Name: Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę oceny aktywności przeciwgrzybiczej makrofagów pęcherzykowych myszy wobec zarodników Aspergillus przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika obejmuje barwienie in vivo, pobieranie płuczką oskrzelowo-pęcherzykową i analizę fagocytozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Allergy and Infectious Disease Grant R01AI079253 (dla B.H.S.), oraz przez National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA016056 dla Roswell Park Cancer Institute.

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Roswell Park Cancer Institute i były zgodne ze wszystkimi przepisami stanowymi, federalnymi i National Institutes of Health.
1. Znakowanie makrofagów in vivo
Uwaga: PHK26 to barwnik lipofilowy, który jest pobierany przez komórki fagocytarne zarówno w krążeniu, jak i w tkankach, gdy jest podawany dożylnie (i.v.). PKH26 wykorzystano do znakowania in vivo w celu zminimalizowania ilości manipulacji makrofagami po zbiorach. PKH-26 ma tę zaletę, że stabilnie gromadzi się w makrofagach pęcherzykowych przez dłuższy czas. Odczekanie 10 dni po podaniu pozwala na usunięcie wszystkich znakowanych komórek z krążenia, pozostawiając tylko makrofagi pęcherzykowe stabilnie znakowane PKH26 8,9. PKH26 jest czerwonym fluorochromem, który ma charakterystykę wzbudzenia (551 nm) i emisji (567 nm) zgodną z systemami wykrywania rodaminy lub fikoerytryny. Każda procedura etykietowania może wprowadzić artefakt, w tym utratę żywotności. Ponieważ jednak używamy tego samego podejścia do znakowania makrofagów w różnych genotypach myszy (np. WT vs. niedobór oksydazy NADPH), efekty tych artefaktów byłyby jednolite.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy PKH26 (1 x 10-3 M w etanolu) w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku C dostarczonym przez producenta.</li>
	<li>Załadować 100 μl rozcieńczonego PKH26 do strzykawki insulinowej o pojemności 1/2 ml (29 G x 1/2") dla każdej myszy.</li>
	<li>Podawać myszom przez wstrzyknięcie dożylne (do żyły ogonowej lub wstecz oczodołu) co najmniej 10 dni przed pobraniem.</li>
</ol>
2. Zbieranie makrofagów pęcherzykowych metodą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)
Liczba myszy do wykorzystania w eksperymencie może się różnić. Typowy plon z niestymulowanej myszy mieści się w zakresie 3-5 x 105 makrofagów pęcherzykowych, jednak liczba ta może się znacznie różnić w zależności od takich czynników, jak wielkość myszy, doświadczenie osoby wykonującej płukanie oraz liczba wkropleń płynu z płukania i objętość pobrana z płuc. W tym protokole płukanie płuc jest wykonywane przy zamkniętej jamie klatki piersiowej, co wraz z powtarzającymi się płukaniami o pojemności 1 ml pomaga zwiększyć wydajność komórek.
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji, podając śmiertelną dawkę środka znieczulającego avertin (12,5 mg) dootrzewnowo (i.p.) w warunkach aseptycznych, aby utrzymać sterylność roztworu.</li>
	<li>Spryskaj mysz dokładnie 70% etanolem.</li>
	<li>Usuń skórę z końca czaszki zwierzęcia, odsłaniając klatkę piersiową (ryc. 1A).
	<ol>
		<li>Wykonaj małe nacięcie w skórze tuż pod membraną.</li>
		<li>Włóż palec do nacięcia i odciągnij skórę od końca czaszki zwierzęcia (ryc. 1A).</li>
		<li>Lekko podnieś głowę, wydłużając brzuszną stronę szyi (ryc. 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytnij mały otwór w klatce piersiowej po prawej stronie klatki piersiowej, aby opróżnić płuca, a także umożliwić wizualizację płuc podczas kolejnych kroków.</li>
	<li>Zlokalizuj tchawicę i ostrożnie wypreparuj otaczającą tkankę.
	<ol>
		<li>Usuń gruczoły ślinowe, mięśnie mostkowo-gnykowe i krtań itp. za pomocą zakrzywionych kleszczy.</li>
		<li>Ostrożnie podnieś zakrzywionymi kleszczami i odetnij nożyczkami cienką tkankę pokrywającą tchawicę (przydankę), odsłaniając leżącą pod spodem strukturę chrząstki pierścieniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzić cewnik do tchawicy.
