Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

Celem tej procedury jest wygenerowanie i oczyszczenie dzikich i zmutowanych wersji wielopodjednostki w kompleksie przebudowującym oh 80 Chromatin. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie jąder od komórek wyrażających epitop flagowy oznaczony białkami O 80 W drugim etapie przygotowuje się ekstrakty jądrowe, a następnie dziki typ lub zmutowany człowiek w kompleksach przebudowujących chromatynę O 80 jest oczyszczany za pomocą chromatografii Anti-Flag aros. Ostatecznie skład podjednostek oczyszczonych kompleksów NO 80 można analizować za pomocą barwienia western blot lub srebra.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób podjednostki kompleksów przebudowujących chromatynę MultiPro przyczyniają się do ich ogólnej aktywności. Metoda ta została zaprojektowana specjalnie do badania dzikich i zmutowanych wersji kompleksu przebudowy chromatyny NO 80, ale może być również stosowana do badania innych wielopodjednostkowych kompleksów jądrowych. Jak mediator.

Najbardziej krytycznym etapem procedury jest etap ekstrakcji jądrowej. Ludzie zwykle napotykają problem, ponieważ na etapie ekstrakcji soli ludzie mają tendencję do zbyt szybkiego lub zbyt energicznego dodawania soli Po hodowli W butelkach rolkowych przenieś komórki HEC 2 9 3 do stożkowej rurki o odpowiedniej wielkości i wiruj je przez 10 minut w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Po usunięciu supinatu, zmierzyć objętość upakowanego osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić osad w pięciu objętościach komórek buforu A z delikatnym pipetowaniem i inkubować komórki na lodzie przez dokładnie 10 minut.

Po ponownym odwirowaniu komórek zmierz osad komórek po raz drugi, powinien on zwiększyć się nawet dwukrotnie. Tym razem ponownie zawiesić komórki w dwóch objętościach komórek buforu A, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do homogenizatora tkankowego o odpowiedniej wielkości i homogenizować zawiesinę komórkową za pomocą luźnego szklanego tłuczka, aż 90% komórek zabarwi się dodatnio za pomocą wirówki trian blue, homogenizowane komórki w 45-mililitrowej probówce wirówkowej o dużej prędkości przez 20 minut w 25, 000 razy G i cztery stopnie Celsjusza w wirniku o stałym kącie nachylenia. Następnie usuń natant SUP zawierający białka cytozolowe z osadu jądrowego, aby wyekstrahować jądra solą.

Teraz dodaj 2,5 mililitra buforu C, ale co trzy mililitry początkowej objętości upakowanych komórek do osadu. Następnie za pomocą pipety serologicznej usunąć osad ze ścianki probówki i przenieść całą mieszaninę do homogenizatora puchowego o odpowiedniej wielkości. Homogenizować mieszaninę dwoma pociągnięciami luźnego tłuczka, aby zawiesić jądra, a następnie przenieść zawieszoną frakcję jądrową nu do schłodzonej zlewki o takiej wielkości, że zawiesina wypełni zlewkę na głębokość co najmniej 0,5 centymetra.

Następnie oblicz objętość pięciu molowych chlorków sodu potrzebnych do doprowadzenia roztworu do końcowego stężenia 0,42 molowego chlorku sodu zgodnie z następującym wzorem. Teraz stopniowo dodawaj obliczoną objętość roztworu soli kropla po kropli, delikatnie przesuwając zawiesinę szklanym prętem na lodzie, aby zwiększyć stężenie soli w zawiesinie, aż cały chlorek sodu zostanie dodany i roztwór stanie się bardzo lepki. Następnie ostrożnie przenieś lepką zawiesinę do 70-mililitrowych probówek poliwęglanowych w wirniku typu 45 TI z zespołem nasadki i użyj mutatora, aby powoli kołysać uszczelnione probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza Po 30 minutach ultraodwirować próbki w wirniku TI 45 przez 30 minut w temperaturze 40 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, i wyciągnąć ekstrakt jądrowy zawierający supernatanty do jednego plastikowego pojemnika.

