Name: In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Poznaj metodę klonalnego śledzenia hematopoetycznych komórek macierzystych in vivo przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej. Technika ta umożliwia wizualizację ewolucji klonalnej w szpiku kostnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. Dziękujemy Borisowi Fehse (Uniwersyteckie Centrum Medyczne Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Niemcy) za dostarczenie pięciu plazmidów wektorowych LeGO; Christianowi A. Combsowi i Nealowi S. Youngowi (NHLBI, NIH) za dyskusje, wsparcie i zachętę podczas tego badania oraz Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) za pomoc w iniekcjach do żył ogonowych.

Wszystkie myszy były trzymane i traktowane zgodnie z Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health, a także zarejestrowane w zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NHLBI. Kobieta B6. SJL-Ptprc(d)Pep3(b)/BoyJ (B6. SJL) i myszy C57Bl/6, w wieku 6-12 tygodni, wykorzystano odpowiednio jako dawcę i biorcę.
Lista materiałów, odczynników i sprzętu znajduje się w Tabeli 1.
1. Transdukcja LeGO mysich HSPC i przeszczep szpiku kostnego
Wykonaj procedury opisane poniżej w certyfikowanym gabinecie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL-2) (kaptur do hodowli tkankowych).
<ol>
	<li>Produkcja wektorów LeGO kodujących 5FP
	<ol>
		<li>Użyj plazmidów wektorowych lentiwirusowych "Gene Ontology" (LeGO), z których każdy koduje inny FP z silnego konstytutywnego promotora SFFV, w tym LeGO-Cer2 (Cerulean), LeGO-G2 (EGFP), LeGO-V2 (Venus), LeGO-T2 (tdTomato) i LeGO-C2 (mCherry) dzięki uprzejmości dostarczonej przez dr Borisa Fehse (Uniwersyteckie Centrum Medyczne Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Niemcy); teraz dostępne również od Addgene5-7.</li>
		<li>Aby wyprodukować wektory LeGO, wysiewaj 5 x 106 komórek 293T w 10-centymetrowych szalkach (użyj 12 szalek na każdy wektor) 24 godziny przed transfekcją w 8 ml pożywki I10 (IMDM uzupełniony 10% FCS i glutaminą / penicyliną / streptomycyną).</li>
		<li>Transfekcja komórek fosforanem wapnia przy użyciu nieznacznie zmodyfikowanego zestawu CAPHOS Zalecenia:
		<ol>
			<li>Na każdą płytkę wymieszaj 15 μg wektora LeGO, 12 μg pCDNA3.HIVgag/pol.4xCTE, 4 μg pRev-TAT i 1 μg plazmidów pMD2.G-VSV-G w obecności 50 μl 2,5 M CaCl2 i dodaj wodę, aby uzyskać 500 μl całkowitej objętości.</li>
			<li>Wytrój plazmidy DNA za pomocą 500 μl 2x HeBS (HEPES-Buffered Saline) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem do każdej płytki komórek 293T.</li>
			<li>Inkubować komórki przez 6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 ; usunąć pożywkę i dodać świeże pożywki hodowlane 6 godzin po transfekcji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbieraj supernatanty hodowlane zawierające cząstki lentiwirusa z każdej płytki, codziennie, przez 3 dni. Każdego dnia po zebraniu supernatantu dodać świeżą pożywkę I10 do każdej płytki.
		<ol>
			<li>Filtrować przez pory 0,22 μm, gromadzić i zagęszczać supernatanty przez ultrawirowanie na wirniku SW28 przez 2 godziny w temperaturze 71 900 x g i 4 °C.</li>
			<li>Zawiesić supernatanty w 1 ml pożywki StemSpan. Podwielokrotnić zapasy lentiwirusa w 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miareczkowanie cząstek lentiwirusowych 
	Określ miano cząstek wektora LeGO w zebranych supernatantach poprzez ilościowe oznaczanie jednostek transdukcji/ml przy użyciu komórek NIH3T3. Miana umożliwiają obliczenie objętości każdego supernatantu wektora potrzebnego do uzyskania pożądanej względnej wielokrotności infekcji (MOI) dla eksperymentalnych komórek docelowych.
	<ol>
		<li>Płytka 5 x 104 komórki NIH3T3 na basenik (płytka 12-dołkowa) w 2 ml pożywki I10 na dzień przed miareczkowaniem.</li>
		<li>Przygotować 5-krotne seryjne rozcieńczenia supernatantów wektorowych w pożywce I10 uzupełnionej siarczanem protaminy (4 mg/ml to 1,000x).</li>
		<li>Usunąć pożywkę z komórek i zastąpić 500 μl roztworów supernatantu zawierających równoważnik 2, 0,8, 0,32 i 0,128 μl stężonego wirusa.</li>
		<li>Określić liczbę (liczbę) komórek obecnych w studzience w czasie transdukcji, licząc jedną studzienkę kontrolną.</li>
		<li>6 godzin po transdukcji dodać 2 ml pożywki I10 i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Zbierz komórki z każdej studzienki za pomocą trypsyny-EDTA i określ procent komórek fluorescencyjnych (%FP) za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Obliczyć miano w następujący sposób, uśredniając miana uzyskane dla każdego dołka (rozcieńczenie), co daje %FP między 1 a 50%: Miano (cząstki wektorowe/ml) = Brak x %FP/ Objętość supernatantu wektorowego (ml). Uśrednić miana uzyskane dla każdego rozcieńczenia, jeżeli %FP mieści się w przedziale od 1 do 50%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie, oczyszczanie, transdukcja i przeszczepianie komórek myszy (schematycznie pokazane na rysunku 1A zaadaptowanym z Malide i wsp.4).
	<ol>
		<li>Uśmiercać myszy dawców za pomocą zatwierdzonej procedury. Pobrać szpik kostny z kończyn przednich i tylnych: wypreparować kość ramienną, udową i piszczelową, dokładnie usunąć wszystkie mięśnie, więzadła i nadmiar tkanki z kości, przeciąć koniec każdej kości jak najbliżej stawu i wypłukać szpik kostny z kości za pomocą igły 27-0 G na strzykawce zawierającej I10 media.</li>
		<li>Osadzać całe komórki szpiku kostnego przez 10 minut w temperaturze 500 x g, w temperaturze 4 °C i dwukrotnie poddać lizie krwinki czerwone za pomocą 50 ml buforu ACK. Ponownie zawieś komórki w 10 ml pożywce I10.</li>
		<li>Oczyść komórki progenitorowe ujemne (Lin-) za pomocą zestawu do zmniejszania linii MACS zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem zestawu:
		<ol>
			<li>Użyj 30 μl mikrokulek antybiotynowych zamiast 10 μl / 107 komórek; zakończ etapy mycia za pomocą pożywki I2 (IMDM uzupełniony 2% FCS) zamiast buforu.</li>
			<li>Wprowadzić jeden etap płukania między inkubację z koktajlem biotyny i przeciwciała a inkubacją z mikrokulkami anty-biotyny; i zrównoważyć kolumnę z I10 zamiast buforem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hodowla komórek Lin przez 48 godzin przy początkowej gęstości 5 x 105 komórek/ml w pożywce StemSpan uzupełnionej 10 ng/ml mysiej IL-3, 100 ng/ml mysiej IL-11, 100 ng/ml ludzkiego liganda Flt-3 i 50 ng/ml mysiego czynnika komórek macierzystych.</li>
		<li>Przenieś 1 do 4 x 105 komórek na 12-dołkowe płytki pokryte retronektyną i transdukuj za pomocą supernatantów LeGO, każdy przy wielokrotności infekcji (MOI) 6-7, aby osiągnąć 50% wydajności ekspresji dla każdego FP, w obecności pożywki StemSpan i cytokin opisanych powyżej oraz 4 μg/ml siarczanu protaminy.</li>
		<li>Transdukuj komórki z każdym wektorem LeGO indywidualnie, jak opisano w kroku 1.3.5 i mieszaj komórki po transdukcji (określanej jako Mix) lub współtransdukuj komórki ze wszystkimi 5 supernatantami wektorów LeGO jednocześnie (określanymi jako Co). Usuń komórki 24 godziny później, przemyj je raz pożywką StemSpan bez cytokin i ponownie zawieś je w pożywce StemSpan bez cytokin do przeszczepu lub przenieś je na świeże podłoże z cytokinami i hodowlę przez dodatkowe 96 godzin przed mikroskopią konfokalną i cytometrią przepływową.
		<ol>
			<li>Przeszczep szpiku kostnego należy przeprowadzić, podając transdukowane Lin-HSPC przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej biorcom 11 Gy z pojedynczą dawką wstępnie napromieniowanych (6-18 godzin przed przeszczepem), w objętości 100 μl, w dawce komórek na mysz odpowiadającej 1-4 x 105 Lin- komórek pierwotnie posianych do transdukcji. W każdym eksperymencie przeszczep całą kohortę zwierząt z tą samą populacją transdukowanych komórek BM dawcy.</li>
			<li>W celu scharakteryzowania in vitro transdukowanych HSPC, hoduj komórki przez dodatkowe 4-5 dni w StemSpan uzupełnionym cytokinami i analizuj za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem wydajności transdukcji oraz za pomocą mikroskopii pod kątem różnorodności kolorów.
			<ol>
				<li>Składaj w ofierze pojedyncze myszy i pobieraj tkanki i narządy do obrazowania, w różnych punktach czasowych do 120 dni po przeszczepie.
				<ol>
					<li>Spryskaj etanolem sierść myszy i naciąć skórę po stronie brzusznej, unikając rozprzestrzeniania się włosów.</li>
					<li>Wypreparuj i wyciąć zgodnie ze standardowymi procedurami śledzionę, węzły chłonne podkolanowe, płuca, serce, skórę, tkankę tłuszczową, mięśnie szkieletowe, nerki, wątrobę, a także głowę do dostępu do kalwarii.</li>
					<li>Alternatywnie, użyj kalwarii lub ustaw okno kostne do wielokrotnego obrazowania na żywo w czasie2,8,9 lub zobrazuj powierzchowne narządy, takie jak skóra i węzły chłonne u żywego zwierzęcia.</li>
				</ol>
				</li>
				<li>Umieścić poszczególne narządy w szklanych szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm nr 0 w PBS o pojemności 50–100 μl w celu zobrazowania ich w stanie nienaruszonym bez cięcia, utrwalania lub dalszej obróbki, jak opisano w kroku 2.5.</li>
				<li>W przypadku obrazowania wolumetrycznego należy przechowywać narządy w zimnym PBS do czasu użycia. W przypadku obrazowania poklatkowego należy natychmiast przejść do obrazowania narządów w DMEM, 10% FBS zawierających 20 mM HEPES w temperaturze 37 °C</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikroskopia konfokalna i dwufotonowa oraz analiza obrazu
<ol>
	<li>Wykonuj obrazowanie mikroskopowe za pomocą pięciokanałowego systemu konfokalnego i wielofotonowego Leica SP5 wyposażonego w wieloliniowe lasery argonowe, diodowe 561 nm, HeNe 594 nm i HeNe 633 nm. Stosować w trybie 2-fotonowym impulsowy laser femtosekundowy Ti:Sapphire (Ti-Sa), przestrajany do wzbudzenia od 680 do 1 080 nm z korekcją dyspersji. Zastosowanie w eksperymentach z udziałem FP z przesunięciem ku czerwieni (tdTomato i mCherry), lasera optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) w celu rozszerzenia zakresu długości fali wyjściowej do 1,030-1,300 nm, sekwencyjnie lub jednocześnie z laserem Ti-Sa.</li>
	<li>Obrazuj różne tkanki za pomocą obiektywu HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA do zanurzania w wodzie (WD = 2,5 mm), suchego obiektywu HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD = 0,6 mm) lub obiektywu HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD = 0,6 mm).</li>
	<li>Uzyskanie konfokalnych widm fluorescencyjnych zbierających stosy lambda (xyλ) emitowanego światła w pasmach 5 nm widma widzialnego z komórek BM transdukowanych pojedynczym wektorem FP LeGO, a także kontrolnych, nieprzeszczepionych BM.
	<ol>
		<li>Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania Leica LAS-AF v2.4.1, aby utworzyć widma referencyjne dla wszystkich 5 FPs, a także dla autofluorescencji (Rysunek 2A). Korzystając z indywidualnych widm FP i różnicy w jasności fluorescencji (wyrażonej jako % EGFP) Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) i mCherry (47%) ustawiono 5 kanałów obrazowania sekwencyjnego w następujący sposób: Cerulean (458/468-482 nm), EGFP (488/496-514 nm), Venus (514/523-558 nm), tdTomato (561/579-597 nm) i mCherry (594/618-670 nm) (Rysunek 2B).</li>
		<li>Sprawdź dokładną separację FPs, ponieważ komórki transdukowane za pomocą każdego pojedynczego FP są widoczne tylko w odpowiednim kanale i nieobecne w pozostałej (Rysunek 2C). Ponadto to zdefiniowane wielokanałowe podejście tworzy unikalny 5-kanałowy "kolorowy wydruk", który umożliwia późniejszą analizę kolorów i śledzenie klonów oraz ma tę zaletę, że skraca czas akwizycji w porównaniu z obrazowaniem spektralnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielna emisja fluorescencji, w trybie 2-fotonowym, za pomocą wysokowydajnych niestandardowych zwierciadeł dichroicznych i zbieranie za pomocą czterokanałowego detektora bez deskryptencji (NDD) w następujący sposób: zwierciadło dichroiczne o długości fali 568 nm, zwierciadło dichroiczne o długości fali 465 nm, po którym następuje filtr emisyjny 452/45 nm dla SHG lub autofluorescencji i Cerulean, filtr emisyjny 525/40 nm dla EGFP lub Wenus, oraz lustro dichroiczne 648 nm i filtr emisji 620/60 nm dla tdTomato lub mCherry.
	<ol>
		<li>Ujawnienie informacji strukturalnych za pomocą mikroskopii dwufotonowej wewnętrznego obrazowania kontrastowego (jak opisano powyżej) autofluorescencji tkanek z elastyny, NADH (wzbudzonej przy 780 nm) i sygnału generowanego przez drugą harmoniczną (SHG) z kolagenu kostnego i fibrylarnego (wzbudzonego przy 920 nm lub 860 nm zebranego w kierunku rozpraszania wstecznego)10,11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku renderowania objętościowego 3D, zbierz serię obrazów x-y-z (zwykle 1 x 1 x 4 μm3 woksele) wzdłuż osi z w odstępach 5 μm na różnych głębokościach (150-300 μm) w szpiku kostnym i innych tkankach, na dużych obszarach, korzystając z funkcji kafelków oprogramowania do automatycznego generowania zszytych objętości obejmujących cały dół mostka, około 2,5 x 1,2 mm2 (x-y) i 300 μm (z) (rysunki 2D-2E) i film 1.
	<ol>
		<li>Obraz szpiku calwarialnego bezpośrednio przez czaszkę bez sekcji2, 8.</li>
		<li>Przekrój mostka wzdłuż płaszczyzny strzałkowej (bisekcja), a następnie poprzecznie na stawie między 2 dołami mostka a obrazem przez przeciętą powierzchnię3,4,12 (przegląd na rycinie 1B zaadaptowany z Takaku i wsp. 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku obrazowania poklatkowego 4D należy umieścić świeżo wycięte próbki węzłów chłonnych podkolanowych, śledziony, płuc lub kości nazębnych nieoszlifowane na szalkach hodowlanych ze szkła nakrywkowego o średnicy 35 mm 0, w 50-100 μl DMEM, 10% FBS zawierającym 20 mM HEPES w temperaturze 37 °C i zastosować wzbudzenie 2-fotonowe Ti-Sa (860 nm) połączone ze wzbudzeniem konfokalnym (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) i skaner rezonansowy Leica (8000 Hz/s), rejestrujący stosy z (~80 μm) w odstępach 20 sekund przez maksymalnie 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Do jednoczesnego trójkolorowego obrazowania 2P należy użyć Ti-Sa dostrojonego do 860 nm jednocześnie z laserem OPO (dostrojonym do 1,130 nm dla tdTomato; lub 1,140 nm mCherry) (Film 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstrukcja i analiza objętości 3D i sekwencji czasowych 4D
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania Imaris x64 w wersji 7.6 lub alternatywnych pakietów oprogramowania, aby przekształcić kafelkowe stosy surowych obrazów w renderowane objętościowo (3D) dane komórek fluorescencyjnych wewnątrz szpiku kostnego i różnych tkanek oraz wyeksportować je jako filmy z rotacją 3D, jak opisano wcześniej3,4 (Film 1) przykład krok po kroku:
		<ol>
			<li>W Imaris otwórz obraz z-stack; Wybierz "Przekrocz", aby wyświetlić wizualizację objętości 3D.</li>
			<li>Użyj "nawigacji", aby obrócić głośność o 360°.</li>
			<li>Wybierz "Animacja", aby utworzyć animację; użyj klatek kluczowych, aby dodać wybrane widoki, powiększenie, obroty objętości; Wyświetl podgląd filmu, edytuj go w razie potrzeby i zapisz plik w żądanym formacie filmu (np. avi, mov).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W celu ilościowej oceny częstotliwości, pozycji, rozmiarów i rozkładu komórek 3D i klonów, należy dalej przetwarzać stosy z za pomocą modułów Imaris XT, które integrują aplikacje MATLAB wykonujące pomiary odległości (przy użyciu algorytmu transformacji odległości) i analizę klastrów, jak opisano wcześniej3,4. Przekształć sekwencje stosów obrazów w czasie w czterowymiarowe filmy (4D) renderowane objętościowo za pomocą oprogramowania Imaris x64 i wykorzystaj analizę punktową i powierzchniową do półautomatycznego śledzenia ruchliwości komórek w trzech wymiarach przy użyciu algorytmów ruchu autoregresyjnego.</li>
		<li>Przeprowadź analizę wielospektralną komórek w następujący sposób: wyodrębnij plamki oznaczone wielokolorem, dodając wszystkie 5 kanałów za pomocą arytmetyki kanałów Imaris XT do nowego kanału; określ dla wszystkich plamek (komórek) średnią intensywność fluorescencji w każdym z 5 kanałów składowych. Eksportuj wartości w oprogramowaniu Excel, aby wykreślić wykresy wyświetlające unikalny "colorprint", tj. względny % każdego FP w pojedynczej komórce (wykres Rysunek 2E). Skoryguj zestaw danych pod kątem dryfu tkanek i oblicz prędkość i przemieszczenie komórek w czasie, długości ścieżek, ścieżki i odległości; eksportuj wartości w oprogramowaniu Excel, aby wykreślić wykresy. Składaj figury kompozytowe za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop CSS 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li>
<li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+marked+by+5+fluorescent+proteins+using+confocal+and+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy.</a> Blood. 120, e105-e116 (2012).</li>
<li>Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+ontology+%28LeGO%29+vectors+equipped+with+novel+drug-selectable+fluorescent+proteins+new+building+blocks+for+cell+marking+and+multi-gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis.</a> Gene Ther. 17, 511-520 (2010).</li>
<li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+%27gene+ontology%27+%28LeGO%29+vectors+for+functional+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16, 698-706 (2008).</li>
<li>Weber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGB+marking+facilitates+multicolor+clonal+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking.</a> Nat Med. 17, 504-509 (2011).</li>
<li>Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transplanted+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+mouse+calvarium+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow.</a> Nature protocols. 6, 1-14 (2011).</li>
<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cellular+dynamics+and+endosteal+location+of+aged+early+hematopoietic+progenitor+cells+revealed+by+time-lapse+intravital+imaging+in+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones.</a> Blood. 114, 290-298 (2009).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisujemy tutaj szczegóły potężnej metodologii opracowanej niedawno do śledzenia komórek klonalnych, łączącej dużą różnorodność generowaną przez znakowanie kombinatoryczne z wektorami LeGO kodującymi 5FP oraz obrazowanie z tandemową mikroskopią konfokalną i 2-fotonową w celu uzyskania wolumetrycznego i dynamicznego obrazowania w żywych tkankach. Rozszerzyło to zastosowanie znakowania kolorami opartego na FP poprzez rejestrowanie konfokalnej tożsamości widmowej w 5 "odrębnych" kanałach 8-bitowych. W ten sposób względny st...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Produkcja komórek krwi, określana jako hematopoeza, jest utrzymywana przez małą populację hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC). Komórki te znajdują się w szpiku kostnym (BM) w złożonej niszy mikrośrodowiskowej składającej się z osteoblastów, komórek zrębu, tkanki tłuszczowej i struktur naczyniowych, z których wszystkie są zaangażowane w kontrolę samoodnawiania i różnicowania1,2. Ponieważ nienaruszony BM był tradycyjnie niedostępny dla bezpośrednich obserwacji, interakcje między HSPC a ich mikrośrodowiskiem pozostają w dużej mierze niescharakteryzowane in vivo. Wcześniej opracowaliśmy metodologię wizualizacji architektury 3D nienaruszonego BM za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i refleksyjnej3. Scharakteryzowaliśmy ekspansję HSPC oznaczonych EGFP w BM, ale użycie tylko jednego FP wykluczyło analizę regeneracji na poziomie klonalnym. Całkiem niedawno wykorzystaliśmy wektory Lentiviral Gene Ontology (LeGO) konstytuujące ekspresję białek fluorescencyjnych (FPs), aby skutecznie oznaczać komórki4,5. Kotransdukcja HSPC z 3 lub 5 wektorami generuje zróżnicowaną paletę kombinatorycznych kolorów, umożliwiając śledzenie wielu pojedynczych klonów HSPC.
Oznaczone HSPC w połączeniu z nową technologią obrazowania pozwalającą na śledzenie indywidualnego naprowadzania i wszczepienia HSPC w BM napromieniowanych myszy. Wektory LeGO wykorzystano do oznaczenia HSPC za pomocą 3 lub 5 różnych FP (od Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato i mCherry) i śledzenia ich wszczepienia w czasie w BM za pomocą mikroskopii konfokalnej i 2-fotonowej, co pozwoliło na wyraźną wizualizację struktur kostnych i innych struktur macierzy oraz relacji klonów HSPC ze składnikami ich mikrośrodowiska. HSPC oczyszczono jako ujemne komórki linii myszy C57Bl / 6 BM, transdukowane wektorami LeGO i ponownie podawane przez wstrzyknięcie żyły ogonowej do myszy kongenicznych z ablacją mielogiczną. Monitorując duże objętości tkanki BM mostka, uwidoczniliśmy wszczepienie śródkostne występujące na wczesnym etapie regeneracji BM. Skupiska komórek o zróżnicowanym widmie kolorystycznym pojawiały się początkowo w bliskiej odległości od kości i rozwijały się centralnie w czasie. Co ciekawe, po ponad 3 tygodniach szpik składał się z makroskopowych klastrów klonalnych, co sugeruje rozprzestrzenianie się hematopoezy pochodzącej z poszczególnych HSPC sąsiadujących ze szpikiem kostnym, a nie powszechne rozprzestrzenianie się HSPC przez krwioobieg. Różnorodność kolorów była mniejsza w późnych punktach czasowych, co sugeruje trudności w transdukcji długoterminowego ponownego zasiedlania komórek wieloma wektorami.
Ponadto, HSPC tworzyły skupiska w śledzionie, organie odpowiedzialnym również za hematopoezę u myszy. Pojedyncze komórki pochodzące z HPSC mogą być rozpoznawane w grasicy, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie, płucach, sercu, skórze, mięśniach szkieletowych, tkance tłuszczowej i nerkach. Obrazy 3D mogą być oceniane jakościowo i ilościowo, aby ocenić rozmieszczenie komórek przy minimalnych zaburzeniach tkanek. Na koniec zilustrowaliśmy wykonalność dynamicznych badań na żywo w 4D, łącząc rezonansowe skanowanie wielofotonowe i konfokalne obrazowanie poklatkowe. Metodologia ta umożliwia nieinwazyjne, wielowymiarowe śledzenie losu komórek o wysokiej rozdzielczości populacji komórek oznaczonych spektralnie w ich nienaruszonej architekturze 3D, zapewniając potężne narzędzie w badaniach nad regeneracją i patologią tkanek.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Produkcja wirusów</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>Ekspresja Cerulean</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>Ekspresja eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Ekspresja Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>Ekspresja tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>Ekspresja</td></tr><tr><td>zestawu do transfekcji fosforanu wapnia</td> mCherry <td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznie</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina</td><td>Gibco, życie Technologia</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Filtr napędzany strzykawką Unite (0,22 &mikro; m)</td> <td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Pobieranie, oczyszczanie, transdukcja i przeszczepianie komórek myszy</td></tr><tr><td>ACK bufor lizujący</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do zubożania komórek linii (mysz)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS + rurki</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji (30 &mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bez surowicy StemSpan SFEM do hodowli i ekspansji komórek krwiotwórczych (500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-11 CF</td><td>R & D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 &mikro; g / ml wynosi 1,000x</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi SCF</td><td>RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 &mikro; g / ml wynosi 2,000x</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-3</td><td>R & D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 & mikro; g / ml wynosi 2,000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligand</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &mikro; g/ml to 1,000x</td></tr><tr><td>płytki 12-dołkowe, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>Ponowne zawieszenie przy 50 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 & mikro; g / ml wynosi 1,000x</td></tr><tr><td colspan="4"><silna>mikroskopia konfokalna i dwufotonowa</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkowe #1 Borokrzemianowe szkło nakrywkowe; 4-dołkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 mm Nr 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS pięciokanałowy mikroskop konfokalny i wielofotonowy</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph zasięg lasera 680-1,080 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Compact OPO zasięg lasera 1,030-1,350 nm</td> Obiektyw do zanurzania w <td>wodzie Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA (WD=2.5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy obiektyw HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA (WD=0.6 mm)Obiektyw do</td> zanurzenia w wodzie <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA (WD=0.6 mm)</td>Oprogramowanie <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris w wersji 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Opracowaliśmy i zatwierdziliśmy metodologię znakowania fluorescencyjnego do klonalnego śledzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, aby badać hematopoezę in vivo przy użyciu eksperymentalnego modelu przeszczepu szpiku kostnego u myszy. Genetyczne znakowanie kombinatoryczne przy użyciu wektorów lentiwirusowych kodujących białka fluorescencyjne (FP) umożliwiło mapowanie losu komórek za pomocą zaawansowanego obrazowania mikroskopowego. Wektory kodujące pięć różnych FP: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato i mCherry zostały użyte do jednoczesnej transdukcji HSPC, tworząc różnorodną paletę komórek oznaczonych kolorem. Obrazowanie za pomocą konfokalnej/dwufotonowej mikroskopii hybrydowej umożliwia jednoczesną ocenę w wysokiej rozdzielczości jednoznacznie oznaczonych komórek i ich potomstwa w połączeniu ze składnikami strukturalnymi tkanek. Analizy wolumetryczne na dużych obszarach ujawniają, że spektralnie kodowane komórki pochodzące z HSPC mogą być wykrywane nieinwazyjnie w różnych nienaruszonych tkankach, w tym w szpiku kostnym (BM), przez długi czas po przeszczepie. Badania na żywo łączące obrazowanie wielofotonowe z szybkością wideo i konfokalne obrazowanie poklatkowe w 4D pokazują możliwość dynamicznego śledzenia komórkowego i klonalnego w sposób ilościowy.

Rekonstrukcje 3D wykonane za pomocą mikroskopii konfokalnej/dwufotonowej całych preparatów szpiku kostnego mostka w czasie ujawniły rozwój i ekspansję przeszczepionych co-5FPs w schemacie o wyjątkowych charakterystykach: klony wydawały się wyraźnie odgraniczone, początkowo homogenicznie znakowane szeroką paletą kolorów, a z czasem ewoluowały w stronę preferencyjnego zawierania komórek głównie jednego koloru. Układ mikroskopii konfokalnej oraz reprezentatywne przykłady obrazowania HSPC znakowanych 5FPs w szpiku kostnym mo...

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie fluorescencyjnie znakowanych klonów krwiotwórczych w żywych tkankach, w tym w szpiku kostnym, z wykorzystaniem nowej strategii mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej. W tym celu izoluje się mysie komórki progenitorowe i macierzyste krwiotwórcze, a następnie poddaje się je kotransdukcji wektorami lentiwirusowymi z biblioteką genów lub wektorami Lego kodującymi pięć białek fluorescencyjnych: Ian, EGFP, Venus, TD tomato oraz m cherry. Przetransdukowane komórki są następnie przeszczepiane do myszy biorców po ablacji szpiku, a po okresach czasu wynoszących do 120 dni pobiera się szpik kostny i organy od myszy biorców, po czym wykonuje się połączoną mikroskopię konfokalną i dwufotonową.Otrzymane obrazy są rekonstruowane w 3D, aby śledzić w czasie lokalizację fluorescencyjnie znakowanych przeszczepionych klonów i komórek. Umożliwia to badanie ewolucji klonalnej podczas hemopoezy oraz losu komórek pochodzących z szpiku kostnego w innych organach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z fizycznym krojeniem tkanek jest połączenie korzyści wynikających z obrazowania o wysokiej rozdzielczości z sekcjonowaniem optycznym za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz wizualizacją komponentów strukturalnych za pomocą mikroskopii dwufotonowej.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hematologii, takie jak specjalistyczna i czasowa analiza klonalna hematopoezy podczas regeneracji szpiku kostnego od wczesnego zaprowadzenia szczepu, z uwzględnieniem utrzymania geograficznego rozszerzających się klonów w czasie. Możliwa jest analiza bardzo dużych objętości nienaruszonej, gęstej tkanki. Na przykład, w celu wizualizacji kolorowo oznakowanych klonów w jamie mostka, komputerowo zrekonstruowano około 3000 obrazów. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat architektury klonalnej w prawidłowej i zaburzonej hematopoezie, może ona zostać zastosowana również do badania regeneracji narządów, odpowiedzi immunologicznych lub wzorców przerzutowania nowotworów.W niniejszej procedurze wektory lentiwirusowe gene ontology lub Lego kodują pięć białek fluorescencyjnych: Ian, EGFP, Venus, TD tomato oraz M Cherry. Każde białko fluorescencyjne jest ekspresowane pod kontrolą silnego konstytutywnego promotora wirusa tworzącego ogniska w śledzionie (SFFV). Po wytworzeniu wektorów Lego kodujących białka fluorescencyjne i miareczkowaniu cząsteczek wirusowych, należy pobrać szpik kostny z kończyn przednich i tylnych uśmierconych myszy dawców poprzez wypreparowanie kości ramiennych, udowych i piszczelowych.Za pomocą skalpela dokładnie usuń wszystkie więzadła mięśniowe i nadmiar tkanki z kości. Następnie przetnij koniec każdej kości jak najbliżej stawu. Używając igły 27G w strzykawce zawierającej I 10 medium, wypłucz szpik kostny do 50 mililitrowej stożkowej probówki do wirowania, a następnie wiruj przy 500 G i temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać pellet komórek.Po odlaniu supernatantu w celu lizy erytrocytów, dodać 50 mililitrów buforu CK i odwirować w ten sam sposób co wcześniej, a następnie odlać supernatant i powtórzyć czynność po usunięciu drugiego supernatantu. Resuspendować komórki w 10 mililitrach medium I 10. Następnie użyć zestawu do deplecji linii komórkowych max, aby oczyścić progenitorowe komórki lineage-negative zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem zestawu szczegółowo opisanym w dołączonym dokumencie.Po oczyszczeniu komórek lineage-negative, wysiać je do kolby T 75 z zagęszczeniem 5×10⁵ komórek/ml w pożywce stem span uzupełnionej o mysie IL-3, mysie IL-11, ludzki ligand FLT3 oraz mysi czynnik wzrostu komórek macierzystych (SCF); inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin. Po dwóch dniach, za pomocą skrobaka do komórek, resuspender komórki i przenieść od 1×10⁵ do 4×10⁵ komórek do każdego dołka płytki 12-dołkowej; do komórek dodać wektory z MOI wynoszącym od 6 do 7 dla każdego z nich w pożywce stem span z cytokinami oraz 4 µg/ml siarczanu protaminy.Aby uzyskać całkowitą objętość jednego mililitra w każdej studzience, należy przygotować kontrolę pojedynczego koloru dla każdego białka fluorescencyjnego. Po 24 godzinach resuspendować komórki za pomocą skrobaka i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności pięciu mililitrów. Następnie odwirować i resuspendować je w medium StemSpan bez cytokin, ponownie odwirować i resuspendować komórki w 100 µL medium StemSpan bez cytokin na jedną iniekcję, do mikroskopii konfokalnej lub cytometrii przepływowej.Przenieś je na płytki 12-dołkowe zawierające świeżą pożywkę z cytokinami i inkubuj przez kolejne 96 godzin. W ramach przygotowania do przeszczepu szpiku kostnego umieść napromieniowane myszy biorców w klatce pod lampą grzewczą, aby myszy się ogrzały. Przygotuj strzykawki do iniekcji, zawierające od 1 do 4 × 10⁵ komórek lineage-negative w 100 µL StemSpan na mysz.Przygotuj jedną strzykawkę dla każdej myszy. Gdy żyły ogonowe będą rozszerzone, myszy są gotowe do iniekcji. Umieść mysz przeznaczoną do iniekcji w stabilizatorze i zdezynfekuj ogon gazikiem nasączonym 70% ethanol.Ten etap umożliwia również lepszą wizualizację żyły ogonowej. Następnie należy wstrzyknąć komórki do żyły ogonowej. Przeprowadzić transplantację u całej kohorty zwierząt, stosując tę samą populację transdukowanych komórek szpiku kostnego dawcy w różnych odstępach czasu, aż do 120 dni po transplantacji.Wyjąć tkanki i organy do obrazowania w całości bez sekcjonowania. Umieścić poszczególne organy na szkiełkach nakrywkowych numer zero o średnicy 35 mm w 50 do 100 µL zimnego PBS do obrazowania time-lapse.Umieścić organy w pożywce DMEM z 10% FBS zawierającej 20 mM HEPES w temperaturze 37 °C i niezwłocznie wykonać obrazowanie. Mikroskopia jest przeprowadzana przy użyciu odwróconego pięciokanałowego systemu konfokalnego i wielofotonowego Leica SP5 wyposażonego w wieloliniowe lasery widzialne: argonowy z diodą 561 nm, helowo-neonowy 594 nm oraz helowo-neonowy 633 nm. Umieścić jedną z próbek transdukowanych lentiwirusem na stoliku mikroskopu i ustawić ostrość.Zbierz stosy obrazów lambda w odstępach pasma wynoszących pięć nanometrów, obejmujących całe widmo światła. Następnie, za pomocą oprogramowania, wybierz obszar zainteresowania na obrazie i wyświetl histogram widma odniesienia. Zapisz te dane.Następnie powtórz ten proces dla każdego białka fluorescencyjnego w eksperymencie. W kolejnym kroku wykorzystaj widma zebrane dla poszczególnych białek fluorescencyjnych do ustawienia szerokości pasma w trybie kanałowym. Aby zrobić to dla każdego kanału, kliknij czarny suwak i wprowadź wartość szerokości pasma, która ma zostać zastosowana.Wybrane pasmo powinno obejmować obszar szczytowy widma wzbudzenia każdego białka fluorescencyjnego, zapewniając jednocześnie brak nakładania się kanałów fluorescencyjnych. Ustaw wzmocnienie i przesunięcie dla każdego detektora w taki sposób, aby zakres dynamiczny sygnału z próbki znajdował się na poziomie wykrywalnym, był zbliżony dla poszczególnych białek fluorescencyjnych i nie występowało nasycenie. Na przykład białko M cherry jest około dwukrotnie mniej jasne niż EGFP, zatem wzmocnienie i przesunięcie należy dostosować tak, aby uzyskać podobny zakres dynamiczny dla obu białek.Na koniec, w trybie kanałowym, należy zarejestrować obraz każdej próbki kontrolnej pojedynczego koloru we wszystkich pięciu kanałach i sprawdzić, czy każde białko fluorescencyjne jest widoczne tylko w odpowiadającym mu kanale i nie występuje w pozostałych. Po zwalidowaniu widm dla wszystkich kanałów należy zapisać ustawienia. Mogą one zostać zaimportowane i wykorzystane w przyszłych eksperymentach z użyciem tych samych białek fluorescencyjnych i tkanek próbek.W niniejszej procedurze zaprezentowano połączone zastosowanie mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej z wykorzystaniem szpiku kostnego mostka; za pomocą skalpela i pęsety wykonuje się przekrój mostka w płaszczyźnie strzałkowej. Następnie wykonuje się cięcie poprzeczne w stawie między dwiema jamami mostka. Przecięte kości umieszcza się stroną cięcia do dołu w naczyniu kulturcyjnym z deductible szkiełkiem przedmiotowym numer zero o średnicy 35 mm, zawierającym od 50 do 100 µL zimnego PBS; obrazowanie będzie odbywać się poprzez powierzchnię cięcia.Sprawdź położenie kości w mikroskopie sekcyjnym. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Następnie skonfiguruj oprogramowanie obrazujące tak, aby sekwencyjnie rejestrować sygnał dwufotonowy oraz sygnał generowania drugiej harmonicznej.Następnie wykonaj pięciokolorową ekscytację konfokalną. Wyznacz granice obszaru zbierania danych Zack z rozmiarem kroku 5 µm w zakresie od 150 do 300 µm. Użyj funkcji kafelkowania (tile), aby oprogramowanie automatycznie wygenerowało zszyte wolumeny obejmujące cały dół mostka o wymiarach około 2,5 na 1,2 mm² w kierunku XY.Uruchom akwizycję w celu sekwencyjnego zbierania obrazów X, Y, Z we wszystkich pięciu kanałach oraz mikroskopii dwufotonowej z sygnałem generacji drugiej harmonicznej z kości i kolagenu włóknistego dla obrazowania time-lapse 4D. Umieść świeżo wycięte, nieprzecięte próbki węzła chłonnego podkolanowego, śledziony, płuca lub kości sklepienia czaszki na szalkach hodowlanych z denkiem ze szkła nakrywkowego nr 0 o średnicy 35 mm w 50 do 100 µL DMEM z 10% FBS i 20 mM HEPES w temperaturze 37 °C.Umieść próbkę na podgrzewanym stoliku mikroskopu. Następnie w oprogramowaniu zmień parametry akwizycji, aby wykorzystać dwufotonowe wzbudzanie laserem tytano-szafirowym przy 860 nanometrach w połączeniu z wzbudzaniem konfokalnym oraz skanerem rezonansowym Leica przy 8 000 hercach na sekundę. Aby wykonać stosy Z o wysokości 80 mikronów w odstępach 22 sekund przez maksymalnie jedną godzinę dla jednoczesnego trójkolorowego obrazowania dwufotonowego, skonfiguruj oprogramowanie tak, aby laser tytano-szafirowy dostrojony do 860 nanometrów pracował jednocześnie z laserem OPO dostrojonym do 1 130 nanometrów dla tdTomato lub 1 140 nanometrów dla mCherry.Na koniec rozpocznij akwizycję, aby zebrać cztery obrazy D. Podobnie jak wcześniej, po zebraniu wszystkich obrazów wykonaj rekonstrukcję i analizę 3D oraz 4D, korzystając z 64-bitowej wersji oprogramowania Amer lub podobnego programu. Otwórz obraz Zack, a następnie wybierz opcję surpass, aby wyświetlić wizualizator objętości 3D.Następnie użyj funkcji Navigate, aby obrócić wolumin o 360 stopni. Dalej wybierz animację. Użyj klatek kluczowych, aby dodać wybrane widoki, powiększenia oraz obroty wolumenu.Przejrzyj film i wprowadź niezbędne poprawki. Na koniec zapisz plik w wybranym formacie wideo, aby prześledzić historię klonalną fluorescencyjnie oznakowanych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Komórki dawcy kotransdukowane pięcioma różnymi wektorami Lego zostały przeszczepione do myszy biorcy, a szpik kostny mostka został zobrazowany i przeanalizowany zgodnie z opisem w tym filmie.W czwartym dniu po przeszczepie, w bliskim sąsiedztwie krawędzi kości, zaznaczonej na biało, widoczne były skupiska komórek barwionych w szerokiej gamie kolorów. Do 31. dnia duży klon o unikalnym zielono-żółtym kolorze powiększył się, zajmując cały otwór (Fosse), co przedstawiono na obrazach złączonych, jak i w pojedynczych kanałach. Analiza zawartości FPS wykazała jednorodne znakowanie przez dwa warianty FPS: EGFP i Venus.Ten film z rekonstrukcją 3D przedstawia architekturę przestrzenną zaznaczonych klonów zamkniętych w kości mostka. Obraz ten pokazuje przykład komórek pochodzących z szpiku kostnego w węźle chłonnym podkolanowym 120 dni po transplantacji. Rozproszone komórki są w większości zaznaczone na żółto i czerwono i są obwiedzione peryferyjnie włóknami kolagenu, przedstawionymi na biało w sercu widzianym od strony osierdzia.Widocznych jest wiele pojedynczych komórek przeplatających się z kardiomiocytami, które są ukazane na biało dzięki autofluorescencji dwufotonowej przy 780 nanometrach. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu kilku dni, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Po opracowaniu, metoda ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie regeneracji i rozwoju organów oraz szerzej w biologii, umożliwiając badanie czasowo-przestrzennych organizacji klonalnie złożonych elementów komórkowych i strukturalnych za pomocą wielokolorowego znakowania oraz obrazowania konfokalnego i dwufotonowego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat opracowywania metodologii znakowania fluorescencyjnego w celu śledzenia klonalnego znakowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w żywych organach.

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo śledzenie klonalne komórek macierzystych i prekursorów krwiotwórczych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi za pomocą mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Poznaj metodę klonalnego śledzenia hematopoetycznych komórek macierzystych in vivo przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej. Technika ta umożliwia wizualizację ewolucji klonalnej w szpiku kostnym.

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Przeglądaj więcej filmów