	<ol>
		<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy umieść szew za (grzbietowo do) tchawicy i przeciągnij przez otwór o długości 10 cm.</li>
		<li>Zaczynając od cricoid (pogrubionego pierścienia chrząstki), ostrożnie poprowadź cewnik 22 G w dół tchawicy, zatrzymując się w miejscu, w którym tchawica znika za mostkiem.</li>
		<li>Mocno zawiąż szew wokół tchawicy i cewnika, aby uzyskać dokładne dopasowanie. Wyjmij igłę z cewnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj 4-drogowy kran odcinający.
	<ol>
		<li>Napełnij jedną strzykawkę o pojemności 6 ml DPBS, 1% FBS i podłącz do 4-kierunkowego kranu, jak pokazano na rysunku 1B.</li>
		<li>Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 6 ml we wskazanym miejscu na 4-kierunkowym zaworze odcinającym (Rysunek 1B).</li>
		<li>Podłącz otwarty port na 4-kierunkowym kurku do cewnika (Rysunek 1B). Uważaj, aby nie usunąć cewnika z tchawicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz płyn popłuczyn z płuc.
	 Uwaga: Badacze mogą zdecydować się na użycie mniejszych objętości płynu do płukania, aby zminimalizować możliwość uszkodzenia tkanki. Ważne jest, aby to samo podejście było konsekwentnie stosowane we wszystkich grupach myszy.
	<ol>
		<li>Przekręć uchwyt na kurku tak, aby pusta strzykawka była zamknięta i powoli wstrzyknij ~1 ml DPBS, 1% FBS, aby napełnić płuca. Obserwuj napompowanie płuc przez otwór wycięty w kroku 2.4.</li>
		<li>Uważaj, aby NIE przesadzić z płucami.</li>
		<li>Przekręć uchwyt na kurku tak, aby cała strzykawka była zamknięta i ostrożnie wyciągnij płyn z płuc.</li>
		<li>Obserwuj, jak płuca opróżniają się przez otwór wycięty w kroku 1.4. Cewnik może wymagać lekkiego przesunięcia do przodu lub do tyłu, aby uzyskać dobre pobranie. Należy podjąć szczególne środki ostrożności, aby cewnik utrzymywał się w tchawicy.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 2.8.1-2.8.4 5-6 razy, aż wszystkie DPBS, 1% FBS zostaną wstrzyknięte i wycofane z płuc. Uwaga: odzyskanie płynu płucnego nie będzie w 100% pokryte wstrzykniętym płynem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opróżnić strzykawkę z płynem do płukania do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Komórki osadu rozdrabniać przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odlać z supernatantu. W razie potrzeby można to zachować do analizy cytokin.</li>
	<li>Zawieś komórki w 1-5 ml RPMI 1640 z 10% FBS i policz na hemocytometr. Oczekuje się, że u myszy niestymulowanej > 95% komórek zebranych przez BAL to makrofagi, co można potwierdzić za pomocą cytologii.</li>
</ol>
3. Hodowla i zbiór grzybów
Aspergillus fumigatus używany w tym protokole wyraża GFP na wszystkich etapach swojego cyklu życia: zarodniki, zarodki i strzępki. Ten szczep grzyba został dostarczony przez dr Margo Moore z Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada.
<ol>
	<li>Konidia płytkowe szczepu Aspergillus fumigatus wykazujące ekspresję GFP na agarze Sabouraud brain heart infusion (BHI) skosy z chloramfenikolem (0,05 g/l) i gentamycyną (0,5 g/l).</li>
	<li>Inkubować w ciemności luźno zakryte przez 7 do 10 dni w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zbierz konidia, myjąc skos 10 ml 0,01% Tween 20 w DPBS. Lekko zeskrob grzyba paskiem, aby się poluzował. Kilkakrotnie spłucz skos, aby zwiększyć wydajność.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę konidialną przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowego o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Konidia w granulkach przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić konidia w 50 ml DPBS i policzyć za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie DPBS i rozcieńczyć do pożądanego stężenia.</li>
</ol>
4. Wyzwanie grzybowe i mikroskopia konfokalna
