Name: Zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj zmodyfikowany test inwazji in vitro do badania roli hormonów, cytokin i czynników wzrostu w inwazji komórek rakowych. Ta metoda pozwala określić wpływ poszczególnych czynników na migrację i inwazję komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy poznają źródła finansowania z D'Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. Przygotuj różne nośniki i dodatkowe komponenty
<ol>
	<li>Przed eksperymentem należy przygotować pożywkę składającą się z DMEM lub innych określonych pożywek z dodatkiem zwykłego FBS, FBS pozbawionego węgla drzewnego lub FBS pozbawionego węgla drzewnego oraz komponentu, który ma być testowany. Należy pamiętać, że w każdym eksperymencie można testować wiele komponentów.</li>
	<li>Odważyć i rozcieńczyć hormony, czynniki wzrostu lub cytokiny odpowiednio, aby rozpuściły się w surowicy pozbawionej węgla drzewnego w stężeniu fizjologicznym.</li>
</ol>
2. Przygotuj matrycę kolagenową na lodzie
<ol>
	<li>Przygotuj 2 ml matrycy kolagenu I o stężeniu 2,2 mg/ml, dodając następujące sterylne przefiltrowane składniki na lodzie: 200 μl 10x PBS (pH 7,4), 5,4 μl 1 N NaOH, 600 μl podwójnie destylowanego H2O i 1,2 ml kolagenu I (w 3,63 mg / ml).</li>
	<li>Trzymaj roztwór kolagenu I na lodzie, aż będzie gotowy do talerzyka.</li>
</ol>
3. Przygotuj płytki migracyjne/inwazyjne do testu
<ol>
	<li>Dla każdej badanej linii komórkowej należy użyć jednej płytki z 24-dołkową komorą, w której 12-dołkowa zawiera wkładki. Użyj dodatkowych 12 studzienek, które nie zawierają wkładek, do dodania pożywki chemoatraktantu i przeniesienia wkładek do zestawu eksperymentalnego. 
	UWAGA: Macierz kolagenowa na płytkach z membraną z teraftalanu etylenu (PET) i wielkością porów 8 μm jest optymalna dla stosowanych tutaj linii komórkowych. Jednak matrycę macierzową w wstępnie powlekanych płytkach można również zastąpić, a wielkość porów zmniejsza się w zależności od badanej linii komórkowej.</li>
	<li>Wyraźnie oznacz płytkę, używając 3 dołków na analizowany stan (migracja FBS, migracja CS-FBS, inwazja FBS i inwazja CS-FBS, a także migracja FBS dla kontrolnej, nieinwazyjnej linii komórkowej). Migracja testu przez ruch przez pory w membranie PET i inwazja testu przez ruch przez matrycę kolagenową lub matrycową, a następnie przez pory w membranie. Użyj różnych kolorowych markerów dla każdego warunku komórki, aby wspomóc proces galwanizacji.</li>
</ol>
4. Złóż Matrycę Inwazji
<ol>
	<li>Ostrożnie odpipetować 75 μl roztworu matrycy kolagenowej do wkładek, które mają być użyte do testów inwazji. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć bąbelków. Rozproszyć pęcherzyki, przykładając odwróconą końcówkę pipety do powierzchni.</li>
	<li>Przenieść płytkę z wkładkami pokrytymi kolagenem do inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut, aby żel zastygł.</li>
</ol>
5. Umieść komórki na błonie lub matrycy inwazji
<ol>
	<li>W międzyczasie trypsynizuj komórki i dodaj pożywkę z 10% FBS. Wirować komórki w masie 200 x g przez 5 minut na wirówce stołowej i płukać 3x w pożywce wolnej od surowicy.</li>
