Name: Metody in vitro Model hodowli komórkowej do badań toksycznych substancji chemicznych wdychanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-08T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj metodę ekspozycji komórek na chlor w modelach in vitro płuc, dróg oddechowych i serca. Technika ta umożliwia badanie toksyczności gazów na komórkach szczura i człowieka bez użycia zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania są wspierane przez Program CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Biuro Dyrektora oraz Narodowy Instytut Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW). SA jest również wspierany przez Szpital Dziecięcy Colorado/Colorado School of Mines Collaboration Pilot Award #G0100394 oraz Children's Hospital Colorado Research Institue Pilot Award #G0100471.

1. Hodowle kardiomiocytów szczurów
<ol>
	<li>Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, IACUC.</li>
	<li>Uzyskać kardiomiocyty szczurów z serc (komór) samców szczurów (240-260 g) metodami opisanymi wcześniej4. Krótko mówiąc, znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu (100 mg/kg; potwierdzić znieczulenie metodą szczypania palców u stóp), a następnie usunąć serca do 10,0 ml, 1 mM Ca2+ zawierającego bufor Krebsa Ringera, pH 7,4.</li>
	<li>Opłucz serca 5-6 razy, aby usunąć krew, a następnie zmień na wolny od Ca2+ bufor Pierścienia Krebsa zawierający 0,02% proteazy i 0,06% kolagenazy A (5,0 ml / serce). Inkubować serca w tym roztworze przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu wstrząsając.</li>
	<li>Po 10-15 minutach przepłukać roztwór enzymatyczny buforem Krebsa wolnym odCa2+ przez dodatkowe 5 minut. Uwolnić komórki z wiotkiej tkanki za pomocą pipety o pojemności 25 ml, kilkakrotnie pipetując zawiesinę w górę i w dół.</li>
	<li>Oddziel komórki od tkanki, filtrując przez nylonową siatkę o grubości 70 μm i pozwól im osiąść w buforze Krebs Ringer zawierającym 0,1 mM Ca2+. Zawiesić osad komórkowy w 1,0 ml buforze Krebs Ringer zawierającym 0,2 mM Ca2+.</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć 5,0 ml albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 60 μg/ml (BSA) w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml, aby oddzielić kardiomiocyty od niemiocytów i pozostawić je na 30 minut. Kardiomiocyty są cięższe i przemieszczają się na dno rurki. Ostrożnie usunąć sklarowane komórki i pożywkę. Powtórz ten krok raz, aby jeszcze bardziej oczyścić komórki.</li>
	<li>Stopniowo przemywać (etapami przy użyciu buforu zawierającego 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM i 1,0 mM Ca2+) miocyty komorowe/kardiomiocyty do buforu zawierającego 1,0 mM Ca2+ i ponownie zawiesić w pożywce ACCT składającej się ze zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco, DMEM zawierającego 2 mg/ml BSA, 2 mM L-karnityny, 5 mM kreatyny, 5 mM tauryny, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Płytki kardiomiocytów w pożywce ACCT o gęstości od 100 do 150 komórek/mm2 na plastikowych szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm lub 35 mm pokrytych lamininą lub szklanych szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 40 x 22 mm wstępnie pokrytych lamininą (1 μg/cm2). Po 1 godzinie umyj naczynia 2,0 ml ACCT, aby usunąć komórki, które nie są przyczepione. Dodać 10,0 ml świeżej pożywki i inkubować komórki.</li>
</ol>
2. Zróżnicowany interfejs powietrze-ciecz (ALI) Hodowla ludzkich komórek podstawnych nabłonka dróg oddechowych
<ol>
	<li>Kupuj ludzkie tkanki tchawicy i oskrzeli z National Disease Research Interchange zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Review Board. Pobranie komórek i przeprowadzenie hodowli z zastosowaniem opublikowanej procedury5,6. W tej procedurze wykorzystuje się hodowle komórkowe, ponieważ są one precyzyjnym modelem narażenia ludzi przez drogi oddechowe na TIC, jednak w razie potrzeby można je wyizolować i wyhodować w komórkach nabłonka dróg oddechowych myszy i/lub szczuraALI 7,8.</li>
	<li>Krótko mówiąc, zrób małe kawałki (~ 1/4 cala) tkanki po usunięciu całej tkanki łącznej i węzłów chłonnych. Umyj tkankę kilka razy w roztworze Ringera z mleczanami. Dodać tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać roztwór proteazy (1% proteazy/0,01% DNazy w minimalnych niezbędnych podłożach, MEM, stosunek tkanki do płynu (1:10)).</li>
	<li>Kołysz chusteczką w temperaturze 4 °C przez noc. Zakończ dysocjację tkanki, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej. Zeskrobać powierzchnię nabłonka skalpelem chirurgicznym i zebrać komórki przez odwirowanie (2 000 obr./min przez 10 min).</li>
	<li>Komórki płytki w pasażu pierwszym na zatrzaskach pokrytych kolagenem w specjalnym pożywce ALI przygotowanym zgodnie ze szczegółowym opisem Fulchera i wsp. 9. Hodowla przez 5 dni przed zmianą na granicę faz powietrze-ciecz (ALI) poprzez usunięcie pożywki wierzchołkowej.</li>
	<li>Karmić komórki za pomocą pożywki ALI co drugi dzień i pozwolić komórkom różnicować się przez dodatkowe 2-3 tygodnie (obserwuj liczne rzęski bijące i wydzielanie śluzu) przed wykonaniem ekspozycji. Umyj powierzchnię wierzchołkową ciepłym PBS wraz z wymianą podłoża.</li>
</ol>
3. Narażenie na chlor
<ol>
	<li>Umieścić system ekspozycji na chlor (CES) w kwalifikowanym okapie chemicznym o prędkości operacyjnej 100 fpm, który zapewnia niezbędną wtórną hermetyzację, aby zapobiec narażeniu personelu w przypadku przypadkowych wycieków chloru.</li>
	<li>Eksploatuj system pod niewielkim nadciśnieniem (0.5 cala wody). Suche powietrze jest podawane z prędkością 15 l/min i podawany jest odpowiedni poziom chloru, aby osiągnąć pożądane końcowe stężenie chloru. Komory posiadają zamykaną pokrywę z 4 zamkami mini BCU i silikonową uszczelką o niskiej twardości, która zapewnia uszczelnienie ciśnieniowe.</li>
	<li>Dostarczyć mieszaninę Cl2 przez regulator przepływu masowego. CES wykorzystuje butlę ze sprężonym gazem zawierającą 1,0% Cl2 w suchym azocie.</li>
	<li>Reguluj przepływ powietrza rozcieńczającego za pomocą specjalnie zaprojektowanego panelu sterowania i podobnie reguluj stężenie Cl2 dostarczanego do komór ekspozycyjnych. Pompa do pobierania próbek o małej objętości wciąga spaliny z komór do analizatora chloru w celu monitorowania stężeń, które są następnie rejestrowane w rejestratorze danych podłączonym do analizatora.</li>
	<li>Zmierz natężenia przepływu w komorach przed ekspozycją za pomocą przepływomierza, aby zapewnić równe natężenie przepływu i spalin.</li>
	<li>Przygotować hodowle komórkowe do ekspozycji, usuwając pożywkę sklarowaną nad osadem i dodając świeżą pożywkę (pożywki podstawno-boczne w hodowlach ALI). W tym czasie można wykonać wszelkie zabiegi wstępne za pomocą środków.</li>
	<li>Wystawić hodowle ALI komórek nabłonka dróg oddechowych na działanie gazu Cl2 (50, 100 lub 300 ppm przez 30 minut) w dwóch szczelnych komorach bioizolacyjnych polisulfonów. Kardiomiocyty (zanurzone lub zlewające się kultury na błonach) są wystawione na działanie 50 lub 100 ppm Cl2 przez 15 minut.</li>