Aby zbadać rolę oksydazy NADPH makrofagów w obronie gospodarza, oceniono zdolność izolowanych makrofagów pęcherzykowych od myszy o trzech genotypach do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus. Genotypy użyte w tym badaniu obejmują; 1) myszy typu dzikiego, 2) myszy Ncf1*/* Mn- z naturalnie występującą mutacją Ncf1 (Ncf1 kodujep47 phox, wymagany składnik oksydazy fagocytów NADPH), pozostawiając je z niedoborem oksydazy NADPH, oraz 3) myszy transgeniczne Ncf1*/* Mn + (MN oznacza transgen zawierający Ncf1 typu dzikiego pod kontrolą ludzkiego promotora CD68), u których aktywność oksydazy NADPH została odtworzona w populacji monocytów / makrofagów10,11.
Mikroskopia konfokalna najlepiej nadaje się do tego testu ze względu na obecność i wzrost niefagocytozowanych konidiów na szkiełkach. Mikroskop konfokalny pozwoli na wizualizację poszczególnych płaszczyzn w obrębie osi Z i umożliwi rozróżnienie grzybów rosnących wokół makrofagów, a nie wewnątrz nich. Wszystkie obrazy konfokalne są uzyskiwane za pomocą soczewki immersyjnej z olejkiem 63X. Stosy Z są pozyskiwane ze współczynnikiem zoomu elektronicznego wynoszącym 2,5. Grubość stosu Z jest określana za pomocą DAPI i obrazów jasnego pola w celu zlokalizowania górnej i dolnej części pola. Stosy Z wahały się od 14 do 24 μm, z pojedynczymi warstwami o grubości ~1 μm. W celu ilościowego określenia makrofagów wykonano pojedyncze skany 1-krotnego zoomu elektronicznego na 10 polach na genotyp. Nienaruszone makrofagi zidentyfikowano na podstawie barwienia błony i jądra odpowiednio PKH26 i DAPI. Konidia zidentyfikowano na podstawie ekspresji FITC i obrazu w jasnym polu.
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne szkiełka nakrywkowe i płytki
	<ol>
		<li>Pod Gabinetem Bezpieczeństwa Biologicznego namocz szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm w 70% etanolu przez 5-10 minut.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe należy spłukać w sterylnym PBS.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków delikatnie umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe na dnie każdego dołka sterylnej, pojedynczo zapakowanej płytki 6-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nasiona ~ 1 x 106 zebranych makrofagów pęcherzykowych oznaczonych PKH26 zawieszonych w 300 μl RPMI 1640, 10% FBS na każdym szkiełku nakrywkowym. Dokładna liczba może się różnić w zależności od plonów.</li>
	<li>Pozwolić makrofagom przylegać przez inkubację w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Następnego ranka dodać ~1 x 107 konidiów A. fumigatus wykazujących ekspresję GFP zawieszonych w 100 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) RPMI 1640, 10% FBS.</li>
	<li>Płytka powrotna do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Komórki należy utrwalać na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po 3, 7 i 14 godzinach napraw komórki, dodając równą objętość 2% formaldehydu do każdej studzienki (końcowe stężenie 1% formaldehydu). Umieść na noc płytki dla wczesnych punktów czasowych w temperaturze 4 °C. W ostatnim punkcie czasowym (14 godzin) utrwal komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Po utrwaleniu delikatnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszków i spłucz w DPBS.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu, umieszczając krawędź szkiełka nakrywkowego na złożonym Kimwipe.</li>
	<li>Nałóż 6 μl fluorescencyjnego medium montażowego z DAPI na szklane szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Połóż jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i delikatnie upuść je stroną z komórkami do dołu do podłoża montażowego. Podłoże montażowe rozprowadzi się i utworzy równą warstwę pod szkiełkiem nakrywkowym. Nie ma potrzeby naciskania na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Przygotowane preparaty należy przechowywać w pudełku na szkiełka (chronionym przed światłem) w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą gotowe do analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>

