Name: Ocena behawioralna układu przedsionkowego starzejącej się myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę oceny równowagi u starzejących się myszy przy użyciu bodźca rotacyjnego i testu na rurze rotacyjnej oraz belce równoważnej. Technika ta pozwala badać zmiany związane z wiekiem w układzie przedsionkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować The Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation oraz Bosch Institute Animal Behavioural Facility.

1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Myszy (C57/BL6) w wieku 1, 9 i 13 miesięcy uzyskano z Centrum Zasobów Zwierzęcych (Perth, Australia). Myszy te były trzymane w standardowych klatkach dla myszy w Bosch Rodent Facility na Uniwersytecie w Sydney w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Przedstawione poniżej procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Sydney.</li>
	<li>Przed każdym testem należy wprowadzić klatki dla myszy do pomieszczenia testowego na 10 minut, aby umożliwić myszom zaaklimatyzowanie się w środowisku testowym.</li>
</ol>
2. Rotarod
<ol>
	<li>Ustaw aparat rotarod (rysunek 1A):
	<ol>
		<li>Zamontuj kołki na każdym pasie rotarod. 
		Uwaga: W tym przypadku kołki szczurze (o średnicy 70 mm) są używane zamiast kołków myszy (o średnicy 32 mm), aby zniechęcić myszy do trzymania się kołka i wykonywania "pasywnych obrotów"10.</li>
		<li>Umieść magnetyczne platformy do lądowania na drucie znajdującym się na dole każdego pasa ruchu rotarodu, upewniając się, że nie przechylają się, aby dotknąć podłogi rotarod i są umieszczone jak najbliżej magnetycznej prawej ściany każdego pasa bez dotykania. 
		Uwaga: Podczas testowania Rotarod myszy muszą chodzić w kierunku do przodu, aby pozostać na obracających się i przyspieszających kołkach. Kiedy mysz nie jest już w stanie utrzymać się na kołku, spada i przemieszcza platformę lądowania, która następnie aktywuje czujnik magnetyczny. Czas potrzebny do upadku z obracającego się kołka, prędkość obrotowa kołka w momencie upadku oraz przebyta odległość są automatycznie obliczane dla każdej myszy i rejestrowane na ekranie wyświetlacza z przodu rotarod.</li>
		<li>Wsuń 2 przezroczyste plastikowe panele z przodu każdego pasa obrotu z krótszymi panelami na dole i dłuższymi panelami powyżej.</li>
		<li>Wprowadź parametry testowe za pomocą klawiatury znajdującej się z przodu rotorodu. Postępować zgodnie z krokami 2.1.4.1 do 2.1.4.6 dla parametrów badania prędkości obrotowej oraz etapami od 2.1.4.7 do 2.1.4.12 dla parametrów badania rotarod przy stałej prędkości.
		<ol>
			<li>Ustaw maksymalny czas trwania testu na 60 sekund.</li>
			<li>Ustaw liczbę torów, które mają być używane (lub liczbę myszy do przetestowania).</li>
			<li>Ustaw prędkość początkową testu na 5 obr./min.</li>
			<li>Ustaw maksymalną prędkość testu na 44 obr./min.</li>
			<li>Ustaw prędkość narastania testu na 60 sekund.</li>
			<li>Ustaw rozmiar wybranych kołków i kierunek obrotu na kołki szczurów obracające się w kierunku do przodu.</li>
			<li>Ustaw maksymalny czas trwania testu na 240 sekund.</li>
			<li>Ustaw liczbę torów, które mają być używane, na 1, ponieważ myszy są testowane indywidualnie.</li>
			<li>Ustaw prędkość początkową testu na 15 obr./min.</li>
			<li>Ustaw maksymalną prędkość testu na 15 obr./min.</li>
			<li>Ustaw prędkość narastania testu na 0 sekund.</li>
			<li>Ustaw rozmiar wybranego kołka i kierunek obrotu na kołek szczura obracający się w kierunku do przodu. 
			Uwaga: powyższe ustawienia mogą ulec zmianie w zależności od potrzeb różnych eksperymentów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść kamerę przed rotarodem do testu rotarod o stałej prędkości, tak aby można było nagrywać zachowanie myszy podczas prób i wykorzystywać filmy do późniejszej analizy w celu określenia czasu, przez jaki myszy były w stanie pozostać na rotarod</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj kroki od 2.2.1 do 2.2.4 dla badania obrotowego przyspieszającego:
	<ol>
		<li>Umieść jedną mysz na każdym nieruchomym kołku na 5 minut, aby umożliwić myszom zaaklimatyzowanie się do rotarodu.</li>
		<li>Delikatnie popchnij myszy, aby były zwrócone w stronę tylnej części rotarodu i rozpocznij test rotarod, gdy wszyscy badani są zwróceni w tym kierunku (patrz rysunek 1B).</li>
		<li>Przywróć wszystkie myszy do klatek, gdy spadną z obracających się kołków i pozostaw je na 10 minut z dostępem do jedzenia i wody.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.2.3, aby ukończyć w sumie 8 prób, upewniając się, że kołki, tory i platformy do lądowania rotarod są oczyszczone z moczu i kału, a następnie przesuwaj platformy lądowania z powrotem do pozycji wyjściowej między każdą próbą. 
		Uwaga: Pierwsze 3-5 prób służy jako próby treningowe, aby umożliwić myszom zapoznanie się z zadaniem. Czas do upadku, przebyta odległość i końcowa prędkość obrotowa kołka w momencie upadku dla każdej kolejnej próby są rejestrowane do późniejszej analizy (rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać kroki od 2.3.1 do 2.3.8 dla badania rotarodu o stałej prędkości:
	<ol>
		<li>Umieść jedną mysz na kołku na 5 minut, aby umożliwić jej zaaklimatyzowanie się do rotarodu. Umieść mysz z powrotem w klatce.</li>
		<li>Rozpocznij nagrywanie wideo w kamerze i naciśnij start na rotarod. Następnie umieść mysz na obracającym się kołku, upewniając się, że jest skierowana do tyłu rotarodu.</li>
		<li>Zatrzymaj nagrywanie wideo w aparacie, gdy mysz spadnie z obracających się kołków, i wróć do klatek na 10 minut z dostępem do jedzenia i wody.</li>
		<li>Powtarzać kroki 2.3.2 i 2.3.3, aż do uzyskania łącznie 8 prób, upewniając się, że kołki, tory i platformy lądowania rotarod są oczyszczone z kału i moczu, a następnie przesunąć platformy lądowania z powrotem do pozycji wyjściowej między każdą próbą.</li>
		<li>Włącz specjalnie zbudowany rotator na 3 Hz na 20 sekund, aby myszy mogły zapoznać się z dźwiękiem. Zatrzymaj rotator po 20 sekundach, wyłączając wiertło i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zatrzymać jego dalsze obracanie się po początkowych 20 sekundach 
		Uwaga: Sam rotator składa się z koła jezdnego gryzonia przymocowanego do wiertła (Rysunek 3A). Na środku koła jezdnego znajduje się mała komora z siatkową pokrywą, w której umieszcza się mysz (Rysunek 3B). Rotator obraca się w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara wokół osi pionowej. Wielkość bodźca jest zgodna z wcześniejszymi badaniami, które pokazują, że stymulacje obrotowe w zakresie od 0,2 do 3 Hz są wystarczające do wygenerowania odpowiedzi VOR i VCR4,11,12.</li>
		<li>Umieść mysz w komorze na środku rotatora i załóż pokrywę.</li>
		<li>Włącz rotator na najniższym ustawieniu 3 Hz na 20 sekund. Uruchom rotor i rozpocznij nagrywanie wideo na kamerze w tym czasie w ramach przygotowań do nadchodzącej próby. Wyłącz wiertło po upływie 20 sekund i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zapobiec jego obracaniu się. Natychmiast przetestuj ponownie mysz na rotarodzie, przenosząc ją tak szybko, jak to możliwe, na obracający się kołek.</li>
		<li>Zatrzymaj nagrywanie wideo w aparacie, gdy mysz spadnie z kołka i włóż mysz z powrotem do klatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść przezroczyste plastikowe panele łagodną mieszanką detergentu i wody oraz cylindryczne kołki, pasy i metalowe platformy do lądowania rotarodu 70% etanolem, gdy wszystkie myszy zostały przetestowane.</li>
</ol>
3. Równoważnia z wyzwaniem przedsionkowym
<ol>
	<li>Ustaw urządzenie równoważni, jak pokazano na rysunku 4A. 
	Uwaga: Aparat równoważni został zaadaptowany z aparatu opisanego w Carter et al. (2001)13. W tym teście myszy przechodzą od dolnego końca belki, który znajduje się 52,5 cm nad ziemią, do zaciemnionej skrzynki bramkowej (13 x 22 cm, z drzwiami o wymiarach 5 x 6 cm) umieszczonej 60 cm nad ziemią (ryc. 4A). Myszy w naturalny sposób szukają ciemności i ochrony pola bramkowego na rzecz odsłoniętej belki, a następnie są zachęcane do pokonywania belki przez lekkie nachylenie, które wykorzystuje ich naturalny mechanizm ucieczki do biegania w górę14. Sama belka ma 1 m długości i okrągły przekrój o średnicy 14 mm. Można zastosować dostosowany zakres średnic wiązki, co pozwala eksperymentatorowi dostosować czułość testu lub dostosować się do większych obiektów. Na dolnym końcu równoważni biała linia wskazuje linię startu. Kolejna linia została narysowana w odległości 60 cm od linii startu na wyższym końcu belki, aby wskazać linię mety (rysunek 4A).
	<ol>
		<li>Umieść 2 kamery, po jednej z każdej strony równoważni, na dolnym końcu równoważni (Rysunek 4B). 
		Uwaga: Kamery te powinny być ustawione pod kątem, aby uchwycić całą długość równoważni i upewnić się, że linie początkowe i końcowe zaznaczone na równoważni są wyraźnie widoczne. Kamery te będą używane do nagrywania wideo zachowania myszy podczas przechodzenia przez równoważnię, a uzyskane filmy zostaną wykorzystane do późniejszej analizy.</li>
		<li>Wyłóż podłogę pudełka bramkowego ręcznikiem papierowym, aby umożliwić łatwe czyszczenie moczu i kału po przetestowaniu każdej myszy, a następnie umieść kopułę obudowy z klatki domowej obiektu wewnątrz pudełka bramkowego.</li>
		<li>Umieść odpowiednią piankę lub inny materiał amortyzujący pod podniesioną belką, aby chronić wszelkie przedmioty, które spadną z urządzenia. Myszy, które upadną, zostaną natychmiast podniesione przez eksperymentatora i umieszczone w polu bramkowym, aby odpoczęły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść jedną mysz w polu bramki na 2 minuty, aby zapoznała się z tym środowiskiem. Zakryj otwór do pola bramkowego ręką w rękawiczce na 5 sekund, jeśli mysz próbuje w tym czasie wejść na belkę, aby zniechęcić do takiego zachowania.</li>
	<li>Trenuj mysz, umieszczając ją na belce tuż za otworem do pola bramkowego i pozwalając jej wejść do pola bramki. Kontynuuj trening myszy, umieszczając ją na belce stopniowo oddalając się od pola bramkowego, aż mysz będzie w stanie przejść od linii startu do pola bramki bez pomocy i minimalnego wahania. Pozostaw mysz na odpoczynek w polu bramkowym na 1 minutę po każdym biegu.</li>
	<li>Rozpocznij testowanie myszy po zakończeniu trenowania.
	<ol>
		<li>Rozpocznij nagrywanie wideo w kamerach.</li>
		<li>Umieść mysz na linii startu belki i poczekaj, aż przejdzie przez belkę w kierunku pola bramkowego.</li>
		<li>Zatrzymaj nagrywanie wideo w kamerach, gdy mysz dotrze do pola.</li>
		<li>Pozostaw mysz na 1 minutę w polu bramkowym. Usuń mocz lub kał, który mógł zostać zdeponowany podczas próby, podczas oczekiwania.</li>
		<li>Powtarzać kroki od 3.4.1 do 3.4.4, aż do zakończenia łącznie 5 prób.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz specjalnie zbudowany rotator o częstotliwości 3 Hz na 20 sekund (jak w teście rotaru o stałej prędkości), aby myszy mogły zapoznać się z dźwiękiem. Zatrzymaj rotator po 20 sekundach, wyłączając wiertło i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zatrzymać jego obracanie się.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze na środku rotatora i załóż pokrywę.</li>
	<li>Włącz rotator na najniższym ustawieniu 3 Hz na 20 sekund. W tym czasie rozpocznij nagrywanie wideo na kamerach, w ramach przygotowań do nadchodzącej próby. Wyłącz wiertło po upływie 20 sekund i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zapobiec jego dalszemu obracaniu się po początkowych 20 sekundach. Przenieś mysz na początek równoważni tak szybko, jak to możliwe i poczekaj, aż mysz przejdzie przez belkę do pola bramki.</li>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie wideo na kamerach, gdy mysz dotrze do pola bramki i wróć do klatki.</li>
	<li>Wyczyść równoważnię 70% etanolem i zmień ręcznik papierowy w pudełku na bramkę po przetestowaniu każdej myszy.</li>
</ol>