	<li>Po ekspozycji przepłukać komory powietrzem, aż poziom Cl2 spadnie poniżej 1 ppm i będzie można go bezpiecznie otworzyć w celu usunięcia komórek (w ciągu 5 minut).</li>
</ol>
4. Pomiar transepitelialnego oporu elektrycznego (TER)
<ol>
	<li>Zmierz TER kultur powietrze-ciecz-granica, ALI, za pomocą woltoomomierza nabłonkowego z parą elektrod "pałeczkowych" chlorku srebra.</li>
	<li>Zrównoważyć elektrodę pałeczki w pożywce ALI 15 minut przed użyciem.</li>
	<li>Dodać ciepłą pożywkę do powierzchni wierzchołkowej (1,0 ml) i podstawno-bocznej (2,0 ml) i zmierzyć TER za pomocą elektrod pałeczek woltoomomierza.</li>
	<li>Zanurz krótsze ramię elektrody w ośrodku wierzchołkowym, a dłuższe ramię w ośrodku podstawno-bocznym. Kliknij przycisk "zmierz" na woltoomomierzu, aby ocenić opór elektryczny.</li>
	<li>Woltomierz ma możliwość pomiaru omów lub k omów. Odejmij oporność na podłożu hodowli bezkomórkowej od odporności mierzonej na każdej warstwie komórki, aby uzyskać oporność przeznabłonkową (TER).</li>
</ol>
5. Pomiar kaspazy
<ol>
	<li>Po ekspozycji dodać świeżą pożywkę ALI (2,0 ml) do powierzchni podstawno-bocznej i inkubować komórkę w temperaturze pokojowej. Zebrać pożywki sklarowane nad osadem po 4 i 24 godzinach.</li>
	<li>Zmierz aktywność kaspazy 3/7 w supernatantach pożywki za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania kaspazy 3/7.</li>
</ol>
6. Western Blot i immunocytochemia
<ol>
	<li>Wykonaj western blot przy użyciu lizatów komórkowych, jak opisano wcześniej10. Zawiesić lizat białkowy (20 μg) w 5-krotnie zredukowanym buforze próbki i gotować przez 5 minut. Poddaj lizat białkowy SDS-PAGE (4-15%) i przenieś oddzielone białka do membrany nitrocelulozowej za pomocą elektroforetycznego blottingu.</li>
	<li>Zablokować niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację błony z 5% mlekiem w buforze do przemywania (PBS + 0,1% detergentu) i zbadać błony pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko SERCA2 lub aktynie sarkomerowej w rozcieńczeniu 1:1 000, przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj i inkubuj błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą i rozwiń do wykrywania, jak opisano wcześniej10, używając dostępnego w handlu zestawu do wykrywania peroksydazy.</li>
	<li>Do celów immunocytochemicznych żywe komórki wyhodowane na wkładkach lub szklanych szkiełkach nakrywkowych na płytkach 6-dołkowych należy traktować 0,4% Triton-X-100 w 10 mM buforze cytrynianu sodu przez 20 minut po spłukaniu PBS.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne wiązanie, traktując komórki 5% surowicą osła przez 20 minut, a następnie inkubuj komórki z niespecyficznymi IgG lub indywidualnymi przeciwciałami pierwszorzędowymi specyficznymi dla aktyny sarkomerowej lub Ki-67.</li>
	<li>Przemyć komórki PBS i inkubować z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi w celu wykrycia przeciwciała pierwszorzędowego i barwienia jądrowego (1 μg/ml DAPI).</li>
	<li>Umyć PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe za pomocą dostępnych na rynku nośników montażowych.</li>
	<li>Wizualizuj barwienie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Mohan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+accidental+exposure+to+chlorine+gas%3A+clinical+presentation%2C+pulmonary+functions+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Chest+Dis+Allied+Sci%22%5BJournal%5D)">Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes.</a> Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).</li>
<li>Kose, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction%2C+acute+ischemic+stroke%2C+and+hyperglycemia+triggered+by+acute+chlorine+gas+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation.</a> Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).</li>
<li>Das, R., Blanc, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+gas+exposure+and+the+lung%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Ind+Health%22%5BJournal%5D)">Chlorine gas exposure and the lung: a review.</a> Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).</li>
<li>Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+the+terminally+differentiated+adult+cardiac+muscle+cell%3A+a+light+and+scanning+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study.</a> Dev Biol. 80, 466-482 (1980).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+suppresses+sarcoplasmic%2Fendoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPase+expression+in+cystic+fibrosis+airways%3A+role+in+oxidant-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death.</a> Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+signals+airway+epithelial+basal+cell+survival+via+coagulation+and+protease-activated+receptor+isoforms+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).</li>
<li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air+liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+tracheal+basal+cells+to+ciliated+cells+and+tissue+reconstruction+on+the+synthesized+basement+membrane+substratum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro.</a> Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).</li>
<li>Fulcher, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Med. , 107-183 (2005).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA2+regulates+non-CF+and+CF+airway+epithelial+cell+response+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone.</a> PloS One. 6, e10(2011).</li>
<li>Martin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine-induced+injury+to+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Chlorine-induced injury to the airways in mice.</a> Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).</li>
<li>Evans, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Chlorine: state of the art.</a> Lung. 183, 151-167 (2005).</li>
<li>Vliet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+nitrogen+species+during+peroxidase-catalyzed+oxidation+of+nitrite.+A+potential+additional+mechanism+of+nitric+oxide-dependent+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity.</a> J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cells+release+ATP+during+ozone+exposure%3A+signaling+for+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival.</a> Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).</li>
<li>Allen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+exposure+of+cultured+cells+and+other+materials+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal+Toxicol%22%5BJournal%5D)">An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone.</a> Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najczęstszy rodzaj ostrej toksyczności występuje, gdy wdycha się trującą substancję chemiczną do płuc. Te substancje chemiczne mogą być również szybko wchłaniane do krwiobiegu i mogą wpływać na inne narządy, takie jak mózg i serce. Toksyczność inhalacyjna różnych czynników wykorzystujących modele zwierzęce jest szeroko badana i opisywana, jednak mechanizmy są mniej poznane. Jest to główna przeszkoda w opracowywaniu skutecznych terapii. Brak systemów ekspozycji in vitro jest główną przyczyną braku wglądu mechanis...