	<li>Zawiesić w pożywce wolnej od surowicy. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika slajdów. Dodać pożywkę wolną od surowicy do końcowego stężenia 5 x 104 komórek/ml.</li>
	<li>Gdy matryca kolagenowa zastygnie (po 30 minutach), dodaj 700 μl pożywki z 2% zdefiniowanym FBS lub FBS pozbawionym węgla drzewnego do każdego dołka. Z 12 wkładek na płytę:
	<ul>
		<li>3 wkładki posiadają kolagen oraz dołki z pożywką + 2% FBS</li>
		<li>3 wkładki posiadają kolagen oraz dołki z pożywką + 2% CS-FBS</li>
		<li>3 wkładki nie posiadają kolagenu i studzienki z mediami + 2% FBS</li>
		<li>3 wkładki nie posiadają kolagenu i studzienki z mediami + 2% CS-FBS</li>
	</ul>
	<ol>
		<li>Stosować dodatkowe płytki w zależności od liczby badanych czynników i z kontrolą braku kolagenu odpowiadającą każdemu schorzeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórek do wkładek w dawce 5 x 104 komórek/ml, posiewając 500 μl komórek na wstawkę we wszystkich wstawkach migracyjnych i inwazyjnych.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 22 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
6. Określ ilościowo liczbę migrujących i atakujących komórek
<ol>
	<li>Ustaw barwienie studzienek za pomocą utrwalacza metanolu, eozyny i hemotoksyliny w oddzielnych studzienkach.</li>
	<li>Użyj bawełnianych wacików, aby usunąć komórki i matrycę z każdej studzienki. Powtórz z drugą aplikacją wacika dla każdej studzienki.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zanurz każdą wkładkę 5 razy na 1 sekundę w każdym z 3 roztworów po kolei.</li>
	<li>Pozostaw wkładki do wyschnięcia O/N.</li>
	<li>Albo i) usunąć filtry za pomocą skalpela, ostrożnie nacinając krawędzie i zamontować na szkiełku podstawowym z szkiełkiem nakrywkowym i olejkiem immersyjnym, albo ii) pozostawić wkładki do wyschnięcia odwrócone O/N i użyć wkładek bezpośrednio do mikroskopii.</li>
	<li>Następnego dnia obejrzyj preparaty lub wkładki pod mikroskopem z obiektywem 20X i zrób 5 zdjęć z różnych obszarów filtra. Aby poprawić spójność, weź 4 zewnętrzne pola i jeden środek.</li>
	<li>Policz komórki dla wszystkich warunków za pomocą oprogramowania ImageJ i zastosuj do poniższych formuł.</li>
	<li>Określ procentową inwazję w następujący sposób: 
	Średnia # komórek atakujących kolagen I wstawiam = a 
	Średnia # komórek migrujących przez wstawkę kontrolną = b 
	% Inwazji = (a / b) * 100</li>
	<li>Określ Indeks Inwazji w 2% FBS w następujący sposób: 
	% inwazji oznaczanych komórek (w 2% FBS) = c 
	% inwazji kontrolnych komórek nieinwazyjnych w (2% FBS) = d 
	Indeks inwazji (FBS) = (c / d)</li>
	<li>Określ Indeks Inwazji w 2% CS-FBS w następujący sposób: 
	% inwazji oznaczanych komórek (w 2% CS-FBS) = e 
	% inwazji kontrolnych komórek nieinwazyjnych w (2% CS-FBS) = f 
	Indeks inwazji (CS-FBS) = (e / f)</li>
</ol>
7. Powtórz protokół eksperymentalny porównujący FBS z węglem drzewnym z FBS + Xn z wieloma czynnikami połączonymi
<ol>
	<li>W razie potrzeby powtórz procedurę wiele razy, używając różnych komponentów dla "X" lub kombinacji składników.</li>
	<li>Zastosuj obliczenia, aby określić udział każdego czynnika "X" w skutkach migracji i inwazji.</li>
</ol>

