Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Ogólnym celem tej skalowalnej procedury jest wyizolowanie specyficznych klonów fagów fab o wysokim powinowactwie z biblioteki wyświetlanej fagi przy użyciu podejścia o wysokiej przepustowości, które umożliwia równoległą selekcję wobec setek antygenowych domen docelowych. Osiąga się to poprzez unieruchomienie najpierw oczyszczonych domen antygenowych w płytkach mikrodołkowych. Kolejne kroki to naświetlanie, przechwytywanie, uwalnianie i amplifikacja klonów fagów, które specyficznie wiążą się z antygenem immobilizowanym na mikropłytce w kolejnych rundach selekcji.

Podczas tego procesu skuteczność selekcji jest monitorowana przy użyciu metod zbiorczych na każdym etapie. Ostatnim krokiem jest ocena specyficzności, powinowactwa i/lub aktywności izolowanych klonów fab. Ostatecznie, specyficzne fragmenty fab o wysokim powinowactwie do dużej liczby antygenów są izolowane równolegle, co umożliwia wytwarzanie przeciwciał przydatnych w analizie całych klas białek powiązanych strukturalnie lub funkcjonalnie.

Znaczenie tej metody polega na tym, że oferuje ona alternatywę, która może pomóc przezwyciężyć ograniczenia i przyspieszyć tempo rozwoju konwencjonalnych technologii przeciwciał zarówno w laboratorium akademickim, jak i przemysłowym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi technikami wytwarzania przeciwciał, takimi jak hybrydoma, jest to, że nie wymaga ona użycia zwierząt. Może być stosowany do praktycznie każdego białka, w tym białek toksycznych i nieimmunogennych.

Jak zobaczymy, można go łatwo zrównoleglić i ostatecznie daje odnawialne rekombinowane DNA kodujące przeciwciało o wysokim powinowactwie specyficzne dla określonego antygenu oraz funkcjonalne i standardowe testy immunologiczne w ciągu zaledwie sześciu do ośmiu tygodni. Biorąc pod uwagę znaczenie przeciwciał w badaniach w dziedzinie biomedycyny, dostrzegliśmy możliwość dostosowania i skalowania generowania antygenów oraz selekcji i identyfikacji przeciwciał do podejścia o wysokiej przepustowości, przy jednoczesnym zachowaniu dostępności do laboratoriów o różnej wielkości i dostępnych zasobach. Rankiem w dniu selekcji fagów należy pobrać pojedynczą kolonię komórek E coli odpornych na T one fagi.

Dodaj go do mililitra dwóch pożywek yt z tetracykliną w ilości 50 mikrogramów na mililitr. Pozwól kolonii inkubować, wstrząsając z prędkością 200 obr./min w 2,5-centymetrowym wytrząsarce orbitalnej. Gdy wzrost kultury jest wizualnie widoczny, przenieś komórki do wymaganej objętości pożywki uzupełnionej tetracykliną.

Musi wystarczyć na 100 mikrolitrów na dobrnik wyboru lub około 10 mililitrów na 96. Dobrze rozszerz podwielokrotności kultury zarówno do penicyliny węglowej, jak i pożywki uzupełnionej kaniną. Kultury te zapewniają ochronę przed wstępną infekcją w komórkach, które mają być użyte do amplifikacji.

Gdy absorbancja optyczna kultury osiągnie 0,4 do 0,8 przy 595 nanometrach. Po pięciu do siedmiu godzinach komórki są gotowe do nałożenia na płytki antygenowe. Aby ten protokół zapewnił pożądane pokrycie biblioteki, należy przygotować wystarczającą ilość płytek z kontraplikowanym antygenem i niespecyficznych płytek z białkiem kontrolnym.

Korzystając z wyświetlanych obliczeń, szczegóły są zawarte w protokole tekstowym. Po nocnym unieruchomieniu docelowych i nieswoistych białek kontrolnych należy usunąć roztwór białka z płytki. Dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego i blokować przez godzinę z potrząsaniem i umyć płytkę cztery razy przed dodaniem biblioteki fagów, gdy komórki rosną.

W dniu selekcji fagów wstępnie usuwamy niespecyficzne lub specyficzne dla znacznika klony FAB FAB wyświetlane z biblioteki, przenosząc 100 mikrolitrów biblioteki fagów na płytki selekcji negatywnej w celu dodania selekcji negatywnej. Usuń wiążący znacznik, dodając nadmiar rozpuszczalnego znacznika powinowactwa. Aby to zrobić, dodaj do każdego z nich końcowe stężenie rozpuszczalnego GST o stężeniu 10 mikromolów.

Następnie inkubuj płytki przez jedną do dwóch godzin na shakerze w temperaturze pokojowej. Aby przygotować docelową płytkę białkową, odessać roztwór białka z płytki, dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego i blokować przez godzinę z wstrząsaniem i przemyć cztery razy przed dodaniem biblioteki fagów. Po inkubacji zebrać z płytek.

Używając 96-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy, przenieś supinat faga na płytki pokryte antygenem. Następnie inkubuj płytki przez jedną do dwóch godzin na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć niezwiązany, myjąc studzienki od ośmiu do 15 razy za pomocą buforu PT.

Można to zrobić ręcznie lub za pomocą automatycznej myjki do płyt. Następnie, tuż przed dodaniem komórek, usuń cały nadmiar buforu do płukania, gdy komórki i płytki antygenowe są gotowe. Eluuj faga, dodając 100 mikrolitrów komórek hodowlanych do każdej studzienki i pozwól płytkom inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pół godziny.

Oczekuje się, że kilka pierwszych rund selekcji nie przyniesie znaczącego wzbogacenia, ale kwantyfikacja wyjściowych mian fagów może zapewnić iluzję minimalnych stężeń fagów potrzebnych do udanej selekcji. Aby to zrobić, podwielokrotność komórek może zostać usunięta przed dodaniem faga pomocniczego w celu zawężenia produkcji faga poprzez przygotowanie i posianie seryjnych rozcieńczeń komórek na płytkach agarowych uzupełnionych antybiotykami. Po inkubacji przez pół godziny dodać M 13 K lub siedem fagów pomocniczych do każdej studzienki, aby uzyskać stężenie 10 miliardów jednostek tworzących kolonie na mililitr.

Pozwól płytkom inkubować przez kolejne 45 minut, tym razem wytrząsając przy 200 obr./min. Następnie przenieś komórki do bloku studni o głębokości 96 dołków z dnem w kształcie litery V zawierającym 1,2 mililitra uzupełnionych dwóch pożywek YT na studzienkę. Pozwól płytkom studzienkowym inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, a następnego dnia wytrząsaj z prędkością 200 obr./min.

Osadzaj bakterie, obracając płytki w temperaturze 4 000 GS przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie z każdej płytki powtórzonej przenieść równe objętości supernatantu zawierającego faga do mini probówki. 96-dołkowe niebieskie pudełko mikropłytki do wykorzystania jako dane wejściowe do kolejnych rund selekcji do połączonego faga, dodać jedną dziesiątą objętość 10 XPBT i wymieszać w celu zneutralizowania.

Teraz powtórz proces wyboru z biblioteki. Wstępna klirens i inkubacja fagów antygenowych trzy do czterech razy przy użyciu faga amplifikowanego z poprzedniej rundy selekcji. Robić to, dopóki nie zaobserwuje się wzbogacenia wiązania docelowego w porównaniu z wiązaniem niespecyficznych białek kontrolnych przez Eliza Płytki mikrodołkowe kodowane dwoma mikrogramami na mililitr antygenu lub białka kontrolnego, jak opisano wcześniej w bibliotece, wstępne odczyszczenie i inkubacja fagów antygenowych, są następnie blokowane i myte jak poprzednio, do zablokowanych i umytych płytek pokrytych antygenem i białkiem kontrolnym, nanieść 100 mikrolitrów rozcieńczonego faga do studzienek i pozostawić płytki do inkubacji, wstrząsając przez 15 minut w temperaturze pokojowej Po inkubacji przemyć płytki osiem razy buforem PT.

Następnie, po przepłukaniu, dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała anty M 13 HRP w stężeniu od jednego do 5 000 lutionów w PBT do każdej studzienki inkubować przez pół godziny, aby umożliwić wiązanie przeciwciała z fagiem związanym z antygenem. Następnie umyć płytki buforem PT sześć razy i jeszcze dwa razy prostym PBS, przygotować, wymieszać i nałożyć 100 mikrolitrów jednego do jednego substratu TMB do każdej z studzienek. Pozwól mu reagować przez pięć do 15 minut, zatrzymując reakcje, gdy nastąpi znaczna zmiana koloru.

Zatrzymaj reakcje, dodając 100 mikrolitrów jednego molowego kwasu fosforowego. Teraz odczytaj absorbancję w studzienkach przy 450 nanometrach i porównaj docelowe sygnały wiązania z sygnałami wiązania białek kontrolnych po wzbogaceniu. Poszczególne klony można wyizolować i scharakteryzować poprzez sekwencjonowanie faga, konwersję DNA faga związanego z wolnym fabem oraz ocenę bezpośredniego wiązania z celem przy użyciu klonalnej FabuLisy, jak wyjaśniono w części tekstowej protokołu.

W przypadku laboratoriów, w których wymagana jest większa przepustowość, metodologia ta może być skalowana i zautomatyzowana. Mając to na uwadze, opracowano dostosowane do potrzeb robotyki, które mogą rozszerzyć możliwości selekcji poprzez automatyzację wszystkich aspektów procedury, w tym blokowania, fagów, wiązania, wyjaśniania i innych. Jednym z podejść do uzyskania antygenu do wykorzystania w selekcji przeciwciał jest zastosowanie technologii syntetycznych genów w celu uzyskania konstruktów do ekspresji izolowanych domen białkowych.

W większości przypadków umożliwia to ekspresję o wysokiej przepustowości i izolację odpowiednich ilości wystarczająco czystego oczyszczonego antygenu do selekcji. Podczas kolejnych rund procesu selekcji, wymykające się stężenia fagów i wzbogacanie faga, który specyficznie wiązał się z antygenem, monitorowano za pomocą miareczkowania fagów, jak pokazano wcześniej, lub monitorowano za pomocą pul fagowych. W teście ELA współczynnik wiązania większy niż dwa na ogół wskazuje na obecność specyficznych klonów wiążących.

I odwrotnie, niższy współczynnik może pomóc w ustaleniu przyczyny niepowodzenia selekcji. Scharakteryzowanie wiązania klonów za pomocą kolormetrycznego testu aminowego umożliwia porównanie wiązania faga fagowego lub fab z unieruchomionym antygenem w porównaniu z wiązaniem ujemnego białka kontrolnego, uzyskując w ten sposób miarę swoistości podczas skalowania i automatyzacji selekcji za pomocą zrobotyzowanych jednostek do obsługi cieczy. Zastosowanie chromoforów absorpcyjnych może pomóc w wykryciu, kiedy określone kanały w fluidyce są albo zatkane, albo straciły uszczelnienie, co skutkuje częściowym dostarczeniem objętości, a także pomóc w rozwiązywaniu problemów podczas optymalizacji procedur mycia, zastosowanie znanych klonów wiążących zapewnia utrzymanie docelowego wiązania, podczas gdy wiązanie tła jest usuwane podczas prania.

Ponadto skuteczne protokoły dekontaminacji zapewniają brak zanieczyszczenia krzyżowego w kolejnych rundach selekcji lub różnych procedurach selekcji i zaleca się, aby dodatkowe parametry rozwiązywania problemów były sprawdzane w protokole tekstowym. Mamy nadzieję, że dzięki zastosowaniu tej techniki do zastosowań przemysłowych umożliwimy naukowcom badanie całych klas strukturalnie lub funkcjonalnie powiązanych białek poprzez przyspieszenie selekcji i identyfikacji odnawialnych przeciwciał o wysokim powinowactwie, a ostatecznym celem jest osiągnięcie maksymalnego pokrycia proteomu.