<ol><li>Agrawal, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+balance+and+vestibular+function+in+US+adults%3A+data+from+the+National+Health+and+Nutrition+Examination+Survey%2C+2001-2004%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004.</a> Arch. Intern. Med. 169, 938-944 (2009).</li>
<li>Schwab, C. W., Kauder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trauma+in+the+geriatric+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Surg%22%5BJournal%5D)">Trauma in the geriatric patient.</a> Arch. Surg. 127, 701-706 (1992).</li>
<li>Stahl, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+video+and+magnetic+search+coil+recordings+of+mouse+eye+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements.</a> J. Neurosci. Methods. 99, 101-110 (2000).</li>
<li>Takemura, K., King, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibulo-collic+reflex+%28VCR%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vestibulo-collic reflex (VCR) in mice.</a> Exp. Brain Res. 167, 103-107 (2005).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J. Neurosci. 19, 3248-3257 (1999).</li>
<li>Wallace, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+and+reflexive+behavior+in+the+aging+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Motor and reflexive behavior in the aging rat.</a> J. Gerontol. 35, 364-370 (1980).</li>
<li>Ingram, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+age+on+motor+performance+in+two+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Differential effects of age on motor performance in two mouse strains.</a> Neurobiol. Aging. 2, 221-227 (1981).</li>
<li>Serradj, N., Jamon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+motricity+of+the+inbred+mice+strains+129%2Fsv+and+C57BL%2F6j%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the motricity of the inbred mice strains 129/sv and C57BL/6j.</a> Behav. Brain Res. 177, 80-89 (2007).</li>
<li>Gage, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+and+motor+deficits+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Spatial learning and motor deficits in aged rats.</a> Neurobiol. Aging. 5, 43-48 (1984).</li>
<li>Rustay, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+task+parameters+on+rotarod+performance+and+sensitivity+to+ethanol+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice.</a> Behav. Brain Res. 141, 237-249 (2003).</li>
<li>Xiaocheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+efferent+vestibular+system+and+vestibular+nucleus+in+rats+with+motion+sickness%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of calcitonin gene-related peptide in efferent vestibular system and vestibular nucleus in rats with motion sickness.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Beraneck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+mouse+vestibulo-ocular+reflex+following+genetic+or+environmental+alteration+of+gravity+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of mouse vestibulo-ocular reflex following genetic or environmental alteration of gravity sensing.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+coordination+and+balance+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor coordination and balance in rodents.</a> Curr. Protoc. Neurosci. , (2001).</li>
<li>Brooks, S. P., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tests+to+assess+motor+phenotype+in+mice%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 519-529 (2009).</li>
<li>Luong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
<li>McFadyen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+among+eight+inbred+strains+of+mice+in+motor+ability+and+motor+learning+on+a+rotorod%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Differences among eight inbred strains of mice in motor ability and motor learning on a rotorod.</a> Genes Brain Behav. 2, 214-219 (2003).</li>
<li>Shiga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+effects+on+vestibulo-ocular+responses+in+C57BL%2F6+mice%3A+comparison+with+alteration+in+auditory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Aging effects on vestibulo-ocular responses in C57BL/6 mice: comparison with alteration in auditory function.</a> Audiol. Neurootol. 10, 97-104 (2005).</li>
<li>Stahl, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+movements+of+the+murine+P%2FQ+calcium+channel+mutant+rocker%2C+and+the+impact+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Eye movements of the murine P/Q calcium channel mutant rocker, and the impact of aging.</a> J. Neurophysiol. 91, 2066-2078 (2004).</li>
<li>Fahlstrom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+in+aging+female+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes in aging female C57BL/6 mice.</a> Neurobiol. Aging. 32, 1868-1880 (2011).</li>
<li>Bâ, A., Seri, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychomotor+functions+in+developing+rats%3A+ontogenetic+approach+to+structure-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Psychomotor functions in developing rats: ontogenetic approach to structure-function relationships.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 19, 413-425 (1995).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+animal+model+for+motion+sickness+and+its+first+application+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">A novel animal model for motion sickness and its first application in rodents.</a> Physiol. Behav. 92, 702-707 (2007).</li>
<li>Tung, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+semi-intact+preparation+of+the+mouse+vestibular+sensory+epithelium+for+electrophysiology+and+high-resolution+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy.</a> J. Vis. Exp. (76), (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Wcześniejsze prace wykazały, że łatwo jest przetrenować myszy zarówno na rotarodzie, jak i na równoważni, a w konsekwencji uzyskanie dokładnych pomiarów może być wyzwaniem15. Na przykład przetrenowanie na rotarodzie może prowadzić do tego, że myszy celowo zeskakują z kołków zarówno w okresie aklimatyzacji, jak i próby, podczas gdy przetrenowanie na równoważni może prowadzić do częstszego zatrzymywania się (zachowanie eksploracyjne) i podróżowania w prz...