Narażenie na toksyczne wdychane chemikalia (TIC)/gazy, takie jak chlor (Cl2), pozostaje ciągłym problemem zdrowotnym w przypadku przypadkowych ekspozycji, jak również w ich potencjalnym użyciu jako czynnika zagrożenia chemicznego. Chociaż płuca są głównym celem, narządy takie jak serce i mózg są również dotknięte1-3. Modele in vivo są zazwyczaj stosowane do badania toksyczności spowodowanych przez TIC, ale testy in vitro do oceny toksyczności są prostsze, szybsze i bardziej opłacalne. Modele in vitro pozwalają również na szeroko zakrojone badania interakcji czynnik-komórka, które mogą być trudne do oceny in vivo. Takie systemy ekspozycji in vitro są rzadkie, a ponadto w niektórych konwencjonalnych modelach, w których czynniki toksyczne są dodawane do pożywki, w której zanurzone są komórki, właściwości czynników mogą się zmieniać w wyniku interakcji i wiązania się ze składnikami pożywki. W takich scenariuszach obiecujące mogą być systemy hodowli komórkowych, takie jak hodowle na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) pierwotnych komórek nabłonka ludzkich dróg oddechowych, które mogą być bezpośrednio narażone na działanie czynników gazowych.
Komórki nabłonkowe wyściełające drogi oddechowe są pierwszą linią obrony przed wdychanymi toksycznymi substancjami chemicznymi. Ludzki nabłonek dróg oddechowych tworzy fizyczną barierę między światłem a leżącymi poniżej komórkami w płucach i uczestniczy w odpowiedzi płuc. Wytwarza szereg cytokin i innych czynników pro- i przeciwzapalnych, a także wydziela śluz/płyn powierzchniowy dróg oddechowych (ASL) pokrywający nabłonek. Jednym z ograniczeń konwencjonalnych zanurzonych systemów hodowli in vitro jest również to, że ASL i śluz pokrywający powierzchnię nabłonka są usuwane lub rozcieńczane. Nie odzwierciedla to stanu fizjologicznego komórek nabłonka płuc, które są wystawione na działanie powietrza. W związku z tym idealny system in vitro do badania toksyczności TIC powinien odzwierciedlać tę architekturę. Istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem szybkich metod badań przesiewowych, które przewidują toksyczność in vivo. Komórki nabłonkowe wyhodowane w ALI różnicują się i mają dobrze zróżnicowane struktury i funkcje w porównaniu z komórkami hodowanymi w zanurzeniu i służą lepszemu modelowi dróg oddechowych.
W tym badaniu opisujemy użycie hodowli interfejsu powietrze-ciecz ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych (tchawiczo-oskrzelowych) do testowania toksyczności trującego wdychanego gazu i porównujemy go z zanurzoną hodowlą komórkową kardiomiocytów, badając w ten sposób kolejny ważny cel toksyczności.