<ol><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinberg%2C+RA+%22The+Biology+of+Cancer%22">The Biology of Cancer</a>. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li>
<li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li>
<li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li>
<li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation%3A+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li>
<li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells%3A+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201(2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li>
<li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%27seed+and+soil%27+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li>
<li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition%3A+concepts+and+molecular+links%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li>
<li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li>
<li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li>
<li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li>
<li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+stem+cells%2C+cytokine+networks%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li>
<li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li>
<li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li>
<li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li>
<li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.J.%2C+V.%2C+M.E.%2C+M.D.%2C+J.M%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+estrogen-independent+breast+cancer+growth+driven+by+low+estrogen+concentrations+are+unique+versus+complete+estrogen+deprivation.Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przerzuty nowotworowe to proces wieloetapowy. Komórki muszą przebić się przez błonę podstawną, zostać unaczynione do układu limfatycznego lub mikronaczyń krwionośnych, w których są transportowane do odległych miejsc. Komórki nowotworowe następnie wynaczyniają się i kolonizują do makroprzerzutów12. Progresja przez przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), inwazja guza i przerzuty zostały wzmocnione przez hormony steroidowe13,14, czynniki wzrostu15-18 i cytokiny19-21. Cząste...

Opracowano nowy test inwazji w celu zidentyfikowania udziału określonych hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu jako chemoatraktantów w inwazji komórek rakowych. Zdolność komórek nowotworowych do inwazji przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM) jest cechą charakterystyczną fenotypuprzerzutowego 1-3. Komory inwazyjne są szeroko stosowane jako narzędzia in vitro do badania inwazji i migracji komórek nowotworowych i mogą dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów inwazji i przerzutów guza in vivo. Komory składają się z cylindrycznych wkładek do hodowli komórkowych zagnieżdżonych w studzienkach płytek do hodowli komórkowych. Dna wkładów to półprzepuszczalne membrany poliwęglanowe lub polistyrenowe o określonych rozmiarach porów.
W standardowym teście inwazji, komórki są umieszczane na błonie insertowej za pomocą pożywki wolnej od surowicy i umieszczane w studzienkach do hodowli komórkowych, które są wypełnione chemoatraktantami podobnymi do surowicy lub surowicy, aby wytworzyć siłę chemoatrakcyjną. Siła ta napędza komórki do przemieszczania się przez półprzepuszczalną błonę (migracja) lub alternatywnie przez powłokę macierzy zewnątrzkomórkowej (inwazja), która może być następnie barwiona przy użyciu konwencjonalnych barwników w celu wykrycia i ilościowego określenia liczby komórek. Liczba komórek jest następnie normalizowana w zależności od zakresu migracji i inwazji w nieinwazyjnej linii komórkowej. Metoda ta pozwala badaczowi ocenić potencjał inwazyjny różnych typów komórek w różnych warunkach, w tym w przypadku manipulacji genetycznych.
Hormony, cytokiny i czynniki wzrostu są kluczowymi składnikami surowicy i coraz częściej okazuje się, że są związane z napędzaniem inwazyjnego fenotypu4. Jednak natura, rola i specyficzność tych chemoatrakcyjnych cząsteczek surowicy w pośredniczeniu w inwazji nadal pozostają nieuchwytne. Wyzwaniem pozostaje ustalenie, jakie konkretne czynniki w chemoatraktantach podobnych do surowicy lub surowicy są odpowiedzialne za napędzanie inwazji komórek rakowych, a także jakie cząsteczki mogą hamować proces inwazji. W niniejszym raporcie opisujemy metodologię oceny potencjalnego udziału hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu obecnych w surowicy jako cząsteczek napędzających chemoprzyciąganie i inwazję komórek nowotworowych.
W tym proponowanym zmodyfikowanym protokole, usuwanie hormonów, cytokin i czynników wzrostu z 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu wytworzenia 2% pozbawionych węgla drzewnego FBS (CS-FBS). Zarówno 2% FBS, jak i 2% CS-FBS są używane jako czynniki do tworzenia siły chemoatrakcyjnej do napędzania inwazji komórek rakowych. Stosowanie 2% CS-FBS jako czynnika chemoatrakcyjnego w porównaniu z normalnym 2% FBS daje kilka korzyści, w tym przede wszystkim możliwość badania fenotypu inwazji raka przy zmniejszonym/względnym braku hormonów, cytokin i czynników wzrostu. Umożliwia również badaczowi ocenę, czy zbiorowe usunięcie hormonów, czynników wzrostu i cytokin powoduje wzrost czy spadek wskaźnika inwazyjnego. Test jest następnie projektowany w celu określenia, czy dodanie pojedynczego składnika, oznaczonego jako "X", może zahamować, zmniejszyć, zwiększyć lub przywrócić wskaźnik inwazyjny do jego pierwotnej wartości (patrz rysunki 2 i 3). Chociaż metodologia ta jest specyficzna dla osiągnięcia fizjologicznych poziomów składnika, który jest usuwany z surowicy podczas usuwania węgla drzewnego, należy również zauważyć, że usuwanie węgla drzewnego może również wpływać na szlaki transdukcji sygnału. Na przykład doniesiono, że usuwanie węgla drzewnego może zmniejszać aktywność fosfatazy alkalicznej komórek osteoprogenitorowych i indukować adipogenezę poprzez redukcję aktywatorów MAPK5. Pożywki pozbawione węgla drzewnego są dostępne na rynku i opierają się na opisanym protokole, który łączy węgiel drzewny z dekstranem i inkubuje z płodową surowicą bydlęcą O/N6.
Ten test został opracowany w odpowiedzi na wynik zgłoszony przez Zuckera i wsp. 7 Autorzy wykazali, że zmutowany fenotyp wpływający na komunikację w węzłach szczelinowych wykazał wzrost wskaźnika inwazji podczas migracji w kierunku mediów z normalnym 2% FBS. Wzrost ten został wyeliminowany poprzez zastąpienie surowicy pozbawionej węgla drzewnego. Na podstawie tego wyniku autorzy doszli do wniosku, że ten mutant wpływa na migrację w kierunku cząsteczki lipofilowej (a dokładniej hormonu, czynnika wzrostu lub cytokiny)7. Powszechnie wiadomo, że hormony, czynniki wzrostu i cytokiny pośredniczą w szlakach sygnałowych zaangażowanych w promocję i inwazję guza4. Dlatego ważne jest, aby badacze naukowi określili, jakie czynniki napędzają inwazję guza na ich konkretne badane komórki rakowe lub mutanty. Test ma na celu określenie roli poszczególnych składników w ich stężeniu fizjologicznym, określonym zgodnie z różnicą między stężeniem składnika "X" w normalnym FBS a CS-FBS. Dzięki opracowaniu tego testu badacze mogą uzyskać lepszy wgląd w specyficzny szlak inwazyjny rządzący ich systemem.
Hormony, czynniki wzrostu i cytokiny często były klasyfikowane jako promotory nowotworów8. Niektóre z tych czynników, takie jak EGF, są wykorzystywane jako bezpośrednie źródła chemoatraktantów w komorach inwazyjnych9. W związku z tym wydaje się prawdopodobne, że reprezentują one główne składniki surowicy, które kierują inwazją guza. Protokół ten proponuje prostą, ale znaczącą modyfikację konwencjonalnego testu inwazji in vitro, która pozwala badaczowi ocenić udział hormonów, czynników wzrostu i cytokin w pośredniczeniu w inwazyjnym potencjale komórek rakowych. Test ma jednak na celu dostarczenie badaczowi odpowiedzi na pytanie, czy procedura będzie skuteczna w jego badaniu na wczesnym etapie analizy, tak aby nie zużywać cennego czasu i zasobów, jeśli zostanie uznana za niepotrzebną. Metoda ta wykorzystuje CS-FBS i opiera się na uznaniu badaczy co do tego, które cząsteczki należy ścigać jako wiodące kandydaci, które potencjalnie pośredniczą w inwazji komórek rakowych. Wyniki tych analiz powinny okazać się przydatne w określeniu, które składniki surowicy służą jako chemoatraktanty lub inhibitory dla konkretnej badanej linii komórkowej lub mutanta. Ponadto podejście to może pomóc badaczowi zidentyfikować kluczowe szlaki sygnałowe promujące lub hamujące inwazję komórek rakowych; w ten sposób ukierunkowując przyszłe projektowanie leków.