<ol><li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K%2B+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li>
<li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li>
<li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li>
<li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li>
<li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li>
<li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li>
<li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li>
<li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li>
<li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li>
<li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li>
<li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li>
<li>García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes%2C+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li>
<li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+from+C3H%2FHeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li>
<li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li>
<li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stosując to podejście do analizy ex vivo aktywności przeciwgrzybiczej makrofagów wraz z prowokacją grzybów in vivo , wcześniej wykazaliśmy, że oksydaza NADPH w makrofagach odgrywa ważną rolę w obronie przed A. fumigatus4. Zastosowanie izolowanych makrofagów pęcherzykowych pozwala nam skupić się na ich aktywności przeciwgrzybiczej przy braku innych komórek odpornościowych (np. rekrutowanych neutrofili), które bronią się przed Aspergillus in vivo.
<p clas...

Makrofagi pęcherzykowe to komórki fagocytarne pierwszej linii, które napotykają wdychane drobnoustroje. Makrofagi rozpoznają motywy Aspergillus poprzez receptory rozpoznające patogeny, połykają i ograniczają wzrost wdychanych zarodników (konidiów) oraz inicjują reakcje zapalne. Oksydaza fagocytowa NADPH przekształca tlen cząsteczkowy w anion ponadtlenkowy i reaktywne produkty pośrednie tlenu (ROI). Przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD) jest dziedzicznym zaburzeniem oksydazy NADPH charakteryzującym się ciężkimi infekcjami bakteryjnymi i grzybiczymi oraz nadmiernymi reakcjami zapalnymi.
Chociaż oksydaza NADPH jest kluczowa dla obrony gospodarza za pośrednictwem neutrofili1-3, znaczenie oksydazy NADPH w makrofagach nie jest dobrze zdefiniowane. Wcześniejsze badania wykazały, że makrofagi pęcherzykowe połykają i zabijają zarodniki Aspergillus, podczas gdy neutrofile celują głównie w stadiumstrzępek 5. Istnieją jednak sprzeczne wyniki co do roli oksydazy NADPH w makrofagach w kontrolowaniu wzrostu zarodników A. fumigatus 6,7.
Celem tej metody było określenie specyficznej roli oksydazy NADPH w makrofagach w pośredniczeniu w obronie gospodarza przed zarodnikami A. fumigatus. Odkryliśmy, że oksydaza NADPH w makrofagach pęcherzykowych kontroluje wzrost fagocytozowanych zarodników A. fumigatus 4. Aby jak najdokładniej modelować reakcję gospodarza na wdychane grzyby, użyliśmy makrofagów pęcherzykowych zebranych przez płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe od niestymulowanych myszy bezpośrednio po uśmierceniu. Zastosowanie wyizolowanych makrofagów pęcherzykowych pozwoliło nam skupić się na ich działaniu przeciwgrzybiczym przy braku innych komórek odpornościowych (np. rekrutowanych neutrofili), które bronią się przed Aspergillus in vivo. W tej metodzie makrofagi pęcherzykowe barwiono in vivo przed zbiorem, aby zminimalizować ilość manipulacji po zbiorach.
Kolejną zaletą tego protokołu jest użycie szczepu A. fumigatus wykazującego ekspresję GFP. Grzyb ten wyraża GFP od stadium konidialnego do etapu strzępek i nie ma potrzeby dalszego barwienia. Aby uzyskać obrazy o większej szczegółowości, zdecydowaliśmy się na mikroskopię konfokalną, która umożliwia rekonstrukcję trójwymiarowych struktur na podstawie uzyskanych obrazów. Rekonstrukcja trójwymiarowa daje możliwość rozróżniania strzępek rosnących wokół makrofaga, a nie w nim lub przez makrofagi. Konidia można również precyzyjnie rozróżnić jako wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Zestaw łączników komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego etykietowania błony komórkowej</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Używany do produkcji AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Używany do produkcji AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (bez wapnia i magnezu)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Służy do wytwarzania buforu do lizy czerwonych krwinek ACK</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Służy do wytwarzania buforu do lizy czerwonych krwinek ACK</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Służy do wytwarzania buforu do lizy czerwonych krwinek ACK</td></tr><tr><td>22 G x 1,00 cala iv. cewnik</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Winged</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Strzykawki 4-kierunkowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>kran Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Gwint</td><td></td><td></td><td></td>do szwów</tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki</td><td></td><td></td><td></td>wirówkowe</tr><tr><td>gąbki z gazy (4 cale kwadratowe)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z L-glutaminą</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyklon</td><td>SH30396.03</td><td>inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>zestaw plam Hema 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Agar do infuzji serca mózgu z chloramfenikolem i gentamycyną Skosy</td><td>BD</td><td>Szczep 297252</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatous z ekspresją białka</td><td></td><td></td> zielonej fluorescencji <td>dostarczony przez dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada</td></tr><tr><td>100 &mu; m Sitka do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego Klasa II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Wirówka z obrotowym wirnikiem kubełkowym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>świetlny Leica DM1000</tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Cytospin 2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> do hodowli komórkowych <td>37 &deg; C, 5%&nbsp; CO2</sub</td></tr><tr><td>>22 x 22 mm szkło z mikro pokrywą</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>szklane szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>System Leica TCS SP2 z laserowym skanerem punktowym</td><td></td><td></td><td>Zamontowany na mikroskopie fluorescencyjnym DMIRE2</td></tr></tbody></table>

ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Płuco jest interfejsem, gdzie komórki gospodarza są rutynowo narażone na działanie mikrobów i produktów mikrobiologicznych. Makrofagi pęcherzykowe to komórki fagocytarne pierwszej linii, które napotykają wdychane grzyby i inne drobnoustroje. Makrofagi i inne komórki odpornościowe rozpoznają motywy Aspergillus przez receptory rozpoznające patogeny i inicjują dalsze reakcje zapalne. Oksydaza NADPH fagocytów wytwarza reaktywne produkty pośrednie tlenu (ROI) i ma kluczowe znaczenie dla obrony gospodarza. Chociaż oksydaza NADPH ma kluczowe znaczenie dla obrony gospodarza za pośrednictwem neutrofili1-3, znaczenie oksydazy NADPH w makrofagach nie jest dobrze zdefiniowane. Celem tego badania było określenie specyficznej roli oksydazy NADPH w makrofagach w pośredniczeniu w obronie gospodarza przed A. fumigatus. Odkryliśmy, że oksydaza NADPH w makrofagach pęcherzykowych kontroluje wzrost fagocytozowanych zarodników A. fumigatus 4. W tym miejscu opisujemy metodę oceny zdolności mysich makrofagów pęcherzykowych (AM) do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus (konidiów). Makrofagi pęcherzykowe są barwione in vivo, a dziesięć dni później izolowane od myszy przez płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL). Makrofagi są siane na szklanych szkiełkach nakrywkowych, a następnie wysiewane zarodnikami A. fumigatus wykazującymi ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). W określonych momentach komórki są utrwalane, a liczba nienaruszonych makrofagów z fagocytozowanymi zarodnikami jest oceniana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych poprzez BAL u myszy niepobudzonych pozwoli na uzyskanie populacji o czystości &gt; 95% na podstawie cytologii. Punkty czasowe 3 i 7 h (Rysunek 2) poprzedzają etap strzępkowy wzrostu grzyba i umożliwiają porównanie wydajności fagocytozy konidiów pomiędzy genotypami. Punkt czasowy 14 h pozwala na porównanie genotypów pod kątem zdolności do hamowania przejścia fagocytowanych konidiów w tkankowo inwazyjny etap strzępkowy (Rysunek 3). Nieuszkodzone makro...

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Ogólnym celem tej procedury jest porównanie zdolności makrofagów do kontrolowania wzrostu grzybów z rodzaju Candida ex vivo. Jest to osiągane poprzez wstępne znakowanie makrofagów pęcherzykowych in vivo lipofilnym barwnikiem PKH 26. Drugim krokiem procedury jest pobranie makrofagów pęcherzykowych od inokulowanych myszy za pomocą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.Trzecim krokiem jest hodowla i zbieranie zarodników grzybów wykazujących pozytywną ekspresję GFP. Ostatnimi etapami są próby zakażenia makrofagów kandyidami GFP-dodatnimi oraz utrwalenie komórek w określonych punktach czasowych. Ostatecznie, przy minimalnej manipulacji komórkami ex vivo, mikroskopia konfokalna pozwala ujawnić zdolność makrofagów pęcherzykowych do kontrolowania wzrostu fagocytowanych drobnoustrojów.Zarodniki Najpierw rozcieńczyć lipofilowy barwnik P HK 26 w stosunku 1:5. W rozcieńczalniku C barwnik zostanie pobrany przez kwaśne komórki FOC. Nabrać 100 µL rozcieńczonego P HK 26 do strzykawki o pojemności 0,5 cc i wstrzyknąć barwnik dożylnie przez kąt oka lub przez żyłę ogonową.Przyjmij, że każda mysz dostarczy od trzech do 500 000 znakowanych makrofagów po 10 dniach. Uśmierć myszy i przygotuj się do otwarcia

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena działania przeciwgrzybiczego izolowanych makrofagów płucnych za pomocą mikroskopii konfokalnej

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Źródło: Barbero, A. M., et.al. Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem odpornościowym SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji badający interakcję między receptorem makrofagów a antygenami Mycobacterium tuberculosis . Antygeny znakowane fluorescencją na slipie są inkubowane z ekstraktami białek makrofagów, sieciowane, znakowane przeciwciałami i wizualizowane przez nakładające się sygnały fluorescencji.

Test fluorescencyjny do badania interakcji receptorów makrofagów z antygenami bakteryjnymi

Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek do analizy aktywności przeciwgrzybiczej u ludzkich neutrofili przy użyciu fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus. Początkowo w neutrofilach wykrywana jest zarówno czerwona, jak i purpurowa fluorescencja, podczas gdy czerwona fluorescencja zmniejsza się z czasem, co wskazuje na degradację konidiów i potwierdza aktywność przeciwgrzybiczą neutrofili.

Ocena w czasie rzeczywistym aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli.  Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Ten protokół zapewnia szybką i niezawodną metodę ilościowego pomiaru fagocytozy konidiów Aspergillus fumigatus przez ludzkie pierwotne fagocyty za pomocą cytometrii przepływowej i do odróżnienia fagocytozy konidiów od zwykłej adhezji do leukocytów.

Pomiar fagocytozy Aspergillus fumigatus Conidia za pomocą ludzkich leukocytów przy użyciu cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus (o wielkości 3 μm) w drogach oddechowych myszy. Metoda może być również stosowana do analizy rozkładu mikrocząstek i aglomeratów nanocząstek w drogach oddechowych w różnych modelach stanów patologicznych.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy

Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana do badań oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Celem pracy jest przedstawienie metody oceny zdolności fagocytozy i klirensu makrofagów pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej pochodzących z monojądrowych stymulowanych Trichoderma stromaticum conidia.

Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

Poznaj metodę oceny aktywności przeciwgrzybiczej makrofagów pęcherzykowych myszy wobec zarodników Aspergillus przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika obejmuje barwienie in vivo, pobieranie płuczką oskrzelowo-pęcherzykową i analizę fagocytozy.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów