Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Poznaj metodę obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych. Technika ta umożliwia monitorowanie dynamiki RNA w czasie rzeczywistym dzięki fluorescencyjnej mikroskopii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation CAREER Award (0953583) oraz National Institute of Health NCI/R21-CA116102, NCI/R21-CA125088, NIBIB/R01-EB012065, NCI/R01-CA157766.

W tym protokole, jeden oligonukleotyd (RBMB1) został oznaczony na swoim końcu 5' barwnikiem reporterowym CF640R i ma sekwencję: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mMMMMMGG mCmAmG mCmAmC mUmU-3'. Domeny samouzupełniające się, które napędzają tworzenie struktury spinki do włosów, są pogrubione. Drugi oligonukleotyd (RBMB2) został oznaczony na końcu 3' wygaszaczem Iowa Black RQ-Sp i ma sekwencję: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.
1. Przygotowanie RBMB
<ol>
	<li>Wykonaj szybkie wirowanie probówek zawierających oligonukleotydy RBMB1 i RBMB2, aby upewnić się, że wysuszony oligonukleotyd znajduje się na dnie probówki, a następnie ponownie zawieś w wodzie wolnej od DNaz i RNaz do końcowego stężenia 100 μM. Na przykład próbkę oligonukleotydu o masie 10 nmoli należy zawiesić w 100 μl wody.</li>
	<li>Zmierz dokładne stężenie podstawowych próbek RBMB1 i RBMB2 za pomocą spektroskopii UV-vis.
	<ol>
		<li>Zmieszać 3 μl próbki RBMB ze 117 μl DPBS (bez wapnia i magnezu) w probówce do mikrowirówki.</li>
		<li>Ślepą próbę spektrofotometru za pomocą DPBS i zmierzyć absorbancję w zakresie 200-800 nm. Uwaga: Szczytowe absorbancje przy 260 nm i 650 nm powinny być widoczne.</li>
		<li>Obliczyć stężenie podstawowe próbek RBMB na podstawie absorbancji przy 260 nm (lub 650 nm dla RBMB1), stosując równanie: 
		Stężenie podstawowe (M) = A260* współczynnik rozcieńczenia/współczynnik ekstynkcji, gdzie A260 to absorbancja przy 260 nm, a współczynnik rozcieńczenia wynosi 40. 
		Uwaga: Współczynnik ekstynkcji dla RBMB można znaleźć w arkuszu specyfikacji dostarczonym przez producenta oligonukleotydów. Współczynnik ekstynkcji CF640R przy 650 nm wynosi 103 000.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieszać 20 μl 100 μM RBMB1, 30 μl 100 μM RBMB2, 6 μl 10x buforu fosforanowego (10x bufor fosforanowy: 480 mM K2HPO4, 45 mM KH2PO4, 140 mM NaH2PO4, pH 7,2) i 4 μl wody wolnej od DNaz i RNaz. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Uwaga: Zazwyczaj wystarcza to na około 50 badań.</li>
	<li>Przygotować kolumnę do chromatografii cieczowej przy użyciu 75 stopnia przygotowawczego Superdex w celu usunięcia wszelkich niezhybrydyzowanych oligonukleotydów RBMB2. Użyj kolumny do chromatografii cieczowej o pojemności 8 ml (0,7 x 20 cm) z objętością złoża ~4 ml, aby oczyścić małą objętość zmieszanych sond.</li>
	<li>Umyj i zrównoważ Superdex z ~ 50 ml 1x buforu fosforanowego za pomocą pompy strzykawkowej pracującej z przepływem o natężeniu przepływu 0,6 ml / min. Zanim cały płyn dostanie się do objętości złoża, zatrzymaj pompę strzykawkową, odłącz ją i pozwól pozostałej cieczy przejść przez kolumnę grawitacyjnie.</li>
	<li>Umieścić mieszaninę RBMB (60 μl) na kolumnie chromatograficznej.
	<ol>
		<li>Po całkowitym wprowadzeniu próbki RBMB do złoża, powoli dodaj kolejne 250 μl 1x buforu fosforanowego na wierzch złoża, aby upewnić się, że cała próbka całkowicie weszła do kolumny.</li>
		<li>Napełnij kolumnę do krawędzi 1x buforem fosforanowym. Zamknij górną część i uruchom pompę strzykawkową - strzykawkę należy napełnić ~50 ml 1x PBS i pracować z natężeniem przepływu 0,6 ml/min.</li>
		<li>Gdy RBMB zbliży się do dna kolumny – próbka RBMB może być zazwyczaj łatwo zwizualizowana ze względu na kolor barwnika wbudowanego w sondę – zebrać przepływ w ilości 2 kropli na probówkę mikrowirówki (1,5 ml). Przestań pobierać próbkę, gdy kolor w probówkach do mikrowirówek stanie się przezroczysty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz probówki zawierające kolorową próbkę RBMB - zwykle 5-6 probówek - i załaduj do odśrodkowego urządzenia filtrującego (odcięcie 10 000 MW). Odwirować próbkę przy 10 000 RCF przez 20 minut lub do uzyskania żądanej objętości. Uwaga: Te prędkości i czasy zazwyczaj dają końcową objętość ~30 μl.</li>
	<li>Zmierzyć dokładne stężenie oczyszczonej próbki RBMB za pomocą spektroskopii UV-Vis.
	<ol>
		<li>Pobrać 3 μl zagęszczonej próbki RBMB i wymieszać ze 117 μl DPBS w probówce do mikrowirówki.</li>
		<li>Ślepą próbę spektrofotometru za pomocą DPBS i zmierzyć absorbancję w zakresie 200-800 nm. Uwaga: Szczytowe absorbancje przy 260 nm i 650 nm powinny być widoczne.</li>
		<li>Obliczyć stężenie podstawowe zhybrydyzowanego RBMB na podstawie absorbancji przy 650 nm, stosując równanie: 
		Stężenie podstawowe (M) = A650* współczynnik rozcieńczenia/współczynnik eksptyczności, gdzie A650 to absorbancja przy 650 nm, współczynnik rozcieńczenia wynosi 40. 
		Uwaga: Współczynnik ekstynkcji dla CF640R przy 650 nm wynosi 103 000, a współczynnik ekstynkcji dla Iowa Black RQ wynosi ~20 000. Współczynniki ekstynkcji są addytywne i nie są wrażliwe na hybrydyzację. W związku z tym podstawowa próbka RBMB ma łączny współczynnik ekstynkcji wynoszący około 123 000 przy 650 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć probówkę odpowiednią nazwą i stężeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 8-dołkowego szkła nakrywkowego z poli-d-lizyną
<ol>
	<li>Przygotować roztwór poli-D-lizyny o stężeniu 0,2 mg/ml, rozpuszczając 5 mg poli-D-lizyny (liofilizowany proszek, napromieniowany g) w 25 ml wysterylizowanej wody w sterylnym środowisku.</li>
	<li>Dodać 200 μl 0,2 mg/ml roztworu poli-D-lizyny do każdego dołka 8-dołkowego szkła nakrywkowego, w sterylnym środowisku.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 16-18 godzin w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odessać poli-D-lizynę i umyć studzienkę 3 razy sterylną wodą destylowaną. Uwaga: Powlekane szkiełka komorowe można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Dostarczenie sondy
Uwaga: Używany system komórkowy powinien zawierać zintegrowany konstrukt genu, który wyraża RNA z co najmniej 4 sekwencyjnymi miejscami wiązania RBMB w regionie 3' bez translacji (UTR). Sekwencje docelowe powinny być komplementarne w stosunku do pętli RBMB. Zaleca się, aby w ramach kontroli negatywnej ta sama linia komórkowa została zmodyfikowana w celu ekspresji tego samego konstruktu genu, ale bez powtórzeń tandemowych. W tym protokole ludzka linia komórkowa włókniakomięsaka, HT1080, została zaprojektowana do ekspresji gfp RNA z 96-tandemowymi powtórzeniami sekwencji docelowej RBMB w 3'-UTR. Kontrolna linia komórkowa została zaprojektowana do ekspresji RNA gfp typu dzikiego.
<ol>
	<li>Płytki w kolbie T25 przy zbiegu 40-50% na dzień przed podaniem sondy. Hodować komórki za pomocą pożywki DMEM uzupełnionej 1% pióra/paciorkowca i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . </li>
	<li>Następnego dnia włącz mikroporator i ustaw parametry mikroporacji na 950 V, 2 impulsy, 25 ms. Uwaga: Parametry te zostały zoptymalizowane dla ogniw HT1080, ale są zależne od typu ogniwa i można je dostosować do innych typów ogniw zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.</li>
	<li>Napełnij probówkę do mikroporacji 4 ml buforu elektrolitycznego i umieść ją na stacji mikroporacji.</li>
	<li>Wyjąć podstawową próbkę oczyszczonego RBMB i rozmrozić ją. Rozcieńczyć kilka mikrolitrów do końcowego stężenia 12 μM z 1x buforem fosforanowym. Na każdą mikroporację potrzeba 1 μl.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml pożywki hodowlanej z FBS, ale bez antybiotyków, do probówki do mikrowirówki. Uwaga: Zostanie on wykorzystany do zawieszenia komórek natychmiast po mikroporacji i na razie można go odłożyć na bok w pobliżu urządzenia do mikroporacji. Włączenie antybiotyków do pożywek hodowlanych zmniejszy żywotność komórek po mikroporacji.</li>
	<li>Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z zmodyfikowanych komórek HT1080 (60-80% zlewania się), przemyj komórki 1 ml DPBS bez Ca2+ i Mg2+ i inkubuj z 1 ml trypsyny przez 1-2 minuty.</li>
	<li>Zatrzymaj trypsynizację, dodając 1 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, bez antybiotyków i czerwieni fenolowej, a następnie przenieś komórki do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Obracać komórki w probówce do mikrowirówek o masie 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić i połączyć granulki komórek w końcową objętość 1 ml DPBS.</li>
	<li>Weź 10 μl z dobrze wymieszanej zawiesiny komórek i policz komórki.</li>
	<li>Kilkakrotnie pipetować komórki w górę i w dół, aby upewnić się, że są dobrze rozproszone, a następnie przenieść 300 000 komórek za pomocą DPBS do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować w dół z prędkością 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Zawiesić osad w 11 μl buforze do resuspensji i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są dobrze rozproszone. Pamiętaj, aby nie generować żadnych pęcherzyków powietrza. Uwaga: Pęcherzyki powietrza spowodują iskrę podczas mikroporacji i spowodują słabe dostarczanie RBMB i śmierć komórki.</li>
	<li>Dodać 1 μl rozcieńczonego RBMB (12 μM) i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Ponownie należy uważać, aby nie generować żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Odessać 10 μl mieszaniny komórek RBMB za pomocą pipety do mikroporacji i włożyć pipetę do probówki do mikroporacji. Naciśnij przycisk start, aby rozpocząć mikroporację. Uwaga: W końcówce nie powinno być widocznych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Gdy ekran mikroporatora pokaże zakończenie, wyjmij pipetę ze stacji, wylej mieszaninę 10 μl do przygotowanej wcześniej probówki mikrowirówkowej z 1 ml pożywką hodowlaną z FBS, ale bez antybiotyków. Delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie kołysząc rurką na boki.</li>
	<li>Wirować komórki w masie 200 x g przez 5 minut i umyć komórki jeszcze dwa razy w 1 ml pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej z FBS, ale bez antybiotyków, w celu usunięcia wszelkich RBMB, które nie zostały dostarczone do komórek. Zawiesić za pomocą 400 μl pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej z FBS, ale bez antybiotyków.</li>
	<li>Umieść mikroporowane komórki w 8-dołkowym szkle nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną w ilości 200 μl na dołek lub w pożądanym zbiegu.</li>
	<li>Opcjonalnie: Jeśli pożądane jest zobrazowanie jądra, dodać Hoescht 33342 do komórek w końcowym stężeniu 0,01 mg/ml.</li>
	<li>Umieścić szkło nakrywkowe z komorą w inkubatorze do hodowli komórkowych. Inkubuj komórki przez 1-2 godziny przed obrazowaniem, aby komórki miały wystarczająco dużo czasu na osadzenie się na powierzchni szkła nakrywkowego. Uwaga: Obrazowanie można wykonać już po 30 minutach od mikroporacji.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Włącz system inkubacji górnej fazy żywej komórki i zrównoważ go, aż osiągnie 37 °C, 5% CO2 i 75% wilgotności.</li>
	<li>Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła i otwórz oprogramowanie Metamorph. Uwaga: Można również korzystać z innych podobnych pakietów oprogramowania do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu.</li>
	<li>Nałóż olejek Immersol na cel.</li>
	<li>Przenieś szkło nakrywkowe z komorą z mikroporowanymi komórkami do systemu inkubacji górnej fazy żywych komórek. Inkubować górny system sceny, aż temperatura i poziomy CO2 ustabilizują się.</li>
	<li>Otwórz zakładkę Acquire w oprogramowaniu Metamorph. Kliknij przycisk Pokaż na żywo, aby znaleźć pole, dostosuj ostrość w białym świetle i kliknij przycisk Zatrzymaj na żywo.</li>
	<li>Na karcie Pobieranie kliknij i otwórz przycisk wyskakujący pobierania strumienia, a następnie skonfiguruj żądane parametry pozyskiwania filmu. Uchwyć 150 klatek za pomocą filtra Cy5/CF640R i zapisz obrazy na dysku twardym.</li>
</ol>

<ol><li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li>
<li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Dictenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+fluorescent+RNA+ensures+a+bright+future+for+visualizing+nucleic+acid+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics.</a> Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).</li>
<li>Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+pulsing+of+a+developmental+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional pulsing of a developmental gene.</a> Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).</li>
<li>Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nascent+RNA+dynamics+reveals+distinct+types+of+transcriptional+pulse+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).</li>
<li>Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li>
<li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+endogenous+RNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).</li>
<li>Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+bicoid+mRNA+in+late+oocytes+is+maintained+by+continual+active+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport.</a> Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).</li>
<li>Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+beta-actin+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell.</a> Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).</li>
<li>Fusco, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mRNA+molecules+demonstrate+probabilistic+movement+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).</li>
<li>Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamics+of+endogenous+mitochondrial+RNA+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells.</a> Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Daigle, N., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LambdaN-GFP%3A+an+RNA+reporter+system+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).</li>
<li>Bogaard, P. T., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacons+to+study+dispersal+of+mRNPs+from+the+gene+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus.</a> Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).</li>
<li>Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+transport+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA transport in the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).</li>
<li>Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+bimolecular+beacons+for+the+sensitive+detection+of+RNA+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), e148(2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li>
<li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+shared-stem+and+conventional+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).</li>
<li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+kinetics+and+thermodynamics+of+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).</li>
<li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (12), e69(2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), e152(2013).</li>
<li>Ainger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+and+localization+of+exogenous+myelin+basic+protein+mRNA+microinjected+into+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes.</a> J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li>
<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).</li>
<li>Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+visualization+in+live+bacterial+cells+using+fluorescent+protein+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation.</a> Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (16), e105(2007).</li>
<li>Chen, A. K., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+RNA+in+living+cells+with+molecular+beacons%3A+current+perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315(2009).</li>
<li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e58(2004).</li>
<li>Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+FRET+molecular+beacons+for+mRNA+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e57(2004).</li>
<li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li>
<li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li>
<li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly%28phenylene+ethynylene%29+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li>
<li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100(2009).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
</ol>

Dr Mark Behlke i dr Ling Huang są zatrudnieni przez IDT, które oferuje na sprzedaż oligonukleotydy podobne do niektórych związków opisanych w manuskrypcie. IDT nie jest jednak spółką notowaną na giełdzie i osobiście nie posiada żadnych udziałów/udziałów w IDT.

Możliwość obrazowania pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego wymaga jasnego i fotostabilnego sygnału fluorescencyjnego, który ma być powiązany z każdym transkryptem RNA oraz niskofluorescencyjnego tła emanującego z niezwiązanych sond fluorescencyjnych. W tej metodzie jasny sygnał fluorescencyjny uzyskuje się poprzez hybrydyzację wielu (do 96) sond fluorescencyjnych opartych na oligonukleotydach, tj. RBMB, na każdym transkryptie RNA....

Ekspresja i regulacja transkryptów RNA to złożony i dynamiczny proces, który jest w dużej mierze odpowiedzialny za kontrolowanie zachowania i losu komórek. Chociaż znaczenie RNA w dyktowaniu funkcji komórki jest znane od jakiegoś czasu, często trudno jest nakreślić wyraźne powiązania między nimi, ponieważ większość narzędzi do analizy RNA nie ma rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia ważnych zdarzeń regulacyjnych, takich jak pękanie transkrypcji, Handel RNA i zlokalizowane przetwarzanie RNA. Doprowadziło to do pojawienia się kilku technik, które umożliwiają wizualizację poszczególnych transkryptów RNA w żywych komórkach w czasie rzeczywistym1. Być może najbardziej znana z tych technik wykorzystuje białko fuzyjne GFP-MS2 do celowania w RNA, które zostało zaprojektowane tak, aby zawierało tandemowe powtórzenia miejsca wiązania MS2 w 3'-UTR2,3. Dzięki zbliżeniu wielu cząsteczek GFP, poszczególne transkrypty RNA pojawiają się jako jasne fluorescencyjne plamki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. System GFP-MS2 dostarczył bezprecedensowego wglądu w zachowanie RNA, w tym bezpośrednią wizualizację i pomiary pękania transkrypcji4,5, wykrywanie unikalnej lokalizacji subkomórkowej i przetwarzania6-9 oraz obrazowanie transportu RNA w czasie rzeczywistym10. Jednak pomimo ogromnego potencjału systemu GFP-MS2, niezwiązane białka fuzyjne GFP-MS2 mogą tworzyć sygnał fluorescencyjny o wysokim tle, co ogranicza wszechstronność i zakres dynamiczny tej techniki. Opracowano kilka podejść w celu ograniczenia tego sygnału tła, w tym subkomórkową kompartmentalizację niezwiązanego GFP-MS210, komplementację fragmentów białka11 oraz alternatywne białka wiążące RNA i cele12. Jednak wszystkie te podejścia pozostają wrażliwe na względną i całkowitą ekspresję celu RNA i białka fuzyjnego GFP-MS2.

Jako alternatywa dla systemów GFP-MS2, molekularne latarnie zostały również użyte do wykrywania zmodyfikowanych transkryptów RNA z tandemowymi powtórzeniami komplementarnego miejsca wiązania w 3'-UTR13,14. Latarnie molekularne to sondy oligonukleotydowe tworzące spinki do włosów, które są znakowane z jednej strony wygaszaczem, a z drugiej fluorescencyjnym reporterem. Gdy nie są związane z docelowym RNA, fluorescencyjny reporter i wygaszacz pozostają w bliskiej odległości, co skutkuje stanem niskiej fluorescencji. Po hybrydyzacji reporter fluorescencyjny i wygaszacz są wypychane do siebie i fluorescencja zostaje przywrócona. Podobnie jak w przypadku systemu GFP-MS2, wiązanie wielu znaczników molekularnych z pojedynczym transkryptem RNA powoduje powstanie jasnej plamki fluorescencyjnej, którą można zidentyfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; Oczekuje się jednak, że fluorescencja tła będzie znacznie niższa ze względu na wygaszoną konfigurację niezwiązanych latarni molekularnych. Niestety, pomimo sprytnego mechanizmu aktywacji, który jest zawarty w projekcie latarni molekularnej, istnieje obecnie coraz więcej dowodów na to, że niezhybrydyzowane latarnie molekularne nie pozostają w konformacji spinki do włosów po wprowadzeniu do żywych komórek. W konsekwencji generują fałszywie dodatni sygnał, który znacznie zmniejsza sygnał do tła. Aby przezwyciężyć tę wadę, niedawno opracowaliśmy nową syntetyczną sondę do obrazowania RNA w żywych komórkach, ratiometryczne bimolekularne latarnie (RBMB; Rysunek 1A)15,16. RBMB składają się z dwóch nici 2'-O-oligonukleotydów metylowych, które tworzą strukturę hybrydową o cechach zarówno krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA), jak i molekularnych radiolatarni. Mechanizm aktywacji pętli i fluorescencji jest podobny do latarni molekularnej, podczas gdy długa dwuniciowa domena z nawisem 3'-UU jest bardziej charakterystyczna dla shRNA. Cechy shRNA są zaprojektowane tak, aby napędzać eksport jądrowy, co, jak odkryliśmy, wydłuża czas życia wewnątrz komórki do >24 godzin, przy minimalnej obserwowalnej degradacji i zapobiega niespecyficznemu otwarciu pętli. W rezultacie, RBMB wykazują znacznie wyższą komunikację sygnału do tła niż latarnie molekularne.

Należy zauważyć, że RBMB nie mogą być przygotowane przy użyciu oligonukleotydów DNA, ponieważ sondy oparte na DNA nie mają takich samych możliwości eksportu jądra jak sondy oparte na RNA. Strukturalnie pętla RBMB jest zwykle zaprojektowana tak, aby miała długość od 15 do 21 zasad, aby stworzyć równowagę między swoistością a selektywnością podczas hybrydyzacji RNA. Krótka łodyga, która tworzy się z dwóch samouzupełniających się domen, jest zwykle zaprojektowana tak, aby składała się z 4 zasad. Jeśli wybrano dłuższą łodygę, szybkość hybrydyzacji między pętlą RBMB a docelowym RNA jest znacznie spowolniona17,18. I odwrotnie, gdy wybierana jest krótsza sekwencja łodyg, temperatura topnienia jest często zbyt niska, aby utrzymać strukturę pętli łodygi w temperaturze 37 °C, co prowadzi do wysokiego sygnału tła. Specyficzność RBMB jest również zmniejszona wraz ze skróceniem długości trzpienia. Ponieważ sekwencja pętli trzpienia RBMB może również wpływać na wydajność RBMB, musi być starannie dobrana19. W szczególności idealne sekwencje pętli powinny mieć minimalną strukturę drugorzędową, hybrydyzować z sekwencjami RNA o minimalnej strukturze drugorzędowej, unikać miejsc wiązania białek i unikać wiązania poza celem. Przewidywania zarówno struktury drugorzędowej RBMB, jak i RNA można uzyskać za pomocą oprogramowania takiego jak mfold20. Komplementarne miejsca poza celem można zidentyfikować za pomocą narzędzia do wyszukiwania podstawowych przypisań lokalnych nukleotydów (BLAST). Jednak ze względu na niespójności w przewidywaniach modelu i trudności w identyfikacji miejsc licytacji białek, specyficzność wszystkich RBMB musi ostatecznie zostać zweryfikowana eksperymentalnie.

Jeśli jest to pożądane, do RBMB15 można dodać nieugaszony barwnik referencyjny, który jest niewrażliwy na stan hybrydyzacji. Dodanie barwnika referencyjnego może dostarczyć marker do dostarczania sondy i być używane do obrazowania ratiometrycznego, jeśli wymagane są dokładniejsze pomiary całkowitej fluorescencji komórkowej. Barwniki referencyjne pozwalają na dostosowanie pomiarów do różnic w tle spowodowanych różnicami w dostarczaniu między komórkami. Jednakże, podczas obrazowania poszczególnych transkryptów RNA barwnik referencyjny nie jest konieczny. Warto zauważyć, że niektóre barwniki referencyjne mogą zakłócać eksport RBMB z jądra, prowadząc do nieco wyższego sygnału tła w jądrze.

Przy odpowiednim zaprojektowaniu, RBMB mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w pojedynczych żywych komórkach, jeśli docelowe RNA jest zaprojektowane tak, aby zawierało co najmniej cztery miejsca wiązania RBMB (Rysunek 1B)16. RBMB mogą być skutecznie dostarczane do szerokiego zakresu typów komórek za pomocą mikroporacji, przy niewielkim lub zerowym wpływie na żywotność komórek21, a ilościowe pomiary ekspresji genów można uzyskać w ciągu 30 minut. Co więcej, metodologia jest dość niewrażliwa na stężenie RBMB i docelowe poziomy RNA, ponieważ fluorescencja z niezwiązanych RBMB jest skutecznie wygaszana. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis metodologii zastosowanej do przygotowania i oczyszczania RBMB, a także ogólną procedurę dostarczania RBMB do żywych komórek za pomocą mikroporacji i obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

<table><tbody><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Life Technologies</td><td>AM9932</td><td>bez DPBS z powłoką DEPC</td></tr> Life <tr><td></td><td>Technologies</td><td>14190-144</td><td>Bez Ca2+ i Mg2+Cary</td></tr> <tr><td>100 Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S381-500</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>420400-0720</td><td>0,7 x 20 cm</td></tr><tr><td>Superdex 75 klasa przygotowawcza</td><td>GE healthcare</td><td>17-1044-01</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-300</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>301035</td><td>60 ml, końcówka Luer-lok</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>MW 10 000 odcięcie</td></tr><tr><td>Wirówka 5418</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td>liofilizowany proszek, napromieniowany g</td></tr><tr><td>8-dołkowe szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific 155409</td><td></td><td>Objętość robocza 0,2-0,5 ml</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Linia komórkowa ludzkiego włókniakomięsaka</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965084</td><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td></tr><tr><td>bez czerwieni fenolowej</td><td>Life Technologies</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> o wysokim poziomie glukozy <td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penecylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>0,05% Trypsin-EDTA</td></tr><tr><td>System transfekcji neonów</td> Life <td>Technologies</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw systemu transfekcji Neon</td><td>Life Technologie</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Silnik świetlny Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Sterowanie programowe </td></tr><tr><td>mikroskop Immersol oil 518F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66B</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów rna w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Rosnąca świadomość, że zarówno czasowa, jak i przestrzenna regulacja ekspresji genów może mieć istotne konsekwencje dla funkcji komórek, doprowadziła do rozwoju różnorodnych technik wizualizacji indywidualnych transkryptów RNA w pojedynczych żywych komórkach. Jedna z obiecujących technik, która została niedawno opisana, wykorzystuje sondę optyczną opartą na oligonukleotydach, ratiometryczną latarnię dwumolekularną (RBMB), do wykrywania transkryptów RNA, które zostały zaprojektowane tak, aby zawierały co najmniej cztery tandemowe powtórzenia sekwencji docelowej RBMB w regionie 3' bez translacji. RBMB są specjalnie zaprojektowane, aby emitować jasny sygnał fluorescencyjny po hybrydyzacji z komplementarnym RNA, ale poza tym pozostają wygaszone. Zastosowanie syntetycznej sondy w tym podejściu pozwala na użycie fotostabilnych, przesuniętych ku czerwieni i wysoce emisyjnych barwników organicznych do obrazowania. Wiązanie wielu RBMB ze zmodyfikowanymi transkryptami RNA powoduje powstanie dyskretnych plamek fluorescencyjnych podczas oglądania pod mikroskopem fluorescencyjnym o szerokim polu widzenia. W związku z tym ruch poszczególnych transkryptów RNA można łatwo zobrazować w czasie rzeczywistym, wykonując szereg czasowy obrazów fluorescencyjnych. Tutaj opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMBs, dostarczanie do komórek za pomocą mikroporacji oraz obrazowanie pojedynczych transkryptów RNA na żywych komórkach.

Wkrótce po mikroporacji komórek HT1080 w obecności RBMB, pojedyncze transkrypty RNA, zaprojektowane tak, aby zawierały wiele miejsc wiązania RBMB w obrębie 3’-UTR, pojawiają się jako jasne fluorescencyjne punkty podczas obrazowania za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 2). Choć pojedyncze transkrypty RNA z zaledwie czterema miejscami wiązania RBMB mogą być obrazowane w żywych komórkach, im więcej miejsc wiązania RBMB w 3’-UTR, tym silniejszy jest sygnał fluorescencyjny. Co więcej...

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie pojedynczych transkrypcji RNA w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez hybrydyzację dwóch oligonukleotydów zaprojektowanych tak, aby tworzyły sondę w formie spinki do włosów, znaną jako ratiometryczna latarnia molekularna (molecular beacon). Drugim krokiem jest oczyszczanie ratiometrycznych latarni molekularnych za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego.Następnie, za pomocą mikroporacji do komórek wykazujących ekspresję zmodyfikowanego celu RNA wprowadza się pomiar stosunku oparty na beaconach molekularnych. Ostatnim krokiem jest osadzenie komórek na płytce z mikrootworami odpowiedniej do mikroskopii żywych komórek. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną do monitorowania przemieszczania się pojedynczych transkrypty RNA, wizualizowanych jako jasne fluorescencyjne punkty w obrębie pojedynczych komórek.Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie syntetycznych sond, które są jasne, fotostabilne i charakteryzują się wysokim stosunkiem sygnału do tła, co otwiera możliwość obrazowania dowolnego endogennego RNA. Przygotowanie mieszaniny ratiometrycznej z wykorzystaniem beaconów molekularnych lub RBM BS należy rozpocząć od zmieszania w probówce następujących odczynników: 20 µL Rbm B one, 30 µL Rbm B two, 6 µL 10x buforu fosforanowego oraz 4 µL wody wolnej od DNA i RNA. Taka ilość jest zazwyczaj wystarczająca na około 50 badań.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W tym czasie przygotować kolumnę do chromatografii cieczowej w celu usunięcia niezhybrydyzowanych oligonukleotydów RBM B two. Użyć 75 super decków klasy preparatywnej w ośmiomililitrowej kolumnie do chromatografii cieczowej o objętości złoża około 4 ml, stosując pompę strzykawkową z przepływem 0,6 ml/min.Przemyj i zrównoważ SUEx około 50 mililitrami jednego x buforu fosforanowego, zanim cały płyn przedostanie się do objętości złoża. Zatrzymaj pompę strzykawkową, odłącz ją i pozwól pozostałemu płynowi przepłynąć przez kolumnę grawitacyjnie. Następnie nanieś mieszaninę RBMB na kolumnę chromatograficzną.Po całkowitym wprowadzeniu próbki RBMB do złoża powoli dodaj kolejne 250 µL jednokrotnego buforu fosforanowego na górę złoża, aby upewnić się, że cała próbka została całkowicie wprowadzona do kolumny. Wypełnij kolumnę jednokrotnym buforem fosforanowym aż do krawędzi. Zamknij górną część i uruchom pompę strzykawkową.Strzykawkę napełnia się około 50 mililitrów 1x PBS, a przepływ ustawia się na 0,6 mililitra na minutę. Zazwyczaj próbkę RBMB można łatwo zlokalizować dzięki barwnikowi wbudowanemu w sondę. Gdy RBMB zbliży się do dna kolumny, należy zbierać frakcje przepływu w ilości dwóch kropli na każdą probówkę do mikrowirówki.Przerwać pobieranie próbki. Gdy kolor próbki w probówkach do mikrocentryfugi stanie się przejrzysty, połączyć probówki zawierające zabarwioną próbkę RBMB (zazwyczaj od pięciu do sześciu probówek) i przelać do urządzenia z filtrem odwirowującym. Centryfugować próbkę przy 10 000 RCF przez 20 minut lub do uzyskania pożądanej objętości.Taka prędkość i czas zazwyczaj pozwolą uzyskać objętość końcową wynoszącą około 30 µL. W niniejszym protokole linia komórek włókniakomięsaka ludzkiego została zmodyfikowana tak, aby eksprymowała Q-F-P-R-N-A z 96 tandemowymi powtórzeniami sekwencji docelowej RBMB w 3' UTR, natomiast kontrolna linia komórek została zmodyfikowana tak, aby eksprymowała Q-F-P-R-N-A typu dzikiego. Jeden dzień przed dostarczeniem sondy komórki wysiano na płytkę z kolby T 25 przy konfluencji hodowli od 40 do 50%. Komórki hodowano w medium DMEM uzupełnionym o 1% pen-strep oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej i inkubowano w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 do następnego dnia.Włącz urządzenie do mikroporacji i ustaw parametry mikroporacji zoptymalizowane dla komórek HT 10 80. Napełnij probówkę do mikroporacji czterema mililitrami buforu elektrolitycznego i umieść ją na stacji do mikropreparacji. Rozmroź zapasową próbkę oczyszczonego RBMB i rozcieńcz kilka mikrolitrów do stężenia końcowego 12 µM w buforze fosforanowym 1x.Do każdej mikroporcji wymagany jest jeden mikrolitr. Dla każdej reakcji w mikroporcji pipetujmy 1 ml pożywki hodowlanej z FBS, ale bez antybiotyków, do probówki do mikrocentryfugi. Odstaw ją w pobliże urządzenia do mikroporcji.Zostanie on użyty później do resuspensji komórek bezpośrednio po mikroprzygotowaniu. Nie stosuje się antybiotyków, ponieważ obniżyłyby one żywotność komórek po mikroprzygotowaniu. Zmodyfikowane komórki HT 10 80 wysiane poprzedniego dnia powinny osiągnąć teraz 60 do 80% konfluencji.Usunąć pożywkę do hodowli komórkowej i jednokrotnie przemyć komórki jednym mililitrem DPBS pozbawionego wapnia i magnezu, a następnie inkubować z jednym mililitrem trypsyny przez jedną do dwóch minut. Zneutralizować działanie trypsyny, dodając jeden mililitr pożywki DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, bez antybiotyków i czerwieni fenolowej, i przenieść komórki do dwóch probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować komórki w probówkach w mikrocentryfużce przy 200 ×g przez pięć minut.Usunąć nadosad, a następnie resuspender i połączyć osady komórkowe w końcowej objętości 1 ml DPBS. Odobrać 10 µl z dobrze wymieszanej zawiesiny komórkowej w celu policzenia komórek, kilkukrotnie pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są dobrze rozproszone, a następnie przenieść 300 000 komórek w DPBS do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Wirować z prędkością 200 ×g przez pięć minut.Usunąć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Resuspender osad w 11 µL buforu Resus suspension i kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby zapewnić dobre rozproszenie komórek. Należy uważać, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza.Dodaj jeden mikrolitr rozcieńczonego RBMB i wymieszaj dokładnie, pipetując go kilka razy w górę i w dół. Ponownie należy uważać, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Kluczowe jest uniknięcie wprowadzenia jakichkolwiek pęcherzyków powietrza do zawiesiny RBMB, ponieważ mogą one spowodować iskrzenie podczas mikrooperacji, co doprowadzi do niewłaściwego dostarczenia RBMB oraz śmierci komórek.Za pomocą pipety do mikroprzygotowań należy pobrać 10 µL mieszaniny komórek RBMB i wprowadzić pipetę do probówki do mikroprzygotowań. Należy nacisnąć przycisk start, aby rozpocząć mikroporację. Po wyświetleniu komunikatu o zakończeniu procesu na ekranie mikroporatora w końcówce nie powinny być widoczne pęcherzyki powietrza.Wyjmij pipetę ze stanowiska i wydmuchaj 10 µL mieszaniny do wcześniej przygotowanej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 mL pożywki hodowlanej z FBS, ale bez antybiotyków, mieszając delikatnie poprzez kilkukrotne kołysanie probówką na boki. Wirować komórki przy 200 ×g przez pięć minut. Przemyć komórki dwukrotnie w 1 mL pożywki hodowlanej bez czerwieni fenolowej z FBS, ale bez antybiotyków, aby usunąć wszelkie rbm BS, które nie zostały dostarczone do komórek.Po drugim płukaniu resuspenduj komórki w 400 µL pożywki hodowlanej bez czerwieni fenolowej z FBS, ale bez antybiotyków. Wysiej komórki do wcześniej przygotowanego, pokrytego polilizyną szkła przedmiotowego z ośmioma komorami, stosując 200 µL na studzienkę lub pożądaną konfluencję.Umieść szkiełko nakrywkowe z komorką w inkubatorze do hodowli komórkowych. Obrazowanie można przeprowadzić już 30 minut po przygotowaniu mikropróbki. Aby rozpocząć tę procedurę, włącz system inkubacji górnej dla stołu do obrazowania żywych komórek i odczekaj do uzyskania równowagi, aż osiągnie on 37 °C, 5% carbon dioxide i 75% humidity.Włącz mikroskop oraz fluorescencyjne źródło światła i uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu Metamorph. Nałóż olej immersyjny na obiektyw. Przenieś szkiełko nakrywkowe z komorą zawierającą komórki z mikroportami na stoлик do żywych komórek.Górny system inkubacji. Inkubuj system nad stołem obiektowym, aż temperatura i poziom dwutlenku węgla zostaną ustabilizowane. Otwórz zakładkę akwizycji (acquire) w oprogramowaniu Metamorph.Kliknij przycisk show live, aby zlokalizować pole widzenia. Dostosuj ostrość w świetle białym, a następnie kliknij przycisk stop live. Przejdź do karty acquire.Kliknij i otwórz przycisk wyskakujący dla akwizycji strumienia i ustaw żądane parametry akwizycji filmu. Pozyskaj 150 klatek przy użyciu filtra SCI five CF six 40 R. Zapisz obrazy na dysku twardym.Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy komórek HT 10 80 stabilnie eksponujących RNA z 96 powtórzeniami tandemowymi lub czterema powtórzeniami tandemowymi miejsca wiązania RBMB w 3' UTR. Po wewnątrzkomórkowym dostarczeniu mbs obecność 96 powtórzeń tandemowych sprawia, że poszczególne transkrypty RNA widoczne są jako jasne fluorescencyjne plamki.W przeciwieństwie do nich, cząsteczki RNA zawierające tylko cztery powtórzenia tandemowe pojawiają się jako bardzo słabe plamki fluorescencyjne i często są wykrywalne jedynie w obszarach o wyjątkowo niskim tle. Pozyskiwanie obrazów w trybie strumieniowym pozwala na obrazowanie pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym. Pojedyncze transkrypty RNA można łatwo zaobserwować w cytoplazmie i jądrze komórkowym, gdzie wykonują ruchy brownowskie lub subdyfuzyjne.W rzadkich przypadkach można zaobserwować RNA podlegające transportowi kierowanemu, co przedstawiono tutaj. Transkrypty RNA podlegające transportowi kierowanemu zazwyczaj poruszają się szybko wzdłuż prostej ścieżki. Na tym montażu trajektoria transkryptu RNA została nałożona na pojedynczą klatkę serii czasowej.Kierunkowe ruchy RNA są zgodne z transportem RNA wzdłuż mikrotubul i mikrofilamentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować i oczyścić sondy molekularne oraz jak wprowadzić sondy molekularne do komórek za pomocą mikroiniekcji i obrazować pojedyncze transkrypty RNA przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych skonstruowanych transkryptów RNA w żywych komórkach z wykorzystaniem bimolekularnych latarni morskich ratiometrycznych

Kinetykę transkrypcyjną polimerazy RNA II mierzy się na wybranych genach w żywych komórkach. mRNA transkrybowane z badanego genu są znakowane fluorescencyjnie, a za pomocą metody FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) wyznacza się kinetykę elongacji transkrypcji in vivo.

Pomiar kinetyki transkrypcji mRNA w pojedynczych żywych komórkach

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI 1.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Ładowanie koralików wprowadza białka, plazmidy i cząsteczki do przylegających komórek ssaków. Ta technika ładowania komórek jest niedroga, szybka i nie wpływa znacząco na zdrowie komórek. Najlepiej nadaje się do obrazowania żywych komórek.

Ładowanie kulek białek i kwasów nukleinowych do przylegających komórek ludzkich

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Celem tego protokołu jest umożliwienie ilościowego pomiaru czasu życia fluorescencji sond Riboglow dla powtarzalnych przepływów pracy obrazowania RNA in vitro, w żywych komórkach ssaków i w trójwymiarowym modelu komórkowym. Przedstawiamy przykłady przygotowania próbek, dostarczania sond, pozyskiwania danych oraz przepływów pracy analizy ilościowej w celu pozyskania bezstronnego pomiaru czasu życia fluorescencji.

Charakteryzacja sond Riboglow in vitro jako podstawa dla fluorescencyjnego obrazowania czasu życia w żywych komórkach ssaków i trójwymiarowych modelach komórkowych

Poznaj metodę obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych. Technika ta umożliwia monitorowanie dynamiki RNA w czasie rzeczywistym dzięki fluorescencyjnej mikroskopii.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Przeglądaj więcej filmów