Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez pierwszą hybrydyzację dwóch oligonukleotydów, które zostały zaprojektowane w celu utworzenia sondy tworzącej spinkę do włosów, znanej jako metryka proporcji za pomocą latarni molekularnej. Drugim krokiem jest oczyszczenie metryki proporcji za pomocą latarni molekularnych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Następnie metryka proporcji za pomocą latarni molekularnych jest wprowadzana do komórek wyrażających zmodyfikowany cel RNA za pomocą mikroporionu. Ostatnim krokiem jest umieszczenie komórek w płytce mikrodołkowej nadającej się do mikroskopii żywych komórek. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do monitorowania ruchów poszczególnych transkryptów RNA wizualizowanych jako jasne fluorescencyjne plamy w pojedynczych komórkach.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona syntetyczne sondy, które są jasne, fotostabilne i wykazują wysoki sygnał do tła, co otwiera możliwość obrazowania dowolnego endogennego RNA Przygotowanie metryki proporcji za pomocą latarni molekularnych lub RBM BS należy rozpocząć od zmieszania następujących odczynników w probówce. 20 mikrolitrów Rbm B jeden 30 mikrolitrów Rbm B dwa sześć mikrolitrów 10 x bufor fosforanowy, i cztery mikrolitry wolnej wody DNA i RNA. Jest to zazwyczaj wystarczające dla około 50 badań.

Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W międzyczasie przygotuj kolumnę do chromatografii cieczowej w celu usunięcia wszelkich zhybrydyzowanych przez UN oligonukleotydów RBM B. Użyj 75 super pokładów klasy przygotowawczej w ośmiomililitrowej kolumnie do chromatografii cieczowej o objętości łoża około czterech mililitrów za pomocą pompy strzykawkowej pracującej z natężeniem przepływu 0,6 mililitra na minutę.

Przemyć i zrównoważyć SUEx około 50 mililitrami jednego buforu fosforanowego x, zanim cały płyn dostanie się do objętości złoża. Zatrzymać pompę strzykawkową, odłączyć ją i pozwolić, aby pozostały płyn przeszedł przez kolumnę grawitacyjnie. Następnie załadować mieszaninę RBMB do kolumny chromatograficznej.

Po całkowitym wprowadzeniu próbki RBMB do złoża, powoli dodaj kolejne 250 mikrolitrów jednego buforu fosforanowego na wierzch złoża, aby upewnić się, że cała próbka całkowicie weszła do kolumny. Napełnij kolumnę do krawędzi jednym buforem fosforanowym x. Zamknij pokrywę i uruchom pompę strzykawkową.

Strzykawka jest wypełniona około 50 mililitrami jednego XPBS i działa z natężeniem przepływu 0,6 mililitra na minutę. Zazwyczaj próbka RBMB może być łatwo zwizualizowana ze względu na kolor barwnika zawartego w sondzie. Gdy RBMB zbliży się do dna kolumny, zebrać przepływ w dwóch kroplach na probówkę mikrowirówki.

Przestań pobierać próbkę. Gdy kolor próbki w mikroprobówkach wirówkowych stanie się wyraźny, połącz probówki zawierające kolorową próbkę RBMB, zwykle od pięciu do sześciu probówek i załaduj do odśrodkowego urządzenia filtrującego. Odwirować próbkę w temperaturze 10 000 RCF przez 20 minut lub do uzyskania żądanej objętości.

Ta prędkość i czas zazwyczaj dają końcową objętość około 30 mikrolitrów. W tym protokole linia komórkowa ludzkiego mięsaka włóknistego została zaprojektowana do ekspresji Q-F-P-R-N-A z 96 tandemowymi powtórzeniami sekwencji docelowej RBMB w trzech głównych UTR, linia komórek kontrolnych została zaprojektowana do ekspresji Q-F-P-R-N-A typu dzikiego na dzień przed komórkami płytki dostarczającej sondę w kolbie T 25 przy kulturze o płynności 40 do 50%. Komórki z pożywką DMEM uzupełniono 1% paciorkowcem pen i 10% płodową surowicą bydlęcą i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla następnego dnia.

Włącz mikro por i ustaw parametry mikro portracji zoptymalizowane dla ogniw HT 10 80. Napełnij rurkę mikro porionową czterema mililitrami buforu elektrolitycznego i umieść ją na stacji mikroprzygotowania. Rozmrozić próbkę podstawową oczyszczonego RBMB i rozcieńczyć kilka mikrolitrów do końcowego stężenia 12 mikromoli za pomocą jednego buforu fosforanowego.

Na każdy mikro porion potrzebny jest jeden mikrolitr. Dla każdej reakcji mikroporionowej odpipetować jeden mililitr pożywki hodowlanej z FBS, ale bez antybiotyków, do mikroprobówki wirówkowej. Odłóż go na bok w pobliżu urządzenia z mikro porionem.

Będzie on później używany do zawieszania komórek bezpośrednio po mikroprzygotowaniu. Nie stosuje się antybiotyków, ponieważ zmniejszyłyby one żywotność komórek po mikroprzygotowaniu. Zmodyfikowane ogniwa HT 10 80 posiane poprzedniego dnia powinny teraz zlewać się w 60 do 80

Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i umyj komórki raz jednym mililitrem DPBS bez wapnia i magnezu, inkubuj z jednym mililitrem trypsyny przez jedną do dwóch minut. Zatrzymaj trypsynę, dodając jeden mililitr pożywki DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą bez antybiotyków i czerwieni fenolowej i przenieś komórki do dwóch 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. Obracaj komórki w mikroprobówce wirówkowej 200 razy G przez pięć minut.

Usunąć zawiesinę supernatantu i połączyć granulki komórek w końcową objętość jednego mililitra DPBS. Usuń 10 mikrolitrów z dobrze wymieszanej zawiesiny komórek, aby policzyć komórki, kilkakrotnie pipetuj komórki w górę iw dół, aby upewnić się, że są dobrze rozproszone i przenieś 300 000 komórek za pomocą DPBS do nowej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Obracaj z prędkością 200 razy G przez pięć minut.

Usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad w 11 mikrolitrach zawiesiny Resus, buforować i pipetować w górę iw dół kilka razy, aby upewnić się, że komórki są dobrze rozproszone. Pamiętaj, aby nie generować żadnych pęcherzyków powietrza.

Dodać jeden mikrolitr rozcieńczonego RBMB i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Ponownie należy uważać, aby nie generować żadnych pęcherzyków powietrza. Bardzo ważne jest, aby unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do zawieszenia sprzedaży RBMB, ponieważ pęcherzyki powietrza spowodują iskrę podczas mikrooperacji i spowodują słabe dostarczanie RBMB i śmierć komórek.

Za pomocą pipety do mikropreparatyki odessać 10 mikrolitrów mieszaniny komórek RBMB i włożyć pipetę do rurki do mikropreparatyki. Naciśnij przycisk start, aby uruchomić mikrokorporację. W końcówce nie powinno być widocznych pęcherzyków powietrza, gdy ekran mikro pora pokazuje zakończenie.

Wyjąć pipetę ze stacji i wylać mieszaninę 10 mikrolitrów do wcześniej przygotowanej probówki mikrowirówki zawierającej jeden mililitr pożywki hodowlanej z FBS, ale bez antybiotyków delikatnie wymieszanych, kilkakrotnie kołysząc probówką na boki. Obracaj komórki 200 razy G przez pięć minut. Umyj komórki dwukrotnie w jednym mililitrze pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej za pomocą FBS, ale bez antybiotyków w celu usunięcia wszelkich BS rbm, które nie zostały dostarczone do komórek.

Po drugim praniu. Resus zawiesić komórki w 400 mikrolitrach pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej z FBS, ale bez antybiotyków. Umieść mikro proporcjonalne komórki w wcześniej przygotowanym szkle nakrywkowym pokrytym poli delizyną z ośmioma dobrze komorowymi szkłem nakrywkowym w ilości 200 mikrolitrów na studzienkę lub przy pożądanej płynności kogeneracji.

Umieścić szklaną pokrywę z komorą w inkubatorze do hodowli komórkowych. Obrazowanie można wykonać już po 30 minutach od mikroprzygotowania. Aby rozpocząć tę procedurę, włącz system inkubacji górnej fazy żywej komórki i zrównoważ go, aż osiągnie 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 75% wilgotności.

Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła, a następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu metamorficznego. Nałóż olejek immersyjny na obiektyw. Przenieś komorę na szkło nakrywkowe z komórkami o mikroporach do etapu żywej komórki.

Najlepszy system inkubacji. Inkubuj górny system sceny, aż temperatura i poziom dwutlenku węgla ustabilizują się. Otwórz zakładkę pobierania w oprogramowaniu metamorph.

Kliknij przycisk pokaż na żywo, aby znaleźć pole. Dostosuj ostrość w białym świetle i kliknij przycisk zatrzymania na żywo. Na karcie pozyskiwania.

Kliknij i otwórz wyskakujący przycisk pobierania strumienia i ustaw żądane parametry pozyskiwania filmu. Uchwyć 150 klatek za pomocą filtra SCI five CF six 40 R. Zapisz obrazy na dysku twardym.

Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy komórek HT 10 80 stabilnie eksprymujących RNA z 96 powtórzeniami tandemowymi lub czterema powtórzeniami tandemowymi miejsca wiązania RBMB w trzech głównych UTR. Po dostarczeniu mbs do wnętrza komórki. Obecność 96 powtórzeń tandemowych pozwala poszczególnym transkryptom RNA wyglądać jak jasne fluorescencyjne plamy.

W przeciwieństwie do tego, RNA zawierające tylko cztery powtórzenia tandemowe wydają się być bardzo słabymi plamami fluorescencyjnymi i często są wykrywalne tylko w obszarach o wyjątkowo niskim tle. Akwizycja obrazów strumieniowych pozwala na obrazowanie poszczególnych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym. Poszczególne transkrypty RNA można łatwo zobaczyć w cytoplazmie i jądrze komórek przechodzących ruchy brownowskie lub subdyfuzyjne

W rzadkich przypadkach obserwuje się RNA poddawane ukierunkowanemu transportowi, jak pokazano tutaj. Transkrypty RNA poddawane ukierunkowanemu transportowi zazwyczaj poruszają się szybko po prostej ścieżce. W tym montażu trajektoria transkryptu RNA jest pokazana nałożona na pojedynczą klatkę szeregu czasowego.

Ukierunkowane ruchy RNA są zgodne z transportem RNA wzdłuż mikrotubul i mikrofilamentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i oczyścić metrykę rasową za pomocą latarni molekularnych. Dostarcz metrykę rasową za pomocą molekularnych latarni do komórek za pomocą mikroparionu i zobrazuj pojedyncze transkrypty RNA za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.