Name: Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj skalowalną metodę izolacji wysokoafinicznych fragmentów przeciwciał z bibliotek fagowych przy użyciu równoległego wyboru przeciw setkom antygenów. Technika ta przyspiesza odkrywanie przeciwciał w immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować NIH Common Fund – Protein Capture Reagents Program za sfinansowanie rozwoju linii selekcji i charakterystyki przeciwciał Recombinant Antibody Network oraz Canadian Foundation for Innovation za sfinansowanie zakupu platformy selekcji robotów.

<ol><li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li>
<li>Miersch, S., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibodies%3A+concepts%2C+potential+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations.</a> Methods. 57, 486-498 (2012).</li>
<li>Schofield, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+phage+display+to+high+throughput+antibody+generation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization.</a> Genome Biol. 8, R254(2007).</li>
<li>Hust, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+scFv+antibody+generation+pipeline+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A human scFv antibody generation pipeline for proteome research.</a> J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).</li>
<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).</li>
<li>Mersmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+scale+antibody+selections+using+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Towards proteome scale antibody selections using phage display.</a> Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).</li>
<li>Pershad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+a+panel+of+highly+specific+antibodies+to+20+human+SH2+domains+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display.</a> Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).</li>
<li>Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+panning+and+screening+procedure+on+microplates+for+antibody+generation+from+phage+display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries.</a> J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).</li>
<li>Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis: methods and applications.</a> Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).</li>
<li>Boersma, Y. L., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARPins+and+other+repeat+protein+scaffolds%3A+advances+in+engineering+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications.</a> 22, 849-857 (2011).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+tag+protein+fusions%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).</li>
<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Fellouse, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+synthetic+antibodies+from+highly+functional+minimalist+phage-displayed+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries.</a> J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).</li>
<li>Paduch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conformation-specific+synthetic+antibodies+to+trap+proteins+in+selected+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states.</a> Methods. 60, 3-14 (2013).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Huang, H., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+binding+specificities+of+peptide+recognition+modules+by+high-throughput+phage+display+selections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections.</a> Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).</li>
<li>McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+analysis+of+peptide-recognition+domain+specificities+by+phage+display+and+deep+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing.</a> Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>den Engelsman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+assessment+of+protein+aggregates+in+pharmaceutical+biotech+product+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development.</a> Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).</li>
<li>Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+thermal+scanning%3A+a+general%2C+rapid+dye-binding+thermal+shift+screen+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).</li>
<li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFellouse%2C+FA+%22Making+antibodies+in+bacteria.+in+Making+and+Using+Antibodies%3A+A+Practical+Handbook%22">Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook</a>. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).</li>
<li>Acton, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+protein+samples+for+NMR+structure%2C+function%2C+and+small-molecule+screening+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies.</a> Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).</li>
<li>Mahon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+interrogation+of+a+minimalist+synthetic+CDR-H3+library+and+its+ability+to+generate+antibodies+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential.</a> J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).</li>
<li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).</li>
<li>Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+natural+antibodies%3A+the+power+of+in+vitro+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas przeprowadzania selekcji przeciwciał in vitro , dwoma głównymi determinantami sukcesu selekcji są: 1) izolacja dobrze sfałdowanych celów antygenowych do selekcji oraz 2) dostępność biblioteki przeciwciał o wysokiej różnorodności funkcjonalnej. W wielu przypadkach dostępność wystarczających ilości dobrze sfałdowanego białka o pełnej długości może być ograniczona. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest wykorzystanie domen zidentyfikowanych na podstawie analizy bioinformatycznej22</s...

Wraz z nadejściem ery postgenomicznej, dostępność wysokiej jakości odczynników wiążących do charakteryzowania i modulowania białek jest niezbędna do otwarcia nowych ścieżek badawczych i terapeutycznych. Przeciwciała nadal mają kluczowe znaczenie zarówno dla naukowców akademickich, jak i przemysłowych jako podstawowe narzędzia badawcze i diagnostyczne oraz potencjalne terapie. Nic dziwnego, że nastąpił imponujący wzrost liczby firm zajmujących się opracowywaniem przeciwciał na zlecenie, z których większość polega na konwencjonalnych technologiach hybrydoma do generowania niestandardowych przeciwciał. Niemniej jednak selekcja in vitro z wykorzystaniem bibliotek przeciwciał wyświetlanych przez fagi staje się potężną technologią alternatywną, która może oferować wyjątkowe korzyści i sukces tam, gdzie konwencjonalne technologie mogą napotkać ograniczenia1, 2.
W świetle znacznego zapotrzebowania na wysokiej jakości przeciwciała jako narzędzia badawcze, dwa główne wyzwania związane z generowaniem przeciwciał odnawialnych to: 1) wydajność selekcji i 2) dostępność antygenu. Wiele grup opisało już procedury selekcji in vitro, mające na celu zwiększenie przepustowości i szybkości identyfikacji przeciwciał. Opisy te szczegółowo opisują różne realne podejścia, które obejmują wybór na podstawie celów o pełnej długości3,4 lub strukturalnie powiązanych domen5,6,7, przy użyciu schematów immobilizacji antygenu3,4 opartych na kulkach6,8 lub płytkach. Ponadto coraz powszechniejsze stosowanie technologii syntezy genów9 sprawiło, że systematyczne wytwarzanie antygenów, zwłaszcza izolowanych domen, jest w miarę opłacalne i może potencjalnie złagodzić trudności w uzyskaniu wystarczających ilości oczyszczonego antygenu o pełnej długości. Wykorzystując te dwie technologie w tandemie, opracowano samodzielny i skalowalny proces generowania i selekcji przeciwciał, który umożliwiłby równoległą izolację przeciwciał dla dużych zestawów eksprymowanych domen antygenowych i ułatwił opracowanie odczynników do charakteryzowania całych klas białek powiązanych strukturalnie lub funkcjonalnie.
W tym celu opracowano zintegrowany potok, który łączy in silico identyfikację ekspresyjnych domen antygenowych, syntezę genów, wysokoprzepustową bakteryjną ekspresję antygenów i skalowalne selekcje przeciwciał wyświetlanych na podstawie fagów. Rurociąg ten wymaga jedynie podstawowej infrastruktury dostępnej dla większości laboratoriów zajmujących się naukami przyrodniczymi (w tym bibliotek przeciwciał, które są coraz częściej dostępne na podstawie licencji lub umowy o transferze materiałów), ale jest również podatny na automatyzację do użytku na skalę przemysłową. Korzystając z tego protokołu, możliwe jest wygenerowanie setek domen antygenowych oznaczonych powinowactwem i rutynowe izolowanie wysoce specyficznych fragmentów przeciwciał do wielu z tych antygenów.
Technologia wyświetlania fagów wykazała kompatybilność z szeroką gamą formatów rekombinowanych odczynników powinowactwa, w tym domenami Fab, scFv i autonomicznymi Fv oraz rosnącą gamą małych 'alternatywnych struktur' (zaprojektowane białka powtórzeń ankyryny (DARPINS), fibronektyna (Fn), domeny lipokaliny i wieleinnych10). Dyskusja ogranicza się w tym przykładzie do izolacji fragmentów przeciwciał Fab, chociaż zakłada się, że metody te można dostosować do innych typów bibliotek. Korzystając z tej technologii, z powodzeniem wybrano Fabs o niskim powinowactwie nanomolowym do małych, znakowanych domen białkowych, w tym domen czynnika transkrypcyjnego, domen SH2, białek wiążących RNA i innych, z których wiele wiąże białko o pełnej długości i jest funkcjonalnych w testach immunologicznych, takich jak immunofluorescencja, immunoprecypitacja i immunohistochemia. Co ważne, rekombinowane klony wiążące są w pełni odnawialne i mogą być ponownie generowane z konstruktów ekspresyjnych poprzez produkcję bakteryjną, oferując zwiększoną spójność, odtwarzalność i opłacalność, co uzasadnia koszt rygorystycznej walidacji klonów.
