozdzielacza mikroladującego z wewnętrznym końcem elastycznego wężyka. Zwróć uwagę na przyciętą do wymiaru naturalną końcówkę pipety 200 µl (biała strzałka). (D) Sześć mikroladerów Eppendorf 20 µl zostaje przycięte do wymiaru i połączone z rozdzielaczem linii jeden-do-sześciu w celu stworzenia aparatury rozdzielacza mikroladującego. (E) Wywierć dwa małe otwory w pokrywce. (F) Pływająca statywa bąbelkowa (Floating Bubble Rack) użyta do wykonania uchwytu na skrawki. (G) Dolne „nóżki” pływającej statywy bąbelkowej zostają usunięte, aby do spodu można było przykleić fragment siatki nylonowej. (H) Napełnij komorę inkubacyjną odpowiednią ilością ACSF, tak aby uchwyt na skrawki pływał. Dostosuj długość wężyka tak, aby końcówki mikroladerów spoczywały w jednym rogu dna komory. Podczas umieszczania komory inkubacyjnej w kąpieli wodnej poziom wody w kąpieli powinien być na tym samym poziomie co ACSF w komorze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Histologia, obraz mikroskopowy warstw tkanki, nabłonek wielowarstwowy płaskie, różnicowanie komórek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ocena kondycji skrawka. (A) Zdrowo wyglądający skrawek hipokampa z obrazowaniem w kontrastowym mikroskopie interferencyjnym (DIC). Zdrowe skrawki mają gładki, aksamitny wygląd i wysoki odsetek zdrowych neuronów piramidalnych CA1. Zwróć uwagę na dendryty apikalne wystające do stratum radiatum. Metoda patch-clamp neuronów wyglądających jak te przedstawione tutaj wykazuje niski spoczynkowy potencjał błonowy (-61 do -62 mV) w standardowym ACSF z 2.5 mM K+ z niewielką liczbą spontanicznych potencjałów czynnościowych. Potencjał błonowy i częstość wyładowań będą różnić się w zależności od stężenia zewnątrzkomórkowego K+ (Xie et al.15). Strzałki wskazują prawdopodobne astrocyty. Skróty: s.r., stratum radiatum; s.py., stratum pyramidale. Pasek skali, 10 µm. (B) Niezdrowe skrawki będą charakteryzować się wysokim odsetkiem martwych neuronów piramidalnych CA1, które przypominają jajka sadzone (białe strzałki wskazują jądra martwych neuronów – „żółtko” jajka sadzonego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Analiza aktywności astrocytów z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego i wykresów słupkowych; odpowiedź na DHPG w grupie kontrolnej i TTX." fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rejestracja wzmocnionej aktywności Gq GPCR oraz wywołanych odpowiedzi Ca2+ mGluR grupy I po długotrwałym hamowaniu potencjałów czynnościowych neuronów poprzez inkubację w TTX. (A) Reprezentatywne obrazy komórek w polu rejestracji inkubowanych w warunkach kontrolnych (panele górne) lub w TTX (panele dolne), które pobrały barwnik wskaźnikowy Ca2+ Oregon Green BAPTA-1 AM (panele lewe) oraz SR-101 (panele środkowe). Pasek skali wynosi 10 µm. Nałożenie obu sygnałów („merge”) wskazuje, że astrocyty ładują wskaźnik Ca2+. Ramki zostały narysowane nad poszczególnymi somami astrocytów w celu rejestracji natężenia fluorescencji w czasie w kanale zielonym, aby monitorować aktywność Ca2+ w astrocytach. (B) Przykładowe przebiegi z ramek rejestracyjnych z A) przedstawiające aktywność Ca2+ w astrocytach. Astrocyty inkubowane w TTX wykazują zwiększoną aktywność spontaniczną i silniejsze wywołane odpowiedzi Ca2+ mGluR grupy I, co potwierdzają zmiany w schemacie odpowiedzi. Pokazano przykłady pojedynczego piku (okrąg), wielu pików (prostokąt) oraz plateau (prostokąt przerywany) przejściowych zmian poziomu Ca2+. (C) Zmiany w schematach odpowiedzi są szczególnie widoczne przy zastosowaniu różnych stężeń agonisty mGluR grupy I, DHPG. Przy danym stężeniu agonisty po inkubacji w TTX widocznych jest więcej odpowiedzi typu wielopikowego i plateau w porównaniu do grupy kontrolnej. (D) Czasy narastania odpowiedzi Ca2+ wywołanych przez DHPG są krótsze w astrocytach inkubowanych w TTX w porównaniu do kontroli (panel górny), podczas gdy amplitudy nie ulegają zmianie (panel dolny), co wskazuje na amplitudy odpowiedzi typu „wszystko albo nic” po osiągnięciu progu odpowiedzi. (E) Czasy narastania spontanicznych przejściowych zmian Ca2+ w astrocytach są również krótsze w astrocytach inkubowanych w TTX w porównaniu do inkubowanych kontrolnie (panel górny), natomiast odsetek astrocytów w populacji wykazujących spontaniczną aktywność Ca2+ Gq GPCR wzrasta (panel dolny). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Analiza odpowiedzi astrocytów; wykresy pokazujące aktywność przy zmiennych poziomach K+ i DHPG; wykresy słupkowe." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Rejestracja osłabionej aktywności Gq GPCR astrocytów oraz wywołanych odpowiedzi Ca2+ receptorów mGluR grupy I po długotrwałym zwiększeniu liczby potencjałów czynnościowych (AP) neuronów poprzez inkubację w podwyższonym stężeniu potasu zewnątrzkomórkowego. (A) Reprezentatywne zapisy poziomu Ca2+ w astrocytach z plastrów inkubowanych w ACSF z 5.0 mM K+ w celu depolaryzacji neuronów i zwiększenia ich podstawowej częstotliwości wyładowań w porównaniu do kontrolnego ACSF (2.5 mM K+ ACSF). Astrocytów inkubowane w ACSF z 5.0 mM K+ wykazują mniej spontanicznych przejściowych wzrostów poziomu Ca2+ w somie oraz słabsze odpowiedzi wywołane DHPG w porównaniu do astrocytów inkubowanych w kontrolnym ACSF. (B) Porównanie wzorców odpowiedzi wywołanych różnymi stężeniami DHPG ujawnia słabsze typy odpowiedzi po długotrwałym zwiększeniu liczby neuronalnych AP. (C) Po długotrwałej inkubacji w podwyższonym stężeniu K+ w porównaniu do kontrolnego ACSF obserwuje się zmniejszenie odsetka astrocytów w populacji wykazujących spontaniczną aktywność Ca2+ (górny panel), natomiast czasy narastania spontanicznej aktywności ulegają wydłużeniu (dolny panel). (D) Czasy narastania wywołanych odpowiedzi Ca2+ astrocytów na różne stężenia DHPG ulegają wydłużeniu po zastosowaniu 5.0 mM K+ w porównaniu do astrocytów inkubowanych w kontrolnym ACSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie długotrwałego zwiększenia lub zmniejszenia sygnalizacji białkowego receptora sprzężonego z białkiem G w astrocytach w odpowiedzi na zmiany w neuronalnej transmisji synaptycznej. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności ostrych skrawków hipokampa od myszy typu dzikiego. Drugim krokiem jest zastosowanie sulur Rumine 1 0 1 do skrawków w celu znakowania astrocytów.Następnie ostre plastry hipokampa inkubuje się przez cztery do sześciu godzin w obecności tetrodotoksyny w celu zablokowania potencjałów czynnościowych neuronów lub w zwykłym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Ostatnim krokiem jest wprowadzenie wskaźnika wapnia do astrocytów w stratum radiatum plastra, stosując protokół ładowania z przeciwciśnieniem (back pressure loading). Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną, aby wykazać zmiany w aktywności sygnalizacyjnej białek GQ GPCR w astrocytach poprzez rejestrację zmian w spontanicznych i wywołanych przejściowych zmianach stężenia wapnia w astrocytach.Ta metoda pozwala na przeanalizowanie plastyczności receptorów astrocytów oraz związanych z nią zmian w sygnalizacji TQG PCR. Może być ona również wykorzystana do pomiaru plastyczności homeostatycznej receptorów metabotropowych w neuronach. Aby rozpocząć tę procedurę, należy włączyć wibrator i upewnić się, że drenaż jest zamknięty.Następnie należy zamocować komorę tnącą w wibratomie i obłożyć ją lodem. W dalszej kolejności należy usunąć smar fabryczny z dwustronnego ostrza brzytwy, mocząc je w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie płukąc wodą dwukrotnie destylowaną. Ostroże należy ostrożnie przeciąć na pół i zamontować jedną połowę w bloku tnącym do przygotowania przekrojów mózgu.Po przedzieleniu mózgu myszy schłodzonym ostrzem żyletki w szalce Petriego, aby zwiększyć powierzchnię chłodzenia i utlenienia. Pozostaw przedzielone półkule w lodowatym buforze do skrawania przez dwie do trzech minut, aż całkowicie ostygną i staną się bardziej sztywne. Następnie nanieś cienką warstwę kleju typu „crazy glue” na platformę wibratomu i przymocuj obie półkule do platformy.Ustawiając strony przecięte skierowane w dół, strony boczne do góry, a opłot pachowy skierowany do przodu, przymocuj platformę w komorze tnącej. Napełnij komorę tnącą lodowatym, dobrze natlenionym buforem do krojenia. Kontynuuj natlenianie komory tnącej podczas przygotowywania parasagitalnych skrawków o grubości 300 mikronów za pomocą wibratomu. Po pocięciu, wyizoluj hipokamp oraz sąsiadującą korę entrynalną z każdego skrawka parasagitalnego w lodowatym, dobrze natlenionym buforze do krojenia.Aby przygotować pipetę transferową, należy odłamać długą końcówkę szklanej pipety Pasteura i nałożyć na złamaną część gruszkę do pipety. Przenosić plasterki hipokampa pojedynczo do komory inkubacyjnej w kąpieli wodnej o temperaturze 35 °C. Należy pamiętać, że ze względów widoczności kroki te są prezentowane z komorami inkubacyjnymi poza kąpielą wodną o temperaturze 35 °C.Inkubować skrawki hipokampa przez 20 minut w 1 µM SR 1 0 1 rozpuszczonym w A CSF o niskiej zawartości wapnia w kąpieli wodnej o temperaturze 35°C. Następnie przenieść je do A CSF o niskiej zawartości wapnia bez SR 1 0 1 na dodatkowe 10 minut. Regeneracja w cieple.Następnie przenieś plastry do kontrolnego lub eksperymentalnego A CSF na pozostałe 15 minut inkubacji w cieple. Po 45-minutowym okresie regeneracji ostrożnie przenieś komory inkubacyjne z kąpieli wodnej o temperaturze 35 °C na blat i pozostaw plastry do dalszej inkubacji w temperaturze pokojowej przez łącznie trzy godziny przed rozpoczęciem protokołu ładowania bolusa. W tej procedurze przygotuj pipetę z kapilary z borokrzemianowego szkła, wyciągniętej do oporności wynoszącej około 1,3 mega ohm po napełnieniu roztworem barwnika.Następnie umieść skrawka hipokampa w komorze rejestracyjnej i stale przepłukuj go natlenionym płynem A CSF z prędkością 1,5 milliliters per minute; używaj tylko skrawków hipokampa z wysokim odsetkiem zdrowych komórek piramidalnych CA1 i gładką powierzchnią, a skrawki wyglądające na niezdrowe odrzuć. Wykorzystując optykę kontrastu różnicowego, zlokalizuj odpowiednie pole astrocytów w stratum radiatum od 40 do 70 microns poniżej powierzchni skrawka. Następnie umieść szklaną pipetę wypełnioną wcześniej roztworem D w standardowym uchwycie mikroelektrody do patch-clamp.Obniż pipetę do powierzchni skrawka nad polem widzenia, tak aby znajdowała się ona na powierzchni skrawka. Wywier ć dodatnie ciśnienie w pipecie, aby rozpocząć wstrzykiwanie barwnika. Powoli opuść pipetę na głębokość około 40 micronów poniżej powierzchni skrawka za pomocą mikromanipulatora i pozwól na wstrzykiwanie barwnika przez około 45 do 60 sekund.Następnie obniż pipetę o kolejne 35 micronów i podawaj barwnik przez około 45 do 60 sekund. Po tym czasie powoli wycofaj końcówkę pipety z preparatu, aby zapewnić pobranie barwnika przez dużą liczbę astrocytów. Zazwyczaj pomocne jest wstrzyknięcie drugiej porcji barwnika w niewielkiej odległości.Aby to osiągnąć, należy podnieść pipetę z powrotem do powierzchni skrawka i upewnić się, że pipeta nie jest zapchana. Następnie należy przesunąć pipetę wzdłuż stratum radium w odległości około 80 do 100 mikronów od pierwszego miejsca wstrzyknięcia, powtórzyć iniekcję bolusa w tym miejscu i odczekać od 30 do 45 minut przed obrazowaniem astrocytów, aby przygotować mikroskop konfokalny do obrazowania. Ograniczenie ekspozycji skrawka na światło laserowe jest niezwykle istotne, ponieważ wysoka ekspozycja może prowadzić do blaknięcia barwnika i/lub fototoksyczności.Ustaw wartości domyślne dla każdego lasera na wysokie ustawienie fotopowielacza, wzmocnienie 1x i moc wyjściową lasera 0,5% na godzinę. Następnie zastosuj powiększenie 1,5x w celu lepszej wizualizacji wypustek astrocytów. Następnie ustaw rozdzielczość pola na 512 pikseli na 512 pikseli.Następnie ustaw prędkość skanowania na maksymalną, która wynosi około 1,2 sekundy na skan. Korzystając z trybu skanowania jednokierunkowego, zarejestruj widma emisji, stosując filtry pasmowo-przepustowe od 503 do 548 nanometrów dla lasera 488 nanometrów oraz od 624 do 724 nanometrów dla lasera 559 nanometrów. Następnie potwierdź, że komórki załadowane barwnikiem wapniowym są astrocytami, wizualizując współoznaczenie SR 1 0 1.Wykorzystanie lasera o długości fali 559 nanometrów do rejestracji aktywności wapniowej astrocytów. Najpierw, przy użyciu oprogramowania do akwizycji obrazu, narysuj ramki nad obszarami zainteresowania w obrębie komórki, w tym przypadku nad ciałami komórkowymi astrocytów. Następnie narysuj jedną ramkę nad tłem w celu uzyskania referencji.Należy zarejestrować 10 minut aktywności wapniowej bazowej w wybranych obszarach zainteresowania (ROI). Następnie należy aplikować wybrany agonista w sekwencyjnie zwiększających się stężeniach, zachowując co najmniej pięć minut przerwy między aplikacjami, aby ograniczyć możliwe odczulenie receptorów. Na koniec pomiaru należy zastosować koktajl agonistów dla innych astrocytarnych receptorów GQ GPCR jako kontrolę pozytywną dla szlaków sygnalizacyjnych astrocytarnych GQ GPCR w Inpact.Po zakończeniu rejestracji wapnia należy wykonać statyczne obrazy przy użyciu laserów o długości fali 488 nm i 559 nm w celu późniejszego potwierdzenia tożsamości astrocytów oraz rozmieszczenia obszarów ROI. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy komórek w polu rejestracji, inkubowanych w warunkach kontrolnych lub w TTX, które pobrały wskaźnik wapnia Oregon Green BAFTA 1:00 AM oraz SR 1 0 1. Nałożenie obu sygnałów wskazuje astrocyty obciążone wskaźnikiem wapnia; ramki zostały narysowane nad somami poszczególnych astrocytów, aby rejestrować natężenie fluorescencji w czasie w kanale zielonym w celu monitorowania aktywności wapniowej w astrocytach.Poniżej przedstawiono przykładowe ślady z rejestracji aktywności wapniowej w astrocytach. Astrocyty inkubowane w TTX wykazują zwiększoną aktywność spontaniczną oraz silniejsze wywołane odpowiedzi wapniowe grupy jednej MGL R, co potwierdzają zmiany w obrazie odpowiedzi. Przedstawiono przykłady pojedynczego piku, wielu pików oraz plateau przejściowego stężenia wapnia. Tutaj znajdują się reprezentatywne ślady rejestracji wapniowej astrocytów z plastrów inkubowanych w aCSF z 5,0 mM potasu w celu depolaryzacji neuronów i zwiększenia ich podstawowej częstotliwości wyładowań w porównaniu do kontrolnego aCSF z 2,5 mM potasu. Astrocyty inkubowane w aCSF z 5,0 mM potasu wykazują mniej spontanicznych somatycznych przejść wapniowych i słabsze odpowiedzi wywołane DHPG w porównaniu do astrocytów inkubowanych w kontrolnym aCSF. Obrazowanie wapnia w astrocytach zapewnia przejrzysty odczyt funkcjonalny zmian w sygnalizacji receptorów sprzężonych z białkiem G.Nie pozwala to jednak na precyzyjne określenie miejsca w szlaku sygnalizacyjnym, w którym zachodzą te zmiany. Dlatego też uzupełniającym podejściem byłoby zastosowanie fluorescencyjnego sortowania komórek lub cytometrii przepływowej na astrocytach wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, a następnie użycie przeciwciała przeciwko interesującemu nas receptorowi sprzężonemu z białkiem G i wykonanie analizy western blot w celu zbadania zmian w poziomach ekspresji receptora. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób pomiaru skalowania aktywności tqt PCR astrocytów w odpowiedzi na zmiany w neuronalnej transmisji synaptycznej poprzez rejestrację spontanicznych i wywołanych przez Agnes zdarzeń wapniowych w astrocytach.

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytów poprzez manipulację częstotliwością wyładowań neuronów

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Właściwości i funkcje wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ astrocytów w prążkowiu pozostają niew pełni zbadane. Opisujemy metody ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w astrocytach prążkowia przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami serotypu 2/5 (AAV2/5), a także procedury wiarygodnego obrazowania sygnałów Ca2 + w astrocytach prążkowia in situ.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół do wywołania urazu kłutym przodomózgowia u dorosłych myszy. Rana kłuta indukuje ciężką reaktywną glejozę i tworzenie się blizn glejowych, które można następnie zbadać za pomocą standardowych metod immunohistochemicznych.

Wywoływanie reaktywnej glejozy in vivo przez uraz kłuty przodomózgowia

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) pojawiła się jako narzędzie do wywoływania ukierunkowanej plastyczności synaptycznej w przodomózgowiu w celu modyfikacji szeregu zachowań. Ten protokół opisuje, jak zaimplementować VNS, aby ułatwić konsolidację pamięci wygaszania strachu.

Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Tutaj opisujemy protokół indukowania długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronów w neuronach przekaźnikowych z grzbietowego bocznego jądra kolankowatego utrzymywanego w wycinkach mózgu ex vivo.

Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Poznaj metodę indukowania plastyczności receptorów GPCR w astrocytach myszy poprzez manipulację aktywnością neuronów. Protokół obejmuje preparat hipokampalny, mikroskopię konfokalną i analizę sygnałów wapniowych.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Przeglądaj więcej filmów