Name: Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania merozoitów Plasmodium falciparum do testów przeciwciał opsonizujących. Technika wykorzystuje E 64 i cytometrię przepływową do pomiaru fagocytozy, umożliwiając badanie odporności na malarię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dzieciom i dorosłym dawcom osocza oraz personelowi Instytutu Badań Medycznych w Papui-Nowej Gwinei. Autorzy pragną podziękować Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny'emu W. Wilsonowi, Ivo Muellerowi i Dianie S Hansen za ich wkład w rozwój tej techniki, a także podziękować Australijskiemu Czerwonemu Krzyżowi za pakiety krwi i surowicy. Prace te były możliwe dzięki Wsparciu Infrastruktury Operacyjnej Rządu Stanu Wiktoria oraz Rządowi Australii NHMRC IRIISS. Praca ta była wspierana przez granty National Health and Medical Research Council # 1031212 i # 637406 oraz grant National Institutes of Health # AI089686.

UWAGA: Wszystkie kroki, oprócz wirowania i cytometrii przepływowej, powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylność. Należy zapewnić podjęcie odpowiednich środków ostrożności w odniesieniu do obchodzenia się z próbkami pobranymi od ludzi. Test jest bardzo czuły na niewielkie ilości osocza. Dostarczone rozcieńczenia są optymalne do rozwiązywania odpowiedzi w zakresie od 5 do 78% w osoczu od częściowo odpornych dzieci z Papui-Nowej Gwinei (PNG). Optymalne rozcieńczenie może się różnić w zależności od testowanych zestawów osocza, dlatego zaleca się miareczkowanie osocza w celu określenia warunków doświadczalnych dla każdego zastosowania. Zapewnić włączenie 2 ujemnych komórek kontrolnych THP-1 z merozoitami przy braku osocza; oraz komórki THP-1 z merozoitami opsonizowanymi pulą osocza od osób nieleczonych wcześniej malarią. Umożliwi to kontrolę przylegania merozoitu do komórek THP-1 i umożliwi rygorystyczne bramkowanie zdarzeń fagocytozy za pomocą cytometrii przepływowej.
Użycie próbek plazmy PNG zostało zatwierdzone przez Komitet Doradczy ds. Badań Medycznych, Ministerstwo Zdrowia Papui-Nowej Gwinei, Komitet Etyki Badań Naukowych Instytutu Waltera i Elizy Hall (numer projektu 04/04). Uzyskano pisemną zgodę rodziców/opiekunów wszystkich uczestników.
1. Kultura THP-1
<ol>
	<li>Utrzymuj ludzką monocytową linię komórkową THP-1 w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 55 μM 2-merkaptoetanolem (pożywka THP-1) oraz w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO2</li>.
	<li>Utrzymuj komórki w gęstości poniżej 5 x 105 komórek/ml. UWAGA: Przerost spowoduje różnicowanie się w komórki przylegające i regulację w dół receptorów Fc. Gdy komórki zostaną pasażowane około 10 razy, rozmrozić nową fiolkę, aby utrzymać fenotyp komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i rozcieńczenie próbki przeciwciał
<ol>
	<li>Podgrzać inaktywowane osocze do badania i osocze kontrolne niezakażone malarią poprzez inkubację w temperaturze 56 °C przez 30 minut</li>
	<li>Próbki osocza należy rozcieńczać seryjnie do 1/2 000 w podłożu THP-1.</li>
	<li>Rozcieńczone osocze należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Hodowla wysoce zsynchronizowanego P. falciparum
UWAGA: Linia D10-PfPHG27 z ekspresją GFP została wykorzystana ze względu na jej 48-godzinny cykl życia, który wspomaga synchronizację pasożytów i kontrolowany czas dodawania E64. Ponadto, ponieważ linia ta wyraża GFP w cytozolu, linia ta umożliwia wykrywanie parazytemii i wolnych merozoitów poprzez cytometryczne wykrywanie GFP metodą cytometrii przepływowej. Jednak intensywność fluorescencji GFP nie jest wystarczająca do zapewnienia wizualizacji w komórkach THP-1, dlatego merozoity są barwione przeciwstawnie bromkiem etydyny (EtBr). Można wykorzystać inne szczepy pasożytów, pod warunkiem, że możliwa jest ścisła synchronizacja. Zsynchronizuj pasożyty za pomocą kombinacji leczenia sorbitolem w celu lizy dojrzałych form28 i heparyny w celu zahamowania inwazji15.
<ol>
	<li>Utrzymuj pasożyty P. falciparum w ludzkich erytrocytach O+ (RBC) na poziomie 3% hematokrytu w pożywce RPMI-1640 (pH 7,4) uzupełnionej 25 mg / ml HEPES, 50 μg / ml hipoksantyny, 10% puli ludzkiej surowicy, 2 mg / ml wodorowęglanu sodu i 20 μg / ml gentamycyny (pożywka pasożyta). Dodać 5 mg/ml chlorowodorku S blasticydyny do pożywki hodowlanej, aby wybrać pasożyty GFP+.</li>
	<li>Inkubować kultury w hermetycznych pojemnikach lub alternatywnie w podwójnie zamkniętych kolbach hodowlanych w temperaturze 37 °C w atmosferze 1%O2, 4% CO2 i 95 % N2 .</li>
	<li>Przygotować cienkie szkiełka rozmazowe, utrwalić w 100% metanolu przez 10 sekund i zabarwić 10% roztworem Giemsy w buforze fosforanowym 6,7 mM (pH 7,1) (roztwór Giemsa) przez 10 minut w celu monitorowania parazytemii. Po zabarwieniu spłucz szkiełko w wodzie i wysusz na powietrzu. Oceń parazytemię za pomocą soczewki immersyjnej 100X z olejkiem. </li>
	<li>Utrzymuj kultury pasożytów na poziomie parazytemii poniżej 5% zakażonych erytrocytów, dzieląc kultury i dodając niezakażone erytrocyty w razie potrzeby. </li>
	<li>Aby zsynchronizować się z heparyną, dodaj 20 j.m./ml heparyny medycznej do kultur pierścieniowych.</li>
	<li>Gdy większość pasożytów znajduje się w stadium schizontu, komórki osadzania w dawce 300 x g przez 5 minut, usuń pożywkę zawierającą heparynę i ponownie zamieszaj w pożywce pasożytniczej, aby umożliwić pęknięcie schizontu i inwazję merozoitu.</li>
	<li>Po 4 godzinach dodać 20 j.m./ml heparyny z powrotem do kultur, blokując dalszą inwazję merozoitu. UWAGA: Może być konieczne przeprowadzenie kilku cykli leczenia sorbitolem i heparyną, zanim pasożyty zostaną wystarczająco zsynchronizowane. Aby wytworzyć odpowiednią liczbę merozoitów, należy przygotować 150 ml kultury pasożytów przy 3 - 5% parazytemii.</li>
</ol>
4. Izolacja trofozoitów P. falciparum w późnym stadium
<ol>
	<li>Trzydzieści sześć godzin po powrocie heparyny do kultur, osadzać komórki z hodowli w ilości 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w pożywce pasożytniczej przy 25% hematokrycie.</li>
	<li>Przymocuj dużą kolumnę magnetyczną (objętość matrycy 6,3 ml) do magnesu i zrównoważ kolumnę z pożywką pasożytniczą, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte.</li>
	<li>Dodaj zawieszoną kulturę P. falciparum do kolumny i dostosuj szybkość przepływu do jednej kropli na sekundę.</li>
	<li>Gdy kultura przejdzie przez kolumnę, przemyj kolumnę pożywką pasożytniczą, aż przepływ będzie czysty.</li>
	<li>Eluować pasożyty z kolumny w 30 ml pożywki pasożytniczej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj cienki rozmaz pasożytów, utrwal w 100% metanolu na 10 sekund i zabarwij roztworem Giemsy przez 3 minuty. Zbadaj szkiełko pod mikroskopem i upewnij się, że pasożyty prawie wypełniają czerwoną krwinkę i wydają się być we wczesnym stadium schizontu. Jeżeli pasożyty nie osiągnęły odpowiedniego etapu dojrzewania, oczyszczone pasożyty należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 1%O2, 4% CO2 i 95% N2 do czasu odpowiedniego rozwoju. UWAGA: Czystość większa niż 90% zakażonych krwinek czerwonych jest wymagana, aby zapewnić, że erytrocyty nie zanieczyszczają preparatów merozoitu.</li>
	<li>Wyizolowane schizonty należy traktować 10 μM E64 (Epoxysuccinylo-L-leucylamido(4-guanidyno)butan (E64) przez 6 - 10 godzin. UWAGA: Możliwe są dłuższe czasy inkubacji z E64, jednak wytworzone merozoity nie będą już inwazyjne.</li>
</ol>
5. Izolacja merozoitów P. falciparum
<ol>
	<li>Po inkubacji z E64 wysmaruj pasożyty, utrwal komórki w 100% metanolu i wybarwij roztworem Giemsy, aby ocenić tworzenie merozoitów otoczonych błoną. UWAGA: Dobry plon merozoitów zostanie osiągnięty, jeśli więcej niż 50% pasożytów utworzy merozoity otoczone błoną.</li>
	<li>Schizonty poddane działaniu E64 w dawce 1 900 x g przez 8 min. Przemyć 50 ml pożywki RT RPMI-1640 (pH 7,4) uzupełnionej 25 mg/ml HEPES, 50 μg/ml hipoksantyny, 2 mg/ml wodorowęglanu sodu i 20 μg/ml gentamycyny (środek myjący) w celu usunięcia pozostałej surowicy ludzkiej.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2 ml środka myjącego. UWAGA: Używanie pożywek THP-1 zawierających FCS spowoduje spienianie się podczas filtracji.</li>
	<li>Przefiltrować 2 ml ponownie zawieszonego E64-schizontów przez filtr strzykawkowy 1,2 μm/32 mm. Zebrać filtrat do probówki o pojemności 10 ml. UWAGA: Przesącz zawiera merozoity i kryształy hemozyny, z niepękniętymi schizontami i zanieczyszczeniami zebranymi w filtrze.</li>
	<li>Przymocuj małą kolumnę magnetyczną do magnesu i zrównoważ ją za pomocą medium THP-1 o objętości 500 μl.</li>
	<li>Przepuścić filtrat przez kolumnę magnetyczną. Zbierz przepływ. UWAGA: Hemozoina zwiąże się z kolumną, podczas gdy merozoity przejdą przez.</li>
	<li>Przepuść przepływ przez kolumnę jeszcze dwa razy, aby usunąć hemoinę, za każdym razem zbierając przepływ.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 2 ml pożywki RT THP-1 w celu zebrania pozostałych merozoitów.</li>
	<li>Dodać EtBr w stężeniu 10 μg/ml (stężenie końcowe) i barwić przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem, aby zapobiec fotowybielaniu. Uwaga: Upewnij się, że wszystkie zanieczyszczone EtBr odpady płynne i plastikowe są usuwane w sposób odpowiedni dla cytotoksycznych chemikaliów. Merozoity nie są już inwazyjne po tej inkubacji.</li>
	<li>Wirować merozoity w temperaturze 4 000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Zawiesić granulki merozoitu w 4 ml pożywki THP-1 i odwirowywać przy 4 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać pożywkę THP-1 do objętości 15 ml i chronić przed światłem.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja stężenia merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przynieś koraliki do liczenia do RT.</li>
	<li>Przygotować PBS z 0,5% BSA do rozcieńczania merozoitów.</li>
	<li>Policz merozoity w 3 rozcieńczeniach; 1 na 100; 1 na 50 i 1 do 25. Przygotuj 3 probówki FACS zawierające odpowiednio 940, 930 i 910 μl PBS+0,5% BSA. Dodać odpowiednio 10, 20 i 40 μl oczyszczonych merozoitów na probówkę.</li>
	<li>Zliczaj kulki przez 30 sekund i dodaj 50 μl kulek na probówkę FACS zawierającą rozcieńczone merozoity.</li>
	<li>Zbadać trzy rozcieńczone próbki merozoitu na cytometrze przepływowym wyposażonym w laser o długości fali 488 nm. Ustaw rygorystyczną bramkę dla merozoitów opartą na podwójnej fluorescencji fluorescencji EtBr i GFP oraz koraliki zliczające bramki przez fluorescencję w osobnym kanale. Zdobywaj wydarzenia, dopóki nie zbierzesz 2 000 koralików. Uwaga: Niniejsze instrukcje odnoszą się do liczenia merozoitów GFP+, które zostały wybarwione przeciwstawnie EtBr. Jeśli nie używasz pasożytów eksprymujących GFP, ustaw bramki merozoitowe na podstawie rozpraszania bocznego i fluorescencji EtBr.</li>
	<li>Określ stosunek merozoitów:koralików, dzieląc liczbę zdarzeń merozoitu przez 2,000 zliczających zdarzeń koralików, oblicz stosunek dla każdego rozcieńczenia. Użyj specyfikacji partii kulek do liczenia, aby określić liczbę kulek w 50 μl kulek dodanych do probówki. </li>
	<li>Pomnóż liczbę kulek w 50 μl przez współczynnik rozcieńczenia i przez stosunek merozoitu do kulek dla tego współczynnika rozcieńczenia. Liczba ta odpowiada stężeniu merozoitów na ml. Wykonaj te czynności dla każdego rozcieńczenia.</li>
	<li>Uśrednić stężenia merozoitu zmierzone w trzech rozcieńczeniach. UWAGA: Odchylenia standardowe przekraczające 10% dla stężeń oznaczonych dla rozcieńczeń 1 na 100, 1 na 50 i 1 na 25 wskazują na niedokładności techniczne w przygotowaniu próbek do liczenia.</li>
	<li>Ponownie zawiesić merozoity w stężeniu 8 x 106 merozoitów/ml w pożywce THP-1, aby zapewnić końcowy stosunek czterech merozoitów na komórkę THP-1. UWAGA: Można stosować inne proporcje merozoitu do THP-1, a stężenia należy odpowiednio zmodyfikować.</li>
</ol>
7. Test fagocytozy
<ol>
	<li>Dodać 200 μl nieaktywnego cieplnie FCS na studzienkę z 96 dołkowymi płytkami dennymi w kształcie litery U i pozostawić w temperaturze RT O/N do płytek blokowych. Po inkubacji usunąć FCS i dwukrotnie przemyć studzienki sterylnym PBS o pojemności 200 μl. Wyjąć PBS i przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	<li>Obliczyć liczbę komórek THP-1 wymaganych do badania próbek osocza i kontroli, umożliwiając trzykrotne studzienki na próbkę przy 1 x 105 ogniwach THP-1 na studzienkę.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie hodowli THP-1, ładując 10 μl kultury na szkiełko hemocytometru. Policz liczbę komórek obecnych w 4 zestawach po 16 narożnych kwadratów hemocytometru pod mikroskopem, a następnie uśrednij liczby. Pomnóż średnią liczbę przez 10 000, aby obliczyć liczbę komórek na ml.</li>
	<li>Odkręć wymaganą liczbę komórek THP-1 przy 500 x g przez 5 minut i ponownie zawieś przy 6,7 x 105 komórek/ml w pożywce THP-1.</li>
	<li>Dodaj 150 μl komórek THP-1 w pożywce THP-1 na dołek do zablokowanej przez FCS 96-dołkowej płytki dolnej U, co daje 105 komórek / dołek. Przygotuj 3 studzienki na próbkę, która będzie testowana. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, aż będzie gotowa do dodania merozoitów.</li>
	<li>Dodać 150 μl preparatu merozoitu w proporcji 8 x 106/ml na studzienkę do oddzielnej 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U. Przygotować jedną studzienkę na badaną próbkę</li>
	<li>Dodać 10 μl przygotowanych rozcieńczonych próbek osocza do płytki zawierającej merozoity i dobrze wymieszać, aby uzyskać jednorodny roztwór.</li>
	<li>Wyjąć płytkę THP-1 z inkubatora i dodać 50 μl roztworu merozoitu/osocza do studzienki zawierającej komórki THP-1, z trzema dowartościami na próbkę osocza.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze przez 40 minut. Przykryć folią w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Po 40 minutach odwirować próbki przez 5 minut przy 500 x g w wirówce schłodzonej o temperaturze 4 °C w celu zatrzymania fagocytozy.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dwukrotnie umyć komórki w lodowatym PBS+0,5% BSA+2 mM EDTA (bufor FACS). UWAGA: EDTA ułatwi utrzymanie zawiesiny pojedynczej komórki do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Utrwal komórki w 90 μl 2% paraformaldehydu (PFA) w PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA (utrwalacz FACS). Pozostawić na lodzie do momentu nabycia, chronić przed światłem.</li>
</ol>
8. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Pobieranie próbek za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser o długości fali 488 nm i przystawkę do czytnika płytek o wysokiej przepustowości. UWAGA: Umożliwi to przebadanie do 400 próbek osocza z jednego preparatu merozoitowego. Komórki można również przenosić do probówek w celu ręcznego ładowania próbki.</li>
	<li>Bramka żywotnych komórek THP-1 przez rozproszenie do przodu i z boku.</li>
	<li>Ustaw bramkę dodatnią EtBr w oparciu o kontrolę "Komórki THP-1 z merozoitami i bez osocza". </li>
	<li>Uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę.</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej i ustawiaj rygorystyczne bramki dla zdarzeń dodatnich EtBr.</li>
	<li>Obliczyć procentową fagocytozę dla każdej próbki: % komórek EtBr+ w próbce minus % komórek dodatnich z osoczem nieimmunologicznym.</li>
	<li>Średnie wyniki dla trzech egzemplarzy. UWAGA: Odchylenia standardowe dla trójki przekraczające 10% wskazują na niedokładności eksperymentalne. Niektóre dodatnie zdarzenia tła EtBr można zaobserwować w wyniku adhezji merozoitu do powierzchni komórek THP-1, ale powinny być spójne we wszystkich próbkach zawierających merozoity. Ustawienie bramki w oparciu o kontrolę "komórki THP-1 z merozoitami i bez osocza", a następnie odjęcie tła kontroli "komórek THP-1 z nieimmunologicznym osoczem" spowoduje % fagocytozy, która odzwierciedla fluorescencję tylko dzięki zinternalizowanym/fagocytozowanym merozoitom.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li>
<li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFowkes%2C+FJI+%22PLoS+Medicine%22">PLoS Medicine</a>. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).</li>
<li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro%2C+but+act+in+cooperation+with+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li>
<li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).</li>
<li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li>
<li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li>
<li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li>
<li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72(2007).</li>
<li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li>
<li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li>
<li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte%3A+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li>
<li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li>
<li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li>
<li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li>
<li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li>
<li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+immunity+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Ataíde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152(2010).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li>
<li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li>
<li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li>
<li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li>
<li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li>
<li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li>
<li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonopsonic+monocyte%2Fmacrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes%3A+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby zmierzyć fagocytozę merozoitu, wymagana jest biegłość w dwóch technikach: oczyszczaniu merozoitów i teście fagocytozy THP-1. Najbardziej krytycznymi krokami do połączenia tych dwóch technik są: 1) Wysoce zsynchronizowane pasożyty; 2) Dodanie E64 we właściwym czasie, aby uzyskać merozoity zamknięte w membranie; 3) Usuwanie hemozyiny w celu uniknięcia agregatów; 4) Dokładne zliczanie merozoitów za pomocą cytometrii przepływowej; 5) rozcieńczenie użytego osocza; oraz 6) utrzymanie niskiej gęstości komórek i liczby pasaży komórek THP-1. Staranne rozważenie tych kluczowych aspektów zapewni zaobserwowanie silnych odpowiedzi fagocytozy.
Chociaż opisano tutaj przygotowanie merozoitów do oceny fagocytozy, technika ta może być wykorzystywana w szerokim zakresie zastosowań. Niezależnie od metodologii dalszego procesu, optymalne przygotowanie merozoitu zależy od prawidłowego czasu dodawania E64 w celu wytworzenia merozoitów. Wykazano, że opisana tutaj metoda E64 daje inwazyjne merozoity do stosowania w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości zdarzeń inwazji i testów wrażliwości na leki15-20. Chociaż żywotność merozoitu nie jest niezbędna do fagocytozy, wymagana jest integralność powłoki powierzchniowej merozoitu. Dlatego opisana tutaj metoda E64 pozwala na wytwarzanie wysokiej jakości merozoitów do oceny odpowiedzi przeciwciał na powłokę powierzchniową. Jak pokazano na rysunku 1, jeśli E64 zostanie dodany zbyt wcześnie lub zbyt późno, merozoity zamknięte w błonie nie powstaną. Z tego powodu wymagane są wysoce synchroniczne hodowle pasożytów. W tym miejscu opisano zastosowanie leczenia sorbitolem i heparyną w celu ścisłej synchronizacji kultur pasożytów D10-GFP w oknie 2 godzin. Heparyna może sprzyjać gametocytogenezie w innych izolatach laboratoryjnych, dlatego powinna być stosowana ostrożnie. Można również stosować alternatywne metody synchronizacji, takie jak alanina, pod warunkiem, że wytwarzane są ściśle zsynchronizowane pasożyty29. Jeśli E64 zostanie dodany do pasożytów asynchronicznych, zostanie wytworzony mniejszy odsetek merozoitów otoczonych błoną, a pozostałe zakażone pasożytem erytrocyty albo pękną normalnie, albo rozwiną nieprawidłową morfologię. Obecność pasożytów, które nie przekształciły się w merozoity zamknięte w błonie, spowoduje zatkanie filtra i znacznie zmniejszy uzyskany plon merozoitu.
Podczas filtracji merozoitów zamkniętych w błonie hemozoina jest uwalniana z wakuoli trawiennych i jest obecna w postaci wolnych kryształów w roztworze. Hemozoina jest wysoce prozapalna i doniesiono, że moduluje odpowiedzi fagocytozy monocytów i makrofagów30,31 . Oprócz modulowania fagocytozy, jak pokazano na rysunku 2, hemooina może tworzyć agregaty z merozoitami w roztworze. Ponieważ komórki THP-1 mogą fagocytozę tych agregatów, może to być głównym czynnikiem zakłócającym ustąpienie fagocytozy za pośrednictwem przeciwciał. Dlatego usunięcie hemozyiny jest konieczne w tym teście, aby uniknąć dodatkowej złożoności hemozyny na biologię fagocytów. Ponadto nieusunięcie hemozyiny może być również szkodliwe w przypadku stosowania tej techniki do generowania wolnych merozoitów do innych zastosowań, zwłaszcza tam, gdzie wymagana jest kwantyfikacja merozoitu.
Jak pokazano na rysunku 4, liczba merozoitów dodanych do testu może wpływać na stopień fagocytozy przez komórki THP-1. Chociaż cytometria przepływowa pozwala na oznaczenie stężenia merozoitu, konieczne jest staranne pipetowanie i powtórzenie zliczania merozoitów w celu poprawy dokładności. Jest to szczególnie ważne, jeśli wiele linii pasożytów ma być testowanych obok siebie. Wcześniej wykazano, że osocze od częściowo odpornych dzieci z PNG może być znacznie rozcieńczone, zanim odpowiedzi spadną23. Opisano tutaj optymalne rozcieńczenie osocza (końcowe rozcieńczenie osocza 1/120 000) dla kohorty dzieci w wieku 5 - 12 lat, które wytworzyły szeroki zakres odpowiedzi fagocytozy opisanych na rycinie 5. Zakres ten pozwolił na stratyfikację odpowiedzi na cztery grupy (0 - 19%, 20 - 39%, 40 - 59% i 60 - 79% fagocytozy), a modelowanie regresji ujawniło, że odpowiedzi opsonizacyjne były związane z ochroną przed chorobą kliniczną i parazytemią o dużej gęstości10 W przypadku różnych badań kohortowych może być konieczne dostosowanie rozcieńczenia osocza, aby zapewnić, że fagocytoza przez komórki THP-1 nie jest nasycona lub poniżej poziomu wykrywalności.
Cytometria przepływowa umożliwia szybką i ilościową fagocytozę z większą dokładnością niż mikroskopia. Protokół ten polega na wysokoprzepustowym, opartym na płytkach i zautomatyzowanym pozyskiwaniu 96-dołkowych płytek w celu zbadania naturalnie nabytej odporności humoralnej. Metoda wymaga barwienia merozoitów bromkiem etydyny, jednak można zastosować alternatywne barwienia DNA, takie jak SYBRgreen, DAPI i jod propidyny, barwienia błonowe lub barwienia białek. Test ten byłby podatny na pierwotne monocyty lub neutrofile i mógłby być dostosowany, gdyby interesująca była biologia fagocytów lub FcR. Komórki pierwotne lub komórki THP-1 różnicowane in vitro za pomocą PMA mogą być wykorzystywane do badania fagocytozy w malarii i innych patogenach 12,32-34. Jednak użycie komórek pierwotnych może być trudne, ponieważ komórki te przylegają, a także wykazują fagocytozę bez przeciwciał35. Ponadto zmienność czystości, żywotności i funkcjonalności to niektóre z kluczowych ograniczeń w stosowaniu pierwotnych komórek fagocytarnych. Receptory Fc zaangażowane w fagocytozę merozoitową pozostają niescharakteryzowane, a zatem użycie przeciwciał blokujących przeciwko specyficznym receptorom Fc może wyjaśnić udział każdego receptora Fc w fagocytozie merozoitu. Ponieważ fagocytoza THP-1 jest zależna od FcR, umożliwia to prostą interpretację obserwowanej fagocytozy. Test ten nadaje się również do zajęcia się specyficznością antygenową przeciwciał opsonizujących, którą można osiągnąć poprzez wykorzystanie pasożytów nokautujących dla antygenów powierzchniowych merozoitu lub użycie oczyszczonych powinowactwem ludzkich przeciwciał do białek powierzchniowych merozoitu. Ponadto brakuje dogłębnych badań odpowiedzi cytokin po fagocytozie merozoitowej, które można by uzyskać za pomocą tego testu.
Te dwie techniki stanowią znaczący postęp w badaniach nad funkcjonalnymi przeciwciałami antymrozoitowymi. Oczyszczanie wysokiej jakości merozoitów jest korzystne w porównaniu z kriokonserwowanymi merozoitami, czyli fluorescencyjnymi mikrosferami pokrytymi antygenami merozoitowymi. Chociaż test ten został wykorzystany jako narzędzie do oceny naturalnie nabytej odporności, może okazać się ważnym narzędziem w walce z nabyciem odporności w odpowiedzi na szczepienie. Chociaż niedawno wykazano, że fagocytoza lub opsonizowane merozoity są związane z ochroną przed malarią kliniczną, nie jest możliwe wyciągnięcie bezpośrednich wniosków z fagocytozy in vitro THP-1 do fagocytozy in vivo merozoitów, ponieważ fagocytoza w tym teście zachodzi w warunkach statycznych i przy braku konkurujących czerwonych krwinek. Potencjalne adaptacje tego testu mogą zatem stanowić wszechstronne narzędzie do dalszego zrozumienia malarii i fagocytozy merozoitowej.

Znaczenie przeciwciał dla odporności na malarię Plasmodium falciparum zostało pokazane 40 lat temu, kiedy immunoglobulina od dorosłych z hiperodpornością została biernie przeniesiona na dzieci cierpiące na ciężką malarię, co skutkowało złagodzeniem choroby1. W związku z tym podjęto znaczne wysiłki w celu zidentyfikowania celów ochronnej odporności na malarię, głównie poprzez pomiar miana przeciwciał przeciwko peptydom lub białkom ulegającym ekspresji bakteryjnej za pomocą testu ELISA. Serologia oparta na teście ELISA również okazała się bardzo zmienna między badaniami i nie dotyczy funkcjonalności przeciwciał2. Wiele antygenów malarii indukuje cytofilowy profil przeciwciał IgG1 i IgG3, szczególnie antygeny powierzchniowe merozoitu3. To odchylenie podklasy sugeruje, że interakcje przeciwciało-receptor Fc (FcR) z fagocytami są ważne dla funkcji efektorowych opsonizujących przeciwciał antimerozoitowych4. Kilka opracowywanych szczepionek przeciwko antygenom merozoitowym ma na celu wywołanie funkcji efektorowych fagocytów 5,6 i chociaż istnieją znaczące dowody na znaczenie interakcji przeciwciało-FcR w modelach malarii u gryzoni7-9, a kilka ostatnich badań potwierdza znaczenie funkcjonalnych przeciwciał i funkcji efektorów fagocytów dla odporności na malarię u ludzi10,11, obszar ten pozostaje słabo zbadany. Badania nad przeciwciałami opsonizującymi specyficznymi dla merozoitu były ograniczone przez dwa czynniki; trudność w wyizolowaniu merozoitów dobrej jakości; i zmienne odpowiedzi fagocytozy z komórek pierwotnych.
Do niedawna, wirowanie z dużą prędkością lub gradienty gęstości Percoll były wykorzystywane do izolowania merozoitów od supernatantów kultur pękających schizontów. Te merozoity rzadko były żywotne i często były dalej manipulowane przez wirowanie gęstości i wiele etapów mycia12 lub kriokonserwację11 przed użyciem w testach. Procesy te potencjalnie odłączają wiele obwodowo związanych białek z powierzchni merozoitu, białek znanych jako cele antygenowe odporności malarycznej13. Ostatnio inhibitor proteazy cysteinowej trans-epoksysukcynylo-L-leucyloamido(4-guanidyno)butan (E64) został wykorzystany do wytworzenia żywotnych merozoitów. E64 zapobiega pękaniu schizontu, generując merozoity zamknięte w błonie14, które mogą zostać zakłócone przez filtrację w celu uwolnienia żywotnych merozoitów 15,16. Technika ta doprowadziła do przestrzennej rozdzielczości wielu białek podczas inwazji erytrocytów 15,17-19 i wyjaśniła specyficzne dla etapu działanie kilku leków przeciwmalarycznych16,20. Jednak wytwarzanie żywotnych merozoitów pozostaje wyzwaniem technicznym. Aby pomóc w rozpowszechnieniu tej techniki i zastosowaniu do funkcjonalnych testów odporności, opisano tutaj szczegółowy protokół oczyszczania żywotnego merozoitu i jego zastosowania w standaryzowanym teście funkcjonalnym współpracy przeciwciało: komórka w opsonizacji i fagocytozie.
Ta technika pokazuje znaczący postęp w stosunku do poprzednich testów opsonizacji merozoitu in vitro, takich jak wybuch oddechowy neutrofili, hamowanie komórkowe zależne od przeciwciał (ADCI) i alternatywne testy fagocytozy merozoitowej. Testy te są słabo odtwarzalne ze względu na zmienność danych wejściowych pasożytów i aktywność pierwotnych komórek fagocytarnych11,21. Zanieczyszczenie hemozoiny może również głęboko wpływać na funkcję fagocytów22. Niedawno zgłoszony solidny i powtarzalny test fagocytozy merozoitowej23 wykorzystuje linię komórek promonocytycznych THP-124. Jest to idealny typ komórki do wysokoprzepustowych testów cytometrii przepływowej, ponieważ nie przylega i specyficznie wykonuje fagocytozę za pośrednictwem receptora Fc25,26. Dodatkową złożonością podczas badania fagocytozy jest to, że stopień fagocytozy zależy od liczby merozoitów w stosunku do komórek THP-1 i stężenia w osoczu. Aby zapewnić powtarzalność między doświadczeniami, merozoity powinny być policzone i należy zastosować określone stężenie. Ze względu na ich niewielkie rozmiary wymagana jest kwantyfikacja metodą cytometrii przepływowej.
Opisana tutaj procedura usuwa hemozoinę i generuje żywotne merozoity, oraz opisuje zastosowanie tych merozoitów do cytometrycznego oznaczania merozoitów metodą cytometryczną, a następnie opsonizacji i fagocytozy. Chociaż są one technicznie wymagające, opisane techniki mogą okazać się przydatne w wyjaśnieniu udziału odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla powierzchni merozoitu na naturalnie nabytą i wywołaną szczepionką odporność.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa THP-1</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>Zastosowanie w roztworze</td></tr><tr><td>długopisu/paciorkowca pod dygestoriami (100x)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>Klasa hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Hipoksyna</td><td>Calbiochem</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka&nbsp;</td><td>Darowizna od Australijskiego Czerwonego Krzyża</td><td></td><td>Dostępne komercyjnie (tj. Invitrogen)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Pfizer</td><td>61022027</td><td>Jakość do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Heparyna Sód BP (5000 IU / ml)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Pochodzenie wieprzowe</td></tr><tr><td>Blasticdyna S-chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 Inhibitor proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>Służy do buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H20</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>Stosować jako bufor fosforanowy</td></tr><tr><td>Azur Eozyna roztworu błękitu metylenowego Giemsy</td><td>Merck</td><td>1.09204.0500</td><td>Rozcieńczenie 1:10 w buforze fosforanowym 6,7 mN (odświeżyć każdą plamę)</td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td>Merck</td><td>10093,5 V</td><td>0,1 M, pH 7,2</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Acrodisc 1,2-&mu; m/32-mm</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4656</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS (do małych kolumn</td><td>)MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>Wymienny z MidiMACS&nbsp;</td></tr><tr><td>Separator VarioMACS (do dużych kolumn)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumna (mała kolumna magnetyczna)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Duża kolumna magnetyczna</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Bio-Rad 1510433</td><td></td><td>Cytotoxic</td></tr><tr><td>CountBright Absolutne kulki zliczające</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Cytometr przepływowy z czytnikiem płytek HTS</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td>Merck</td><td>10093,5 V</td><td>0,1 M, pH 7,2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysokowydajne oczyszczanie merozoitów plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Antygeny merozoitowe Plasmodium falciparum są opracowywane jako potencjalne szczepionki przeciwko malarii. Jednym z aspektów odporności na malarię jest usuwanie wolnych merozoitów z krwi przez komórki fagocytarne. Jednak ocena skuteczności funkcjonalnej przeciwciał opsonizujących specyficznych dla merozoitu jest trudna ze względu na krótki okres półtrwania merozoitów i zmienność pierwotnych komórek fagocytarnych. W niniejszym artykule szczegółowo opisano metodę wytwarzania żywotnych merozoitów przy użyciu inhibitora proteazy E64 oraz test fagocytozy zależnej od opsoniny merozoitu przy użyciu promonocytarnej linii komórkowej THP-1. E64 zapobiega pękaniu schizontu, umożliwiając jednocześnie rozwój merozoitów, które są uwalniane w wyniku filtracji schizontów poddanych obróbce. Merozoity znakowane bromkiem etydyny są opsonizowane próbkami ludzkiego osocza i dodawane do komórek THP-1. Fagocytoza jest oceniana za pomocą ustandaryzowanego protokołu o wysokiej przepustowości. Żywotne merozoity są cennym źródłem do oceny wielu aspektów biologii P. falciparum, w tym oceny funkcji immunologicznej. Poziomy przeciwciał mierzone tym testem są związane z kliniczną odpornością na malarię u osób naturalnie narażonych. Test może być również przydatny do oceny przeciwciał indukowanych szczepionką.

Stopień dojrzałości pasożytów przed zastosowaniem E64 jest kluczowy dla uzyskania merozoitów zamkniętych w błonie. Rysunek 1Ai przedstawia odpowiedni stopień dojrzałości schizontów do dodania E64. Pasożyty powinny być duże i niemal całkowicie wypełniać erytrocyt. Cętkowany wygląd w barwieniu Giemsy wskazuje na rozpoczęcie merogoni; w tym momencie należy dodać E64, aby uzyskać merozoity zamknięte w błonie (Rysunek 1Aii). Jeśli E64 zostanie dodane wcześniej, w stadium trofozoitów, merozoity zamknięte w błonie nie powstaną nawet po 12 h działania E64. Zamiast tego pasożyty przybierają nieprawidłową morfologię, np. powiększenie wakuoli trawiennej (Rysunek 1Bi i 1Bii), a merozoity nie tworzą się. Jeśli E64 zostanie dodane zbyt późno do schizontów, merozoity zamknięte w błonie nie powstaną, ponieważ pękanie schizontów nie zostanie zahamowane (Rysunek 1Ci i 1Cii). Wymagany jest wysoki stopień synchronizacji pasożytów, w przeciwnym razie po zastosowaniu E64 zaobserwuje się spektrum wszystkich trzech opisanych wyników.
Usunięcie hemozoiny jest kolejnym krytycznym krokiem w oczyszczaniu merozoitów. Jeśli merozoity nie zostaną oczyszczone z hemozoiny, powstają skupiska merozoitów i hemozoiny, których nie można rozdzielić poprzez pipetowanie. Agregaty te są rejestrowane przez cytometr jako pojedyncze zdarzenia, choć wykazują inne charakterystyki rozproszenia światła przedniego (forward-scatter) i bocznego (side-scatter) niż pojedyncze merozoity, co prowadzi do niedokładnego liczenia merozoitów metodą cytometrii przepływowej (Rysunek 2A). Ponieważ komórki THP-1 również mogą fagocytować hemozoinę, skupiska merozoitów i hemozoiny mogą być przez nie pochłaniane (Rysunek 2B). Agregaty te wykazują silną fluorescencję EtBr, ponieważ zawierają wiele merozoitów. Fagocytoza agregatów skutkuje profilem fluorescencji EtBr komórek THP-1 równoważnym temu, który obserwuje się podczas fagocytozy wielu pojedynczych merozoitów. Zatem, jeśli hemozoina nie zostanie usunięta, fluorescencja EtBr w komórkach THP-1 będzie przeszacowywać potencjał opsonizacyjny testowanej plazmy. Zgłoszono również, że hemozoina znacząco zmienia funkcje fagocytów. Merozoity wykazujące pozytywny sygnał GFP są barwione kontrastowo EtBr w celu lepszej wizualizacji merozoitów fagocytowanych przez komórki THP-1. Stosując warunki opisane w niniejszym protokole, wszystkie merozoity GFP-dodatnie są barwione kontrastowo EtBr, który posiada jaśniejszą intensywność fluorescencji (Rysunek 3A). Ocena fagocytozy za pomocą fluorescencji EtBr zapewnia lepszą rozdzielczość wykrywania fagocytozy merozoitów niż fluorescencja GFP (Rysunek 3B).
Liczba merozoitów dodanych do testu będzie modulować obserwowaną ilość fagocytozy. Z tego powodu krytyczne jest dokładne zliczanie za pomocą cytometrii przepływowej. Zwiększanie stosunku merozoitów do komórek THP-1 spowoduje zwiększone przyleganie merozoitów do komórek THP-1 w obecności osocza (Rycina 4A). Zwiększanie stosunku merozoitów:THP-1 prowadzi również do nasilenia odpowiedzi fagocytycznej w przypadku opsonizacji merozoitów (Rycina 4B). Aby uzyskać silne odpowiedzi fagocytyczne, zaleca się stosunek merozoitów:THP-1 wynoszący 4:1. Przy zastosowaniu tego stosunku oraz wskazanego rozcieńczenia osocza, test ten pozwala na rozróżnienie niskiego, średniego i wysokiego poziomu przeciwciał opsonizujących. Przy użyciu próbek osocza z PNG oraz w pozostałych opisanych warunkach zaobserwowano odpowiedzi fagocytyczne w zakresie od 0 do 78%. Wykazano niedawno, że takie odpowiedzi wiążą się z naturalnie nabytą odpornością kliniczną na malarię10. Rycina 5 przedstawia przykłady czterech kwartyli odpowiedzi fagocytycznej u osób z PNG.
<img alt="Schemat mikroskopowy przedstawiający morfologię komórek przed i po traktowaniu E64; dołączono pasek skali." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Moment dodania E64 jest kluczowy dla generowania otoczonych błoną merozoitów. (A) Odpowiedni stopień dojrzałości pasożytów i) przed traktowaniem E64 oraz ii) otoczone błoną merozoity powstałe po 6 h traktowania E64. (B) Otoczone błoną merozoity nie powstają, jeśli E64 zostanie dodane do niedojrzałych pasożytów; i) późne stadia trofozoitów oraz ii) po 12 h działania E64. (C) Pękanie schizontów nie zostaje zahamowane, jeśli E64 zostanie dodane do późnych schizontów segmentowanych; i) późne stadia schizontów oraz ii) po 6 h działania E64. Pasek skali reprezentuje 10 μm.
<img alt="Cytometria przepływowa i mikroskopia wpływu hemozoiny na komórki; wykresy FSC vs SSC, obrazy komórkowe." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Usuwanie hemozoiny jest kluczowe dla uzyskania zawiesiny pojedynczych merozoitów. Agregaty merozoitów i hemozoiny tworzą się po filtracji merozoitów zamkniętych w błonach, chyba że hemozoina zostanie oddzielona od merozoitów metodą magnetyczną. (A) Wykresy rozproszenia światła w przód (FSC) i prostopadłego (SSC) dla merozoitów z usuniętą hemozyną oraz z zachowaną hemozyną. (B) Agregaty hemozyny i merozoitów mogą być fagocytowane przez komórki THP-1. Preparaty cytospinowe komórek THP-1 barwione metodą Diff-Quick, inkubowane z preparatami merozoitów upsonizowanych osoczem PNG, z hemozyną lub bez hemozyny. Pasek skali oznacza 10 μm.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej: merozoity GFP+, barwienie EtBr, analiza komórek, intensywność fluorescencji, wykresy danych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Barwienie bromkiem etydyny pozwala na lepszą rozdzielczość fagocytozy merozoitów. Oczyszczone merozoity D10-GFP zostały poddane przeciwbarwieniu EtBr w celu zwiększenia intensywności fluorescencji. (A) Histogram cytometrii przepływowej oczyszczonych merozoitów z bramkowaniem na merozoity GFP-dodatnie oraz wykres kropkowy pokazujący fluorescencję EtBr w obrębie tej bramkowanej populacji GFP-dodatniej. (B) Rozproszenie przednie (forward scatter) w funkcji GFP oraz rozproszenie przednie w funkcji EtBr komórek THP-1 po fagocytozie merozoitów wykazujących podwójną fluorescencję GFP i EtBr. Bramki wyznaczono na podstawie komórek THP-1 z merozoitami oraz kontroli bez osocza.
<img alt="Cytometria przepływowa i wykres przedstawiający fluorescencję EtBr komórek z plazmą PNG/nieimmunologiczną, stosunek merozoitów." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Stosunek merozoitów do komórek THP-1 wpływa na obserwowany stopień fagocytozy. (A) Przedstawiono pięć stosunków merozoitów do komórek THP-1: 50:1, 20:1, 10:1, 4:1, 1:1. Kontrola z samymi komórkami wskazuje fluorescencję tła wynikającą z obecności komórek THP-1. Fluorescencja EtBr komórek THP-1 dla każdego stosunku jest wskazana dla merozoitówyopsonizowanych pulą plazmy PNG lub nieimmunologiczną plazmą australijską. (B) Średnia intensywność fluorescencji komórek THP-1 dla różnych stosunków merozoitów do komórek THP-1 oraz opsonizacji pulą plazmy PNG lub nieimmunologiczną plazmą australijską (średnia+SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dane z cytometrii przepływowej, EtBr vs. FSC, wykres pokazujący procentowe udziały populacji komórek (8,2%, 26%, 51%, 76%)." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Możliwość pomiaru szerokiego zakresu przeciwciał opsonizujących. Merozoity zostały opsonizowane plazmą od osób z PNG i inkubowane z komórkami THP-1. Przedstawiono cztery reprezentatywne odpowiedzi fagocytozy. Bramki wyznaczono na podstawie komórek THP-1 z merozoitami w kontroli bez plazmy; liczby wskazują % fagocytozy po odjęciu kontroli z komórkami THP-1 i plazmą nieimmunologiczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie czystych merozoitów Plasmodium falciparum o wysokiej wydajności w celu ilościowego określenia ich opsonizacji przez przeciwciała ludzkie. Jest to osiągane poprzez wstępne hamowanie pękania schizontów za pomocą E 64 w celu wytworzenia struktur merozoitów zamkniętych w błonie. W drugim kroku wolne merozoity są zbierane, a następnie barwione bromkiem AUM w celu ich kwantyfikacji. W ostatnim kroku merozoity są inkubowane z różnymi próbkami ludzkiej osocza oraz ludzkimi komórkami monocytarnymi THP-1.Ostatecznie opsonizację merozoitów przez różne próbki ludzkiej osocza można zróżnicować za pomocą cytometrii przepływowej. Przewagą tej techniki nad istniejącymi testami funkcjonalnej odporności na merozoity malarii jest wykorzystanie nienaruszonych merozoitów oraz fakt, że odpowiedzi fagocytozy są silne i mierzalne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii malarii, takie jak: jakie jest znaczenie przeciwciał oksydacyjnych i fagocytozy dla odporności przeciw malarii u osób szczepionych lub naturalnie eksponowanych?Wizualizacja tej techniki jest kluczowa, ponieważ moment dodania E 64 ma istotne znaczenie dla zapewnienia powstania mezo. Ze względu na to, że przygotowanie i enumeracja mezo są wymagające technicznie, po separacji magnetycznej trofozoitów P. falciparum w późnym stadium należy ocenić dojrzałość pasożytów poprzez utrwalenie cienkiego rozmazu pasożytów w 100% metanolu przez 10 sekund i ich barwienie w Giza przez trzy minuty. Należy zbadać zabarwiony preparat pod mikroskopem, aby upewnić się, że pasożyty niemal całkowicie wypełniają erytrocyty i znajdują się we wczesnym stadium schizonty.Jeśli pasożyty nie osiągnęły odpowiedniego stadium dojrzałości, należy kontynuować ich inkubację do czasu właściwego rozwoju. Po osiągnięciu odpowiedniej dojrzałości izolowane schizonty należy traktować 10 µM E 64 i inkubować przez kolejne od sześciu do 10 godzin. Po inkubacji z E 64 należy przygotować rozmaz z potraktowanych pasożytów.Utrwal preparat na szkiełku w 100% metanolu i zabarw go metodą Giemsy, aby potwierdzić, że co najmniej 50% pasożytów utworzyło błonę. Osad z pozostałych próbek traktowanych E 64 wiruj przez osiem minut przy 1900 Gs w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj pasożyty w 50 mililitrach PBS w temperaturze pokojowej.Przemyj podłoźem w celu usunięcia pozostałości ludzkiej surowicy. Po odlaniu supernatantu resuspenduj osad pasożytów w dwóch mililitrach podłoża do płukania, a następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 1,2 µm, zbierając maites i kryształy hemonu do probówki o pojemności 10 ml. Następnie przymocuj małą kolumnę magnetyczną do magnesu i zrównoważ ją 500 µl pożywki THP one.Przepuść filtrat przez kolumnę magnetyczną trzy razy, zbierając koraliki magnetyczne z frakcją przepływową przy każdym przejściu. Następnie przemyj kolumnę dwoma mililitrami medium THP 1 w temperaturze pokojowej, aby zebrać pozostałe koraliki magnetyczne.Usunięcie heminy jest krytycznym etapem oczyszczania maites. Jeśli maites nie zostaną oddzielone od heminy, utworzą się klastry maites-hemina, co doprowadzi do niedokładnego liczenia maites metodą cytometrii przepływowej. Komórki THP-1 mogą fagocytować heminę, w związku z czym klastry maites-hemina mogą być również wchłaniane.W związku z tym, jeśli hemyna nie zostanie usunięta, potencjał opsonizacyjny badanego osocza zostanie również przeceniony. Wybarwiaj zebrane maite w stężeniu 10 µg/ml bromku ahy w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Po 30 minutach odwiruj maite, odlej nadsadź przelewając ją do odpowiedniego pojemnika na odpady i przemyj osad z maite w 4 ml pożywki THP one pellet maites.Następnie resuspenduj komórki w 15 mililitrach pożywki TP one, chroniąc je przed światłem. Aby określić ilość maites metodą cytometrii przepływowej, policz maites w rozcieńczeniach 1:100, 1:50 oraz 1:25.W pierwszej kolejności odmierzyć 940, 930 i 910 µL PBS z dodatkiem BSA do trzech różnych probówek do FACS, a następnie dodać odpowiednio 10, 20 i 40 µL oczyszczonych maites do każdej z probówek. Następnie mieszać w wirówce wortexowej kuleczki liczące w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, a potem dodać 50 µL kuleczek do każdej probówki zawierającej rozcieńczone maites. Próbki trzech rozcieńczeń maites analizować na cytometrze przepływowym wyposażonym w laser o długości fali 488 nm, ustawiając rygorystyczne bramkowanie dla maites w oparciu o podwójne bramkowanie fluorescencyjne dla bromku aterium i GFP; kuleczki analizować w osobnym kanale i rejestrować zdarzenia aż do zebrania 2000 kuleczek.Aby określić liczbę maites w każdym rozcieńczeniu, wyciągnij średnią z trzech pomiarów stężenia maites. Następnie zawieś ponownie maites w stężeniu 8×10⁶ maites/ml w pożywce THP-1, aby zapewnić końcowy stosunek 4 maites na jedną komórkę THP-1 w celu pomiaru fagocytozy maites. Najpierw odwiruj odpowiednią liczbę komórek THP-1 do analizy i zawieś je ponownie w stężeniu 6,7×10⁵ komórek/ml w pożywce THP-1.Następnie do płytki 96-dołkowej z wypukłym dnem (U bottom), zablokowanej FCS, przeniesie się 150 µL komórek THP-1 w trzech powtórzeniach dla każdego badanego warunku, tak aby końcowe stężenie wynosiło 10⁵ komórek na dołek. Płytkę należy umieścić w inkubatorze do momentu dodania makrofagów. Następnie do oddzielnej, zablokowanej FCS płytki 96-dołkowej z wypukłym dnem (U bottom) doda się 150 µL wyizolowanych makrofagów w stężeniu 8 × 10⁶/ml, w jednym dołku dla każdego badanego warunku.Do każdego dołka płytki dodaj 10 µL przygotowanych rozcieńczonych próbek osocza, mieszając dokładnie, aby uzyskać jednorodny roztwór. Następnie do każdego dołka płytki THP-1 dodaj 50 µL roztworu osocza, wykonując pomiary w trzech powtórzeniach dla każdej badanej próbki osocza. Dobrze wymieszaj próbki, a następnie inkubuj kokultury pod przykryciem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.Po 40 minutach odwiruj próbki w schłodzonej wcześniej wirówce, aby przerwać proces fagocytozy. Następnie dwukrotnie przemyj komórki lodowatym buforem fax. Po drugim przemyciu utrwal komórki w 90 µL utrwalacza fax i pozostaw je w lodzie.Chronić przed światłem do momentu analizy. Stopień dojrzałości pasożytów przed traktowaniem E 64 jest kluczowy dla powstania maites zamkniętych w błonie. Pasożyty powinny być duże, niemal całkowicie wypełniać erytrocyt i wykazywać nakrapiane barwienie Gemsa.Dodanie E 64 na tym etapie spowoduje powstanie maitozoitów otoczonych błoną po inkubacji przez 6 do 10 godzin. Jeśli E 64 zostanie dodane wcześniej, do pasożytów w stadium trofozoitów, maitozoity otoczone błoną nie powstaną. Jeśli E 64 zostanie dodane później, rozerwanie schizontów nie zostanie zahamowane.Wymagany jest wysoki poziom synchronizacji pasożytów. W przeciwnym razie po zastosowaniu E 64 zaobserwuje się pełne spektrum trzech opisanych wyników; pomiar fagocytozy za pomocą fluorescencji bromku acrydynowego zapewnia lepszą rozdzielczość fagocytozy pasożytów niż sama fluorescencja GFP. Zwiększenie stosunku maites do komórek THP-1 skutkuje zwiększoną adhezją maites do komórek THP-1.W przypadku braku przeciwciał specyficznych dla maite, zwiększenie stosunku MEITE do komórek THP-1 również prowadzi do wzrostu fagocytozy w przedziale od 0 do 78%. Opsonizację maite zaobserwowano przy użyciu próbek osocza z Papui-Nowej Gwinei przy stosunku MAITE do komórek THP-1 wynoszącym 4:1. Dane te przedstawiają przykłady czterech kwartyli odpowiedzi kwasowej PHA u czterech reprezentatywnych osób z Papui-Nowej Gwinei. Wykazano, że przeciwciała opsonizujące mierzone za pomocą tego testu są powiązane z odpornością kliniczną na malarię podczas przeprowadzania tej procedury.Kluczowe punkty, o których należy pamiętać, aby zapewnić sukces fagocytozy, to uzyskanie wysoce zsynchronizowanych pasożytów w celu otrzymania w pełni dojrzałych i nienaruszonych merozoitów oraz odpowiednie utrzymanie hodowli komórek THP-1. Technika oczyszczania merozoitów przedstawiona w tej procedurze może zostać dostosowana do każdego zastosowania wymagającego wysokiej jakości merozoitów malarii, takich jak testy inwazji, proteomika czy serologia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat zastosowania metody E 64 w celu oczyszczania merozoitów oraz badania przeciwciał opsonizujących poprzez pomiar fagocytozy przez komórki THP-1.

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wysoki wydajności proces oczyszczania merozoitów Plasmodium falciparum do zastosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Opisano model in vitro sekwestracji w malarii mózgowej1. Krwinki czerwone zakażone Plasmodium falciparum są selekcjonowane pod kątem wiązania się z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego. Wyselekcjonowane pasożyty wykazują wyraźny fenotyp. Proces selekcji można zastosować w przypadku różnych szczepów P. falciparum oraz linii komórek śródbłonka.

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służąca do identyfikacji transkryptów mRNA w pojedynczych komórkach umożliwia analizę aktywności poligenowej, takiej jak jednoczesna transkrypcja więcej niż jednego członka wielogenowej rodziny var w erytrocytach zakażonych Plasmodium falciparum 1. Technika ta jest adaptowalna i może być stosowana w odniesieniu do różnych typów genów, komórek i organizmów.

Analiza transkrypcji genów w pojedynczych komórkach metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) RNA

Metoda ta bada fenotyp agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (pRBC) pośredniczonej przez płytki krwi w izolatach klinicznych. Jest to realizowane poprzez izolację oraz wspólną inkubację osocza bogatopłytkowego i zawiesiny pRBC.

Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

Ten film demonstruje test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej, obejmujący znakowane i opsonizowane erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum przez monocyty. Cytometria przepływowa identyfikuje fluorescencję w monocytach, potwierdzając pomyślną identyfikację opsonizowanych erytrocytów poprzez fagocytozę.

Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Paramagnetyczne właściwości hemozoiny są wykorzystywane do izolowania późnych stadiów wzrostu czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum w hodowli. Metoda jest prosta i szybka i nie wpływa na późniejsze zdolności inwazyjne pasożytów.

Separacja erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum w późnym stadium za pomocą środków magnetycznych

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum.  Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Poznaj metodę oczyszczania merozoitów Plasmodium falciparum do testów przeciwciał opsonizujących. Technika wykorzystuje E 64 i cytometrię przepływową do pomiaru fagocytozy, umożliwiając badanie odporności na malarię.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Przeglądaj więcej filmów