W tym protokole i towarzyszącym mu filmie pokazane są podstawowe metody selekcji przeciwciał z bibliotek wyświetlanych przez fagi przy użyciu unieruchomionych domen antygenowych. Ta szczególna metoda wykorzystuje domeny białkowe znakowane GST unieruchomione przez pasywną adsorpcję w płytkach mikrodołkowych, chociaż z powodzeniem zastosowano również inne znaczniki11,12,13 i formaty selekcyjne13,14,2. Szczegółowo omówiono krytyczne kwestie dotyczące konfiguracji i przeprowadzania selekcji z równoległym monitorowaniem parametrów selekcji mającym na celu identyfikację i wyizolowanie specyficznie wzbogaconych przeciwciał klonalnych w celu walidacji.

<table><tbody><tr><td>MATERIAŁY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nowy Brunszwik Wytrząsarka inkubatorowa Innova44</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidator 96-kanałowy ręczny system pipetowania stołowego</td><td>Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Wirówka stołowa Sorvall ST-40</td><td>Thermo Product</td><td></td><td></td>75004525</tr><tr><td>ELx405 Select Deep Well Microplate Washer</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy zautomatyzowany robot do wyboru fagów o wysokiej przepustowości</td><td>S& P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa stożkowa probówka Falcon: 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa stożkowa probówka Falcon: 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1,7 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Corning</td><td>MCT-175-L-C</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa/384-dołkowa płytka Maxisorp</td><td>Sigma</td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowy blok głębinowy z dnem w kształcie litery V</td><td>Corning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Mini-tubka 96-dołkowa sterylna mikropłytka niebieskie pudełko</td><td>Corning</td><td>AXY-MTS-06-C-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Oddychająca samoprzylepna folia uszczelniająca do płytek</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td></td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer</td><td></td>katalogowy</tr><tr><td>glikol polietylenowy</td><td></td><td>Bioshop PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt</td><td>drożdżowy Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>bio-trypton</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>N-Z amina</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>laktoza</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>karbenicylina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>kanamycyna</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>tetracyklina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>monozasadowy fosforan potasu</td><td>Bioshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Anachemia</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Bioshop</td><td>SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe Barwnik żelowy DNA</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>kwas fosforowy</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>lizozym</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>benzonaza</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr> koktajl <tr><td>inhibitorów proteazy tabletki</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>1,000x pomocniczy (M13K07) zapas (1013 faga na ml)</td><td>NEB</td><td>N0315S</td> HRP sprzężone przeciwciało <td></td></tr><tr><td>specyficzne dla M13 (anty-M13-HRP).