Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie czystych merozoitów Plasmodium falciparum o wysokiej wydajności w celu ilościowego określenia ich opsonizacji przez przeciwciała ludzkie. Jest to osiągane poprzez wstępne hamowanie pękania schizontów za pomocą E 64 w celu wytworzenia struktur merozoitów zamkniętych w błonie. W drugim kroku wolne merozoity są zbierane, a następnie barwione bromkiem AUM w celu ich kwantyfikacji. W ostatnim kroku merozoity są inkubowane z różnymi próbkami ludzkiej osocza oraz ludzkimi komórkami monocytarnymi THP-1.

Ostatecznie opsonizację merozoitów przez różne próbki ludzkiej osocza można zróżnicować za pomocą cytometrii przepływowej. Przewagą tej techniki nad istniejącymi testami funkcjonalnej odporności na merozoity malarii jest wykorzystanie nienaruszonych merozoitów oraz fakt, że odpowiedzi fagocytozy są silne i mierzalne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii malarii, takie jak: jakie jest znaczenie przeciwciał oksydacyjnych i fagocytozy dla odporności przeciw malarii u osób szczepionych lub naturalnie eksponowanych?

Wizualizacja tej techniki jest kluczowa, ponieważ moment dodania E 64 ma istotne znaczenie dla zapewnienia powstania mezo. Ze względu na to, że przygotowanie i enumeracja mezo są wymagające technicznie, po separacji magnetycznej trofozoitów P. falciparum w późnym stadium należy ocenić dojrzałość pasożytów poprzez utrwalenie cienkiego rozmazu pasożytów w 100% metanolu przez 10 sekund i ich barwienie w Giza przez trzy minuty. Należy zbadać zabarwiony preparat pod mikroskopem, aby upewnić się, że pasożyty niemal całkowicie wypełniają erytrocyty i znajdują się we wczesnym stadium schizonty.

Jeśli pasożyty nie osiągnęły odpowiedniego stadium dojrzałości, należy kontynuować ich inkubację do czasu właściwego rozwoju. Po osiągnięciu odpowiedniej dojrzałości izolowane schizonty należy traktować 10 µM E 64 i inkubować przez kolejne od sześciu do 10 godzin. Po inkubacji z E 64 należy przygotować rozmaz z potraktowanych pasożytów.

Utrwal preparat na szkiełku w 100% metanolu i zabarw go metodą Giemsy, aby potwierdzić, że co najmniej 50% pasożytów utworzyło błonę. Osad z pozostałych próbek traktowanych E 64 wiruj przez osiem minut przy 1900 Gs w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj pasożyty w 50 mililitrach PBS w temperaturze pokojowej.

Przemyj podłoźem w celu usunięcia pozostałości ludzkiej surowicy. Po odlaniu supernatantu resuspenduj osad pasożytów w dwóch mililitrach podłoża do płukania, a następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 1,2 µm, zbierając maites i kryształy hemonu do probówki o pojemności 10 ml. Następnie przymocuj małą kolumnę magnetyczną do magnesu i zrównoważ ją 500 µl pożywki THP one.

Przepuść filtrat przez kolumnę magnetyczną trzy razy, zbierając koraliki magnetyczne z frakcją przepływową przy każdym przejściu. Następnie przemyj kolumnę dwoma mililitrami medium THP 1 w temperaturze pokojowej, aby zebrać pozostałe koraliki magnetyczne.

Usunięcie heminy jest krytycznym etapem oczyszczania maites. Jeśli maites nie zostaną oddzielone od heminy, utworzą się klastry maites-hemina, co doprowadzi do niedokładnego liczenia maites metodą cytometrii przepływowej. Komórki THP-1 mogą fagocytować heminę, w związku z czym klastry maites-hemina mogą być również wchłaniane.

W związku z tym, jeśli hemyna nie zostanie usunięta, potencjał opsonizacyjny badanego osocza zostanie również przeceniony. Wybarwiaj zebrane maite w stężeniu 10 µg/ml bromku ahy w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Po 30 minutach odwiruj maite, odlej nadsadź przelewając ją do odpowiedniego pojemnika na odpady i przemyj osad z maite w 4 ml pożywki THP one pellet maites.

Następnie resuspenduj komórki w 15 mililitrach pożywki TP one, chroniąc je przed światłem. Aby określić ilość maites metodą cytometrii przepływowej, policz maites w rozcieńczeniach 1:100, 1:50 oraz 1:25.

W pierwszej kolejności odmierzyć 940, 930 i 910 µL PBS z dodatkiem BSA do trzech różnych probówek do FACS, a następnie dodać odpowiednio 10, 20 i 40 µL oczyszczonych maites do każdej z probówek. Następnie mieszać w wirówce wortexowej kuleczki liczące w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, a potem dodać 50 µL kuleczek do każdej probówki zawierającej rozcieńczone maites. Próbki trzech rozcieńczeń maites analizować na cytometrze przepływowym wyposażonym w laser o długości fali 488 nm, ustawiając rygorystyczne bramkowanie dla maites w oparciu o podwójne bramkowanie fluorescencyjne dla bromku aterium i GFP; kuleczki analizować w osobnym kanale i rejestrować zdarzenia aż do zebrania 2000 kuleczek.

Aby określić liczbę maites w każdym rozcieńczeniu, wyciągnij średnią z trzech pomiarów stężenia maites. Następnie zawieś ponownie maites w stężeniu 8×10⁶ maites/ml w pożywce THP-1, aby zapewnić końcowy stosunek 4 maites na jedną komórkę THP-1 w celu pomiaru fagocytozy maites. Najpierw odwiruj odpowiednią liczbę komórek THP-1 do analizy i zawieś je ponownie w stężeniu 6,7×10⁵ komórek/ml w pożywce THP-1.

Następnie do płytki 96-dołkowej z wypukłym dnem (U bottom), zablokowanej FCS, przeniesie się 150 µL komórek THP-1 w trzech powtórzeniach dla każdego badanego warunku, tak aby końcowe stężenie wynosiło 10⁵ komórek na dołek. Płytkę należy umieścić w inkubatorze do momentu dodania makrofagów. Następnie do oddzielnej, zablokowanej FCS płytki 96-dołkowej z wypukłym dnem (U bottom) doda się 150 µL wyizolowanych makrofagów w stężeniu 8 × 10⁶/ml, w jednym dołku dla każdego badanego warunku.

Do każdego dołka płytki dodaj 10 µL przygotowanych rozcieńczonych próbek osocza, mieszając dokładnie, aby uzyskać jednorodny roztwór. Następnie do każdego dołka płytki THP-1 dodaj 50 µL roztworu osocza, wykonując pomiary w trzech powtórzeniach dla każdej badanej próbki osocza. Dobrze wymieszaj próbki, a następnie inkubuj kokultury pod przykryciem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.

Po 40 minutach odwiruj próbki w schłodzonej wcześniej wirówce, aby przerwać proces fagocytozy. Następnie dwukrotnie przemyj komórki lodowatym buforem fax. Po drugim przemyciu utrwal komórki w 90 µL utrwalacza fax i pozostaw je w lodzie.

Chronić przed światłem do momentu analizy. Stopień dojrzałości pasożytów przed traktowaniem E 64 jest kluczowy dla powstania maites zamkniętych w błonie. Pasożyty powinny być duże, niemal całkowicie wypełniać erytrocyt i wykazywać nakrapiane barwienie Gemsa.

Dodanie E 64 na tym etapie spowoduje powstanie maitozoitów otoczonych błoną po inkubacji przez 6 do 10 godzin. Jeśli E 64 zostanie dodane wcześniej, do pasożytów w stadium trofozoitów, maitozoity otoczone błoną nie powstaną. Jeśli E 64 zostanie dodane później, rozerwanie schizontów nie zostanie zahamowane.

Wymagany jest wysoki poziom synchronizacji pasożytów. W przeciwnym razie po zastosowaniu E 64 zaobserwuje się pełne spektrum trzech opisanych wyników; pomiar fagocytozy za pomocą fluorescencji bromku acrydynowego zapewnia lepszą rozdzielczość fagocytozy pasożytów niż sama fluorescencja GFP. Zwiększenie stosunku maites do komórek THP-1 skutkuje zwiększoną adhezją maites do komórek THP-1.

W przypadku braku przeciwciał specyficznych dla maite, zwiększenie stosunku MEITE do komórek THP-1 również prowadzi do wzrostu fagocytozy w przedziale od 0 do 78%. Opsonizację maite zaobserwowano przy użyciu próbek osocza z Papui-Nowej Gwinei przy stosunku MAITE do komórek THP-1 wynoszącym 4:1. Dane te przedstawiają przykłady czterech kwartyli odpowiedzi kwasowej PHA u czterech reprezentatywnych osób z Papui-Nowej Gwinei. Wykazano, że przeciwciała opsonizujące mierzone za pomocą tego testu są powiązane z odpornością kliniczną na malarię podczas przeprowadzania tej procedury.

Kluczowe punkty, o których należy pamiętać, aby zapewnić sukces fagocytozy, to uzyskanie wysoce zsynchronizowanych pasożytów w celu otrzymania w pełni dojrzałych i nienaruszonych merozoitów oraz odpowiednie utrzymanie hodowli komórek THP-1. Technika oczyszczania merozoitów przedstawiona w tej procedurze może zostać dostosowana do każdego zastosowania wymagającego wysokiej jakości merozoitów malarii, takich jak testy inwazji, proteomika czy serologia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat zastosowania metody E 64 w celu oczyszczania merozoitów oraz badania przeciwciał opsonizujących poprzez pomiar fagocytozy przez komórki THP-1.