<table><tbody><tr><td>Wkłady kontrolne BioCoat z 8.0 i mikro; m Membrana PET</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 w każdej z dwóch płytek 24-dołkowych. PET = teraftalan etylenu</td></tr><tr><td>Kolagen I, ogon szczura</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Źródło = ścięgno ogona szczura, czystość = 90%</td></tr><tr><td>Utrwalacz; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Utrwalacz na bazie metanolu, hematoksylina/eozyna</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life</td><td>Technologies 16000</td><td>Oznaczona jako FBS</td></tr><tr><td>Węgiel drzewny surowicy bydlęcej pozbawionej węgla Technologie</td><td>życia Life Technologies</td><td>12676</td><td>Oznaczona jako CS-FBS</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Oznaczone jako FBS</td></tr><tr><td>Węglowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>oznaczona jako CS-FBS</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Surowica krwi służy jako chemoatraktant, do którego migrują i atakują komórki rakowe, ułatwiając ich przedostawanie się do mikronaczyń. Jednak rzeczywiste cząsteczki, w kierunku których migrują komórki, pozostają nieuchwytne. Ten zmodyfikowany test inwazji został opracowany w celu identyfikacji celów, które napędzają migrację i inwazję komórek. Technika ta porównuje indeks inwazji w trzech warunkach, aby określić, czy określony hormon, czynnik wzrostu lub cytokina odgrywają rolę w pośredniczeniu w inwazyjnym potencjale komórki rakowej. Stany te obejmują i) normalną płodową surowicę bydlęcą (FBS), ii) FBS pozbawioną węgla drzewnego (CS-FBS), która usuwa hormony, czynniki wzrostu i cytokiny oraz iii) cząsteczkę CS-FBS + (oznaczoną jako "X"). Znacząca zmiana w inwazji komórek z CS-FBS w porównaniu z FBS wskazuje na udział hormonów, cytokin lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w zmianie. Poszczególne cząsteczki można następnie dodać z powrotem do CS-FBS, aby ocenić ich zdolność do odwrócenia lub uratowania fenotypu inwazji. Ponadto dwa lub więcej czynników można połączyć w celu oceny addytywnego lub synergicznego wpływu wielu cząsteczek w napędzaniu lub hamowaniu inwazji. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta umożliwia badaczowi określenie, czy hormony, cytokiny i/lub czynniki wzrostu odgrywają rolę w inwazji komórek, służąc jako chemoatraktanty lub inhibitory inwazji dla określonego typu komórki rakowej lub określonego mutanta. Identyfikując określone chemoatraktanty i inhibitory, ten zmodyfikowany test inwazji może pomóc w wyjaśnieniu szlaków sygnałowych, które kierują inwazją komórek rakowych.

