In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie fluorescencyjnie znakowanych klonów krwiotwórczych w żywych tkankach, w tym w szpiku kostnym, przy użyciu nowatorskiej strategii mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej. Aby to zrobić, izoluje się i kotransdukuje krwiotwórcze komórki progenitorowe i macierzyste murn za pomocą ontologii genów lentiwirusowych lub wektorów Lego kodujących pięć białek fluorescencyjnych, Ian, EGFP, Venus, pomidora TD i wiśni m. Transdukowane komórki są następnie przeszczepiane myszom biorcom poddanym ablacji szpiku i po okresie do 120 dni pobiera się szpik kostny i narządy od myszy biorców i przeprowadza się połączoną mikroskopię konfokalną i dwufotonową.

Uzyskane obrazy są rekonstruowane w 3D w celu śledzenia lokalizacji fluorescencyjnie oznaczonych przeszczepionych klonów i komórek w czasie. Ułatwia to badanie ewolucji klonalnej podczas hematopoezy i losu komórek pochodzących ze szpiku kostnego w innych narządach. Główną przewagą tej techniki nad fizycznym cięciem tkanek jest to, że łączy ona zalety obrazowania w wysokiej rozdzielczości z sekcją optyczną za pomocą mikroskopii konfokalnej i wizualizacją elementów strukturalnych za pomocą podwójnej mikroskopii.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematologii, takie jak specjalna i czasowa analiza klonalna hematopoezy podczas regeneracji szpiku kostnego od wczesnego wszczepienia z geograficznym utrzymaniem ekspansji klonów w czasie, Można badać bardzo duże objętości nienaruszonej gęstej tkanki. Na przykład około 3000 obrazów zostało zrekonstruowanych obliczeniowo w celu wizualizacji oznaczonych kolorem klonów w fau mostka. Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w architekturę klonalną w prawidłowej i zaburzonej hematopoezie, może być również stosowana do badania regeneracji narządów, odpowiedzi immunologicznych lub wzorców przerzutów guza.

W tej procedurze ontologia genów lentiwirusowych lub wektory Lego kodują pięć białek fluorescencyjnych: Ian EGFP, Venus, pomidor TD i M Cherry. Każde białko fluorescencyjne ulega ekspresji z silnie konstytutywnego wirusa tworzącego ognisko śledziony lub promotora SFFV. Po wytworzeniu wektorów Lego kodujących białka fluorescencyjne i miareczkowaniu cząstek wirusa, zbierz szpik kostny z przednich i tylnych kończyn myszy dawcy ofiary, preparując hum, oko, kości udowe i piszczelowe.

Użyj skalpela, aby dokładnie usunąć wszystkie więzadła mięśniowe i nadmiar tkanki z kości. Następnie przetnij koniec każdej kości jak najbliżej stawu. Używając igły o rozmiarze 27 G na strzykawce zawierającej pożywkę I 10, przepłucz szpik kostny do 50-mililitrowej stożkowej wirówki wirówkowej o stężeniu 500 G i czterech stopniach Celsjusza, aby otulić komórki.

Po odrzuceniu supernatantu do liczu krwinek czerwonych dodać 50 mililitrów wirówki buforowej CK, jak poprzednio, następnie odrzucić supernatant i powtórzyć czynność po odrzuceniu drugiego supernatantu. Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki I 10. Następnie użyj zestawu do maksymalnego zubożenia linii, aby oczyścić ujemne komórki progenitorowe linii zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem zestawu szczegółowo opisanym w dokumencie towarzyszącym.

Po oczyszczeniu ujemnych komórek linii, umieść je w kolbie T 75 o gęstości pięć razy 10 do piątej komórki na mililitr w pożywce o rozpiętości macierzystej uzupełnionej mysim IL three mysim IL 11, ludzkim ligandem FL three i czynnikiem mysich komórek macierzystych inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2 przez 48 godzin. Po dwóch dniach użyj skrobaka do komórek, aby ponownie zawiesić komórki i przenieś od jednego do czterech razy 10 do pięciu komórek na 12 dołków. Studnia dodajcie wektory o MOI od sześciu do siedmiu każdy w pożywce macierzystej z cytokinami i czterema mikrogramami na mililitr siarczanu protaminy do komórek.

Aby doprowadzić całkowitą objętość w każdym studzience do jednego mililitra, należy przygotować pojedynczą kontrolę koloru dla każdego białka fluorescencyjnego. Po 24 godzinach ponownie zawieś komórki za pomocą skrobaka i przenieś je do pięciomililitrowej probówki wirówkowej. Następnie odwirować i ponownie zawiesić je w pożywce macierzystej bez cytokin, ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach pożywki macierzystej bez cytokin na wstrzyknięcie lub do mikroskopii konfokalnej lub cytometrii przepływowej.

Przenieś je na 12-dołkowe płytki zawierające świeżą pożywkę z cytokinami i kulturą na dodatkowe 96 godzin. Przygotowując się do przeszczepu szpiku kostnego, umieść napromieniowane myszy biorców w klatce pod ciepłym światłem, podczas gdy myszy się rozgrzewają. Przygotować strzykawki do wstrzykiwań z jednym do czterech razy 10 do piątej linii ujemnych komórek w 100 mikrolitrach rozpiętości łodygi na mysz.

Przygotować jedną strzykawkę dla każdej myszy. Kiedy żyły ogonowe są rozszerzone, myszy są gotowe do wstrzyknięcia. Umieść mysz do wstrzyknięcia w ograniczniku dla myszy i zdezynfekuj ogon podkładką nasączoną 70% etanolem.

Ten krok pozwala również na lepszą wizualizację żyły ogonowej. Następnie wstrzyknij komórki do żyły ogonowej. Przeszczep całą kohortę zwierząt z tą samą populacją transdukowanych komórek szpiku kostnego dawcy w różnym czasie, do 120 dni po przeszczepie.

Odzyskaj tkanki i narządy w celu nienaruszonego obrazowania bez cięcia. Umieść poszczególne narządy w 35 milimetrach numer zero. Przykryj szklane naczynia hodowlane w 50 do 100 mikrolitrach zimnego PBS do obrazowania poklatkowego.

Umieść narządy w DMEM 10% FBS zawierającym 20 milimolowych stosów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i natychmiast zobrazuj. Tutaj mikroskopia jest wykonywana przy użyciu odwróconego pięciokanałowego systemu konfokalnego i wielofotonowego Leica SP, wyposażonego w wieloliniowe lasery widzialne z diodą argonową 561 nanometrów, helem, neonem 594 nanometrów i helem neonowym 633 nanometrów. Umieść jedną z pojedynczych próbek transdukowanych klockami Lego na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość.

Zbieraj stosy obrazów lambda w odstępach pasma pięciu nanometrów obejmujących całe spektrum światła. Następnie użyj oprogramowania, aby wybrać obszar zainteresowania na obrazie i wyświetlić histogram widma referencyjnego. Zapisz te dane.

Następnie powtórz ten proces dla każdego białka fluorescencyjnego w eksperymencie. Następnie użyj widm zebranych z poszczególnych białek fluorescencyjnych, aby ustawić szerokości pasma w trybie kanału. Aby to zrobić dla każdego kanału, kliknij suwak i wstaw przepustowość, która ma być używana.

Wybrana szerokość pasma powinna obejmować obszar piku każdego widma wzbudzenia białek fluorescencyjnych, zapewniając jednocześnie, że kanały fluorescencyjne nie nakładają się na siebie. Ustaw wzmocnienie i przesunięcie dla każdego detektora tak, aby zakres dynamiczny próbki wyjściowej był na wykrywalnym poziomie, podobnym dla białek fluorescencyjnych i bez nasycenia. Na przykład białko wiśni M jest o połowę jaśniejsze niż EGFP, więc wzmocnienie i przesunięcie powinny być dostosowane, aby uzyskać podobny zakres dynamiki dla obu.

Na koniec, w trybie kanałowym, uchwyć obraz każdej pojedynczej próbki kontrolnej koloru ze wszystkimi pięcioma kanałami i sprawdź, czy każde białko fluorescencyjne jest widoczne tylko w odpowiednim kanale i nieobecne w pozostałych. Po zatwierdzeniu widm dla wszystkich kanałów zapisz ustawienia. Można je importować i wykorzystywać w przyszłych eksperymentach, które wykorzystują te same białka fluorescencyjne i tkankę próbki.

Tutaj pokazano połączoną mikroskopię konfokalną i dwufotonową przy użyciu szpiku kostnego mostka za pomocą skalpela i pęsety poprzez przecięcie mostka wzdłuż płaszczyzny strzałkowej. Następnie wykonaj poprzeczne cięcie w stawie między dwoma fosami mostka. Umieść kości przecięte twarzą w dół w 35-milimetrowym szklanym naczyniu hodowlanym z liczbą zero, zawierającym od 50 do 100 mikrolitrów zimnego PBS, obrazowanie odbędzie się przez przeciętą twarz.

Sprawdź położenie kości w mikroskopie preparacyjnym. Umieścić próbkę na stoliku mikroskopu. Następnie ustaw oprogramowanie do obrazowania tak, aby sekwencyjnie przechwytywało dwa fotony z sygnałem generowanym przez drugą harmoniczną.

Następnie pięciokolorowe wzbudzenie konfokalne. Ustaw granice obszaru zbierania Pock, umieszczając odstępy o wielkości pięciu mikronów powyżej 150 do 300 mikronów. Użyj funkcji kafelka, aby poinstruować oprogramowanie, aby automatycznie generowało zszyte objętości obejmujące cały mostek Fosse o wymiarach około 2,5 na 1,2 milimetra kwadratowego w kierunku XY.

Zainicjuj przechwytywanie, aby sekwencyjnie zbierać obrazy X, Y, Z we wszystkich pięciu kanałach oraz dwie mikroskopie fotonowe z sygnałem generowanym przez drugą harmoniczną z kolagenu kostnego i fibrylarnego dla obrazowania poklatkowego w czterech D. Umieść świeżo wycięte, nieoszlifowane próbki węzłów chłonnych podkolanowych, śledziony, płuc lub kości nazębnych na 35 milimetrach numer zero. Przykryj szklane naczynia hodowlane w 50 do 100 mikrolitrach DMEM z 10% FBS i 20 milimolowymi hałdami w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umieścić próbkę na podgrzewanym stoliku mikroskopu. Następnie w oprogramowaniu przełącz parametry przechwytywania, aby użyć dwóch fotonów wzbudzenia tytanowo-szafirowego o długości 860 nanometrów w połączeniu ze wzbudzeniem konfokalnym oraz skanera rezonansowego Leica o częstotliwości 8 000 Hz na sekundę. Przyjmując stosy Z o grubości 80 mikronów w 22. odstępach czasu przez maksymalnie jedną godzinę w celu jednoczesnego obrazowania trzech kolorów i dwóch fotonów, poinstruuj oprogramowanie, aby używało szafiru tytanowego dostrojonego na 860 nanometrów jednocześnie z laserem OPO dostrojonym do 1,130 nanometra dla pomidora TD lub 1,140 nanometra dla wiśni M.

Na koniec zainicjuj przechwytywanie, aby zebrać cztery obrazy D. Tak jak poprzednio, po zebraniu wszystkich obrazów, wykonaj rekonstrukcję i analizę 3D i Four D za pomocą wersji Amer 64-bit lub podobnego oprogramowania w oprogramowaniu. Otwórz obraz Zack, wybierz pozycję przewyższaj, aby wyświetlić wizualizator objętości 3D.

Następnie użyj funkcji Nawiguj, aby obrócić wolumin o 360 stopni. Następnie wybierz animację. Użyj klatek kluczowych, aby dodać wybrane widoki, powiększenie i obroty woluminu.

Wyświetl podgląd filmu i edytuj go w razie potrzeby. Na koniec zapisz plik w żądanym formacie filmu, aby prześledzić historię klonalną fluorescencyjnie znakowanych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Komórki dawcy transdukowane pięcioma różnymi wektorami Lego przeszczepiono myszowi biorcy, a szpik kostny mostka zobrazowano i przeanalizowano zgodnie z opisem w tym filmie.

Po czterech dniach od przeszczepu skupiska komórek zaznaczone w szerokiej gamie kolorów były widoczne w bliskiej odległości od krawędzi kości, która jest pokazana na biało. Do 31 dnia duży klon o unikalnym zielono-żółtym kolorze rozprzestrzenił się i zajął cały Fosse, jak pokazano na połączonych i jednokanałowych zdjęciach. Analiza zawartości FPS wykazała jednorodne oznaczanie przez dwie wariancje FPS: EGFP i Venus.

Ten film z rekonstrukcją 3D pokazuje architekturę przestrzenną oznaczonych klonów zamkniętych w kości mostka. Zdjęcie przedstawia przykład komórek pochodzących ze szpiku kostnego w węźle chłonnym podkolanowym 120 dni po przeszczepie. Komórki rozproszone są najczęściej oznaczone kolorem żółtym i czerwonym i są obwodowo otoczone włóknami kolagenowymi pokazanymi na biało w sercu widzianym od strony nasierdzia.

Widoczne są liczne pojedyncze komórki przeplatane między kardiomiocytami pokazanymi na biało, uwidocznionymi przez ich autofluorescencję dwóch fotonów na głębokości 780 nanometrów po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu kilku dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Po jej opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regeneracją i rozwojem narządów, a także biologii, do badania przestrzennych układów czasowych klonalnie złożonych elementów komórkowych i strukturalnych poprzez wielokolorowe znakowanie oraz obrazowanie konfokalne i dwufotonowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować metodologię znakowania fluorescencyjnego do śledzenia klonalnego znakowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w żywych narządach.