Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczenie rekombinowanych polipeptydów podobnych do elastyny z E. coli poprzez odwrotny cykl przejścia. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie lizatu z komórek E. coli, które uległy ekspresji rekombinowanej elastyny, takiej jak polipeptyd, i usunięcie nierozpuszczalnych resztek komórkowych przez wirowanie. Drugim krokiem jest usunięcie rozpuszczalnych zanieczyszczeń poprzez wywołanie przemiany polipeptydowej przypominającej elastynę z dodatkiem soli lub ciepła.

Następnie zbiera się elastynę, podobną do polipeptydu, przez odwirowanie i odrzucenie supernatantu. Ten krok jest określany jako gorący wir. Następnie zawieszony roztwór polipeptydu podobny do elastyny jest wirowany w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.

Rozpuszczalny polipeptyd podobny do elastyny w supernatancie jest zatrzymywany, a osad jest odrzucany. Ten etap nazywa się zimnym wirowaniem, powtarzaniem cykli gorących i zimnych wirów, aż do osiągnięcia zadowalającej czystości polipeptydu podobnego do elastyny. Ostatecznie, cykl odwrotnego przejścia daje czyste produkty polipeptydowe podobne do elastyny, które można scharakteryzować do stosowania w różnych zastosowaniach biomedycznych.

Polipeptydy podobne do elastyny oczyszczone tą techniką mają wiele użytecznych zastosowań, w tym bioczujniki, inżynierię tkankową i dostarczanie leków, gdzie temperatura przejścia i architektura biopolimeru polipeptydu podobnego do elastyny mogą być specjalnie dostrojone do każdego zastosowania. Aby rozpocząć, należy wyrazić pożądany plazmid kodujący ELP w E. coli, używając warunków opisanych w dołączonym protokole tekstowym. Po wytrząsaniu jednolitrowej kultury w inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przenieś kulturę do litrowej butelki wirówki, a następnie odwiruj butelkę w temperaturze 2000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant i resus. Zawieś osad w wodzie PBS lub innym pożądanym buforze do całkowitej objętości 45 mililitrów. Następnie przenieśli zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Umieść zawiesinę komórek na lodzie i po schłodzeniu poddaj sonikacji przez łącznie dziewięć minut w cyklach po 10 sekund włączenia i 20 sekund wyłączenia. O mocy wyjściowej 85 watów. Pozostawić próbkę do ostygnięcia na lodzie przez około 10 minut po pierwszej rundzie sonikacji, a następnie powtórzyć dziewięciominutowy cykl sonikacji.

Przenieś lizat do 50-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem. Następnie dodaj dwa mililitry polietylenu o wadze 10% na objętość na każdy litr kultury i potrząśnij probówką, aby wymieszać Następnie, odwiruj probówkę w temperaturze 16 000 GS przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś supernatant do czystej 50-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem i wyrzuć osad.

Dodać krystaliczny chlorek sodu do próbki, aby indukować przejście ELP. Po rozpuszczeniu soli roztwór stanie się mętny, co wskazuje na oddzielenie faz ELP od roztworu. Następnie granulować ELP, odwirowując próbkę w temperaturze 16 000 GS przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej osad ELP może początkowo wydawać się nieprzezroczysty, odrzucić supernatant, a następnie dodać od jednego do pięciu mililitrów pożądanego buforu po schłodzeniu. Granulka ELP może wydawać się półprzezroczysta i mieć brązowy kolor. Resus zawiesić osad, pipetując lub obracając rurkę o cztery stopnie Celsjusza.

Następnie odpipetować jeden mililitr podwielokrotności zawieszonego roztworu ELP do czystych 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. Odwirować probówki w temperaturze 16 000 GS przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś supernatant do czystej probówki i wyrzuć granulki.

Indukować przejście ELP z dodatkiem chlorku sodu. Jeżeli ELP ma wysoką temperaturę przejścia, której nie można indukować za pomocą samej soli, należy inkubować próbkę w bloku grzewczym przez 15 minut w temperaturze wyższej od temperatury przejścia ELP. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16 000 GS przez 10 minut w temperaturze wyższej niż temperatura stosowana w etapie przejścia ELP.

Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ELP w 500 do 750 mikrolitrach żądanego buforu, pipetując lub obracając probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż do ponownego rozpuszczenia osadu. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16 000 GS przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać wszelkie nierozpuszczalne zanieczyszczenia. Następnie przenieś snat do czystej probówki i wyrzuć osad Powtarzaj cykle odwrotnego przejścia, aż nie zaobserwuje się osadu zanieczyszczającego.

Zazwyczaj wymaga to od dwóch do pięciu cykli. Przygotować serię rozcieńczeń roztworów ELP w PBS lub innym pożądanym buforze. Następnie użyj spektrofotometru UV v z kontrolowaną temperaturą, aby zmierzyć gęstość optyczną przy 350 nanometrach w zakresie temperatur, jednocześnie podgrzewając próbkę z szybkością jednego stopnia Celsjusza na minutę.

Jeśli nie obserwuje się wzrostu gęstości optycznej, temperatura przejścia może przekroczyć górną granicę temperatury. Następnie zmierz spadek gęstości optycznej w tym samym zakresie temperatur przy szybkości chłodzenia jednego stopnia Celsjusza na minutę. Aby zweryfikować odwracalność wykresu przejścia ELP, gęstość optyczną w funkcji temperatury, należy określić temperaturę przejścia homopolimeru ELP.

Identyfikując punkt przegięcia na tym profilu zmętnienia, pomyślne oczyszczenie LP jest potwierdzone przez stronę SDS, jak można zobaczyć tutaj. Liczba zanieczyszczeń jest znacznie większa w początkowym lizacie e-coli w porównaniu z próbką po jednej rundzie odwrotnego cyklu przejścia. Temperatura przejścia ELP jest charakteryzowana przez zaprogramowaną temperaturowo mętność dla homopolimeru ELP.

Profil zmętnienia wykazuje pojedynczy gwałtowny wzrost gęstości optycznej, która określa temperaturę przejścia przy danym stężeniu. Odwracalny charakter przejścia ELP potwierdza skan zmętnienia chłodzenia. Kopolimery bloków matrycowych ELP wykazują bardziej złożony profil zmętnienia niż LP homopolimerowe.

Następnie można wykonać pomiary dynamicznego rozpraszania światła, aby potwierdzić zachowanie tych LP, które można wywnioskować z pliku profilu zmętnienia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać rekombinowane polipeptydy takie jak elastyna z E. coli za pomocą odwrotnego cyklu przejścia. Nie, nie, nie, nie, nie.