<table><tbody><tr><td>Szczury</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Sprague-Dawley&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorine</td><td>AirGas, Inc</td><td>X02NI99CP163LS1</td><td></td></tr><tr><td>zestaw kaspazy 3/7&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>Woltoomomierz nabłonkowy i elektroda pałeczka</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM i STX2</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki Snapwell</td><td>Corning</td><td>07-200-708</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek nylonowych 70 mikronów</td><td>Corning</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Komory bioizolacyjne polisulfonowe&nbsp;</td><td>BCU, Allentown Cage Equipment BCU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało sarkomeryczne aktyny</td><td>Abcam Cambridge, MA</td><td>ab28052</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SERCA2</td><td>Bioodczynniki powinowactwa, złote, CO</td><td>MA3-9191</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Ki-67</td><td>Dako, Carpinteria, CA</td><td>M7248</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone Alexa 488</td><td>Invitrogen, Grand Island, Nowy Jork</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Karnityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Kreatynina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6257</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Dzwonka Krebsa</td><td>Proteaza Sigma-Aldrich</td><td>K4002</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DNAaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Mleczanowy roztwór Ringera</td><td>Abott Laboratories</td><td>7953</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Fisher Scientific</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>4-15% żele SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Dergent, Tween&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania peroksydazy</td><td>Pierce</td><td>3402</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe, Fluormount G</td><td>eBiosciences</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD nauki biologiczne</td><td>354259</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Technologie życia</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>200-6140AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