Wskaźnik inwazji jest obliczany dla każdego warunku poprzez normalizację do nieinwazyjnej linii komórkowej. W naszych eksperymentach jako linie inwazyjne wykorzystujemy linię komórek czerniaka 1205Lu oraz ustalone stabilne linie wariantów, a jako logiczną kontrolę – przednowotworowy wariant nieinwazyjny WM793, z którego wywodzą się komórki 1205Lu10. Jako macierz inwazyjną stosujemy kolagen I, ponieważ jest on głównym składnikiem skóry właściwej. Jest to zgodne z wcześniejszym badaniem, w którym wykazano, że op...

Ten artykuł wideo opisuje zmodyfikowaną metodę in vitro do badania roli hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu w napędzaniu inwazji komórek rakowych.

Zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest opracowanie testu in vitro do badania roli hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu w stymulowaniu inwazji komórek nowotworowych. Jest to realizowane poprzez ustalenie w drugim kroku, czy istnieje różnica w indeksie inwazji pomiędzy różnymi wariantami komórkowymi lub mutantami. Test inwazji powtarza się z użyciem pożywki oczyszczonej węglem aktywnym, która usuwa z surowicy wszelkie hormony, czynniki wzrostu lub cytokiny.Następnie powtarza się test inwazyjności, dodając do medium oczyszczonego węglowym filtrem konkretny, znany czynnik, aby ustalić, czy migracja w kierunku tego czynnika nasila czy hamuje inwazję. Wyniki wskazują zmiany w indeksie inwazyjności dla konkretnych populacji komórek, które występują podczas migracji w stronę znanych czynników eksperymentalnych, w oparciu o normalizację wyników względem indeksu inwazyjności populacji komórek nieinwazyjnych. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas wykonywania tradycyjnego testu inwazyjności, kiedy zauważyłem znaczną różnicę w indeksach inwazyjności dla różnych mutantów komórkowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjny test inwazyjności, jest możliwość specyficznego zbadania roli hormonów, konkretnych czynników wzrostu oraz cytokin w promowaniu lub hamowaniu inwazji komórkowej. Metoda ta może być pomocna w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, w tym w określeniu, które czynniki prowadzą do przerzutowania nowotworów. Zastosowanie tej techniki może wskazać kierunek podejścia terapeutycznego w przyszłym projektowaniu leków. Dla każdej linii komórkowej przeznaczonej do testów należy użyć płytki 24-dołkowej z 12 insertami.Następnie należy opisać płytki zgodnie z warunkami analizy. Kolejno należy ostrożnie nalać 75 µL świeżo przygotowanego roztworu macierzy kolagenowej do każdego insertu, który będzie wykorzystany w teście inwazji, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie płytki z insertami pokrytymi kolagenem należy inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut, aby żel mógł stężeć.Po odłączeniu komórek eksperymentalnych za pomocą trypsyny, dodać pożywkę uzupełnioną o 10% FBS, aby zneutralizować enzym, a następnie trzykrotnie przemyć komórki w PBS. Następnie zawiesić osad w pożywce bezsurowiczej i przeprowadzić odliczanie komórek. Po zestaleniu się macierzy kolagenowej dodać pożywkę bezsurowiczą tak, aby uzyskać końcowe stężenie 50 000 komórek na mililitr.Po 30 minutach do każdej studni dodaj 700 µL pożywki zawierającej 2% defined FBS, 2% charcoal stripped FBS lub 2% charcoal stripped FBS z dodatkowym komponentem. Na górną część każdego insertu do migracji lub inwazji dodaj 500 µL zawiesiny komórek w pożywce bezzserwatkowej. Inkubuj testy przez 22 godziny w temperaturze 37 °C.Następnie do trzech pustych dołków płytki komory dodaj metanol, utrwalacz, eozynę oraz hematynę. Potem usuń komórki i macierz z górnej części każdego insertu, wykonując dwa kolejne przecierania patyczkiem bawełnianym. Następnie użyj pęsety.Zanurz każdy wkład pięć razy, po jednej sekundzie za każdym razem, kolejno w każdym z trzech roztworów barwiących, a następnie pozostaw wkłady do wyschnięcia na noc w pozycji odwróconej. Następnego dnia, używając obiektywu 20x, wykonaj zdjęcia komórek na wkładach poprzez bezpośrednią obserwację zabarwionych preparatów.Dla każdej próbki wykonuje się pięć zdjęć, w tym cztery z zewnętrznych pól membrany i jedno z centrum. Na koniec, przy użyciu oprogramowania ImageJ, należy policzyć komórki na każdym zdjęciu i obliczyć indeks inwazji, normalizując go względem nieinwazyjnej linii komórkowej. Model ten prezentuje potencjalne wyniki, jakie mogą zostać uzyskane podczas testu inwazyjności, oraz sposób interpretacji odpowiadających im danych.Każde koło ilustruje reprezentatywny wynik dla barwionego filtra z jednego z trzech badanych warunków, a każda kropka reprezentuje komórkę, która przeniknęła przez macierz inwazyjną i została zabarwiona na spodniej stronie membrany. Następnie dla każdego warunku oblicza się indeks inwazyjności zgodnie z jego normalizacją względem nieinwazyjnej linii komórkowej. Na przykład, w tym reprezentatywnym eksperymencie przebadano trzy hormony w celu zidentyfikowania potencjalnego czynnika x.Dwa z hormonów nie wpłynęły na indeks inwazji, natomiast jeden z nich wykazuje właściwości hamujące. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około czterech godzin w pierwszym dniu i jednej godziny w drugim dniu, pod warunkiem prawidłowej realizacji wszystkich kroków. Podczas stosowania tej metody ważne jest staranne i dokładne oznakowanie każdego pojedynczego wkładu komórkowego.Zastosowaliśmy system kodowania kolorami oraz różne kropki, aby starannie oznaczyć każdy wkład komórkowy. W dalszej kolejności do walidacji wyników in vitro można wykorzystać inne metody, takie jak modele mysie in vivo dla przerzutów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać fizjologiczne znaczenie czynników, takich jak hormony, czynniki wzrostu i cytokiny, jako stymulatorów lub inhibitorów inwazji komórkowej w modelu in vitro.Dziękujemy za zainteresowanie naszym filmem i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zmodyfikowany in vitro test inwazyjności w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu w mediacji inwazji komórek nowotworowych

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ten film opisuje technikę wykorzystania natywnej matrycy do badania inwazji komórek nowotworowych. Technika zastosowana w tym teście zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy.

Test inwazji komórek nowotworowych: natywna metoda 3D oparta na macierzy in vitro do oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Tutaj prezentujemy protokół do badania inwazji komórek nowotworowych na żywe normalne fragmenty tkanek w trzech wymiarach. Ta technika hodowli narządowej jest stosowana głównie do testowania potencjalnie przeciwinwazyjnych leków in vitro.

Test inwazji serca piskląt do badania inwazyjności komórek rakowych i aktywności potencjalnie przeciwinwazyjnych związków

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj zmodyfikowany test inwazji in vitro do badania roli hormonów, cytokin i czynników wzrostu w inwazji komórek rakowych. Ta metoda pozwala określić wpływ poszczególnych czynników na migrację i inwazję komórek nowotworowych.

Zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych

Przeglądaj więcej filmów