Następnie podziel roztwór ekstraktu jądrowego na porcje o dogodnej wielkości, zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować aros Anti-Flag do oczyszczania immunologicznego, zacznij od użycia pipety o pojemności 200 mikrolitrów z odciętą końcówką, aby przenieść 200 mikrolitrów przez zawiesinę kulek 50% Anti-Flag aros do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Przenieś wstępnie umyte kulki do stożkowej probówki zawierającej 10 mililitrów świeżo rozmrożonego ekstraktu jądrowego przed godzinami czterech stopni Celsjusza z powolnymi obrotami na rotatorze laboratoryjnym, a następnie zbierz flagę aros przez wirowanie przez pięć minut 1000 razy G i cztery stopnie Celsjusza.

Następnie umyj ekstrakt z kulek P w 10 mililitrach, czterech 50 przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, delikatnie kołysząc na mutatorze. Następnie, po odwirowaniu mieszaniny ekstraktu z perełek, ponownie użyj ponownie. Zawieś osad w 100 do 150 mikrolitrach świeżych cztery 50, przenieś kulki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Kontynuując płukanie 15-mililitrowej stożkowej probówki 100 do 150 mikrolitrami kwartów Lizolu 50, aż wszystkie kulki zostaną przeniesione do probówki mikrowirówki. Po odwirowaniu kulek w mikrowirówce umyj je trzykrotnie jednym mililitrem lys four 50 i raz jednym mililitrem EB 100.Buffer. Następnie, aby wymyć związane białka, dodaj 200 mikrolitrów buforu EB 100 zawierającego peptyd flagowy i inkubuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na orzechu.

Po pół godzinie zdegranuluj kulki w otrzymanej mikrowirówce, a następnie przenieś natant SUP zawierający eluowany w kompleksie OAC C do świeżej probówki do mikrowirówki. Po powtórzeniu wyjaśnienia jeszcze cztery razy, przepuść wyciągnięty eluat przez pustą kolumnę wirową, aby usunąć wszelkie pozostałości kulek aerodynamicznych flagi z frakcji białkowej. Na koniec użyj odśrodkowego urządzenia ultrafiltracyjnego z granicą masy cząsteczkowej 50 000 mas cząsteczkowych, aby skoncentrować wspomnianą frakcję białkową około 10-krotnie.

Jak pokazano na tym rysunku, czystość kompleksów NO 80 przygotowanych przy użyciu wskazanych podjednostek znacznika flagowego, jak właśnie pokazano, można ocenić przy użyciu barwionych srebrem żeli poliakrylamidowych SDS. Wszelkie białka, które pojawiają się na tym pasie kontrolnym, są zanieczyszczeniami, które wiążą się niespecyficznie z aeros flagi. Etykiety te wskazują zakazy odpowiadające badanym podjednostkom NO 80, a te wskazują ruchliwość markerów masy cząsteczkowej.

Pozycja dzikiego typu NO 80 jest oznaczona czarnym kwadratem, a pozycje mutantów NO 80 są oznaczone otwartymi okręgami. Pasy oddzielone czarną linią pochodzą z oddzielnych żeli. Skład kompleksów można ocenić za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciał przeciwko różnym podjednostkom NO 80.

na przykład. Poniżej oceniono podjednostki modułu domeny terminala końcowego, modułu powiązanego z centrum Helikazy i modułu SNF dwa. Po opanowaniu tej techniki można zakończyć w ciągu jednego dnia, zaczynając od zbierania komórek, a kończąc na oczyszczaniu kompleksów.

Technika ta pozwoli naukowcom oczyścić kompleksy i podkompleksy wielopodjednostkowe komórek ssaków w celu zbadania ich funkcji. Po obejrzeniu tego filmu lepiej zrozumiesz, jak oczyścić przebudowę chromatyny i inne wielopodjednostkowe kompleksy białkowe z komórki ludzkiej lub innych linii komórkowych pędu.