metody in vitro model hodowli komórkowej do badań toksycznych substancji chemicznych wdychanych

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Hodowle komórkowe są niezbędne do opracowania i zbadania skuteczności środków terapeutycznych, przed ich użyciem w modelach zwierzęcych. Posiadamy unikalną zdolność do modelowania dobrze zróżnicowanych komórek ludzkiego nabłonka dróg oddechowych i mięśnia sercowego. Może to być nieocenione narzędzie do badania szkodliwych skutków toksycznych wdychanych substancji chemicznych, takich jak chlor, które normalnie mogą wchodzić w interakcje z powierzchnią komórek i tworzyć różne produkty uboczne w reakcji z wodą i ograniczać ich skutki w zanurzonych kulturach. Nasz model wykorzystujący dobrze zróżnicowane hodowle komórek nabłonka ludzkich dróg oddechowych na granicy powietrze-płyn omija to ograniczenie, a także daje możliwość oceny krytycznych mechanizmów toksyczności potencjalnie trujących wdychanych substancji chemicznych. Opisujemy zwiększoną utratę integralności błony, uwalnianie kaspazy i śmierć po toksycznym wdychanym substancjach chemicznych, takich jak narażenie na chlor. W tym artykule proponujemy metody modelowania ekspozycji na chlor w komórkach nabłonka serca i dróg oddechowych ssaków w hodowli oraz proste testy oceniające jego wpływ na te typy komórek.

Pierwotne pręcikowate kardiomiocyty przytwierdzają się do matryc lamininy, rozprzestrzeniają i różnicują w kultury konfluentne (Rycina 1A oraz jej powiększenie). Komórki te zostały dodatkowo scharakteryzowane na podstawie ekspresji aktyny sarkomerowej oraz SERCA2 (Ryciny 1B i 1C). Kardiomiocyty szczura są bardzo podatne na toksyczność chloru, ponieważ 15 min ekspozycji na 100 ppm chloru spowodowało rozległe zaokrąglenie i śmierć komórek w kulturach zanurzonych oraz przer...

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie metody ekspozycji kultur komórkowych na wdychane toksyczne chemikalia. Narażenie zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz (ALI) komórek nabłonka dróg oddechowych zapewnia unikalny model narażenia dróg oddechowych na toksyczne gazy, takie jak chlor. W niniejszej pracy opisano wpływ ekspozycji na chlor na hodowle komórek nabłonka i zanurzonych kultur kardiomiocytów na granicy faz powietrze-ciecz. Systemy ekspozycji in vitro umożliwiają przeprowadzenie ważnych badań mechanistycznych w celu oceny szlaków, które można następnie wykorzystać do opracowania nowych środków terapeutycznych.

Metody in vitro Model hodowli komórkowej do badań toksycznych substancji chemicznych wdychanych

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zaobserwowanie efektu narażenia na chlor w modelach hodowli komórkowych in vitro płuc, dróg oddechowych i serca. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę kardiomiocytów szczura lub ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych. Hodowle kardiomiocytów szczura zostaną poddane działaniu chloru w celu oceny toksyczności chloru względem organów życiowych, takich jak serce, natomiast narażenie zróżnicowanych hodowli ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych na chlor pozwala na dalsze modelowanie ekspozycji ludzi na toksyczne gazy.Ostatecznie można zmierzyć uwalnianie kaspazy 3 i 7 oraz transepitelialny opór elektryczny, aby odpowiednio określić apoptyczną śmierć kardiomiocytów oraz przerwanie ciągłości błony i śmierć komórek nabłonka dróg oddechowych człowieka. Główną zaletą tej metody jest wykorzystanie pierwotnych kultur komórek tkankowych zamiast całych zwierząt, co umożliwia zastosowanie prostej metody testowania chemicznego in vitro. Wskazówka cztery: przeprowadź eksperymenty z ekspozycją na chlor.System ekspozycji na chlor musi znajdować się w certyfikowanej dygestorium chemicznym o operacyjnej prędkości przepływu powietrza 100 FPM przed rozpoczęciem ekspozycji. Najpierw należy ustawić system na lekkie nadciśnienie wynoszące pół cala słupa wody, a następnie wprowadzić suche powietrze i odpowiedni poziom chloru do systemu z prędkością 15 liters per minute za pomocą kontrolera przepływu masowego; system ekspozycji na chlor wykorzystuje butlę z gazem sprężonym zawierającą 1% chloru w suchym azocie. Następnie należy zablokować pokrywę komory za pomocą czterech zamków jednostki zabezpieczającej mini biocon i silikonowej uszczelki o niskiej twardości w celu zapewnienia szczelności ciśnieniowej.Następnie, korzystając z dedykowanego panelu sterowania przepływem, należy uregulować przepływ powietrza rozcieńczającego oraz stężenie chloru w komorach ekspozycyjnych. Pompa próżniowa o małej wydajności zasysa powietrze wylotowe z komór do analizatora chloru w celu monitorowania stężeń, które są następnie rejestrowane przez rejestrator danych podłączony do analizatora. Przed ekspozycją należy użyć przepływomierza do pomiaru natężenia przepływu wewnątrz komór, aby zapewnić równy dopływ i odpływ powietrza.Następnie usuń supernatant z hodowli badanych komórek i dodaj do nich świeżą pożywkę. Po tym czasie poddaj hodowle komórkowe działaniu chloru w odpowiednim stężeniu PPM i przez określony czas ekspozycji w dwóch szczelnych komorach Biocon do treści komórkowych.Po ekspozycji należy przepłukać komory powietrzem przez około pięć minut, aż poziom chloru spadnie poniżej 1 PPM, co umożliwi bezpieczne otwarcie układu i wyjęcie komórek. W celu pomiaru transepithelialnej oporności elektrycznej kultur komórek eksponowanych na chlor, należy użyć omometru epitelialnego z parą elektrod w kształcie pałeczek z chlorku srebra. Najpierw należy poddać elektrody równoważeniu w medium do interfejsu powietrze-ciecz na 15 minut przed użyciem.Następnie dodaj 1 ml ciepłej pożywki na powierzchnię apikalną oraz 2 ml na powierzchnię basolateralną hodowli komórkowej. Teraz zanurz krótsze ramię elektrody w pożywce apikalnej, a dłuższe ramię w pożywce basolateralnej i kliknij przycisk pomiaru na woltomierzu, aby ocenić oporność elektryczną. Następnie, aby określić transepitelialną oporność elektryczną, odejmij oporność zmierzoną na podłożu hodowlanym pozbawionym komórek od oporności zmierzonej dla każdej warstwy komórek.Pierwotne, surowe uformowane kardiomiocyty przytwierdzają się, rozprzestrzeniają i różnicują na matrycach lamininy w konfluencyjne kultury. W tym reprezentatywnym eksperymencie kardiomiocyty RAC zostały dodatkowo scharakteryzowane pod kątem aktyny sarkomerycznej oraz ekspresji circa two. Kardiomiocyty szczura są bardzo podatne na toksyczność chloru. 15-minutowa ekspozycja na 100 PP M chloru powoduje rozległe zaokrąglenie i śmierć komórek w kulturach zanurzonych oraz rozpad konfluencyjnych warstw komórek obserwowanych na membranach pokrytych lamininą.Komórki wykazują również nasiloną apoptotyczną śmierć komórkową, o czym świadczy uwalnianie kaspazy 3 i 7 w kardiomiocytach hodowanych na insertach. Na kolejnych rysunkach przedstawiono reprezentatywny eksperyment z zróżnicowanym nabłonkiem dróg oddechowych człowieka poddanym działaniu chloru.Ekspozycja nabłonka dróg oddechowych człowieka na chlor powoduje złuszczanie i odrywanie się błon komórkowych zarówno przy niskich, jak i wysokich stężeniach; uszkodzenia wywołane niskim stężeniem chloru są szybko odwracane. Jednak w komórkach eksponowanych na wyższe stężenia chloru zdolność do regeneracji po ekspozycji na gaz jest opóźniona lub nieobecna, co zaobserwowano podczas inspekcji wizualnej lub oceny proliferacji komórek za pomocą barwienia KI 67. Pomiary oporności elektrycznej nabłonka (TEER) oraz aktywności kaspaz dodatkowo potwierdzają te wyniki i dostarczają dowodów na utratę integralności błon oraz apoptyczną śmierć komórek po ekspozycji na chlor. Zatem badania te opisują opracowanie systemu ekspozycji na chlor in vitro, który po jego wdrożeniu powoduje utratę integralności błon oraz śmierć komórek nabłonka dróg oddechowych i kardiomiocytów.Technika ta utorowała drogę badaczom do zgłębiania mechanizmów uszkodzeń wywoływanych przez gazy trujące w złożonych narządach, takich jak płuca i serce.

in-vitro-cell-culture-model-for-toxic-inhaled-chemical-testing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

In vitro Model kultury komórkowej do testowania toksycznych chemikaliów wdychanych

Celem tego protokołu jest wystawienie ludzkich organotypowych 3D modeli tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt dymu papierosowego (CS) na granicy powietrze-ciecz. Wpływ CS na tkanki jest następnie badany za pomocą testu aktywności cytochromu P450, pomiaru bicia rzęsek i podejścia opartego na biologii systemowej.

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Na całym świecie rośnie liczba użytkowników elektronicznych papierosów (e-papierosów). Niewiele jednak wiadomo na temat skutków zdrowotnych wywoływanych przez wdychane aerozole do e-papierosów. W tym artykule opisano technikę wytwarzania aerozolu w e-papierosach odpowiednią do narażenia zwierząt i późniejszych badań toksykologicznych. Takie protokoły są wymagane do ustanowienia eksperymentalnie odtwarzalnych i znormalizowanych systemów ekspozycji na e-papierosy.

Wytwarzanie aerozolu z papierosów elektronicznych przez urządzenie do waporyzacji maszynowej trzeciej generacji: zastosowanie do badań toksykologicznych

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzania przenośnych ekspozycji aerozoli komórkowych i mierzenia odpowiedzi komórkowej. W metodzie wykorzystuje się komórki hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, naśladując fizjologię in vivo. Odpowiedź komórkową na aerozole z nanocząstek miedzi obserwowano jako stres oksydacyjny poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i cytotoksyczność jako uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej.

Nowa przenośna kaseta do naświetlania in vitro do pobierania próbek aerozoli

Prezentujemy solidny, przenośny i predykcyjny system ekspozycji in vitro do badania i monitorowania cząstek unoszących się w powietrzu pod kątem ich ostrej cytotoksyczności płucnej poprzez eksponowanie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy powietrze-ciecz (ALI).

Ocena ostrej toksyczności inhalacyjnej cząstek unoszących się w powietrzu poprzez wystawienie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy faz powietrze-ciecz

Prezentowany tutaj jest protokół pierwotnej izolacji monocytów ludzkiej krwi, jak również ich różnicowania na makrofagi i komórki dendrytyczne oraz łączenia z komórkami nabłonkowymi w wielokomórkowy model ludzkiego płuca. Porównano reakcje biologiczne kokultur złożonych z komórek odpornościowych zróżnicowanych ze świeżo wyizolowanych lub rozmrożonych monocytów, po ekspozycji na bodźce prozapalne.

Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Opisana jest metoda hodowli komórkowej i ekspozycji modelu oskrzelowego in vitro dla realistycznej, powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki do testów toksyczności.

Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Ustanawiamy ustandaryzowany model in vitro do badania ekspozycji na opary konopi na granicy powietrza i cieczy. Model ten zapewnia systematyczne podejście do badania wpływu waporyzowanej marihuany, odpowiadając na rosnące zainteresowanie waporyzatorami z konopi indyjskich jako alternatywą dla palenia.

Metody in vitro Narażenie komórek nabłonka płuc na działanie konopi indyjskich na granicy faz powietrze-ciecz

Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Poznaj metodę ekspozycji komórek na chlor w modelach in vitro płuc, dróg oddechowych i serca. Technika ta umożliwia badanie toksyczności gazów na komórkach szczura i człowieka bez użycia zwierząt.

Metody in vitro Model hodowli komórkowej do badań toksycznych substancji chemicznych wdychanych

Przeglądaj więcej filmów