</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr><tr><td>Substrat TMB: wymieszaj równe objętości TMB i sub2O2 sub&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Biobasic</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Taq</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>Egzonukleaza</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna z krewetkami</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Zapotrzebowanie na przeciwciała, które spełniają potrzeby zarówno badań podstawowych, jak i klinicznych, jest wysokie i w przyszłości znacznie wzrośnie. Oczywiste jest jednak, że tradycyjne technologie monoklonalne nie są osamotnione w tym zadaniu. Doprowadziło to do opracowania alternatywnych metod w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wysokiej jakości i odnawialne odczynniki o powinowactwie do wszystkich dostępnych elementów proteomu. W tym celu opracowano wysokoprzepustowe metody przeprowadzania selekcji z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi do zastosowań obejmujących różne antygeny i zoptymalizowane pod kątem szybkiej przepustowości i sukcesu. W niniejszym dokumencie szczegółowo opisano protokół, który ilustruje za pomocą demonstracji wideo równoległą selekcję klonów Fab-phage z bibliotek o wysokiej różnorodności w stosunku do setek celów przy użyciu ręcznego 96-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy lub zautomatyzowanego systemu robotyki. Korzystając z tego protokołu, pojedynczy użytkownik może wygenerować setki antygenów, równolegle wybrać przeciwciała przeciwko nim i zweryfikować wiązanie przeciwciał w ciągu 6-8 tygodni. Zwrócono uwagę na: i) realny format antygenu, ii) charakterystykę antygenu przed selekcją, iii) krytyczne etapy, które wpływają na selekcję klonów specyficznych i o wysokim powinowactwie, oraz iv) sposoby monitorowania skuteczności selekcji i charakterystyki klonów przeciwciał we wczesnym stadium. Dzięki takiemu podejściu uzyskaliśmy syntetyczne fragmenty przeciwciał (Fabs) dla wielu klas docelowych, w tym jednoprzebiegowych receptorów błonowych, wydzielanych hormonów białkowych i wielodomenowych białek wewnątrzkomórkowych. Fragmenty te są łatwo przekształcane w przeciwciała o pełnej długości i zostały zweryfikowane pod kątem wysokiego powinowactwa i swoistości. Ponadto wykazano, że są one funkcjonalne w różnych standardowych testach immunologicznych, w tym Western blot, ELISA, immunofluorescencji komórkowej, immunoprecypitacji i powiązanych testach. Metodologia ta przyspieszy odkrywanie przeciwciał i ostatecznie przybliży nas do realizacji celu, jakim jest generowanie odnawialnych, wysokiej jakości przeciwciał przeciwko proteomowi.

Opisany tutaj protokół był wykorzystywany do równoległej izolacji fragmentów przeciwciał skierowanych przeciwko różnorodnym domenom antygenowym, powiązanym zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie, z kombinatorycznych bibliotek Fab prezentowanych na fagach. Problemy związane z dostępnością antygenów można w wielu przypadkach rozwiązać poprzez identyfikację in silico ekspresyjnych domen antygenowych odpowiednich do selekcji przeciwciał23. Połączenie ekspresji antygenu z selekcją przeciwciał w ramach jednego l...

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Ogólnym celem tej skalowalnej procedury jest wyizolowanie specyficznych klonów fagów fab o wysokim powinowactwie z biblioteki prezentowanej na fagach, przy użyciu podejścia wysokoprzepustowego, które umożliwia równoległą selekcję przeciwko setkom antygenicznych domen docelowych. Osiąga się to poprzez uprzednią unieruchomienie oczyszczonych domen antygenicznych w płytkach mikrotitracyjnych. Kolejne etapy polegają na eksponowaniu, wychwytywaniu, uwalnianiu i amplifikacji klonów fagów fab, które specyficznie wiążą się z unieruchomionym na płytce antygenem, w kolejnych rundach selekcji.W trakcie tego procesu skuteczność selekcji jest monitorowana przy użyciu metod pulowania na każdym etapie. Ostatnim krokiem jest ocena swoistości, powinowactwa i/lub aktywności wyizolowanych klonów fab. W rezultacie równolegle izolowane są specyficzne fragmenty fab o wysokim powinowactwie przeciwko dużej liczbie antygenów, co umożliwia generowanie przeciwciał przydatnych w analizie całych klas białek powiązanych strukturalnie lub funkcjonalnie.Znaczenie tej metody polega na tym, że oferuje ona alternatywę, która może pomóc w przełamaniu ograniczeń i przyspieszeniu tempa konwencjonalnych technologii opracowywania przeciwciał, zarówno w laboratoriach akademickich, jak i przemysłowych. Główną zaletą tej techniki w stosunku do konwencjonalnych metod opracowywania przeciwciał, takich jak technika hybridoma, jest fakt, że nie wymaga ona wykorzystania zwierząt. Może być ona stosowana w odniesieniu do praktycznie każdego białka, w tym białek toksycznych i nieimmunogennych.Jak zobaczymy, proces ten można łatwo zrównoleglić, co w rezultacie pozwala w czasie zaledwie od sześciu do ośmiu tygodni uzyskać odnawialne rekombinowane DNA kodujące przeciwciało o wysokim powinowactwie, specyficzne dla konkretnego antygenu, a także funkcjonalne i standardowe testy immunoologiczne. Mając na uwadze znaczenie przeciwciał w badaniach biomedycznych, dostrzegliśmy możliwość adaptacji i przeskalowania procesu generowania antygenów oraz selekcji i identyfikacji przeciwciał do podejścia wysokoprzepustowego, przy jednoczesnym zachowaniu dostępności dla laboratoriów o różnej wielkości i dostępnych zasobach. Rano w dniu selekcji fagów należy pobrać pojedynczą kolonię fagoodpornych komórek e coli z etapu T1.Dodaj to do jednego mililitra pożywki 2YT z tetracykliną w stężeniu 50 µg/mL. Inkubuj kolonię w wytrząsarce orbitalnej o promieniu 2,5 cm przy prędkości 200 RPM. Gdy wzrost kultury stanie się widoczny, przenieś komórki do wymaganej objętości pożywki uzupełnionej tetracykliną.Należy przygotować objętość wystarczającą do uzyskania 100 µL na każdą studzienkę selekcyjną, czyli około 10 mL na płytkę 96-dołkową. Alikwoty hodowli należy namnożyć w pożywkach uzupełnionych węglem, penicyliną i kanamycyną. Hodowle te zabezpieczają przed przedwczesną infekcją komórek wykorzystywanych do amplifikacji.Gdy absorbancja optyczna hodowli osiągnie wartość od 0.4 do 0.8 przy 595 nanometrach. Po pięciu do siedmiu godzinach komórki są gotowe do naniesienia na płytki z antygenem. Aby zapewnić pożądane pokrycie biblioteki w tym protokole, należy przygotować odpowiednią liczbę powtórnych płytek z antygenem oraz płytek z białkiem kontrolnym nieswoistym.Szczegóły obliczeń wykorzystane w procedurze zostały przedstawione w protokole tekstowym. Po całonocnej immobilizacji białek docelowych i białek kontrolnych nieswoistych, należy usunąć roztwór białek z płytki. Następnie dodać 200 µL buforu blokującego i inkubować przez jedną godzinę przy potrząsaniu, a następnie przemyć płytkę czterokrotnie przed dodaniem biblioteki fagów w trakcie wzrostu komórek.W dniu selekcji fagów przeprowadzamy wstępne oczyszczanie biblioteki z klonów FAB wykazujących nieswoiste wiązanie lub wiązanie swoiste dla znacznika, przenosząc 100 µl biblioteki fagowej na płytki do selekcji negatywnej w celu przeprowadzenia dodatkowej selekcji negatywnej. Fagi wiążące znacznik usuwa się poprzez dodanie nadmiaru rozpuszczalnego znacznika powinowactwa. W tym celu do każdej próbki dodaje się rozpuszczalne GST do stężenia końcowego 10 µM.Następnie inkubuj płytki przez jedną do dwóch godzin na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Aby przygotować płytkę z białkiem docelowym, odessaj roztwór białka z płytki, dodaj 200 µL buforu blokującego i blokuj przez jedną godzinę z wytrząsaniem, a następnie przemyj cztery razy przed dodaniem biblioteki fagów. Po inkubacji zbierz supernat fagowy z płytek.Używając 96-kanałowego dozownika cieczy, przenieś nadsącz fagowy na płytki powlekane antygenem. Następnie inkubuj płytki od jednej do dwóch godzin na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usuń niezwiązane fagi, przemywając studzienki od 8 do 15 razy buforem PT.Można to wykonać ręcznie lub za pomocą automatycznej myjki do płytek. Następnie, tuż przed dodaniem komórek, należy usunąć cały nadmiar buforu myjącego, gdy płytki z komórkami i antygenami będą gotowe. Eluuj fagi, dodając 100 µL rosnących komórek do każdej studni, i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez pół godziny.Nie oczekuje się, aby pierwsze kilka rund selekcji doprowadziło do istotnego wzbogacenia, jednak kwantyfikacja mian uzyskanego faga pozwala upewnić się, że osiągnięto minimalne stężenia faga niezbędne do przeprowadzenia udanych selekcji. W tym celu, przed dodaniem faga pomocniczego, można pobrać alikwot komórek, aby dokładniej określić wydajność faga poprzez przygotowanie i wysianie rozcieńczeń seryjnych komórek na płytkach agarowych z dodatkiem antybiotyku. Po inkubacji przez pół godziny, do każdej studzienki należy dodać faga pomocniczego M 13 K oh seven do stężenia 10 miliardów jednostek tworzących kolonie na mililitr.Inkubować płytki przez kolejne 45 minut, tym razem z wytrząsaniem przy 200 RPMs. Następnie przenieść komórki do bloku głębokich studzienek 96-dołkowych z dnem w kształcie litery V, zawierającego 1,2 milliliters uzupełnionej pożywki two YT na każdą studzienkę. Inkubować płytki głębokostudzienkowe w temperaturze 37 degrees Celsius przez noc z wytrząsaniem przy 200 RPMs do następnego dnia.Wytrąć bakterie w formie osadu, wirując płytki przy 4 000 GS przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie z każdej powielonej płytki przenieś równe objętości naddatku zawierającego fagi do mini probówki. Niebieskie pudełko na mikro płytkę 96-dołkową, która posłuży jako materiał wejściowy do kolejnych rund selekcji do połączonych fagów, dodaj 1/10 objętości 10 XPBT i wymieszaj w celu neutralizacji.Następnie powtórz proces selekcji z biblioteki. Przeprowadź wstępne oczyszczanie i inkubację fagów z antygenem od trzech do czterech razy, wykorzystując fagi namnożone z poprzedniej rundy selekcji. Powtarzaj tę procedurę do momentu zaobserwowania wzbogacenia wiązania do celu w porównaniu z wiązaniem nieswoistych białek kontrolnych za pomocą płytek mikrodołkowych ELISA pokrytych 2 µg/mL antygenu lub białka kontrolnego, zgodnie z wcześniejszym opisem we wstępnym oczyszczaniu biblioteki i inkubacji fagów z antygenem; następnie płytki pokryte antygenem i białkiem kontrolnym zablokuj i przemyj w ten sam sposób co wcześniej. Do dołków nanieś 100 µL rozcieńczonego nadsączu fagowego i inkubuj płytki z wytrząsaniem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyj płytki osiem razy buforem PT.Następnie po przemyciach do każdej studni należy dodać 100 µL przeciwciała anty-M13 HRP w rozcieńczeniu 1:5 000 w buforze PBT i inkubować przez pół godziny, aby umożliwić wiązanie przeciwciał z fagami związanymi z antygenem. Następnie płytki należy przemyć sześciokrotnie buforem PT i dwukrotnie czystym buforem PBS, a następnie przygotować, wymieszać i nanieść 100 µL substratu TMB w stosunku 1:1 do każdej studni. Pozostawić do reakcji na 5–15 minut, przerywając reakcję w momencie wystąpienia znacznej zmiany barwy.Zatrzymać reakcje poprzez dodanie 100 µL 1 M kwasu fosforowego. Następnie zmierzyć absorbancję w dołkach przy 450 nm i porównać sygnały wiązania celu z sygnałami wiązania białek kontrolnych po wzbogaceniu. Poszczególne klony można wyizolować i scharakteryzować poprzez sekwencjonowanie fagów, konwersję DNA fagów związanych z wolnym fragmentem Fab oraz ocenę bezpośredniego wiązania z celem przy użyciu clonal FabuLisa, zgodnie z opisem w tekście protokołu.W laboratoriach, w których wymagana jest wyższa przepustowość, metodologię