Nasz zmysł równowagi jest prawdopodobnie jednym z najbardziej pomijanych, ale istotnych elementów nawet najbardziej podstawowych czynności motorycznych, takich jak chodzenie i obracanie się. Na równowagę wpływa wiele czynników, w tym siła mięśni, koordynacja ruchowa i funkcja przedsionkowa, i tylko w obecności neuropatii przedsionkowych lub podczas normalnego starzenia się docenia się znaczenie w pełni funkcjonalnego systemu równowagi. Zaburzenia układu przedsionkowego są często związane z doświadczaniem zawrotów głowy lub zawrotów głowy i braku równowagi, co skutkuje zwiększonym ryzykiem upadków i późniejszych urazów1. Jest to szczególnie ważne w starszych populacjach, gdzie upadki są jedną z głównych przyczyn urazów2.
Testy funkcji przedsionkowych są zwykle oparte na odruchach przedsionkowych, w szczególności przedsionkowo-ocznych (VOR) lub przedsionkowo-kolczystych (VCR). VOR i magnetowid są niezbędne do stabilizacji obrazów na siatkówce i pozycji głowy podczas ruchów odpowiednio głowy i ciała. Zazwyczaj pomiary VOR wymagają inwazyjnej implantacji cewek poszukiwawczych w celu pomiaru ruchów gałek ocznych lub śledzenia ruchu gałek ocznych3. Jest to trudne u myszy ze względu na mały charakter oka myszy i trudności w wykryciu źrenicy do analizy wideo3. Alternatywnie, magnetowid został wykorzystany do pomiaru stabilizacji głowy w odpowiedzi na ruchy ciała u myszy bez konieczności inwazyjnej operacji4. Mimo to niewiele badań koncentruje się konkretnie na tym, jak działa układ przedsionkowy jako całość, a co ważniejsze, jak zmienia się podczas starzenia się.
Aby w prosty i nieinwazyjny sposób ocenić ogólną wydajność równowagi, zmodyfikowaliśmy dwa powszechnie używane testy behawioralne. Testy z rotarodem i pochyloną równoważnią oceniają różne aspekty wydajności motorycznej u gryzoni i w poprzednich badaniach były wykorzystywane w akumulatorze testowym w celu uzyskania pełnego profilu zdolności motorycznych. Na tę zdolność może wpływać choroba lub modyfikacja genetyczna, a także jest wrażliwa na procesy związane z normalnym rozwojem i starzeniemsię 5-7. Wcześniejsze prace z użyciem rotarodu wykazały, że koordynacja ruchowa u myszy pogarsza się po 3miesiącu życia 8. Ponadto szczury wykazują zauważalne deficyty równowagi wraz z wiekiem w teście równoważni9.
Ten artykuł opisuje użycie testów rotarod i równoważni w połączeniu z bodźcem przedsionkowym w celu rzucenia wyzwania układowi przedsionkowemu i scharakteryzowania późniejszego wpływu na wydajność równowagi u młodych i starszych myszy. Chociaż opisane proste i nieinwazyjne metody nie są zaprojektowane jako samodzielne pomiary obwodowej funkcji przedsionkowej, zapewniają one użyteczną i prostą miarę behawioralną do porównywania zmian komórkowych i subkomórkowych na wielu etapach przetwarzania przedsionkowego podczas normalnego starzenia się u myszy.

