Test transgenicznych gryzoni do ilościowego określania częstości mutantów męskich komórek rozrodczych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar częstości mutacji indukowanych w genie reporterowym odzyskanym z komórek linii zarodkowej samców myszy transgenicznych po narażeniu na mutagen chemiczny lub fizyczny. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie poddanie samców myszy działaniu podejrzewanego mutagenu komórek linii zarodkowej. Drugim krokiem jest zebranie komórek linii zarodkowej po przejściu przez pożądane etapy spermatogenezy.

Następnie DNA zawierające transgen raportujący z mutacją jest odzyskiwane z komórek linii zarodkowej. Ostatnim krokiem jest pakowanie odzyskanych genów raportujących do cząsteczek faga lambda. Ostatecznie wykorzystuje się in vitro test selekcji pozytywnej, aby zmierzyć odsetek zmutowanych genów raportujących odzyskanych z komórek linii zarodkowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test specyficznego locus czy test domino, jest fakt, że mutacje są mierzone bezpośrednio w komórkach linii zarodkowej, a nie poprzez ocenę mutantów w potomstwie. Możliwość zbadania dużej liczby komórek linii zarodkowej od jednego samca zwiększa czułość analizy w stosunku do metod tradycyjnych, jednocześnie drastycznie redukując zapotrzebowanie na zasoby zwierzęce oraz czas. Metoda ta pozwala rozwiązać kluczowe problemy w dziedzinie toksykologii genetycznej i mutagenezy, takie jak identyfikacja czynników mutagennych dla komórek linii zarodkowej oraz wyjaśnianie ich mechanizmów działania.

Choć opisujemy tę metodę na przykładzie modelu myszy Muta, można ją łatwo zastosować do innych transgenicznych systemów gryzoni, które posiadają wektory raportujące mutacje fagowe bakterii. Co więcej, mimo że metoda opisuje proces dla męskich komórek linii zarodkowej, ma ona ogólną zastosowalność w odniesieniu do tkanek somatycznych i, co istotne, jest objęta międzynarodową zharmonizowaną wytyczną testową opublikowaną przez OECD. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z synchronizacją czasu w części in vitro analizy, ponieważ kilka etapów wiąże się z długimi okresami oczekiwania.

Kroki muszą zostać starannie zaplanowane i skoordynowane, aby zrealizować tę metodę w odpowiednim czasie. Procedurę zaprezentują John Gingrich oraz Linda Soper, biolodzy w moim laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wybrać trzy krytyczne zmienne doświadczalne: czas podania, czas pobierania próbek oraz populację zbieranych komórek zarodkowych.

Zmienne te można dostosować w celu zbadania efektów ekspozycji w różnych typach komórek zarodkowych oraz w różnych fazach spermatogenezy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy losowo podzielić transgeniczne samce myszy w wieku od ośmiu do 12 tygodni na grupę kontrolną i grupy badawcze, zachowując minimum pięć osobników w każdej grupie. Następnie myszy należy poddać działaniu związku testowego oraz odpowiedniej kontroli, stosując właściwą drogę podania przez wybrany czas ekspozycji.

Następnie wybierz odpowiedni czas pobrania próbek w zależności od interesującego typu komórek metagenicznych plemników. Po upływie wyznaczonego czasu uśmierć myszy poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych w znieczuleniu izofluranem. Aby wyciąć jądra, wykonaj nacięcie w jamie brzusznej i zlokalizuj podskórną tkankę tłuszczową.

Ostrożnie odciągnij poduszkę tłuszczową, aby wyciągnąć jądra i najogony z moszny. Następnie wycinej najogon. Zamroź najogon w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

Po przygotowaniu do przetworzenia nasienia Cota, rozmroź najduszniki Cota na lodzie, a następnie przenieś rozmrożone najduszniki do szalki Petriego. Następnie, używając skalpela lub żyletki, dokładnie rozdrobnij najduszniki Cota i pipetuj 700 µL DPBS o temperaturze pokojowej do szalki Petriego. Następnie użyj końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 1000 µL, aby uwolnić plemniki z ogona, zasysając i wypuszczając zawiesinę około 10 razy lub do momentu, aż DPBS stanie się mętny od plemników; przefiltruj zawiesinę plemników przez stalowy filtr siatkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie odwiruj probówkę przy 11 000 ×g przez trzy minuty.

Ostrożnie odlej supernatant z probówki, nie naruszając osadu. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego, 1x roztworu cytrynianu sodu w soli fizjologicznej i mieszaj probówkę w wirówce wortex do całkowitego resuspensowania osadu. Dalej, dodaj do probówki 15 µL 10% SDS i energicznie potrząsaj probówką przez 30 sekund, aby zniszczyć komórki niebędące plemnikami.

Następnie wiruj probówkę przy 11 000 ×g przez dwie minuty. Po wirowaniu ostrożnie odlej supernatant z probówki, dodaj 940 µL zimnego 0,2x cytrynianu sodu w roztworze soli fizjologicznej i ponownie wymieszaj probówkę na wortexie, aż osad zostanie resuspendowany. Dodaj 120 µL A beta merkaptoetanolu, 100 µL 10% SDS, 20 µL 0,5 M EDTA pH 8 oraz 20 µL roztworu o stężeniu 60 mg/mL.

Dodaj proteinazę K do resuspenderowanych plemników. Dobrze wymieszaj roztwór, a następnie umieść probówkę na rotatorze w temperaturze 37°C przez noc w celu przeprowadzenia trawienia. Po nocnym trawieniu wyizoluj DNA z ogonów plemników, postępując zgodnie z krokami opisanymi w protokole tekstowym dotyczącym przeprowadzania ekstrakcji fenolowo-chloroformowej.

Rozpuścić osad DNA w 40 do 100 µL buforu Tris-EDTA o pH 8 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Odczekać kilka dni do całkowitego rozpuszczenia DNA przed przejściem do kolejnego kroku. Przed przeprowadzeniem testu mutacji LAX Z przygotować i wysterylizować w autoklawie odpowiednią liczbę probówek z odpowiednio ukształtowanym dnem dla liczby przetwarzanych próbek.

Następnie aseptycznie wlej agar do szalek Petriego o średnicy 90 mm i pozwól agarowi zastygnąć w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj 10 ml bulionu LB, 100 µL 20% roztworu maltozy, 25 µL ampicyliny o stężeniu 20 mg/ml oraz 20 µL kanamycyny o stężeniu 5 mg/ml. Następnie zaszczep probówkę szczepem E. coli LAX Z- GAL- i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 240 RPM. Pierwszego dnia badania dokonaj subkultury komórek, przygotowując rozcieńczenie 1:100 kultury nocnej w świeżym medium LB bez antybiotyków.

Inkubuj hodowlę w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 240 RPM przez około trzy godziny lub do momentu, gdy OD 600 osiągnie wartość jeden. Po osiągnięciu wartości OD 600 równej jeden, podziel zawiesinę komórkową równomiernie do probówek o pojemności 50 ml i odwiruj przy 1 300 ×g w temperaturze 15 °C przez 10 minut. Następnie odlej supernatant i resuspenduj komórki w połowie pierwotnej objętości pożywki LB zawierającej 10 mM siarczanu magnezu.

Odstawić komórki na czas przygotowania pozostałych odczynników. Pakować DNA w cząstkach bakteriofaga Lambda, pipetując najpierw 4 µL DNA wyekstrahowanego z plemników coda za pomocą pipety o szerokim otworze do probówki o objętości 1,5 ml.

Rozmrozić pierwszą probówkę z zestawu ekstraktu do pakowania fagów w temperaturze pokojowej, a następnie pipetować 4,8 µL ekstraktu do pakowania do probówki zawierającej DNA. Następnie delikatnie wymieszać roztwór końcówką pipety i inkubować probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez 1,5 godziny. Następnie rozmrozić drugą probówkę z ekstraktem do pakowania i ponownie pipetować 4,8 µL do probówki zawierającej DNA.

Delikatnie wymieszaj roztwór końcówką pipety, a następnie inkubuj probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez 1,5 godziny. Resuspenduj zapakowane cząsteczki fagów w 500 µL buforu soli magnezowej i umieść probówki na rotatorze na 30 minut przy 20 RPM. Po rotacji krótko wymieszaj próbki w wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przy 11 000 ×g przez 30 sekund, aby osadzić próbki na dnie probówki.

Cząsteczki fagów są teraz gotowe do infekcji. Następnie przygotuj osiem mililitrów górnej warstwy agarowej dla każdego miana i płyty z mutantami. Utrzymuj górne warstwy agarowe w temperaturze 50 °C przed dodaniem siarczanu magnezu do stężenia 10 mM oraz dodaj trzy gramy na litr selektywnego czynnika PGAL do selekcji mutantów.

Górny świder należy użyć tylko przed zakażeniem komórek. Oznacz dwie probówki o pojemności 50 ml dla każdej próbki: jedną jako mutant, a drugą jako miano. Następnie oznacz osiem płytek z otworem pod świder dla każdej próbki: cztery dla mutanta i cztery dla miana.

Następnie pipetuj dwa mililitry resuspenderowanych komórek do każdej probówki 50 ml. Dodaj 500 µL opakowanych cząsteczek fagów do probówki 50 ml oznaczonej jako mutant. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i pozostaw cząsteczki fagów na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zainfekowały komórki.

Po 30-minutowej inkubacji krótko wymieszaj zainfekowane komórki na wirówce typu vortex, a następnie przenieś 15 µL zainfekowanych komórek do odpowiedniej probówki mianowania o objętości 50 mL. Do probówki mianowania 50 mL dodaj 30 mL medium mianującego (titer top auger) o temperaturze 50 °C. Bezzwłocznie rozdziel mieszaninę medium i komórek pomiędzy cztery płytki mianowania.

Upewnij się, że do pożywki do selekcji mutantów o temperaturze 50 °C dodano 3 g/L PGAL. Następnie dodaj 30 ml pożywki do selekcji mutantów zawierającej PGAL do probówki z mutantami o pojemności 50 ml. Od razu po tym rozdziel mieszaninę pożywki i komórek na cztery płytki z mutantami.

Pozostaw płytki do zastygnięcia, a następnie odwróć je i inkubuj w temperaturze 37°C przez noc. Po nocnej inkubacji oblicz liczbę plam przejaśnienia na płytkach z mutantami oraz płytkach do miareczkowania. Następnie oszacuj częstotliwość mutacji, dzieląc całkowitą liczbę policzonych plam mutantów na czterech płytkach z mutantami przez szacowaną całkowitą liczbę jednostek tworzących plamy w całkowitej objętości zainfekowanych komórek, wyznaczoną na podstawie płytek do miareczkowania.

Typowy test mutacji komórek linii zarodkowej u gryzoni transgenicznych skutkuje powstaniem bardzo niewielu plamyków na szalkach z mutantami, zwłaszcza w grupach kontrolnych. Z drugiej strony na szalkach do oznaczania miana wykrywanych jest setki plamyków. Podanie samcom myszy szczepu mutt pojedynczej ostrej dawki doustnej ENU w ilościach 0, 25, 50 i 100 mg/kg, a następnie zastosowanie 70-dniowego czasu próbkowania, pozwoliło na pomiar zdarzeń mutacyjnych w komórkach macierzystych spermatogonii.

Niska dawka ENU spowodowała 2,6-krotny wzrost częstości mutacji w stosunku do kontroli, natomiast dawka maksymalna wywołała wzrost 4,4-krotny. Podczas projektowania eksperymentów z wykorzystaniem tej procedury ważne jest, aby zawsze brać pod uwagę kwestie czasowe. Cykl metageniczny plemników, czas podania preparatu, czas pobierania próbek oraz typ pobieranych komórek muszą zostać starannie dobrane, aby zaobserwować efekty pochodzące z pożądanego typu komórek metagenicznych plemników.

Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać sekwencjonanie DNA plam mutantów w celu charakterystyki mutacji oraz identyfikacji mutantów, które mogą wynikać z procesów ekspansji klonalnej. Technika ta umożliwia badaczom z dziedziny toksykologii genetycznej identyfikację mutagenów, które mogą oddziaływać na linię zarodkową. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu wyznaczania indukowanej częstotliwości mutacji w komórkach zarodkowych lub u transgenicznych myszy samców poddanych działaniu mutagenu.

Analiza ta znajduje potencjalne zastosowanie w badaniach regulacyjnych mutagenów komórek linii zarodkowej oraz w bardziej ukierunkowanych badaniach mechanistycznych.