tę można skalować i automatyzować. W tym celu opracowano spersonalizowane systemy robotyczne, które pozwalają zwiększyć wydajność selekcji poprzez automatyzację wszystkich etapów procedury, w tym blokowania, wiązania fagów, elucji i innych czynności. Jednym ze sposobów pozyskania antygenu do selekcji przeciwciał jest wykorzystanie technologii syntetycznych genów w celu otrzymania konstruktów do ekspresji wyizolowanych domen białkowych.W większości przypadków umożliwia to wysokoprzepustową ekspresję i izolację odpowiednich ilości wystarczająco czystego oczyszczonego antygenu do selekcji. Podczas kolejnych rund procesu selekcji stężenia eluowanych fagów oraz wzbogacenie frakcji fagów specyficznie wiążących się z antygenem monitorowano za pomocą miareczkowania fagów, zgodnie z wcześniej opisaną metodą, lub poprzez analizę pul fagowych. W teście ELA stosunek wiązania większy niż dwa zazwyczaj wskazuje na obecność klonów specyficznie wiążących.I odwrotnie, niższy stosunek może pomóc w ustaleniu przyczyny niepowodzenia selekcji. Charakterystyka wiązania klonów za pomocą kolorymetrycznego testu aminokwasowego umożliwia porównanie wiązania fagów Fab lub fragmentów Fab do unieruchomionego antygenu z wiązaniem białka kontrolnego (negatywnego), co pozwala na pomiar specyficzności podczas skalowania i automatyzacji selekcji z wykorzystaniem robotycznych systemów do obsługi cieczy. Zastosowanie chromoforów absorbujących może pomóc w wykryciu sytuacji, gdy konkretne kanały w układzie płynnym są zatkane lub utraciły szczelność, co prowadzi do dostarczenia niepełnej objętości, oraz wspomóc rozwiązywanie problemów podczas optymalizacji procedur płukania; użycie znanych wiążących klonów zapewnia utrzymanie wiązania z celem przy jednoczesnym usuwaniu wiązania niespecyficznego podczas etapów płukania.Dodatkowo, skuteczne protokoły dekontaminacji zapewniają brak kontaminacji krzyżowej z kolejnych rund selekcji lub różnych procedur selekcyjnych, a zalecane dodatkowe parametry rozwiązywania problemów zostały omówione w protokole tekstowym. Poprzez przeskalowanie tej techniki do zastosowań przemysłowych mamy nadzieję umożliwić badaczom eksplorację całych klas białek powiązanych strukturalnie lub funkcjonalnie, przyspieszając selekcję i identyfikację wysokopowinowactwych odnawialnych przeciwciał, z ostatecznym celem osiągnięcia maksymalnego pokrycia proteomu.

scalable-high-throughput-selection-from-phage-displayed-synthetic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Skalowalny wybór o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych na bakteriofagie

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę budowy biblioteki syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi z dostosowaną różnorodnością. Przeciwciała syntetyczne mają szerokie zastosowanie, od badań podstawowych po diagnostykę chorób i terapię.

Budowa biblioteki Fab Display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Opisujemy wydajną metodę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz cząsteczek RNA z wirusowych społeczności środowiskowych. Kwasy nukleinowe są frakcjonowane przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie z zastosowaniem rosnących stężeń buforów zawierających fosforany. Metoda ta umożliwia izolację wszystkich typów wirusowych kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych.

Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Poznaj skalowalną metodę izolacji wysokoafinicznych fragmentów przeciwciał z bibliotek fagowych przy użyciu równoległego wyboru przeciw setkom antygenów. Technika ta przyspiesza odkrywanie przeciwciał w immunologii.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi (Wideo) | JoVE Journal

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Przeglądaj więcej filmów