<table><tbody><tr><td>Rotarod</td><td>IITC Nauki przyrodnicze Inc.</td><td>#755</td> <td>"Kołki rozporowe" = średnica 70 mm. Nie pozwól, aby etanol stykał się z pleksiglasem.</td></tr><tr><td>iPhone</td><td>Apple</td><td></td><td>Może używać dowolnego typu aparatu. Rzep mocowany do tylnej powierzchni do mocowania do ramienia przegubowego 3D.</td></tr><tr><td>Ramię przegubowe 3D</td><td>Fisso/Baitella</td><td>Classic 3300-28</td><td>Każdy rodzaj stabilnego stojaka pionowego byłby wystarczający. Rzep jest przymocowany do wierzchołkowego końca ramienia w celu zamocowania iPhone'a.</td></tr><tr><td>Drewniana belka krocząca: pas gładkiego drewna o długości 1 m o okrągłym przekroju o średnicy</td><td></td><td></td> 14 mm <td>W celu dopasowania do parametrów eksperymentalnych można zastosować różne średnice i kształty przekrojów Drewniana skrzynka</td></tr><tr><td>na bramkę (130 x 140 x 220 mm) wykonana z desek</td><td></td><td></td><td></td>o grubości 11 mm</tr><tr><td>Stojak nośny wykonany z belek 41 x 41 mm: 2 belki pionowe w odległości 525 i 590 mm od podłoża odpowiednio na początku i na końcu bramki; Belka pozioma o długości 803 mm, która biegnie wzdłuż podłoża bezpośrednio pod belką prowadzącą; dwie belki o długości 20 mm działają jak "stopy", łącząc belki poziome i pionowe na każdym końcu; blok o wymiarach 21 x 21 x 36 mm ociosany na wierzchołkowym końcu "początkowej" belki pionowej; Otwór o wymiarach 13 x 13 mm wycięty jest w środku tego bloku, tworząc tunel biegnący prostopadle do belki kroczącej.</td><td></td><td></td><td>Usztywnij wszystkie połączenia za pomocą małych stalowych wsporników.</td></tr><tr><td>farba (na bazie wody)</td><td>Handycan</td><td>Akryl Matowy</td><td>2-3 warstwy na wszystkie drewniane powierzchnie aparatu równoważni</td></tr><tr><td>Wykończenie bezbarwne</td><td>Wattle Estapol</td><td>Poliuretan Matt</td><td>Pojedyncza warstwa na wszystkie belki. Podwójna warstwa na wszystkie inne powierzchnie aparatu równoważni</td></tr><tr><td>Pianka, materiał</td><td></td><td></td> opakowaniowy <td>Aby zamortyzować wszelkie upadki z równoważni</td></tr><tr><td>70% etanolu, ręczniki</td><td></td><td></td> papierowe <td>Czysta belka i skrzynka bramkowa między każdym zwierzęciem.</td></tr><tr><td>Gaziki/ręczniki</td><td></td><td></td> papierowe <td>Do wyłożenia podłogi w polu bramkowym</td></tr><tr><td>Domek dla myszy (z klatki domowej)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena behawioralna układu przedsionkowego starzejącej się myszy

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Związany z wiekiem spadek równowagi wiąże się z pogarszającą się siłą mięśni, koordynacją ruchową i funkcją przedsionkową. Podczas gdy wiele badań wykazuje zmiany w fenotypie równowagi wraz z wiekiem u gryzoni, bardzo niewiele z nich izoluje wkład układu przedsionkowego w równowagę w normalnych warunkach lub podczas starzenia się. Używamy dwóch standardowych testów behawioralnych, aby scharakteryzować wydajność równowagi myszy w określonych punktach wiekowych w ciągu całego życia: test Rotarod i test pochylonej równoważni. Co jednak ważne, specjalnie zbudowany rotator jest również używany do stymulacji układu przedsionkowego myszy (bez wywoływania jawnych objawów choroby lokomocyjnej). Te dwa testy zostały wykorzystane do wykazania, że zmiany w wydajności równowagi za pośrednictwem układu przedsionkowego są obecne przez całe życie myszy . Wstępne wyniki pokazują, że zarówno test rotarod, jak i zmodyfikowany test równoważni mogą być wykorzystywane do identyfikacji zmian w wydajności równowagi podczas starzenia się jako alternatywa dla trudniejszych i bardziej inwazyjnych technik, takich jak pomiary przedsionkowo-oczne (VOR).

Rotarod
Sprawność motoryczną myszy opisano jako czas upadku (Time To Fall, TTF) zarejestrowany dla każdej myszy w ciągu 8 prób. Na podstawie tych pomiarów TTF można wykreślić krzywe uczenia się dla każdej myszy. Rysunek 2 przedstawia przykłady sprawności motorycznej jednej miesięcznej myszy oraz jednej dziewięciomiesięcznej myszy w przebiegu 8 prób. Krzywe uczenia się te wykazują wzrost TTF podczas pierwszych 3–5 prób, po czym następuje plateau. Pomiary TTF zarejestrowane przed o...

Wiadomo, że kontrola motoryczna i równowaga pogarszają się wraz z wiekiem. W artykule przedstawiono szereg standardowych nieinwazyjnych testów behawioralnych z dodatkiem prostego bodźca obrotowego, który stanowi wyzwanie dla układu przedsionkowego i pokazuje zmiany w wydajności równowagi w mysim modelu starzenia.

Ocena behawioralna układu przedsionkowego starzejącej się myszy

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie zmian w sprawności równowagi w mysim modelu starzenia. Jest to realizowane poprzez wstępny trening myszy na aparaturze w celu ich aklimatyzacji, a w drugim kroku — naukę zadania. Następnie myszy są poddawane testom na aparaturze w celu oceny ich koordynacji ruchowej i równowagi.Następnie myszy poddaje się stymulacji przedsionkowej i ponownie testuje na aparaturze. Ponownie wyniki wykażą zmiany w równowadze związane z wiekiem na podstawie danych z rotarodu i belki równoważnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test odruchu przedsionkowo-ocznego, który śledzi ruchy gałek ocznych, jest to, że jest to prosta i nieinwazyjna metoda pomiaru sprawności równowagi.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat zmian związanych z wiekiem w zakresie równowagi u myszy, można ją również zastosować w innych układach, takich jak zaburzenia ery i nerwowo-mięśniowe. Procedury zostaną zaprezentowane przez Victorię Tongue, doktorantkę w moim laboratorium, Edwarda Dabneya, asystenta badawczego w laboratorium, oraz Thomasa Burtona, kierownika Bosche Institute Animal Behavioral Facility na Uniwersytecie w Sydney.W teście rotarod myszy muszą iść wzdłuż obracającego się i przyspieszającego pręta. W momencie utraty równowagi aktywują czujnik magnetyczny. Parametry punktowe są rejestrowane przez aparat rotarod.Zacznij od zainstalowania kołków w każdym torze rotora. Do dyspozycji są kołki o różnych rozmiarach, przeznaczone dla myszy oraz szczurów. Niemniej jednak zastosowanie kołków dla szczurów w przypadku myszy sprawdza się dobrze i zapobiega przyczepianiu się myszy do kołków zamiast spadania.Następnie umieść magnetyczne platformy lądowania na drucie pod każdym pasem pręta rotora. Upewnij się, że platformy nie są przechylone tak, aby dotykać podłoża, oraz że znajdują się jak najbliżej prawej magnetycznej ścianki, nie dotykając jej. Na koniec przesuń slajd dwa.Przezroczyste plastikowe panele znajdują się przed każdym torami pręta rotacyjnego. Krótszy panel umieszcza się poniżej, a dłuższy powyżej. Klatki z myszami należy przenieść do pomieszczenia testowego na 10 minut przed rozpoczęciem prób, aby myszy mogły się zaaklimatyzować.Wprowadź parametry testowe dla próby na rotarodzie z przyspieszeniem. Najpierw ustaw maksymalny czas trwania testu na 60 sekund. Następnie ustaw liczbę używanych torów lub liczbę myszy do przebadania.Następnie ustaw prędkości. Ustaw prędkość początkową testu na 5 RPM oraz prędkość maksymalną na 44 RPM. Ustaw rampę wzrostu prędkości na 60 sekund.Na koniec ustaw parametry kołowrotka dla szczurów, wybierając obrót w kierunku przednim. Gdy myszy będą gotowe, umieść pierwszą grupę do badania na nieruchomych prętach na pięć minut, aby mogły się zaaklimatyzować. Następnie delikatnie popchnij myszy tak, aby były zwrócone tyłem do pręta rotora, i rozpocznij test, gdy wszystkie myszy będą zwrócone w odpowiednim kierunku.Po upadku myszy, należy umieścić je z powrotem w klatkach na 10 minut z wolnym dostępem do pokarmu i wody pomiędzy próbami, aby zwierzęta mogły odpocząć; w tym czasie należy usunąć odchody zwierząt z drążków, ścieżek i platform lądowania. Należy również przygotować platformy lądowania do następnego testu. Proces ten należy powtórzyć łącznie w ośmiu próbach dla każdej myszy.Pierwsze trzy do pięciu prób służą jako próby treningowe. Po zakończeniu wszystkich ośmiu prób należy dokładnie oczyścić prowadnice trzpieni oraz platformy lądowania rotora 70% ethanol oraz przemyć przezroczyste plastikowe panele łagodnym detergentem. W tym teście myszy idą po odsłoniętej belce o długości jednego metra i średnicy 14 milimetrów, ustawionej pod lekkim kątem, w kierunku celu.Ciemna komora zawierająca kopułę mieszkalną obiektu. Po obu stronach belki równoważnej ustawiono dwie kamery. Każda z nich jest skierowana pod kątem tak, aby uchwycić całą długość belki. Nagrania wideo dokumentują próby odbywające się poniżej belki.Podłoga jest pokryta materiałem amortyzującym. Myszy, które spadną, należy natychmiast podnieść i umieścić wewnątrz skrzynki celu w celu regeneracji. Wnętrze skrzynki celu jest wyłożone ręcznikiem papierowym, aby ułatwić usuwanie odchodów zwierząt pomiędzy testami.Pudełko jest wystarczająco duże, aby zmieścić w nim kopułę osłonową. Przed rozpoczęciem testowania myszy należy umieścić ją w pudełku docelowym na dwie minuty. Jeśli mysz będzie próbowała opuścić pudełko docelowe, należy zasłonić otwór prowadzący do wiązki dłonią w rękawiczce na pięć sekund, aby zniechęcić ją do ponownych prób wyjścia.Następnie mysz musi zostać przeszkolona do wykonania zadania. Umieść ją na belce tuż przed skrzynką z celem i pozwól jej dojść do skrzynki. Następnie pozwól jej odpocząć przez minutę, po czym umieść ją w dalszej części belki i ponownie pozwól jej dojść do celu.Zawsze zapewnij myszy minutę odpoczynku w boksie celu pomiędzy próbami treningowymi. Przesuwaj mysz coraz dalej w dół belki, aż zacznie ona samodzielnie wchodzić z linii startowej bez pomocy. Aby przeprowadzić test, rozpocznij nagrywanie, a następnie umieść mysz na linii startowej.Zatrzymaj nagrywanie, gdy mysz dotrze do klatki z celem lub gdy mysz spadnie z belki pomiędzy próbami. Pozwól myszy odpocząć przez minutę w klatce z celem, a w tym czasie usuń wszelki mocz lub odchody z belki oraz znajdującej się pod nią pianki. Każda mysz powinna zostać przetestowana w ten sposób pięć razy.Aby wprowadzić dodatkowe wyzwanie przedsionkowe do tego testu, najpierw użyj rotatora, aby oswoić myszy z dźwiękiem urządzenia pracującego z częstotliwością 3 Hz. Uruchom go na 20 sekund, a następnie przenieś mysz do komory na rotatorze.Jeśli pojawią się trudności z opuszczeniem myszy do komory, należy podać jej przedmiot do uchwycenia przed wprowadzeniem obu do wnętrza. Gdy mysz znajdzie się w komorze, usuń przedmiot, załóż pokrywę i uruchom rotator na 20 sekund. Przy częstotliwości 3 Hz rozpocznij nagrywanie wideo podczas obrotu.Po 20 sekundach wyłącz rotator i ręcznie zatrzymaj koło tak szybko, jak to możliwe. Następnie niezwłocznie przenieś mysz na linię startową i pozwól jej ukończyć próbę. Jak zwykle, test ten można przeprowadzić od jednego do trzech razy, zanim myszy przestaną współpracować.Należy pamiętać o czyszczeniu ramienia wagi i wymianie ręcznika papierowego pomiędzy myszami w przypadku testu rotarod. Czas upadku dla jednej miesięcznej oraz jednej dziewięciomiesięcznej myszy systematycznie wzrastał podczas prób od pierwszej do piątej, dlatego uznano je za próby treningowe.Do analizy danych wykorzystano wyniki z momentu, w którym wynik ustabilizował się, co zaznaczono linią przerywaną. Miesięczne myszy były w stanie utrzymać się na obrotowym pręcie znacznie dłużej niż myszy w wieku dziewięciu miesięcy. Dane z niewielkiej próby przedstawiono jako średnią plus lub minus jedno odchylenie standardowe.Wpływ stymulacji przedsionkowej na sprawność utrzymywania równowagi był również większy wraz z wiekiem. 22-sekundowy obrót z częstotliwością 3 Hz przed próbą wydłużył czas przejścia po belce równoważnej między linią startu a metą u myszy w wieku 9 i 13 miesięcy, ale nie u młodych myszy. Istotność statystyczną oceniono za pomocą anowy dla pomiarów powtarzanych z testem post hoc Tukeya.Podczas wykonywania tego zadania ważne jest, aby jak najszybciej przenieść zwierzę z bodźca przedsionkowego do aparatu, aby zminimalizować ryzyko powrotu zwierzęcia do stanu równowagi przed zakończeniem zadania zgodnie z opisaną procedurą. Inne techniki, takie jak PCR, obrazowanie wapnia (calcium imaging) oraz elektrofizjologia patch-clamp, mogą zostać wykorzystane do odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład czy zmiany w sprawności ruchowej i równowadze korelują ze zmianami w funkcji komórek rzęsek przedsionkowych.

behavioral-assessment-of-the-aging-mouse-vestibular-system

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ocena behawioralna układu przedsionkowego starzejącego się myszy

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Analiza funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych jest skomplikowana przez ich lokalizację głęboko w najtwardszej części czaszki, kości skroniowej skalistej. W większości badań nad funkcjonalnymi komórkami rzęsatymi wykorzystano dokładnie izolowane komórki rzęsate. W tym artykule opisano częściowo nienaruszony preparat nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej.

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

Testy behawioralne są używane w badaniach przedklinicznych do oceny fenotypowych skutków choroby lub leczenia na samopoczucie zwierzęcia. Aby globalnie ocenić funkcjonowanie motoryczne, wybraliśmy testy ogólnej lokomocji, siły mięśniowej i koordynacji: odpowiednio test otwartego pola, test siatki i test rotarod.

Bateria testów behawioralnych oceniających ogólną lokomocję, siłę mięśni i koordynację u myszy

Ten protokół opisuje chirurgiczną labiryntektomię szczura, która jest użyteczną metodą do badania układu przedsionkowego.

Chirurgiczna labiryntektomia szczura w celu zbadania układu przedsionkowego

W tym badaniu demonstrujemy wykorzystanie kinematycznej analizy chodu opartej na obrazowaniu w płaszczyźnie brzusznej do monitorowania subtelnych zmian w koordynacji ruchowej, jak również postępu neurodegeneracji wraz z wiekiem w modelach mysich (np. linie myszy z mutacją endofiliny).

Analiza chodu zależnych od wieku zaburzeń motorycznych u myszy z neurodegeneracją

Prezentowany protokół powoduje uporczywy konflikt sensoryczny w eksperymentach mających na celu badanie długoterminowej nauki. Nosząc na stałe urządzenie na głowie, myszy są stale narażone na niedopasowanie sensoryczne między bodźcami wzrokowymi i przedsionkowymi podczas swobodnego poruszania się w klatkach domowych.

Długotrwały konflikt sensoryczny u swobodnie zachowujących się myszy

Przedstawiono protokoły oceny autonomicznych i behawioralnych efektów pasywnego ruchu u gryzoni za pomocą pionowego ruchu windy i obrotu diabelskiego młyna.

Ocena autonomicznych i behawioralnych skutków ruchu biernego u szczurów za pomocą pionowego ruchu windy i obrotu diabelskiego młyna

Prezentowany tutaj jest protokół dla modelu przewlekłej fragmentacji snu (CSF) osiągnięty przez elektrycznie sterowany wirnik orbitalny, który może wywołać potwierdzony deficyt poznawczy i zachowanie podobne do lęku u młodych myszy typu dzikiego. Model ten można zastosować do badania patogenezy przewlekłych zaburzeń snu i zaburzeń pokrewnych.

Model przewlekłej fragmentacji snu wykorzystujący wibrujący wirnik orbitalny do wywoływania deficytu poznawczego i zachowań podobnych do lęku u młodych myszy typu dzikiego

Celem niniejszego protokołu jest dostarczenie instrukcji i wytycznych dotyczących oceny kruchości fizycznej u laboratoryjnych myszy C57Bl/6x129J. Szczegóły dotyczące każdej miary używanej w indeksie kruchości fizycznej zostały wyjaśnione. Przedstawiono również kilka metod raportowania wyników dotyczących słabości.

Ocena słabości w modelu starzejącej się myszy

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Poznaj nieinwazyjną metodę oceny równowagi u starzejących się myszy przy użyciu bodźca rotacyjnego i testu na rurze rotacyjnej oraz belce równoważnej. Technika ta pozwala badać zmiany związane z wiekiem w układzie przedsionkowym.

Ocena behawioralna układu przedsionkowego starzejącej się myszy

Przeglądaj więcej filmów