Name: Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Naucz się niechromatograficznej metody oczyszczania polipeptydów elastynopodobnych z Escherichia coli przy użyciu cyklicznej inwersji przejścia fazowego. Ta technika umożliwia uzyskanie czystych biopolimerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Trójkąt Badawczy NSF MRSEC (DMR-1121107).

1. Wyrażenie ELP
<ol>
	<li>Zaszczepić 3 ml sterylnej pożywki Terrific Broth za pomocą bulionu DMSO lub kolonii E. coli na płytce agarowej odpowiedniej do ekspresji białka, która zawiera pożądany plazmid kodujący ELP pod kontrolą promotora T7-lac. Dodać odpowiedni antybiotyk i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (O/N) z ciągłym wstrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Dodać 1 ml kultury O/N do 1 l sterylnego podłoża Terrific Broth w 4-litrowej kolbie. Dodać odpowiedni antybiotyk i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, wytrząsając w sposób ciągły z prędkością 200 obr./min. UWAGA: "Nieszczelna" ekspresja wyjściowa obserwowana w przypadku promotora T7-lac jest wystarczająca do ekspresji wielu ELP na wysokim poziomie, jeśli hodowla jest inkubowana przez 24 godziny. Można jednak zastosować bardziej konwencjonalne podejście, w którym ekspresja białka jest dodatkowo indukowana przez dodanie 0,2-1 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktozydu (IPTG), gdy gęstość optyczna kultury osiąga 0,6.</li>
	<li>Przenieść kulturę z 4-litrowej kolby do 1-litrowej butelki wirówkowej i odwirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 2 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. UWAGA: Jeśli wyhoduje się więcej niż 1 l kultury, można je skondensować, dodając kolejny litr kultury do granulki i powtarzając krok 1.3. Do 2 l kultury można skondensować w jednokomórkowym osadzie.</li>
	<li>Zawiesić osad w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS), wodzie lub innym pożądanym buforze, aby osiągnąć 45 ml zawiesiny komórkowej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie ELP: Wstępne kroki i pierwsza runda cyklu odwrotnego przejścia
<ol>
	<li>Sonikować zawieszone osady komórkowe przez łącznie 9 minut w cyklach po 10 sekund "włączenia" i 20 sekund "wyłączenia" przy mocy wyjściowej 85 W, utrzymując próbkę na lodzie. Na krótko pozostawić próbkę do ostygnięcia na lodzie, a następnie powtórzyć 9-minutowy cykl jeszcze raz. UWAGA: Jeśli przewiduje się, że ELP będzie miał bardzo niskieTt, interwał "wyłączenia" można zwiększyć do 40 sekund, aby uniknąć podgrzewania roztworu powyżej TT.</li>
	<li>Przenieść lizat do probówki wirówkowej z okrągłym dnem o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 2 ml 10% (w/v) polietylenoiminy (PEI) na każdy litr kultury i wstrząsnąć do wymieszania. UWAGA: PEI jest dodatnio naładowanym polimerem, który pomaga w kondensacji ujemnie naładowanych zanieczyszczeń genetycznych. Nie wykonuj tego kroku, jeśli ELP jest naładowany ujemnie, ponieważ PEI może również skondensować i usunąć produkt ELP.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej z okrągłym dnem o pojemności 50 ml i wyrzucić osad.</li>
	<li>Opcjonalny etap "wypalania": Inkubować próbkę w temperaturze 60 °C przez 10 minut w celu denaturacji zanieczyszczeń białkowych, a następnie przenieść do temperatury 4 °C lub do lodu, aż ELP zostanie całkowicie rozpuszczony. Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej z okrągłym dnem o pojemności 50 ml i wyrzucić osad. UWAGA: Nie wykonuj tego kroku, jeśli peptyd lub białko jest połączone z ELP i oczekuje się, że ulegnie denaturacji w stanie podwyższonego ciepła. Może to spowodować, że przejście ELP stanie się nieodwracalne pod wpływem ciepła lub może zniszczyć aktywność stopionego ugrupowania.</li>
	<li>Indukować przejście ELP z dodatkiem krystalicznego NaCl (nieprzekraczającego 3 M). Alternatywnie, cytrynian sodu (nieprzekraczający 0,3 M) może być stosowany do ELP, które mają wyższąTts lub niską wydajność. UWAGA: Roztwór powinien stać się mętny po rozpuszczeniu soli, co wskazuje na oddzielenie faz ELP od roztworu. Bardzo hydrofilowe ELP o wysokiej T t s mogąwymagać pewnego stopnia ogrzewania, w połączeniu z dodatkiem soli, w celu wywołania separacji faz ELP w tej wstępnej indukcji przejścia ELP.</li>
	<li>Wirować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut przy 16 000 x g (gorące wirowanie). UWAGA: Należy obserwować osad ELP, którego wielkość zależy od wydajności ekspresji ELP. Ten granulat ELP może początkowo wydawać się nieprzezroczysty, ale po schłodzeniu będzie wydawał się półprzezroczysty i może mieć brązowy kolor. Granulka ELP stanie się bardziej bezbarwna w miarę postępu oczyszczania i usuwania zanieczyszczeń.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać 1-5 ml pożądanego buforu do osadu. Zawiesić osad poprzez pipetowanie lub ustawienie probówki tak, aby obracała się w temperaturze 4 °C. UWAGA: Wymagana objętość buforu będzie zależała od wielkości osadu ELP, a tym samym od wydajności ekspresji ELP, gdzie należy dodać wystarczającą ilość buforu, aby umożliwić rozwiązanie osadu ELP. ELP o wysokiej zawartości cysteiny czerpią korzyści z oczyszczania w wodzie za pomocą 10 mM chlorowodorku tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP-HCl) o pH 7 w celu wyeliminowania interakcji dwusiarczkowych z białkami zanieczyszczającymi. ELP o wysokiej zawartości ładunku czerpią korzyści z oczyszczania w pH dostosowanym do neutralizacji ich ładunku i zmniejszenia oddziaływań elektrostatycznych z białkami zanieczyszczającymi.</li>
	<li>Przenieść zawieszony roztwór ELP w podwielokrotnościach o objętości 1 ml do czystych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g (wirowanie na zimno). Należy obserwować niewielką ilość nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki i wyrzucić osad.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie ELP: Kolejne rundy cyklu odwrotnego przejścia
<ol>
	<li>Indukować przejście ELP za pomocą ciepła i/lub dodania NaCl. Próbki mogą być inkubowane w bloku grzewczym lub w łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze powyżejtt. Jeśli jednak ELP jest połączony z białkiem (co wyklucza użycie ciepła) lub jeśli ELP ma wysoki Tt, którego nie można osiągnąć samym ciepłem, można dodać kroplami 5 M roztwór NaCl w celu wywołania przejścia ELP. UWAGA: Roztwór powinien zmętnieć, wskazując na separację faz ELP od roztworu.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 16 000 x g (gorące wirowanie). Jeżeli w kroku 3.1 użyto ciepła, należy przeprowadzić ten etap wirowania w temperaturze wyższej niż wymagana do wywołania przejścia ELP. Jeśli w kroku 3.1 użyto samego NaCl, wykonaj ten etap wirowania w temperaturze RT. UWAGA: Należy obserwować osad ELP.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, dodać 500-750 μl pożądanego buforu i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie lub ustawienie probówki tak, aby obracała się w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g (wirowanie na zimno). Należy obserwować niewielką ilość nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki i wyrzucić osad.</li>
	<li>Powtarzaj kroki od 3.1 do 3.5, aż w kroku 3.4 nie zaobserwuje się żadnych osadów zanieczyszczeń.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie po oczyszczeniu (opcjonalnie)
<ol>
	<li>W razie potrzeby należy przeprowadzić dializę próbki w odpowiednim buforze w celu usunięcia nadmiaru soli z oczyszczonego roztworu ELP. UWAGA: ELP przeznaczone do liofilizacji należy dializować w stosunku do ddH2O O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W razie potrzeby liofilizować ELP do długotrwałego przechowywania, zamrażając roztwór w temperaturze -80 °C przez 30 minut przed liofilizacją O/N. UWAGA: Liofilizacja nie powinna być stosowana w przypadku ELP z dołączonymi białkami.</li>
	<li>W razie potrzeby odzyskaj wolny peptyd lub białko z fuzji peptydów lub białek ELP, usuwając znacznik ELP:
	<ol>
		<li>Trawić fuzję peptydu lub białka ELP za pomocą biotynylowanej proteazy (zgodnie z zaleceniami dostawcy proteazy) lub z fuzją ELP proteazy odpowiadającą miejscu proteazy genetycznie zaprojektowanemu między peptydem lub białkiem a ELP.</li>
		<li>W razie potrzeby usunąć biotynylowaną proteazę za pomocą kulek zmodyfikowanych streptawidyną (zgodnie z zaleceniami dostawcy proteazy).</li>
		<li>Indukować przejście rozszczepionego ELP i/lub fuzji proteazy ELP przez kroplowe dodawanie 5 M roztworu NaCl.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 16 000 x g. UWAGA: Należy obserwować osad ELP.</li>
		<li>Zebrać supernatant i wyrzucić osad ELP. Dializować supernatant w stosunku do żądanego buforu lub użyć filtra odśrodkowego do przeprowadzenia wymiany buforu w celu usunięcia wysokiego stężenia soli z czystego roztworu peptydu lub białka.</li>
		<li>Potwierdź całkowite rozszczepienie wolnego peptydu lub białka ze znacznika ELP za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka: SDS-PAGE
<ol>
	<li>Przygotować próbki ELP do SDS-PAGE, mieszając 10 μl ELP rozcieńczonego w wodzie z 10 μl buforu do próbki zawierającego 2-merkaptoetanol. UWAGA: 40 μg ELP jest często wystarczające do oceny wielkości i czystości produktu ELP.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 100 °C przez 2 minuty, a następnie naładować ją na żel poliakrylamidowy wraz z drabinką białkową o odpowiedniej wielkości.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 180 V, aż barwnik zbliży się do dna żelu (około 45 min).</li>
	<li>Żel należy zabarwić roztworem 0,5 M CuCl2 przez 5 minut, jednocześnie kołysząc. UWAGA: ELP zazwyczaj nie są wizualizowane przez barwienie Coomassie Brilliant Blue, ponieważ niektóre sekwencje ELP nie wchodzą w interakcje z tym barwnikiem. Coomassie Brilliant Blue oddziałuje głównie z resztami argininy i słabo oddziałuje z innymi resztami zasadowymi - histydyną i lizyną - oraz resztami aromatycznymi - tryptofanem, tyrozyną i fenyloalaniną26. Tak więc ELP i fuzje peptydów lub białek ELP mogą być barwione Coomassie Brilliant Blue tylko wtedy, gdy ich pierwszorzędowa sekwencja zawiera wystarczającą liczbę tych specyficznych reszt.</li>
	<li>Sprawdzić, czy MW pasma ELP odpowiada MW teoretycznej MW oczekiwanej od genu ELP i czy nie ma żadnych zewnętrznych prążków zanieczyszczeń. UWAGA: Niektóre ELP migrują z pozorną MW do 20% wyższą niż oczekiwaneMW 9,27.</li>
</ol>
6. Charakterystyka: Spektrometria mas czasu przelotu wspomagana matrycowo desorpcją/jonizacją laserową (MALDI-TOF-MS)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór ELP w 50% wodnym roztworze acetonitrylu zawierającym 0,1% kwasu trifluorooctowego, aby osiągnąć stężenie ELP około 25 μM. UWAGA: Roztwór ten powinien być wolny od soli, dlatego ELP należy dializować w stosunku doH2Opo oczyszczeniu.</li>
	<li>Przygotować roztwór matrycowy nasyconego kwasu synapinowego w 50% wodnym roztworze acetonitrylu zawierającym 0,1% kwasu trifluorooctowego.</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu ELP do 9 μl roztworu matrycy, aby uzyskać stężenie ELP około 2,5 pmol/μl. UWAGA: Mieszaninę tę można dodatkowo rozcieńczyć roztworem matrycy w celu optymalizacji sygnału MALDI-TOF.</li>
	<li>Umieść 1-2 μl mieszaniny ELP na metalowej płytce MALDI i pozostaw miejsce do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Uzyskaj widma 5-10 za pomocą MALDI-TOF, aby określić stosunek masy do ładunku (m/z) ELP i wywnioskować jego zmierzone MW.</li>
</ol>
7. Charakterystyka: Zmętnienie zaprogramowane temperaturowo i dynamiczne rozpraszanie światła
<ol>
	<li>Oznaczyć T ELP za pomocą mętności zaprogramowanej temperaturowo:
	<ol>
		<li>Przygotować serię rozcieńczeń (np. od 5 do 100 μM) roztworów ELP w żądanym buforze.</li>
		<li>Za pomocą spektrofotometru UV-Vis z kontrolowaną temperaturą zmierz gęstość optyczną (O.D.) przy 350 nm w zakresie temperatur (np. 20-80 °C) przy szybkości ogrzewania 1 °C/min. UWAGA: Jeśli nie obserwuje się wzrostu średnicy zewnętrznej, Tt może przekroczyć górną granicę temperatury przyrządu. Pozorne Tt można zmniejszyć przez dodanie NaCl. Zacznij od 1 M NaCl i zwiększaj w krokach co 0,5 M, aż do wykrycia przejścia ELP w mierzalnym zakresie temperatur.</li>
		<li>Sprawdzić odwracalność przejścia ELP, mierząc spadek średnicy zewnętrznej w tym samym zakresie temperatur przy szybkości chłodzenia 1 °C/min.</li>
		<li>Określić T homopolimeru ELP, identyfikując punkt przegięcia profilu zmętnienia (średnica zewnętrzna wykreślona w funkcji temperatury). UWAGA: Temperaturę tę można łatwo zdefiniować na podstawie pochodnej krzywej OD, gdzie temperatura odpowiadająca maksimum pochodnej jest zdefiniowana jako Tt. Bardziej złożone architektury ELP będą charakteryzować się bardziej skomplikowanymi profilami zmętnienia i powinny być dalej analizowane zgodnie z opisem w sekcji 7.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodatkowa charakterystyka ELP, które wykazują bardziej złożone właściwości termiczne (np. kopolimery diblokowe ELP, które samoorganizują się w sferyczne miceli) uzyskuje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS):
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór ELP w żądanym buforze i przepuścić próbkę przez filtr o wielkości porów 20-450 nm. UWAGA: Wybór wielkości porów filtra będzie zależał od obecności, wielkości i stabilności wszelkich zespołów ELP w roztworze. Najmniejszy możliwy rozmiar porów filtra jest preferowany w celu wyeliminowania zanieczyszczeń, takich jak kurz, które obniżają jakość pomiarów DLS. Większy rozmiar porów filtra powinien być stosowany, gdy występuje znaczny opór podczas przepuszczania roztworu ELP przez mniejsze rozmiary porów filtra.</li>
		<li>Zmierzyć promień hydrodynamiczny (RH) w zakresie temperatur odpowiadającym obszarowi zainteresowania określonemu w profilu zmętnienia. UWAGA: Unimery ELP mają zazwyczaj RH<10 nm, zespoły nanocząstek mają RH~20-100 nm, a agregaty mają RH>500 nm. Każdy wzrost wilgotności względnej powinien odpowiadać wzrostowi średnicy zewnętrznej przy 350 nm mierzonemu za pomocą spektrofotometrii UV-Vis w funkcji temperatury, która jest proporcjonalna do wielkości cząstki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Chemistry+of+Biological+Free+Energy+Transduction+As+Demonstrated+by+Elastic+Protein-Based+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers.</a> J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).</li>
<li>Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+elastin-like+protein+in+pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).</li>
<li>Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+production+of+an+elastin-like+polypeptide+by+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).</li>
<li>Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+elastin-like+polypeptides+with+different+transition+temperatures+by+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).</li>
<li>Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+synthetic+protein-based+polymer+%28elastomer%29+gene+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).</li>
<li>Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+elastin-like+polypeptide+fusions+for+expression+and+purification+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).</li>
<li>Conrad, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELPylated+anti-human+TNF+therapeutic+single-domain+antibodies+for+prevention+of+lethal+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock.</a> Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).</li>
<li>Kaldis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+human+interleukin-10+fusions+in+tobacco+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures.</a> Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).</li>
<li>McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recursive+directional+ligation+by+plasmid+reconstruction+allows+rapid+and+seamless+cloning+of+oligomeric+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes.</a> Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).</li>
<li>Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+parallel+method+for+synthesizing+DNA+repeats+enables+the+discovery+of+%27smart%27+protein+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers.</a> Nat Mater. 10, 141-148 (2011).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+effects+of+chain+length+and+concentration+on+the+thermal+behavior+of+elastin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+of+Polypeptide+Inverse+Temperature+Transition+Depends+on+Mean+Residue+Hydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity.</a> Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+change+in+Gibbs+free+energy+for+hydrophobic+association+-+Derivation+and+evaluation+by+means+of+inverse+temperature+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions.</a> Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).</li>
<li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Hofmeister+anions+on+the+phase+transition+temperature+of+elastin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+physical+chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides.</a> The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).</li>
<li>Kim, B., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+actuation+of+inverse+phase+transition+of+a+stimulus-responsive+fusion+polypeptide+by+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding.</a> J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).</li>
<li>Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+peptide+motifs+from+calmodulin+confer+divalent+ion+selectivity+to+elastin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).</li>
<li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides%3A+biomedical+applications+of+tunable+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers.</a> Biopolymers. 94, 60-77 (2010).</li>
<li>McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+solid+tumors+by+elastin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).</li>
<li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. , (2010).</li>
<li>Shamji, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+fusion+protein+between+thermally+responsive+elastin-like+polypeptide+and+interleukin-1+receptor+antagonist%3A+sustained+release+of+a+local+antiinflammatory+therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic.</a> Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).</li>
<li>Hassouneh, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+multivalent+display+of+proteins+by+temperature+triggered+self-assembly+of+elastin-like+polypeptide+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers.</a> Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).</li>
<li>Lan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+nonchromatographic+method+for+the+purification+of+recombinant+proteins+using+elastin-like+polypeptide-tagged+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases.</a> Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).</li>
<li>Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-in-one+chromatography-free+purification%2C+tag+removal%2C+and+site-specific+modification+of+recombinant+fusion+proteins+using+sortase+A+and+elastin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides.</a> Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+expression+and+purification%22%5BJournal%5D)">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li>
<li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

ELP oferują niedrogi i wolny od chromatografii sposób oczyszczania poprzez wykorzystanie ich zachowania fazowego reagującego na bodziec. Podejście to wykorzystuje zachowanie LCST ELP i fuzji peptydów lub białek ELP w celu wyeliminowania zarówno rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń po ekspresji genetycznie kodowanych ELP w E. coli. Ta łatwość oczyszczania może być wykorzystana do produkcji ELP do różnych zastosowań lub może być wykorzystana do oczyszczania rekombinowanych peptydów lub białek, w których ELP może działać jako znacznik oczyszczający, który można usunąć w procesie po oczyszczeniu.
Oczyszczanie ELP obejmuje wstępne etapy lizy E. coli i usunięcia genomowych i nierozpuszczalnych szczątków komórkowych z surowego lizatu hodowlanego (ryc. 1), a następnie usunięcie pozostałości rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń przez ITC (ryc. 2). Wirowanie po wyzwoleniu przejścia ELP przez dodanie ciepła lub soli oddziela ELP od rozpuszczalnych zanieczyszczeń w supernatancie, w kroku zwanym gorącym wirowaniem. Po ponownym rozpuszczeniu ELP, roztwór jest ponownie odwirowywany w temperaturze poniżej tt w celu usunięcia nierozpuszczalnych osadów zanieczyszczających, w kroku zwanym zimnym wirowaniem. Naprzemienne wirowanie na gorąco i na zimno poprawia czystość roztworu ELP w każdym cyklu, przy niewielkim koszcie uzyskania plonu. Wydajność oczyszczania różni się w zależności od ELP T, długości i skondensowanych peptydów lub białek. Zazwyczaj protokół ten daje 100 mg oczyszczonego ELP na litr kultury E. coli, jednak plony mogą sięgać nawet 500 mg/l. Ostateczna czystość produktu ELP jest potwierdzona przez SDS-PAGE (rysunek 3). MW oczyszczonego ELP powinna być ściśle zgodna z teoretyczną MW kodowaną przez gen ELP. Jednak niektóre ELP migrują w SDS-PAGE z pozorną MW do 20% wyższą niż oczekiwaneMW 9,27. Bardziej precyzyjną analizę ELP MW można uzyskać za pomocą MALDI-TOF-MS, który może również dostarczyć dodatkowych informacji na temat czystości produktu ELP wraz z ortogonalnymi technikami analitycznymi, takimi jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).
Po oczyszczeniu ELP Tt jest mierzony za pomocą mętności zaprogramowanej pod kątem temperatury. Technika ta monitoruje średnicę zewnętrzną roztworu ELP podczas wzrostu temperatury. T t jest zależny od stężenia, dlatego zaleca się scharakteryzowanie szeregu stężeń istotnych dla zamierzonego zastosowania ELP. W przypadku homopolimerów ELP profil zmętnienia wykazuje pojedynczy gwałtowny wzrost, który odpowiada przejściu ELP od agregatów jednomerowych do agregatów w skali mikronowej (rysunek 4A). Tt definiuje się jako temperaturę odpowiadającą punktowi przegięcia w profilu zmętnienia, precyzyjnie wyznaczoną jako maksimum pierwszej pochodnej średnicy zewnętrznej w odniesieniu do temperatury. Odwracalność przejścia fazowego ELP potwierdza spadek średnicy zewnętrznej w stosunku do wartości wyjściowej, gdy temperatura jest obniżana poniżej Tt (rysunek 4B). Profil zmętnienia wraz ze wzrostem i spadkiem temperatur będzie różnił się wielkością i kinetyką ze względu na osiadanie koacerwatów ELP i zmienną histerezę rozpuszczania ELP. Fuzje peptydów lub białek ELP podobnie wykazują zachowanie LCST w ten sposób, w którym peptyd lub białko połączone z ELP wpływana TT. W przypadku fuzji białek ELP przejście jest odwracalne poniżej temperatury topnienia białka. Podczas gdy turbidymetria zaprogramowana temperaturowo jest doskonałą metodą wstępnej charakterystyki termicznej produktów ELP, alternatywne techniki, takie jak różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC), mogą być również stosowane do pomiaru ELP Tt.
ELP o bardziej złożonej architekturze wykazują bardziej skomplikowane zachowania termiczne, które można również scharakteryzować za pomocą zmętnienia zaprogramowanego w temperaturze. Na przykład kopolimery diblokowe ELP wykazują charakterystyczny profil zmętnienia odpowiadający ich samoorganizacji w sferyczne micele w krytycznej temperaturze micelizacji wywołanej temperaturą. W przypadku takich kopolimerów diblokowych ELP średnica zewnętrzna zwykle najpierw wzrasta o 0,1-0,5 jednostki powyżej linii podstawowej, wskazując na przejście od unimerów do miceli, po czym gwałtowny wzrost średnicy zewnętrznej (do 2,0 jednostek powyżej linii podstawowej) w wyższej temperaturze wskazuje na tworzenie się agregatów w skali mikronowej (rysunek 5A). Dodatkowe informacje na temat samoorganizujących się struktur ELP wyzwalanych temperaturą uzyskuje się za pomocą DLS, techniki, która mierzywilgotność względną zespołów ELP w roztworze. Zmiany wilgotnościwzględnej są ściśle zgodne ze zmianami średnicy zewnętrznej mierzonymi za pomocą mętności (ryc. 5B). Unimery ELP zwykle wykazują RH<10 nm, podczas gdy zespoły nanocząstek wykazują RH~20-100 nm, a agregaty wykazują RH>500 nm. Dodatkowe informacje o samoorganizujących się nanocząstkach ELP, takie jak liczba agregacji i morfologia, można uzyskać za pomocą statycznego rozpraszania światła lub kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej 17,23,29.
Ze względu na możliwość przestrajania właściwości termicznych ELP, różne konstrukcje ELP uzyskuje się zakres Tts. Ważne jest, aby pamiętać, że nieodłączneT t będzie miało wpływ na optymalizację protokołu oczyszczania dla każdego ELP, gdzie ekstremalnie niskie lubwysokie T ts będzie wymagało największej modyfikacji tego standardowego protokołu. ELP o ekstremalnie wysokich temperaturach przejścia mogą nie nadawać się do oczyszczania przy takim podejściu. Jeśli projekt nowych ELP i fuzji peptydów lub białek ELP może zagrozić odpowiedzi termicznej ELP, można dołączyć prosty znacznik histydyny do alternatywnego oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa do unieruchomionego metalu. Dodatkowo, charakterystyka sekwencji ELP może wymagać modyfikacji tego protokołu, jeśli pozostałość gościa jest ładowana. Manipulacja pH buforu może być stosowana jako metoda zmiany całkowitego ładunku ELP w celu wyeliminowania oddziaływań elektrostatycznych z zanieczyszczeniami17. Ponadto protokół ten jest odpowiedni dla szczególnych okoliczności fuzji ELP z peptydami i białkami, gdy podejmowane są odpowiednie środki w celu zapewnienia, że proces oczyszczania nie zaburza aktywności skonoperowanej części. Uwagi w całym protokole dotyczące takich modyfikacji służą ukierunkowaniu oczyszczania ELP, które mogą stanowić takie wyzwania w odniesieniu do problemów związanych zTt, ładunkiem lub fuzją.
Oczyszczanie ELP za pomocą ich zachowania LCST stanowi proste i wolne od chromatografii podejście do oczyszczania większości ELP i fuzji peptydów lub białek ELP ulegających ekspresji w E. coli. Podsumowany tutaj protokół pozwala na oczyszczanie ELP w ciągu jednego dnia przy użyciu sprzętu, który jest wspólny dla większości laboratoriów biologicznych. Mamy nadzieję, że łatwość oczyszczania ELP i ich fuzji zachęci do coraz większej różnorodności projektów ELP do nowych zastosowań w materiałoznawstwie, biotechnologii i medycynie.

Elastynopodobne polipeptydy (ELP) to biopolimery złożone z powtarzającego się pentapeptydu VPGXG, gdzie X, reszta gościa, to dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny. ELP wykazują zachowanie przejścia fazowego o niższej temperaturze krytycznej roztworu (LCST), tak że jednorodny roztwór ELP rozdzieli się na dwie fazy po podgrzaniu do LCST, co jest powszechnie nazywane odwrotną temperaturą przejścia (TT) w literaturze ELP1. Obie fazy składają się z bardzo rozcieńczonej fazy globulki ELP i fazy osadowej bogatej w ELP. Osad bogaty w ELP powstaje w krótkim czasie po agregacji łańcuchów ELP w cząstki o rozmiarach mikronów, które następnie łączą się. To zachowanie występuje w zakresie kilku stopni Celsjusza i jest zazwyczaj odwracalne, ponieważ jednorodny roztwór jest odzyskiwany po powrocie do temperatury poniżej tt.
ELP są zazwyczaj syntetyzowane w Escherichia coli (E. coli) ze sztucznego genu, który jest ligowany do plazmidu ekspresyjnego. Plazmid ten jest następnie przekształcany w linię komórkową E. coli, która jest optymalna dla ekspresji białek. Użyliśmy wyłącznie systemu wektorów pET T7-lac do ekspresji dużej różnorodności ELP w E. coli, chociaż inne systemy ekspresji w drożdżach2-4, grzybach5 i roślinach6-8 zostały również wykorzystane przez innych badaczy. Istnieje wiele podejść do genetycznej konstrukcji powtarzalnych genów ELP, w tym rekurencyjna ligacja kierunkowa (RDL)9, rekurencyjna kierunkowa ligacja przez rekonstrukcję plazmidu (PRe-RDL)10 i amplifikacja cyklu tocznego z rozszerzeniem nakładania się (OERCA)11. Zdolność do inżynierii ELP na poziomie genetycznym daje możliwość wykorzystania technik rekombinacji DNA do tworzenia ELP o różnych architekturach (np. monobloki, dibloki, tribloki itp.), które mogą być dalej dołączane do funkcjonalnych peptydów i białek. Kontrola na poziomie genetycznym zapewnia również, że każdy ELP ulega ekspresji z dokładną długością i składem podyktowanym przez jego matrycę plazmidu genetycznego, co zapewnia doskonale monodyspersyjne produkty biopolimerowe.
Właściwości termiczne każdego ELP zależą od parametrów wewnętrznych biopolimeru, takich jak jego masa cząsteczkowa (MW) i sekwencja, a także czynników zewnętrznych, w tym jego stężenia w roztworze i obecności innych substancji rozstanowych, takich jak sole. Długość ELP12 i jego skład pozostałości gościnnych 1,13,14 to dwa ortogonalne parametry w konstrukcji ELP, które można wykorzystać do kontroliTt, gdzie hydrofobowe pozostałości gości i dłuższe łańcuchy skutkują niższym Tts, podczas gdy hydrofilowe pozostałości gościnne i krótsze długości łańcuchów skutkują wyższym Tts. Stężenie ELP jest odwrotnie proporcjonalne do Tt, w których roztwory o większym stężeniu ELP mają niższe Tts12. Rodzaj i stężenie soli mają również wpływ na ELP Tt, gdzie wpływ soli jest zgodny z serią Hofmeistera15. Aniony kosmotropowe (Cl- i wyższe w serii Hofmeistera) obniżają ELP Tt, a zwiększenie stężenia soli wzmacnia ten efekt. Te wewnętrzne i zewnętrzne parametry można dostroić w celu uzyskania zachowania termicznego w docelowym zakresie temperatur, który jest wymagany dla określonego zastosowania ELP.
Reagujące na bodźce zachowanie ELP jest przydatne w różnorodnych zastosowaniach, w tym w biosensoryce16,17, inżynierii tkankowej18 i dostarczaniu leków19,20. Dodatkowo, gdy ELP są łączone z peptydami lub białkami na poziomie genetycznym, ELP może służyć jako prosty znacznik oczyszczania, aby zapewnić niedrogą metodę wsadową do oczyszczania rekombinowanych peptydów lub białek, która nie wymaga chromatografii21. Modyfikacja procesu oczyszczania zapewnia utrzymanie aktywności peptydu lub białka połączonego z ELP. Fuzje peptydów lub białek ELP można oczyścić do zastosowań, w których znacznik ELP jest przydatny22,23 lub alternatywnie, gdy wymagany jest wolny peptyd lub białko, można wprowadzić miejsce rozpoznawania proteazy między peptydem lub białkiem a ELP. Usunięcie znacznika ELP można następnie osiągnąć poprzez trawienie z wolną proteazą lub fuzję proteazy ELP, przy czym ta ostatnia zapewnia dodatkową łatwość przetwarzania, ponieważ ostatnia runda oczyszczania ELP może oddzielić znacznik ELP i fuzję proteazy ELP od docelowego peptydu lub białka w jednym kroku24,25. Poniższy protokół opisuje procedurę oczyszczania ELP i fuzji peptydów lub białek ELP za pomocą ich właściwości termicznych oraz omawia podstawowe techniki charakteryzowania odpowiedzi termicznej produktów ELP.

<table><tbody><tr><td>Wektory ekspresyjne pET-24a(+) pET-25b(+)</td><td>Novagen</td><td>69749-3 69753-3</td><td>T7-lac z opornością na kanamycynę (pET-24) lub ampicylinę (pET-25).</td></tr><tr><td>Ultra BL21 (DE3) kompetentne komórki</td><td>Edge BioSystems</td><td>45363</td><td>Competent E. coli do ekspresji białek rekombinowanych.</td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) Pożywka do uprawy w suchym proszku</td><td>MO BIO Laboratories</td><td>12105</td><td>Pożywka jest odtwarzana w DI H2O i sterylizowana w autoklawie przed użyciem.</td></tr><tr><td>Izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>IPTG jest odtwarzany w DI H2O, sterylnie filtrowany i dodawany do kultur w celu wywołania zwiększonej ekspresji.</td></tr><tr><td>Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td>Te tabletki PBS po rozpuszczeniu w 1 l DI H2O, dają 10 mM bufor fosforanowy ze 140 mM NaCl i 3 mM KCl o pH 7,4 w temperaturze 25 °C.</td></tr><tr><td>Roztwór polietylenoiminy (PEI) (~50% w/v)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195444</td><td>PEI jest przygotowywany jako 10% (w/v) roztwór w dejonizowanym H2O.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe szybkoobrotowe Nalgene Oak Ridge, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0050</td><td>Te probówki z okrągłym dnem wytrzymują wirowanie z dużą prędkością 30-50 ml.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td>Podstawowy roztwór TCEP-HCl przygotowuje się w temperaturze 100 mM w DI H2O i dostosowuje do pH 7,0. W przypadku ELP o wysokiej zawartości cysteiny roztwór podstawowy tego środka redukującego dodaje się do osadu ELP, aby osiągnąć 10 mM w H2O.</td></tr><tr><td>Gotowy żel Tris-HCl żel, 4-20% liniowy gradient poliakrylamidowy żel, 10 dołków, 30 &mu; l</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-1105</td><td>Te liniowe żele gradientowe zapewniają dobrą wizualizację ELP o zakresie MW.</td></tr><tr><td>Chlorek miedzi dwuwodny (CuCl2&#183; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C454-500</td><td>Przefiltrowany roztwór 0,5 M przygotowuje się do barwienia ujemnego żeli poliakrylamidowych Tris-HCl.</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Anotop 10: 0,02 i mu; M 0,1 &MU; M 0,2 &MU; m</td><td>Whatman</td><td>6809-1002 6809-1012 6809-1022</td><td>Te filtry strzykawkowe o średnicy 10 mm umożliwiają przygotowanie małych objętości do pomiarów DLS.</td></tr><tr><td>Filtr Millex-HV: 0,45 &mu; m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHVX13NK</td><td>Te filtry strzykawkowe o średnicy 13 mm umożliwiają przygotowanie małych objętości roztworów z dużymi zespołami nanocząstek do pomiarów DLS.</td></tr></tbody></table>

niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Polipeptydy podobne do elastyny to powtarzalne biopolimery, które wykazują niższą temperaturę krytyczną roztworu podczas przemiany fazowej, istniejące jako rozpuszczalne unimery poniżej charakterystycznej temperatury przejścia i agregujące się w mikronowe koacerwatory powyżej ich temperatury przejścia. Konstrukcja polipeptydów podobnych do elastyny na poziomie genetycznym pozwala na precyzyjną kontrolę ich sekwencji i długości, co decyduje o ich właściwościach termicznych. Polipeptydy podobne do elastyny są wykorzystywane w różnych zastosowaniach, w tym w biodetekcji, inżynierii tkankowej i dostarczaniu leków, gdzie temperaturę przejścia i architekturę biopolimeru ELP można dostosować do konkretnego zastosowania. Co więcej, zachowanie przemian fazowych w dolnej temperaturze krytycznej roztworu polipeptydów podobnych do elastyny umożliwia ich oczyszczanie przez ich reakcję termiczną, tak że ich selektywne koacerwowanie i rozpuszczanie umożliwia usunięcie zarówno rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń po ekspresji w Escherichia coli. Podejście to może być stosowane do oczyszczania samych polipeptydów podobnych do elastyny lub jako narzędzie do oczyszczania fuzji peptydów lub białek, w których rekombinowane peptydy lub białka genetycznie dołączone do znaczników polipeptydowych podobnych do elastyny można oczyścić bez chromatografii. Protokół ten opisuje oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny i ich fuzji peptydów lub białek oraz omawia podstawowe techniki charakterystyki w celu oceny zachowania termicznego czystych produktów polipeptydowych podobnych do elastyny.

W niniejszym rozdziale opisano reprezentatywne wyniki oczyszczania i charakterystyki homopolimeru ELP oraz diblock copolymeru ELP. Po 24 h ekspresji w E. coli, komórki są zbierane przez wirowanie i lizowane za pomocą sonikacji. Zazwyczaj po sonikacji następuje subtelna zmiana barwy, co potwierdza wystąpienie wystarczającej lizy komórek (Rysunek 1A). Po dodaniu PEI komponenty genomiczne oraz szczątki komórkowe są zbierane przez wirowanie, co pozwala oddzielić duży osad nierozpuszczalnych zanieczyszczeń od rozpuszczalnego ELP znajdującego się w supernatancie (Rysunek 1B). ELP jest następnie oczyszczany metodą odwróconego cyklu przejścia (ITC), która wykorzystuje właściwości LCST do oddzielenia ELP zarówno od rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń (Rysunek 2)28. Przejście fazowe ELP jest wywoływane przez dodanie ciepła i/lub soli. Wirowanie prowadzi do powstania osadu na dnie probówki, który składa się z ELP oraz niektórych nierozpuszczalnych zanieczyszczeń (Rysunek 1C). Ten krok – nazywany wirowaniem na gorąco (hot spin) – pozwala usunąć rozpuszczalne zanieczyszczenia zawarte w supernatancie, podczas gdy osad ELP jest zachowywany i resuspendTime w zimnym buforze. Ponownie rozpuszczony ELP jest wirowany w temperaturze 4 °C. Ten krok – nazywany wirowaniem na zimno (cold spin) – pozwala usunąć osad nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, podczas gdy supernatant zawierający rozpuszczalny ELP jest zachowywany. Powtarzanie cyklu naprzemiennych wirowań na gorąco i na zimno zwiększa czystość ELP, jednak kosztem niewielkiego spadku wydajności, ponieważ w każdej rundzie ITC część pozostałego ELP jest tracona w probówkach wirówki oraz na końcówkach pipet.
Poprawność oczyszczania ELP oraz fuzji ELP z peptydami lub białkami potwierdza się za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Małe alikwoty pobierane na poszczególnych etapach procesu oczyszczania wykazują stopniowe oczyszczanie ELP z lizatu E. coli. ELP jest nadekspresowane w surowym lizacie E. coli, a ilość zanieczyszczeń maleje z każdą kolejną rundą ITC (Rycina 3). Oczyszczone ELP widoczne jest jako pojedynczy prążek w pobliżu przewidywanej teoretycznej masy cząsteczkowej MW.
Wartość Tt ELP określa się za pomocą turbidymetrii programowanej temperaturowo. Profil mętności homopolimeru ELP wykazuje pojedynczy, gwałtowny wzrost O.D. przy 350 nm (około 2,0 jednostek powyżej linii bazowej dla stężenia ELP 25 μM) (Rycina 4A). Skanowanie mętności podczas chłodzenia potwierdza odwracalny charakter przejścia ELP, ponieważ O.D. powraca do poziomu bazowego po obniżeniu temperatury poniżej Tt (Rycina 4B). Diblokowe kopolimery ELP wykazują bardziej złożony profil mętności w porównaniu do homopolimerów ELP. O.D. zazwyczaj najpierw wzrasta do 0,1-0,5 jednostek powyżej linii bazowej, po czym następuje gwałtowny wzrost O.D. do 2,0 jednostek powyżej linii bazowej (Rycina 5A). Pomiary DLS dostarczają informacji o zmianie RH w zależności od temperatury, co potwierdza dane uzyskane z profilu mętności (Rycina 5B).
<img alt="Schemat procesu sonikacji; probówki pokazujące tworzenie się osadu białkowego podczas wirowania." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wstępne oczyszczanie ELP. Po 24 h ekspresji komórki E. coli są zbierane przez wirowanie i resuspendowane w PBS. A) Komórki są lizowane poprzez sonikację, której towarzyszy subtelna zmiana koloru, w wyniku której lizat ciemnieje po sonikacji. B) Po dodaniu PEI w celu kondensacji zanieczyszczeń DNA, lizat jest wirowany, a duży osad nierozpuszczalnych szczątków zostaje oddzielony od rozpuszczalnych ELP w supernatancie. C) Przejście ELP jest indukowane poprzez przyłożenie ciepła i/lub dodanie soli, a wirowanie prowadzi do powstania półprzezroczystego osadu ELP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat oczyszczania ITC; proces koacervacji ELP i wirowanie; metoda krok po kroku." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Odwrócony cykl przejścia. ELP jest oczyszczane z zanieczyszczeń rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych z wykorzystaniem jego właściwości LCST. Zaczynając od lizatu bogatego w ELP (1), indukuje się przejście ELP poprzez dodanie ciepła i/lub soli, a następnie ELP jest oddzielane przez wirowanie (wirowanie na gorąco) (2). Osad ELP jest zachowany (3a), natomiast nadsącz zawierający zanieczyszczenia rozpuszczalne zostaje odrzucony (3b). ELP jest resuspensowane w zimnym buforze (4) i ponownie wirowane w 4 °C (wirowanie na zimno) (5). Osad zawierający zanieczyszczenia nierozpuszczalne zostaje odrzucony (6a), a nadsącz zawierający rozpuszczalne ELP jest zachowany (6b). Cykle naprzemiennych wirowań na gorąco i na zimno są powtarzane do momentu uzyskania pożądanej czystości, określonej za pomocą SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żel SDS-PAGE wykazujący rozdział białek, ścieżki oznaczone 1-10, wyniki procesu oczyszczania białek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza SDS-PAGE produktów oczyszczania ELP. Prawidłowe oczyszczanie ELP potwierdzono za pomocą SDS-PAGE. Nadekspresja ELP jest widoczna w surowym lizacie E. coli po sonikacji (2). Po dodaniu PEI i wirowaniu rozpuszczalne ELP pozostaje w dużej mierze w nadosadzie (3), choć część ELP zostaje utracona wraz z odrzuconym osadem zanieczyszczeń nierozpuszczalnych (4). Nadosad po pierwszym wirowaniu na gorąco zawiera znaczną ilość rozpuszczalnych zanieczyszczeń (5). Nadosad po pierwszym wirowaniu na zimno wskazuje na dobrą separację ELP od zanieczyszczeń nierozpuszczalnych (6). Dodatkowe cykle wirowania na gorąco (7) i na zimno (8) usuwają odpowiednio pozostałe rozpuszczalne i nierozpuszczalne zanieczyszczenia, aż do momentu, gdy nadosady po końcowym wirowaniu na gorąco (9) i na zimno (10) nie wykazują obcych pasm zanieczyszczeń, co potwierdza satysfakcjonującą czystość produktu ELP. Ten homopolimer ELP o sekwencji SKGPG-(VGVPG)80-Y ma oczekiwaną masę cząsteczkową 33.37 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe denaturacji termicznej, gęstość optyczna w funkcji temperatury, wpływ stężenia i ogrzewania, wykres." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Charakteryzacja homopolimeru ELP za pomocą turbidymetrii programowanej temperaturowo. Tt dla ELP jest wyznaczany poprzez monitorowanie O.D. przy 350 nm podczas zwiększania temperatury w tempie 1 °C/min. A) Homopolimery ELP wykazują pojedynczy, gwałtowny wzrost O.D., który definiuje ich Tt przy danym stężeniu. B) Odwracalność przejścia ELP jest weryfikowana poprzez monitorowanie O.D. przy 350 nm roztworu o stężeniu 25 μ M podczas obniżania temperatury; odwracalność jest potwierdzona powrotem O.D. do poziomu bazowego. Ten homopolimer ELP posiada sekwencję SKGPG-(VGVPG)80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres gęstości optycznej w funkcji temperatury pokazujący zmiany promienia hydrodynamicznego w zależności od poziomów stężenia." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Charakterystyka diblock copolymeru ELP za pomocą turbidymetrii programowanej temperaturowo i dynamicznego rozpraszania światła. ELPy ulegające samoorganizacji w nanoskali, takie jak diblock kopolimery ELP tworzące sferyczne micele, wykazują bardziej złożone profile mętności. A) Umiarkowany wzrost gęstości optycznej (O.D.) wskazuje na przejście z unimerów w micele, przed gwałtownym wzrostem O.D., który sygnalizuje całkowitą agregację ELP w agregaty w skali mikronowej. B) Pomiary DLS potwierdzają zachowanie wywnioskowane z profilu mętności dla roztworu o stężeniu 25 μM, dostarczając informacji o zmianie RH w funkcji temperatury. W tym przypadku unimer ELP ma RH ~8 nm, a micela ma RH ~25 nm. Ten diblock kopolimer ELP posiada sekwencję GCGWPG-(VGVPG)60-(AGVPGGGVPG)30-PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Polipeptydy podobne do elastyny to biopolimery reagujące na bodźce, o różnych zastosowaniach, od oczyszczania białek rekombinowanych po dostarczanie leków. Protokół ten opisuje oczyszczanie i charakterystykę polipeptydów podobnych do elastyny oraz ich fuzji peptydów lub białek z Escherichia coli przy użyciu ich zachowania przemiany fazowej w dolnej temperaturze roztworu krytycznego jako prostej alternatywy dla chromatografii.

Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów podobnych do elastyny z E. coli za pomocą odwróconego cyklu przejścia (inverse transition cycling). Osiąga się to najpierw poprzez zebranie lizatu z komórek E. coli, które wyekspresowały rekombinowany polipeptyd podobny do elastyny, oraz usunięcie nierozpuszczalnych resztek komórkowych poprzez wirowanie. Drugim krokiem jest usunięcie rozpuszczalnych zanieczyszczeń poprzez indukowanie przejścia polipeptydu podobnego do elastyny za pomocą dodania soli lub ciepła.Następnie osad polipeptydu podobnego do elastyny zbiera się za pomocą wirowania, a nadsącz jest odrzucany. Krok ten nazywa się wirowaniem na gorąco (hot spin). W kolejnym etapie resuspensowany roztwór polipeptydu podobnego do elastyny poddaje się wirowaniu w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.Rozpuszczalny polipeptyd podobny do elastyny w supernatancie zostaje zachowany, a osad jest odrzucany. Krok ten nazywany jest wirowaniem na zimno; cykle wirowania na gorąco i na zimno należy powtarzać do czasu uzyskania satysfakcjonującej czystości polipeptydu podobnego do elastyny. Ostatecznie, odwrócone cykle przejścia pozwalają na otrzymanie czystych produktów polipeptydów podobnych do elastyny, które mogą zostać scharakteryzowane pod kątem zastosowania w różnych aplikacjach biomedycznych.Polipeptydy podobne do elastyny oczyszczone tą techniką mają szereg przydatnych zastosowań, w tym w biosensingu, inżynierii tkankowej i dostarczaniu leków, gdzie temperaturę przejścia oraz architekturę biopolimeru polipeptydu podobnego do elastyny można precyzyjnie dostosować do każdego zastosowania. Aby rozpocząć, należy wyekspresować wybrany plazmid kodujący ELP w e coli, stosując warunki opisane w towarzyszącym protokole tekstowym. Po inkubacji jednej litr kultury w inkubatorze z wytrząsaniem przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, należy przenieść kulturę do jednej litrowej butelki wirówkowej, a następnie wirować ją z prędkością 2000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.Następnie odlej nadsącz i zutylizuj go. Resuspenduj osad w wodzie z PBS lub innym wybranym buforze do całkowitej objętości 45 ml. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.Umieścić zawiesinę komórkową w lodzie, a po ochłodzeniu sonikować przez łącznie dziewięć minut w cyklach: 10 sekund pracy i 20 sekund przerwy. Zastosować moc wyjściową 85 watów. Po pierwszej serii sonikacji pozwolić próbce chłodzić się w lodzie przez około 10 minut, a następnie powtórzyć dziewięciominutowy cykl sonikacji.Przenieś lizat do 50 ml okrągłodennej probówki wirówkowej. Następnie dodaj dwa mililitry 10% (w/v) glikolu polietylenowego na każdy litr hodowli i wstrząśnij probówką w celu wymieszania, a następnie odwiruj zawartość przy 16 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przenieś nadsącz do czystej 50 ml okrągłodennej probówki wirówkowej i odrzuć osad.Do próbki dodać krystaliczny chlorek sodu, aby wywołać przejście ELP. Po rozpuszczeniu soli roztwór stanie się mętny, co wskazuje na separację fazową ELP z roztworu. Następnie osadzić ELP poprzez wirowanie próbki przy 16 000 GS przez 10 minut.W temperaturze pokojowej pellet ELP może początkowo wydawać się nieprzezroczysty; należy odlać nadsącz, a następnie, po schłodzeniu, dodać od jednego do pięciu mililitrów odpowiedniego buforu. Pellet ELP może stać się półprzezroczysty i przybrać brązowy kolor. Ponownie zawiesić pellet poprzez pipetowanie lub rotowanie probówki w temperaturze 4 °C.Następnie pipetuj aliquoty po 1 ml resuspenderowanego roztworu ELP do czystych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Wirować probówki z prędkością 16 000 GS przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przenieś nadsącz do czystej probówki i odrzuć osad.Wywołaj przejście ELP poprzez dodanie chlorku sodu. Jeśli ELP posiada wysoką temperaturę przejścia, której nie można wywołać samą solą, inkubuj próbkę w bloku grzejnym przez 15 minut w temperaturze powyżej temperatury przejścia ELP. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 16, 000 GS przez 10 minut w temperaturze wyższej niż temperatura zastosowana w etapie przejścia ELP.Odlej nadsącz i resuspenduj osad ELP w 500 do 750 µL odpowiedniego buforu poprzez pipetowanie lub rotowanie probówki w temperaturze 4 °C, aż do ponownego rozpuszczenia osadu. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby wytrącić nierozpuszczalne zanieczyszczenia. Przenieś następnie nadsącz do czystej probówki i odrzuć osad. Powtarzaj cykle odwróconej przejścia do momentu, gdy nie będzie zaobserwowano osadu z zanieczyszczeniami.Zazwyczaj wymaga to od dwóch do pięciu cykli. Należy przygotować szereg rozcieńczeń roztworów ELP w PBS lub innym wybranym buforze. Następnie, używając spektrofotometru UV z kontrolą temperatury, należy zmierzyć gęstość optyczną przy 350 nanometrach w zakresie określonych temperatur, podgrzewając próbkę z szybkością jednego stopnia Celsjusza na minutę.Jeśli nie zaobserwowano wzrostu gęstości optycznej, temperatura przejścia może przekraczać górną granicę temperatury. Następnie należy zmierzyć spadek gęstości optycznej w tym samym zakresie temperatur przy szybkości chłodzenia wynoszącej jeden stopień Celsjusza na minutę. Aby zweryfikować odwracalność wykresu przejścia ELP (gęstość optyczna w funkcji temperatury), należy następnie wyznaczyć temperaturę przejścia homopolimeru ELP.Poprzez zidentyfikowanie punktu przegięcia na tym profilu mętności potwierdzono pomyślną puryfikację LP za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, co widać tutaj. Liczba zanieczyszczeń jest znacznie większa w początkowym lizacie E. coli w porównaniu z próbką po jednej rundzie odwróconego cyklu przejścia. Temperatura przejścia ELP jest określana poprzez programowaną temperaturą mętność dla homopolimeru ELP.Profil mętności wykazuje pojedynczy, gwałtowny wzrost gęstości optycznej, który definiuje temperaturę przejścia przy danej koncentracji. Odwracalny charakter przejścia ELP potwierdzono w pomiarze mętności podczas chłodzenia. Kopolimery blokowe ELP wykazują bardziej złożony profil mętności niż homopolimery LP.Następnie można przeprowadzić pomiary dynamicznego rozpraszania światła, aby potwierdzić zachowanie tych LP wywnioskowane z pliku profilu mętności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oczyszczać rekombinowane polipeptydy podobne do elastyny z E. coli, stosując odwrócony cykl przejścia fazowego. Nie, nie, nie, nie, nie.

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niechromatograficzna czyszczenie rekombinowanych polipeptydów przypominających elastynę i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Technologie rekombinowane umożliwiły projektantom materiałów tworzenie nowatorskich sztucznych białek z dostosowanymi funkcjami do zastosowań inżynierii tkankowej. Na przykład sztuczne białka macierzy zewnątrzkomórkowej można zaprojektować tak, aby zawierały domeny strukturalne i biologiczne pochodzące z natywnych ECM. W tym miejscu opisujemy budowę i oczyszczanie białek aECM zawierających powtórzenia podobne do elastyny.

Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Ten protokół opisuje procedurę wzbogacania białek ECM z tkanek lub guzów oraz deglikozylacji i trawienia preparatów wzbogaconych w ECM na peptydy w celu analizy ich składu białkowego za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Protokół ten opisuje szybką, powtarzalną metodę ekstrakcji i wytrącania opartą na rozpuszczalnikach organicznych do oczyszczania polipeptydu podobnego do elastyny (ELP) z Escherichia coli, oferując potencjalnie skalowalną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania ELP.

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Naucz się niechromatograficznej metody oczyszczania polipeptydów elastynopodobnych z Escherichia coli przy użyciu cyklicznej inwersji przejścia fazowego. Ta technika umożliwia uzyskanie czystych biopolimerów.

Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal

Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów