Name: Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj izolację i ekspansję ludzkich komórek więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej. Ta metoda umożliwia opracowanie łaty do naprawy częściowych uszkodzeń ACL.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować funduszowi startowemu i grantowi badawczemu wydziału chirurgii z Southern Illinois University, School of Medicine; oraz grantowi Memorial Medical Foundation.

1. Odzyskanie chirurgiczne
Uwaga: Uzyskano zgodę IRB na pobranie kikuta ACL podczas operacji rekonstrukcji ACL. Przyznano zwolnienie z IRB, ponieważ używany kikut ACL był na ogół wyrzucany jako odpad chirurgiczny. Do pobrania kikuta ACL wykorzystano 20 pacjentów.
<ol>
	<li>Podać pacjentowi znieczulenie ogólne i przedoperacyjne antybiotyki zgodnie z protokołem instytucji.</li>
	<li>Załóż opaskę uciskową i napompuj 100 mg powyżej skurczowego ciśnienia krwi.</li>
	<li>Ułóż pacjenta w pozycji leżącej. Wykonaj poziome przednio-boczne nacięcie kolanem w zgięciu 30-45° dla portalu 5 mm i włóż artroskopowy trokar i kamerę do worka nadrzepkowego pod kątem 30°.</li>
	<li>Wykonaj rutynową artroskopię diagnostyczną.</li>
	<li>Wprowadź wcięcie i opłucz błoniastą błonę maziową nad rozdartym ACL.</li>
	<li>Użyj golarki 4.5 mm i ablatora, aby zidentyfikować kikut ACL.</li>
	<li>Użyj kaczego dzioba prosto gorzkiego, aby zebrać wiele próbek z pozostałego pnia ACL.</li>
	<li>Przechowywać próbkę w roztworze soli fizjologicznej w sterylnym pojemniku.</li>
	<li>Wyślij próbki do patologii w celu odkodowania i ostatecznej dostawy do laboratorium.</li>
	<li>Powrót do zdrowia pacjenta i opieka pooperacyjna zgodnie z protokołem instytucji.</li>
</ol>
2. Trawienie tkanek i izolacja hACL
<ol>
	<li>Przenieś ludzką tkankę ACL otrzymaną z patologii na szalkę Petriego ze sterylną solą fizjologiczną/PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).</li>
	<li>Zmiel tkankę za pomocą sterylnych nożyczek na 1-2 mm3 kawałki i umyj zmieloną tkankę solą fizjologiczną co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Trawić zmieloną tkankę z 0,4% kolagenazą w pożywce DMEM/F-12 (50/50, 1x) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować komórki w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce.</li>
	<li>Przemyć komórki pożywką 2-3 razy, a następnie wysiewać/hodować w kolbach T-25 przez 2-3 dni.</li>
</ol>
3. Ekspansja komórkowa, zamrażanie i rozmrażanie
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu świetlnego, aby uwidocznić komórki hodowane przez 2-3 dni w kolbie T-25.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w pożywce DMEM/F-12 (50/50, 1x) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S). 
	Uwaga: Zmień pożywkę, gdy komórki wykazują przyleganie i standardową morfologię. Użyj mikroskopu świetlnego, aby obserwować komórki.</li>
	<li>Przemyć zlewające się komórki PBS w 7 dniu (~1,3 X 106 komórek/kolbę). Dodać trypsynę (0,5 g/l) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodaj pożywkę do zawieszonych komórek, aby zneutralizować trypsynę. Podzielić mieszaninę pożywki i komórki między trzy kolby T-25.</li>
	<li>Przemyć zlewające się komórki PBS, dodać trypsynę (0,5 g/l) i ponownie zawiesić je w pożywce zamrażającej zawierającej DMSO, FBS i kompletną pożywkę (DMEM/F-12 Medium + 10% FBS + 1% P/S) w stosunku 1:2:7.</li>
	<li>Fiolki kriogeniczne należy przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli komórki zostaną zużyte w ciągu miesiąca, i w ciekłym azocie, jeśli komórki będą przechowywane przez dłuższy czas.</li>
	<li>Rozmrozić fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu ponownego użycia. 
	Uwaga: Zazwyczaj przeżywa 90-95% komórek.</li>
</ol>
4. Produkcja rusztowania 2-D z kwasu polimlekowo-ko-glikolowego (PLAGA)
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 g PLAGA w 12 ml dichlorometanu w 20 ml fiolce scyntylacyjnej i wirować roztwór przez 8 godzin ze stałą prędkością (800 obr./min). 
	Uwaga: Szczegółowy opis w Gupta et al.15</li>
	<li>Przenieść rozpuszczony roztwór na szklaną szalkę Petriego wyłożoną fluorowanym papierem ochronnym.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego pod okapem próżniowym na 30 minut. Pozostaw szalkę Petriego w temperaturze -20 °C na noc, a następnie w temperaturze pokojowej. Umieść szalki Petriego w liofilizarze, aby zapewnić całkowite odparowanie rozpuszczalnika w celu uzyskania cienkich warstw polimeru.</li>
	<li>Umieścić folie polimerowe w eksykatorze na 24 godziny.</li>
	<li>Pokrój folie polimerowe na okrągłe krążki o średnicy 12 mm i przechowuj je w eksykatorze do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
</ol>
5. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
<ol>
	<li>Umyj komórki (50 000 komórek/dysk) wysiane na kontrolnym TCPS i rusztowaniu PLAGA PBS 7 dni po wysiewie.</li>
	<li>Użyj 1,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu do utrwalenia komórek i 2,5% OsO4 w 0,1 M buforze kakodylanu do utrwalenia.</li>
	<li>Przemyć utrwalone komórki 0,1 M buforem kakodylowym. Wysuszyć utrwalone ogniwa za pomocą seryjnego odwadniania etanolem (50%, 70%, 80%, 90% i 100%) przez 15 minut każda, a następnie wysuszyć w heksametyldisilazanie (HMDS) przez noc.</li>
	<li>Odpowietrzyć komorę systemu napylania SEM za pomocą zaworu guzikowego i podnieść górną płytę.</li>
	<li>Umieścić wysuszone próbki w komorze. Opuść górną płytę.</li>
	<li>Przełącz pokrętło sterujące na pompę, aby rozpocząć opróżnianie komory.</li>
	<li>Otwórz zawór wycieku argonu. Poczekaj, aż podciśnienie spadnie do 0,05 mbar.</li>
	<li>Pokryj wysuszone próbki cienką warstwą (0,13 nm) złota/palladu.</li>
	<li>Przywróć zawór wycieku argonu do pozycji zamkniętej.</li>
	<li>Wyłącz pokrętło sterujące</li>.
	<li>Odpowietrzyć komorę za pomocą zaworu guzikowego i podnieść górną płytę.</li>
	<li>Wyjąć próbki i przechowywać je w eksykatorze przez 24 godziny.</li>
	<li>Obserwuj próbki pod skaningowym mikroskopem elektronowym.</li>
</ol>
6. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Umyj komórki (50 000 komórek/dysk) wysiane na kontrolnym TCPS i rusztowaniu PLAGA PBS 7 dni po wysiewie.</li>
	<li>Napraw komórki za pomocą 70% etanolu (na zimno) przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować utrwalone komórki w temperaturze pokojowej z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS zawierającym 0,05% Triton X-100 przez 20 minut.</li>
	<li>Zanurz próbki w 1% Tween w temperaturze pokojowej na 20 minut.</li>
	<li>Dodać mysie przeciwciało monoklonalne anty-β-aktyny (1:400) i inkubować komórki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj komórki 0,05% Tween. Dodać przeciwciało drugorzędowe (kozi anty-mysie F (ab') 2 fragment IgG sprzężony z sondą fluorescencyjną, 1:400) do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki PBS. Wybarwić komórki barwnikiem jądrowym i zamontować przy użyciu 80% glicerolu.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterior+cruciate+ligament%3A+A+dilemma+in+sports+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine.</a> Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).</li>
<li>Owings, M. F., Kozak, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambulatory+and+inpatient+procedures+in+the+United+States%2C+1996%5BTitle%5D)+AND+%22Vital+Health+Stats%22%5BJournal%5D)">Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996.</a> Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).</li>
<li>Frank, C. B., Jackson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+reconstruction+of+the+anterior+cruciate+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">The science of reconstruction of the anterior cruciate ligament.</a> J Bone Joint Surg Am. 79, 1556-1576 (1997).</li>
<li>Miyasaka, K. C., Daniel, D. M., Stone, M. L., Hirshman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+knee+ligament+injuries+in+the+general+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Knee+Surg%22%5BJournal%5D)">The incidence of knee ligament injuries in the general population.</a> Am J Knee Surg. 4, 3-8 (1991).</li>
<li>Taylor, D. C., Posner, M., Curl, W. W., Feagin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+tears+of+the+anterior+cruciate+ligament%3A+over+30+year+follow-up+of+patients+treated+with+arthrotomy+and+primary+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Isolated tears of the anterior cruciate ligament: over 30 year follow-up of patients treated with arthrotomy and primary repair.</a> Am J Sports Med. 37 (1), 65-71 (2009).</li>
<li>Liljedahl, S. O., Lindvall, N., Wetterfors, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnosis+and+treatment+of+acute+ruptures+of+the+anterior+cruciate+ligament%3A+a+clinical+and+arthrographic+study+of+forty-eight+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Early diagnosis and treatment of acute ruptures of the anterior cruciate ligament: a clinical and arthrographic study of forty-eight cases.</a> J Bone Joint Surg Am. 47, 1503-1513 (1965).</li>
<li>Oensten, M., Lysholdm, J., Gillquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suture+of+fresh+ruptures+of+the+anterior+cruciate+ligament%3A+A+5+year+follow+up%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop+Scan%22%5BJournal%5D)">Suture of fresh ruptures of the anterior cruciate ligament: A 5 year follow up.</a> Acta Orthop Scan. 55, 270 (1984).</li>
<li>Buckley, S. L., Barrack, R. L., Alexander, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+conservatively+treated+partial+anterior+cruciate+ligament+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">The natural history of conservatively treated partial anterior cruciate ligament tears.</a> Am J Sports Med. 17 (2), 221-225 (1989).</li>
<li>Noyes, F. R., Mooar, L. A., Moorman, C. T. 3rd, McGinnis, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+tears+of+the+anterior+cruciate+ligament.+Progression+to+complete+ligament+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Partial tears of the anterior cruciate ligament. Progression to complete ligament deficiency.</a> J Bone Joint Surg Br. 71 (5), 825-833 (1989).</li>
<li>Bak, K., Scavenius, M., Hansen, S., Norring, K., Jensen, K. H., Jorgensen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+partial+rupture+of+the+anterior+cruciate+ligament.+Long+term+followup+of+56+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg+Sports+Traumatol+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">Isolated partial rupture of the anterior cruciate ligament. Long term followup of 56 cases.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (2), 66-71 (1997).</li>
<li>Fritschy, D., Panoussopoulos, A., Wallensten, R., Peter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+predict+the+outcome+of+a+partial+rupture+of+the+anterior+cruciate+ligament%3F+A+prospective+study+of+43+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg+Sports+Traumatol+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">Can we predict the outcome of a partial rupture of the anterior cruciate ligament? A prospective study of 43 cases.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (1), 2-5 (1997).</li>
<li>Sommerlath, K., Odensten, M., Lysholm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+late+course+of+acute+partial+anterior+cruciate+ligament+tears.+A+nine+to+15+year+follow-up+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop%22%5BJournal%5D)">The late course of acute partial anterior cruciate ligament tears. A nine to 15 year follow-up evaluation.</a> Clin Orthop. , 281-2152 (1992).</li>
<li>Barrack, R. L., Buckley, S. L., Bruckner, J. D., Kneisl, J. S., Alexander, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+versus+complete+acute+anterior+cruciate+ligament+tears%3A+the+results+of+nonoperative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Partial versus complete acute anterior cruciate ligament tears: the results of nonoperative treatment.</a> J Bone Joint Surg Br. 72 (4), 622-624 (1990).</li>
<li>Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+potential+of+primary+ACL+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Current status and potential of primary ACL repair.</a> Clin Sports Med. 28 (1), 51-61 (2009).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+walled+carbon+nanotube+composites+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Single walled carbon nanotube composites for bone tissue engineering.</a> J Orthop Res. 9, 1374-1381 (2013).</li>
<li>Fruensgaard, S., Johannsen, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+ruptures+of+the+anterior+cruciate+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Incomplete ruptures of the anterior cruciate ligament.</a> J Bone Joint Surg Br. 71, 526-530 (1989).</li>
<li>Sandberg, R., Balkfors, B., Nilsson, B., Westlin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operative+versus+non-operative+treatment+of+recent+injuries+to+the+ligaments+of+the+knee.+A+prospective+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Operative versus non-operative treatment of recent injuries to the ligaments of the knee. A prospective randomized study.</a> J Bone Joint Surg Am. 69, 1120-1126 (1987).</li>
<li>Lamar, D. S., Bartolozzi, A. R., Freedman, K. B., Nagda, S. H., Fawcett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+modification+of+partial+tears+of+the+anterior+cruciate+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22Arthroscopy%22%5BJournal%5D)">Thermal modification of partial tears of the anterior cruciate ligament.</a> Arthroscopy. 21 (7), 809-814 (2005).</li>
<li>Indelli, P. F., Dillingham, M. F., Fanton, G. S., Schurman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monopolar+thermal+treatment+of+symptomatic+anterior+cruciate+ligament+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop%22%5BJournal%5D)">Monopolar thermal treatment of symptomatic anterior cruciate ligament instability.</a> Clin Orthop. 407, 138-147 (2003).</li>
<li>Smith, D. B., Carter, T. R., Johnson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+failure+rate+for+electrothermal+shrinkage+of+the+lax+anterior+cruciate+ligament%3A+a+multicenter+follow-up+past+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arthroscopy%22%5BJournal%5D)">High failure rate for electrothermal shrinkage of the lax anterior cruciate ligament: a multicenter follow-up past 2 years.</a> Arthroscopy. 24 (6), 637-641 (2008).</li>
<li>Buda, R., Ferruzzi, A., Vannini, F., Zambelli, L., Di Caprio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+technique+with+semitendinosus+and+gracilis+tendons+in+chronic+partial+lesions+of+the+ACL%3A+clinical+and+arthrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg+Sports+Traumatol+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">Augmentation technique with semitendinosus and gracilis tendons in chronic partial lesions of the ACL: clinical and arthrometric analysis.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 14 (11), 1101-1107 (2006).</li>
<li>Sekiya, J. K., Golladay, G. J., Wojtys, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autodigestion+of+a+hamstring+anterior+cruciate+ligament+autograft+following+thermal+shrinkage%3A+a+case+report+and+sentinel+of+concern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Autodigestion of a hamstring anterior cruciate ligament autograft following thermal shrinkage: a case report and sentinel of concern.</a> J Bone Joint Surg Am. 82 (10), 1454-1457 (2000).</li>
<li>Farquharson-Roberts, M. A., Osborne, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+rupture+of+the+anterior+cruciate+ligament+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Partial rupture of the anterior cruciate ligament of the knee.</a> J Bone Joint Surg Br. 65, 32-34 (1983).</li>
<li>Rue, J. P., Ghodadra, N., Bach, B. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femoral+tunnel+placement+in+single-bundle+anterior+cruciate+ligament+reconstruction%3A+a+cadaveric+study+relating+transtibial+lateralized+femoral+tunnel+position+to+the+anteromedial+and+posterolateral+bundle+femoral+origins+of+the+anterior+cruciate+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Femoral tunnel placement in single-bundle anterior cruciate ligament reconstruction: a cadaveric study relating transtibial lateralized femoral tunnel position to the anteromedial and posterolateral bundle femoral origins of the anterior cruciate ligament.</a> Am J Sports Med. 36, 73-79 (2008).</li>
<li>Carey, J. L., Dunn, W. R., Dahm, D. L., Zege, S. L., Spindler, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+with+autograft+compared+with+allograft%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg%22%5BJournal%5D)">A systematic review of anterior cruciate ligament reconstruction with autograft compared with allograft.</a> J Bone Joint Surg. 91, 2242-2450 (2009).</li>
<li>Murray, M. M., Martin, S. D., Martin, T. L., Spector, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+changes+in+the+human+anterior+cruciate+ligament+after+rupture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Histological changes in the human anterior cruciate ligament after rupture.</a> J Bone Joint Surg Am. 82, 1387-1397 (2000).</li>
<li>Andrish, J., Holmes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+synovial+fluid+on+fibroblasts+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of synovial fluid on fibroblasts in tissue culture.</a> Clin Orthop Relat Res. (138), 279-283 (1979).</li>
<li>Murray, M. M., Spindler, K. P., Ballard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+histologic+repair+in+a+central+wound+in+the+anterior+cruciate+ligamentwith+a+collagen-platelet-rich+plasma+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced histologic repair in a central wound in the anterior cruciate ligamentwith a collagen-platelet-rich plasma scaffold.</a> J Orthop Res. 25, 1007-1017 (2007).</li>
<li>Carter, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+cruciate+ligament+thermal+shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Anterior cruciate ligament thermal shrinkage.</a> Clin Sports Med. 21, 693-700 (2002).</li>
<li>Perry, J. J., Higgins, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+and+posterior+cruciate+ligament+rupture+after+thermal+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Arthroscopy%22%5BJournal%5D)">Anterior and posterior cruciate ligament rupture after thermal treatment.</a> Arthroscopy. 16, 732-736 (2000).</li>
<li>Cheng, M. T., Yang, H. W., Chen, T. H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+multipotent+stem+cells+from+human+cruciate+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of multipotent stem cells from human cruciate ligaments.</a> Cell Prolif. 42 (4), 448-460 (2009).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+anterior+cruciate+ligament-derived+vascular+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human anterior cruciate ligament-derived vascular stem cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (6), 859-872 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Głównym celem tego badania rusztowania hACL/2D było wykorzystanie uzyskanych komórek w plastrze do zwiększenia pierwotnej naprawy częściowych rozdarć ACL. Nieoperacyjne leczenie częściowych zerwań ACL może obejmować krótki okres unieruchomienia, usztywnienia, progresywny program rehabilitacji i regularne kontrole 13,16,17. Jednak wiele badań pokazuje, że leczenie zachowawcze u sportowców wiązało się ze słabymi wynikami i niepowodzeniami. Buckley i wsp. ocenili 25 pacjentów z częściowymi zerwaniami ACL...

Więzadło krzyżowe przednie (ACL) jest często uszkadzane więzadło wewnątrzstawowe kolana. Rocznie w Stanach Zjednoczonych zgłaszanych jest około 200 000 urazów (ACL). Ponad 75% pacjentów doświadczających urazu ACL decyduje się na ortopedyczną chirurgię rekonstrukcyjną 1,2,3,4. Interwencja chirurgiczna jest często wskazana ze względu na z natury słaby potencjał gojenia3. Rekonstrukcja ACL jest zwykle wykonywana za pomocą autoprzeszczepu lub ścięgna alloprzeszczepu. Autoprzeszczep i przeszczep allogeniczny stanowią złoty standard w rekonstrukcji, ponieważ mogą pochwalić się wysokimi wskaźnikami sukcesu, a naprawa szwów pierwotnych, inna opcja leczenia, wykazała wskaźnik niepowodzeń sięgający 94% 5,6,7.
Częściowe zerwania ACL stanowią od 10% do 28% wszystkich zerwań ACL8. W badaniu prospektywnym Noyes i wsp. oszacowali, że 50% pacjentów z częściowymi łzami dotykającymi więcej niż połowy ACL rozwinęło się do całkowitej niewydolności ACL po leczeniu nieoperacyjnym9. Inne badania wskazują na utrzymującą się niestabilność i pogorszenie funkcji, a mniej niż 30% pacjentów jest w stanie powrócić do poziomu aktywności sprzed urazu 9,10,11,12,13. Możliwości leczenia są ograniczone i obejmują metody zachowawcze, termokurczliwość pozostałego ACL lub rekonstrukcję ACL. W ostatnim czasie wzrosło zainteresowanie rozszerzoną naprawą pierwotną. Techniki te wykorzystują leki biologiczne w celu poprawy naprawy szwów pierwotnych14. Ostatnie badania próbowały pobrać mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z hACL w celu obejścia ograniczeń przeszczepów,31,32 ale ważność i skuteczność tych komórek jest nadal nieznana. Idealnym źródłem komórek do zastosowań w inżynierii tkankowej wydają się być niemezejymalne komórki fibroblastów pochodzące z hACL.
Obecne badania koncentrują się na zidentyfikowaniu odpowiedniego materiału matrycowego i źródła komórek dla zaprojektowanego rusztowania. Jest to standardowa procedura, w której zerwany ACL jest wyrzucany jako odpad chirurgiczny podczas operacji rekonstrukcyjnej, jednak to uszkodzone więzadło może być wysokiej jakości źródłem pozyskiwania komórek potrzebnych do rozwoju i wzmocnienia idealnej wymiany ACL za pomocą inżynierii tkankowej. Nasze laboratorium opracowało protokół ekspansji in vitro tych pobranych komórek pochodzących z hACL. Korzystając z zaprojektowanej matrycy 2D nasączonej komórkami pochodzącymi z hACL, zaprojektowaliśmy plaster, który może potencjalnie wspomóc częściową naprawę ACL i wzmocnić zerwane więzadła.

<table><tbody><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-103C</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Gibco</td><td>17018-029</td><td>Przechowywać pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Cellgro</td><td>10-092-CV</td><td>Sklep pod adresem 4 &#176;C. Ciepły w 37 &#176; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>Przechowywać w -80 i #176; C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; </td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe C - 15 ml</td><td>Kolby Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>BD Falcon</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina trypsyny-versenu</td><td>Lonza</td><td>17-161E</td><td>Przechowywać pod adresem 4 &#176;C. Ciepło w 37 i #176; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Ciecz palna. Może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych.</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Corning</td><td>430489</td><td></td></tr><tr><td>PLAGA</td><td>Purac Biomaterials</td><td>Purasorb PLG8523</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Dyski TCPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36423-0010</td><td>Możliwe zagrożenie rakiem. Przechowywać w suchym, chłodnym miejscu.</td></tr><tr><td>Papier Bytac</td> Saint <td>gobin performance plastics</td><td>1420652</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-21G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>Przechowywać pod adresem 4 i #176; C</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-&beta-aktynowe (1&#176; Ab)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5441</td><td>Sklep pod adresem -20 &#176; C</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-myszy (2&#176; Ab)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4408</td><td>Przechowuj pod adresem -20 i # 176; C</td></tr><tr><td>Hoechst dye</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14530</td><td>Przechowuj pod adresem -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2547-1</td><td>Działa toksycznie przez drogi oddechowe i po połknięciu. Powoduje oparzenia wszystkimi drogami narażenia.</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC43085-1000</td><td>Łatwopalna ciecz i para. Powoduje oparzenia wszystkimi drogami narażenia.</td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td>McKesson</td><td>25-716</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Olympus</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Thermo scientific</td><td>2845</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>VX-200</td><td></td></tr><tr><td>Szklane płytki Petriego</td><td>fisher Scientific</td><td>S31473</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P1225</td><td>Acu-Punch został użyty do cięcia 12 mm krążków</td></tr><tr><td>Kacodylate Bufor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>97068</td><td>Ciecz łatwopalna, rakotwórcza i drażniąca.</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Szkodliwy po połknięciu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td>Przechowywać z dala od źródeł ciepła, iskier, płomieni i innych form zapłonu.</td></tr><tr><td>Znieczulenie ogólne/regionalne</td><td>Amphastar pharmaceuticals</td><td></td><td>1% Lidokaina, 0,25% Bupiwakaina, Środki znieczulające do indukcji i leczenia podtrzymującego</td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Hospira</td><td>0409-0805-01</td><td>Ancef 1 g dożylnie</td></tr><tr><td>Trokar artroskopowy</td><td>Smith i siostrzeniec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera artroskopowa</td><td>Smith i siostrzeniec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chwytak artroskopowy i gorzka golarka</td><td>Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,5 mm</td> interferencyjne <td>Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> ze <td>stali nierdzewnej</td><td>Arthrex</td><td></td></tr><tr><td>Napylarka do napylania</td><td>Polaron</td><td>E5400</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Uraz ACL jest często spotykanym problemem u osób aktywnych. Nawet częściowe zerwanie tego wewnątrzstawowego więzadła kolana prowadzi do braków biomechanicznych, które upośledzają funkcję i stabilność. Obecne opcje leczenia częściowych zerwań ACL obejmują zarówno nieoperacyjne, zachowawcze leczenie, jak i wiele opcji chirurgicznych, takich jak: modyfikacja termiczna, naprawa pojedynczego pęczka, całkowita rekonstrukcja i rekonstrukcja uszkodzonej części więzadła natywnego. Niewiele badań, jeśli w ogóle, wykazało, że jakakolwiek pojedyncza metoda leczenia jest konsekwentnie lepsza, a w wielu przypadkach pacjenci nadal wykazują trwałą niestabilność i inne choroby współistniejące.
Celem tego badania jest zidentyfikowanie potencjalnego źródła komórek do wykorzystania w rozwoju łatki inżynierii tkankowej, która mogłaby zostać zaimplementowana do naprawy częściowo zerwanego ACL. Opracowano nowatorski protokół do ekspansji komórek pochodzących od pacjentów poddawanych rekonstrukcji ACL. Aby wyizolować komórki, zmieloną tkankę hACL uzyskaną podczas rekonstrukcji ACL trawiono w roztworze kolagenazy. Ekspansję przeprowadzono przy użyciu pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S). Komórki były następnie przechowywane w temperaturze -80 ºC lub w ciekłym azocie w pożywce zamrażającej składającej się z DMSO, FBS i pożywki ekspandującej. Po rozmrożeniu komórki pochodzące z hACL zostały następnie wysiane na rusztowanie inżynierii tkankowej, PLAGA (kwas polimlekowo-ko-glikolowy) i polistyren kontrolny do hodowli tkankowej (TCPS). Po 7 dniach wykonano SEM w celu porównania adhezji komórkowej do PLAGA w porównaniu z kontrolnym TCPS. Morfologię komórkową oceniano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Mikrofotografie SEM (Scanning Electron Microscope) wykazały, że komórki rosły i przylegały zarówno do powierzchni PLAGA, jak i TCPS, a do 7 dnia zlewały się na całej powierzchni. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało normalne, nienaprężone wzorce morfologiczne na obu powierzchniach. Technika ta jest obiecująca pod kątem zastosowań w regeneracji i rekonstrukcji ACL.

Model roboczy pobierania chirurgicznego, trawienia tkanek i izolacji komórek pochodzących z ludzkiego więzadła krzyżowego przedniego (hACL) przedstawiono na Rysunku 1. Komórki migrowały z eksplantatów i przylgnęły do kolb T-25. Komórki te hodowano przez 3 dni, a następnie poddano wizualizacji pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 2). Do 7. dnia uzyskano konfluentną monowarstwę. Obecność zdrowych, żywotnych komórek wskazała na pomyślne pobranie i hodowlę komórek pochodzących z hACL.
<p c...

Do przyszłych zastosowań jako łatka do naprawy częściowych zerwań więzadła krzyżowego przedniego (ACL), ludzkie komórki pochodzące z ACL zostały wyizolowane z tkanki uzyskanej podczas procedur rekonstrukcyjnych, namnażone in vitro i wyhodowane na rusztowaniach inżynierii tkankowej. Następnie przeprowadzono adhezję komórkową i morfologię, aby potwierdzić biokompatybilność na powierzchni rusztowania.

Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie inżynieryjnie tkankowego więzadła krzyżowego przedniego lub łaty ACL dla pary częściowo zerwanych ACL. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie pobranie od pacjenta tkanki ACL i przechowywanie jej w soli fizjologicznej. Uzyskany preparat ACL jest rozdrabniany i trawiony kolagenazą w celu pozyskania komórek pochodzących z ACL.Następnie wyizolowane komórki poddaje się hodowli i ekspansji. Kolejnym krokiem jest wykonanie dwuwymiarowego rusztowania z kopolimeru kwasu polimlekowego i glikolowego. W ostatnim kroku komórki są wysiewane na tę błonę polimerową.W końcowej fazie wykorzystuje się skaningową mikroskopię elektronową oraz mikroskopię immunofluorescencyjną, aby wykazać biokompatybilność powierzchni rusztowania. Dzisiaj zaprezentujemy naszą technikę opracowania łaty w przypadku częściowych zerwań ACL. Jest to istotne ze względu na fakt, że więzadła ACL nie regenerują się samoistnie.Jest to nowa, innowacyjna technika, którą opracowaliśmy, aby wspomóc gojenie ACL. Aby rozpocząć, przenieś ludzką tkankę ACL otrzymaną z patomorfologii do szalki Petriego z jałową solą fizjologiczną i solą fosforanową (PBS), a następnie posiekaj tkankę za po

surgical-retrieval-isolation-vitro-expansion-human-anterior-cruciate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Chirurgiczne pozyskiwanie, izolacja i in vitro ekspansja komórek pochodzących z więzadeł krzyżowych człowieka w zastosowaniach inżynierii tkankowej

Opisano eksperymentalną technikę leczenia uszkodzeń chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Implantacja autologicznych chondrocytów osadzonych na macierzy jest powszechnie akceptowaną metodą przebudowy i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej, zapewniającą satysfakcjonujące długoterminowe wyniki. Transplantacja autologicznych chondrocytów wspomagana macierzą (MACT) oferuje zstandaryzowaną i klinicznie uznaną metodę implantacji.

Przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Inżynieria tkankowa często obejmuje ekspansję in vitro w celu stworzenia autoprzeszczepów do regeneracji tkanek. W tym badaniu opracowano metodę rozbudowy, regeneracji i rekonstrukcji tkanek in vivo w celu zminimalizowania przetwarzania komórek i materiałów biologicznych poza organizmem.

Tkanka mielona w skompresowanym kolagenie: bioprzeszczep zawierający komórki do jednoetapowej naprawy rekonstrukcyjnej

Prezentujemy model tkanki więzadła, w którym trójwymiarowe konstrukty są traktowane ludzką surowicą kondycjonowaną wysilaniem i analizowane pod kątem zawartości kolagenu, funkcji i biochemii komórkowej.

Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Poznaj izolację i ekspansję ludzkich komórek więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej. Ta metoda umożliwia opracowanie łaty do naprawy częściowych uszkodzeń ACL.

Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal

Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów