Name: Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania i oczyszczania ludzkich kompleksów INO80 z komórek HEK293 przy użyciu chromatografii immunoafinitycznej. Technika ta umożliwia analizę składu podjednostek i badanie mechanizmów remodelowania chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium autorów jest wspierana przez grant z National Institute of General Medical Sciences (GM41628) oraz przez grant dla Stowers Institute for Medical Research z Helen Nelson Medical Research Fund w Greater Kansas City Community Foundation.

1. Generowanie i hodowla stabilnych linii komórkowych HEK293 wykazujących ekspresję pełnowymiarowych lub zmutowanych wersji białka Ino80 z tagiem epitopowym FLAG lub innych podjednostek kompleksu INO80
<ol>
	<li>Sklonuj cDNA kodującą pełnowymiarową lub zmutowaną ludzką ATPazę Ino80 lub inną podjednostkę INO80 do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA5/FRT z ramką odczytu zgodną z N-terminalnym znacznikiem epitopowym FLAG.</li>
	<li>Przed kontynuacją potwierdź sekwencję wstawionych cDNA za pomocą sekwencjonowania DNA.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia transfekcji hoduj komórki Flp-In HEK293 w 10 cm naczyniach hodowlanych w pożywce zawierającej DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 5% glutaminy i 10% FBS (płytki surowicy bydlęcej).</li>
	<li>Gdy komórki osiągną ~70% konfluencji, dodaj do każdego naczynia hodowlanego mieszaninę 40 µl odczynnika do transfekcji FuGENE6, 0,5 µg odpowiedniego plazmidu ekspresyjnego pcDNA5/FRT oraz 9,5 µg pOG44, kodującego rekombinazę Flp, w całkowitej objętości 800 μl.</li>
	<li>Po 48 godz. potraktuj komórki trypsyną i przesiej je w stosunku 1:30 do naczyń 10 cm, a następnie hoduj w DMEM z 5% glutaminą, 10% FBS i 100 µg/ml hygromycyny B przez 3 – 4 tygodnie. Wymieniaj pożywkę hodowlaną zawsze, gdy zacznie żółknąć (zazwyczaj co 3 – 5 dni).</li>
	<li>Aby zidentyfikować pozytywne klony wykazujące najwyższy poziom ekspresji białka z oznacznikiem FLAG, wybierz pojedyncze kolonie oporne na hygromycynę B i przenieś je do pojedynczych studni płytki 24-dołkowej.
	<ol>
		<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, zbierz komórki z każdej studni w ~1 ml PBS i osadź przez wirowanie przy 1 000 x g przez 5 min.</li>
		<li>Po usunięciu supernatantu resuspenduj osad komórkowy w 60 µl buforu do próbek SDS-PAGE.</li>
		<li>Połowę zresuspendowanego osadu komórkowego poddaj elektroforezie SDS-PAGE i western blottingowi w celu monitorowania ekspresji białka przynęci z oznacznikiem FLAG; drugą połowę zachowaj do przyszłych analiz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli w lizatach komórkowych nie wykryto ludzkiego białka Ino80 z oznacznikiem FLAG, dalej powiększ początkową populację komórek klonalnych, przesiewając komórki z pojedynczych studni płytki 24-dołkowej do 15 cm naczyń hodowlanych.
	<ol>
		<li>Aby zebrać komórki z naczyń 15 cm, zresuspenduj niemal konfluencyjne komórki w lodowatym PBS i przenieś do probówki stożkowej 50 ml.</li>
		<li>Dopełnij do końcowej objętości 50 ml, dodając dodatkowy PBS.</li>
		<li>Osadź komórki przy 1 000 x g przez 5 min i usuń jak największą ilość supernatantu.</li>
		<li>Zresuspenduj osad komórkowy w 1 ml buforu Lys450 (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% TritonX-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glicerolu, 1 mM DTT, 200 µM PMSF oraz koktajl inhibitorów proteaz w stosunku 1:1 000). 
		UWAGA: tutaj i w innych miejscach zawsze dodawaj DTT, PMSF i koktajl inhibitorów proteaz do buforów bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
		<li>Immunoprecypituj białka z oznacznikiem FLAG z otrzymanego lizatu całokomórkowego, używając 20 µl żelu agarozowego anty-FLAG, a następnie przeanalizuj eluaty FLAG metodą western blottingu. [Szczegóły procedury immunoprecypitacji znajdują się w kroku 5.]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mrożone banki wybranych klonalnych linii komórkowych12 i przechowuj je w ciekłym azocie do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Hodowla linii komórkowych HEK293 w butelkach obrotowych
W celu wielkoskalowego otrzymywania kompleksów INO80 należy hodować komórki w 10 – 20 butelkach z wałkami; typowa wydajność z każdej butelki wynosi ~1 ml osadu komórkowego.
<ol>
	<li>Do każdej butelki walcowej dodać 200 ml DMEM, 5% glutaminy i 10% serum cielęcego, bez hygromycyny B.</li>
	<li>Przenieść wszystkie komórki z jednej naczyniowej szalki 15 cm o niemal pełnej konfluencji do każdej butelki walcowej.</li>
	<li>Umieścić butelki walcowe w inkubatorze do butelek walcowych w temperaturze 37 °C i obracać z prędkością 0,2 rpm.</li>
	<li>Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie ~70%, odlać i usunąć medium.</li>
	<li>Do każdej butelki dodać ~50 ml lodowatego PBS. Trzymając butelki poziomo, delikatnie zamieszać, aby poluzować monowarstwę komórek.</li>
	<li>Przenieść resuspenderowane komórki do plastikowych butelek stożkowych o pojemności 250 ml i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Przepłukać butelki walcowe dodatkowym PBS, przenosząc go sekwencyjnie z butelki do butelki. Gdy roztwór płuczący przestanie być przejrzysty (zazwyczaj po przepłukaniu około 5 butelek), dodać go do zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Z pelletować komórki poprzez wirowanie przy 400 x g przez 10 min.</li>
	<li>Delikatnie resuspenderować komórki w PBS, połączyć je w jednej butelce stożkowej 250 ml i przechowywać na lodzie do czasu dalszej obróbki.</li>
</ol>
3. siRNA-pośrednie wyciszanie podjednostek INO80 w komórkach wykazujących ekspresję innej podjednostki INO80 z tagiem FLAG
Aby uzyskać subkompleksy INO80 pozbawione pojedynczej podjednostki, należy zastosować immunopuryfikację FLAG w celu oczyszczenia kompleksów INO80 z komórek traktowanych siRNA lub komórek stabilnie wykazujących ekspresję shRNA. Opisany tutaj protokół „odwróconej” transfekcji siRNA (małych interferujących RNA) został zoptymalizowany dla komórek HEK293 hodowanych w naczyniach o średnicy 15 cm. Protokół przeznaczony jest dla jednego naczynia 15 cm z komórkami i powinien zostać odpowiednio przeskalowany w zależności od wymaganej liczby komórek. Aby przygotować ilości kompleksu INO80 użyteczne biochemicznie z komórek traktowanych siRNA, należy przeskalować hodowlę do 40 naczyń 15 cm; pozwoli to uzyskać około 2 - 4 ml zbitego osadu komórkowego.
<ol>
	<li>Hodować komórki HEK293 stabilnie wykazujące ekspresję pożądanej podjednostki kompleksu INO80 w naczyniach 15 cm do osiągnięcia niemal pełnej konfluencji.</li>
	<li>Do probówki zawierającej liofilizowane siRNA dodać objętość buforu do resuspensji siRNA (20 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7.5 oraz 0,2 mM MgCl2), wystarczającą do przygotowania roztworu zapasowego siRNA o stężeniu 50 µM. Kilkukrotnie pipetować roztwór i inkubować na nutatorze przez 30 min w RT, aby upewnić się, że siRNA jest całkowicie rozpuszczone.</li>
	<li>Przygotować koktajl do transfekcji zawierający siRNA i odczyn do transfekcji. Wymieszać 10 μl roztworu zapasowego siRNA 50 µM z 32 µl Lipofectamine RNAiMAX i dodać do 4 ml pożywki Opti-MEM Reduced Serum Medium, delikatnie mieszając; przed użyciem pozwolić wszystkim odczynnikom wyrównać temperaturę do RT.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w RT przez 30 min.</li>
	<li>Przygotować komórki Flp-In HEK293 stabilnie wykazujące ekspresję pożądanej podjednostki INO80 do transfekcji.
	<ol>
		<li>Podczas inkubacji z Kroku 3.4 raz przemyć komórki w naczyniach 15 cm przy użyciu PBS w RT.</li>
		<li>Po usunięciu PBS potraktować komórki 1 ml trypsyny, aż zaczną odrywać się od płytki.</li>
		<li>Natychmiast dodać 10 ml pożywki kompletnej (DMEM + 5% glutaminy + 10% FBS) do trypsynizowanych komórek i delikatnie wymieszać. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1 000 x g przez 5 min w RT.</li>
		<li>Resuspender osad komórkowy w ~4 ml pożywki kompletnej i policzyć komórki w resuspensji za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki pożywką kompletną do stężenia ~5,4 x 106/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do każdego naczynia 15 cm dodać 15 ml kompletnej pożywki hodowlanej, a następnie 4 ml koktajlu do transfekcji. Delikatnie zamieszać, aby pożywka i koktajl do transfekcji zostały dokładnie wymieszane. Na koniec dodać jeden ml zawiesiny komórkowej i ponownie delikatnie zamieszać, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Po 60 h hodowli w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2, delikatnie usunąć pożywkę, resuspender komórki w lodowatym PBS i niezwłocznie przystąpić do przygotowania ekstraktów jądrowych.</li>
</ol>
4. Przygotowanie ekstraktów jądrowych
Procedura ta została zmodyfikowana na podstawie protokołu Dignama13 i może być skalowana w górę lub w dół w zależności od wielkości początkowych pelletów komórkowych. Zazwyczaj 1 ml zwartego pelletu komórkowego pozwala uzyskać 1 ml końcowego ekstraktu jądrowego. Wszystkie bufory powinny być schłodzone w lodzie, a wszystkie etapy należy przeprowadzać w pomieszczeniu chłodniczym lub w lodzie, jeśli odpowiednie pomieszczenie chłodnicze nie jest dostępne.
<ol>
	<li>Izolacja jąder komórkowych:
	<ol>
		<li>Ostrożnie przenieść komórki do odpowiednio dobranej rozmiarowo (15 lub 50 ml) stożkowej probówki z podziałką i wirować przy 1 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i zmierzyć objętość osadu komórkowego. 1 ml osadu komórkowego odpowiada około 3 x 108 komórkom HEK293.</li>
		<li>Dodać 5 objętości osadu komórkowego Buforu A (10 mM HEPES, pH 7.9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl oraz świeżo dodane 1 mM DTT, 200 µM PMSF i koktajl inhibitorów proteaz w stosunku 1:1 000). Resuspendować osad komórkowy, delikatnie pipetując.</li>
		<li>Inkubować na lodzie przez dokładnie 10 min.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz.</li>
		<li>Objętość osadu komórkowego powinna wzrosnąć maksymalnie 2-krotnie podczas inkubacji w Buforze A.</li>
		<li>Resuspendować komórki w dwóch objętościach osadu komórkowego Buforu A i przenieść zawiesinę komórkową do odpowiednio dobranej rozmiarowo homogenizatorki Dounce. W przypadku objętości osadu komórkowego mniejszej niż 2 ml, należy użyć homogenizatora 7 ml; dla 2–4 ml osadu komórkowego – homogenizatora 15 ml, a dla 10 ml lub więcej – homogenizatora 40 ml.</li>
		<li>Homogenizować zawiesinę komórkową za pomocą LUŹNEGO szklanego tłoka homogenizatora Dounce, aż 90% komórek wykaże pozytywne barwienie 1% błękitem trypanowym.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę do 45 ml probówki do wirówki wysokich prędkości i wirować przy 25 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C w rotorze JA-17 lub podobnym (patrz Tabela materiałów/sprzętu).</li>
		<li>Z osadu jądrowego usunąć nadsącz, który zawiera białka cytozolowe lub białka wyciekające z jądra podczas frakcjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja jąder za pomocą soli:
	<ol>
		<li>Dodać Bufor C (20 mM HEPES, pH 7.9, 25% glicerolu, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA oraz świeżo dodane 1 mM DTT, 200 µM PMSF i koktajl inhibitorów proteaz w stosunku 1:1 000) do osadu jądrowego; należy użyć 2,5 ml Buforu C na każde 3 ml początkowej objętości osadu komórkowego (~1 x 109 komórek).</li>
		<li>Za pomocą szklanej rurki lub pipety oddzielić osad jądrowy od ścianki probówki i przenieść całą mieszaninę do odpowiednio dobranej rozmiarowo homogenizatorki Dounce.</li>
		<li>Resuspendować jądra, homogenizując mieszaninę dwoma ruchami LUŹNEGO tłoka.</li>
		<li>Przenieść resuspendowaną frakcję jądrową do schłodzonego zlewka. Wybrać taki zlewek, aby zawiesina wypełniała go na głębokość co najmniej 0,5 cm.</li>
		<li>Aby wyekstrahować białka jądrowe z chromatyny lub innych nierozpuszczalnych struktur, stopniowo zwiększyć stężenie soli w zawiesinie do 0,42 M NaCl poprzez kroplowe dodawanie 5 M NaCl, delikatnie mieszając zawiesinę pipetą lub szklaną rurką na lodzie; po dodaniu całego 5 M NaCl roztwór powinien stać się bardzo lepki lub żelowy. Obliczyć objętość 5 M NaCl potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 0,42 M NaCl zgodnie z następującym wzorem: 
		<img alt="Równanie dla stężenia NaCl; Objętość=początkowa objętość komórek+Bufor C krok 4.2.1/10,9; obliczenia chemiczne." fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Ostrożnie przenieść lepką zawiesinę do 10 ml probówek z poliwęglanu dla rotora typu 70.1 Ti (lub równoważnego) lub do 70 ml butelek z poliwęglanu dla rotora typu 45 Ti lub podobnego (patrz Tabela materiałów/sprzętu). Szczelnie zamknąć parafilmem w przypadku probówek 10 ml lub za pomocą zestawu nakrętek w przypadku butelek 70 ml.</li>
		<li>Powoli kołysać zamknięte probówki w temperaturze 4 °C przez 30 min przy użyciu nutatora.</li>
		<li>Wirować próbki w rotorze typu 45 Ti lub 70.1 Ti przez 30 min przy 120 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść nadsącz do jednej plastikowej probówki lub butelki. Nadsącz ten stanowi ekstrakt jądrowy, a osad zawiera chromatynę i inne szczątki jądrowe.</li>
		<li>Podzielić ekstrakt jądrowy na wygodne alikwoty, zamrozić go w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Oczyszczanie immunoafinicyjne ludzkiego kompleksu INO80 lub podkompleksów INO80
<ol>
	<li>Aby rozmrozić zamrożony ekstrakt jądrowy, należy umieścić probówki z ekstraktem na blacie laboratoryjnym lub toczyć je w dłoniach, aż zamrożony materiał zmieni się w zawiesinę. Następnie probówki należy umieścić w lodzie lub w chłodni do czasu całkowitego rozmrożenia ekstraktu.</li>
	<li>Rozmrożony ekstrakt jądrowy należy przenieść do poliwęglanowych probówek do ultrawirówki o pojemności 10 ml i wirować przy 100 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C w rotorze typu 70.1 Ti lub odpowiedniku, aby usunąć ewentualne wytrącone osady, które mogły powstać podczas cyklu zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Nadłoś należy przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Należy dodać świeży DTT, PMSF oraz koktajl inhibitorów proteaz do stężeń końcowych: 1 mM DTT, 200 µM PMSF oraz 1:1 000 koktajlu inhibitorów proteaz.</li>
	<li>W celu przygotowania agarozy anty-FLAG do immunopuryfikacji należy przenieść 200 µl 50% zawiesiny kulek agarozowych anty-FLAG do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, używając pipety P200 lub podobnej, z końcówką, której wierzchołek został odcięty czystym skalpelem lub żyletką.</li>
	<li>Kuleczki należy sfałdo-wać poprzez wirowanie w mikrowirówce stołowej przy 8 000 x g przez 30 s. Należy usunąć nadłoś i przemyć kuleczki, resuspendując je w 1 ml buforu Lys450, a następnie wirować przy 8 000 x g przez 30 s. Kuleczki należy przemyć jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Przemyte kuleczki agarozowe anty-FLAG należy resuspendować w około 100 µl ekstraktu jądrowego, używając pipety o regulowanym objętości P200 lub podobnej, z końcówką o odciętym wierzchołku, a następnie za pomocą tej samej końcówki przenieść resuspendowane kuleczki do stożkowej probówki 15 ml zawierającej ekstrakt. Czynność tę należy powtórzyć kilka razy, aż wszystkie kuleczki zostaną przeniesione do probówki 15 ml.</li>
	<li>Mieszaninę ekstraktu i kuleczek należy inkubować przez 4 h w temperaturze 4 °C przy powolnym obrocie na rotatorze laboratoryjnym. OPCJONALNIE: Można dodać benzonukleazę w stężeniu 25 jednostek/ml w celu usunięcia zanieczyszczającego DNA.</li>
	<li>Agarozę FLAG należy zebrać poprzez wirowanie przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Kuleczki należy resuspendować w 10 ml buforu Lys450 w celu przemycia, a następnie inkubować przez 5 min w temperaturze 4 °C przy delikatnym kołysaniu na nutatorze. Kuleczki należy wirować przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Kuleczki należy resuspendować w 100–150 µl buforu Lys450 i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Należy kontynuować płukanie probówki stożkowej 15 ml za pomocą 100–150 µl buforu Lys450, aż wszystkie kuleczki zostaną przeniesione do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Kuleczki należy wirować przy 8 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C w mikrowirówce. Należy przemyć je jeszcze trzy razy 1 ml buforu Lys450 oraz raz 1 ml buforu EB100 (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glicerolu, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,05% TritonX-100 oraz świeżo dodany 1 mM DTT, 200 µM PMSF i 1:1 000 koktajl inhibitorów proteaz).</li>
	<li>Aby eluować związane białka, należy dodać 200 µl buforu EB100 zawierającego 0,25 mg/ml peptyd FLAG 1x. Inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C na nutatorze.</li>
	<li>Kuleczki należy wirować przy 8 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C w mikrowirówce. Nadłoś zawierający eluowany kompleks INO80 należy przenieść do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Eluowanie należy powtórzyć jeszcze cztery razy, a wszystkie nadłośnie połączyć w jednej probówce.</li>
	<li>Aby usunąć resztkowe kuleczki agarozy FLAG z elowanej frakcji białkowej, należy przepuścić eluat przez pustą kolumnę wirową.</li>
	<li>Eluowaną frakcję białkową należy skoncentrować około 10-krotnie za pomocą ultrafiltru wirówkowego (próg odcięcia masy cząsteczkowej 50 000).</li>
	<li>W celu usunięcia peptydu FLAG należy przepuścić skoncentrowaną frakcję białkową sekwencyjnie przez dwie kolumny odsolankowe.</li>
	<li>Oczyszczoną i odsoloną frakcję białkową należy podzielić na alikwoty po 20 µl, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Skład podjednostkowy kompleksu INO80 lub podkompleksów INO80 należy przeanalizować na żelach barwionych srebrem lub metodą western blotting, a ich stężenia oszacować za pomocą półilościowego western blottingu, używając jako standardów preparatów rekombinowanych podjednostek INO80 o znanym stężeniu.</li>
</ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%2C+Annual+Review+of+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li>
<li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li>
<li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination%3A+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li>
<li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li>
<li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li>
<li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution%2C+Biotechniques%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li>
<li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badania strukturalne i funkcjonalne wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę ssaków z wyższych eukariontów były utrudnione przez trudności w przygotowaniu biochemicznie użytecznych ilości takich kompleksów zawierających zmutowane podjednostki lub całkowicie pozbawionych pewnych podjednostek. Istnieje szereg przeszkód technicznych: po pierwsze, manipulacja genetyczna w komórkach ssaków jest technicznie trudna i czasochłonna. W przeciwieństwie do komórek drożdży, których genom można łatwo edytować i cel...

Ewolucyjnie zachowane kompleksy przebudowujące chromatynę rodziny SNF2 są kluczowymi regulatorami organizacji chromatyny i dostępności DNA1. Te kompleksy remodelujące zawsze zawierają centralną podjednostkę ATPazy podobną do SNF2, która w niektórych przypadkach łączy się z różnymi białkami pomocniczymi i tworzy wielopodjednostkowe zespoły makromolekularne. Aby zbadać szczegóły molekularne procesu przebudowy chromatyny zależnego od ATP, ważne jest zrozumienie wkładu danych podzbiorów podjednostek i / lub struktur domenowych w aktywność kompleksów. Takie analizy wymagają zdolności do generowania wysoce oczyszczonych zmutowanych kompleksów, które nie mają określonych podjednostek białkowych lub struktur domenowych.
Poprzednie badania strukturalno-funkcyjne kompleksów remodelujących chromatynę zależne od ATP koncentrowały się głównie na systemie modelowym drożdży ze względu na wyższą podatność genomu drożdży na manipulację (zobacz na przykład odnośniki1-4). Biorąc pod uwagę zachowanie składu i funkcjonalności podjednostek wśród ortologicznych kompleksów przebudowujących, badania struktury i funkcji kompleksów przebudowujących drożdże dostarczyły ważnych informacji na temat ich odpowiedników u wyższych eukariontów. Niemniej jednak istnieją znaczne różnice specyficzne dla gatunku między kompleksami przebudowy, wynikające z przyrostu lub utraty podjednostek specyficznych dla gatunku, zysku lub utraty domen specyficznych dla gatunku podjednostek konserwatywnych oraz zmienności sekwencji w obrębie domen konserwatywnych podjednostek. Takie różnice mogą być w zasadzie spowodowane potrzebą przystosowania się wyższych komórek eukariotycznych do nowych środowisk molekularnych i komórkowych. Tak więc zrozumienie, w jaki sposób podjednostki wyższych eukariotycznych kompleksów remodelujących przyczyniają się do procesu przebudowy nukleosomów, jest cenne, ponieważ nie tylko rzuca światło na podstawowe mechanizmy procesu przebudowy chromatyny zależnej od ATP, ale także może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów, za pomocą których regulowana jest struktura chromatyny i ekspresja genów u wyższych eukariontów.
Do tej pory przeprowadzono tylko ograniczone badania strukturalne i funkcjonalne wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę u ssaków, częściowo ze względu na trudności w uzyskaniu biochemicznie zdefiniowanych kompleksów i podkompleksów przebudowujących chromatynę. Częściowo ominęliśmy te trudności za pomocą procedur opisanych poniżej, w których oczyszczanie powinowactwa immunologicznego stosuje się do przygotowania nienaruszonych podkompleksów INO80 lub INO80 z komórek ludzkich stabilnie eksprymujących N-końcowy epitop FLAG oznaczony typem dzikim lub zmutowanymi wersjami Ino805-7 (Figura 1). Aby uzyskać nienaruszone kompleksy INO80 z komórek ludzkich, rekombinację za pośrednictwem Flp stosuje się do generowania transgenicznych linii komórkowych HEK293 stabilnie eksprymujących cDNA znakowane epitopem FLAG kodujące podjednostki kompleksu INO808-10. Ponieważ nadmierna ekspresja podjednostek INO80 może być nieco toksyczna, konieczne jest wyizolowanie i utrzymanie klonalnych linii komórkowych w selektywnych warunkach, aby zapewnić stabilną ekspresję transgenu podczas wielu pasaży potrzebnych do ekspansji hodowli komórkowych na dużą skalę. Aby uzyskać mniejsze podkompleksy INO80, które zawierają tylko podzbiór podjednostek, z powodzeniem zastosowaliśmy dwa podejścia (Rysunek 2A,B). W pierwszym generujemy linie komórkowe HEK293 Flp-In stabilnie eksprymujące zmutowane wersje Ino80, które nie mają domen wymaganych do interakcji z określonymi podjednostkami5. Alternatywnie, knockdown za pośrednictwem siRNA jest stosowany do zubożenia pożądanej podjednostki z komórek wyrażających odpowiednią podjednostkę INO80 oznaczoną FLAG (dane niepublikowane). Wreszcie, w celu oczyszczenia ludzkich kompleksów INO80, chromatografię na bazie agarozy11 FLAG stosuje się do wzbogacenia frakcji zawierającej INO80 z ekstraktów jądrowych, skutecznie zmniejszając w ten sposób obecność zanieczyszczających białek cytozolowych w końcowej frakcji zawierającej oczyszczone podkompleksy INO80 lub INO80.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I (stabilizowana glutamina)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>SAFC</td><td>12176C</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE6</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B, sterylna w PBS</td><td>AG Scientific</td><td>H-1012-PBS</td><td></td></tr><tr><td>Wektor pcDNA5/FRT</td><td>Life Technologies</td><td>V6010-20</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In HEK293 komórki</td><td>Life Technologies</td><td>R780-07</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 Wektor ekspresji rekombinazy Flp</td><td>Life Technologies</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>EZview Czerwona surowica cielęca ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SAFC</td><td>12138C</td><td></td></tr><tr><td>TARGETplus Basen SMARTsiRNA</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor do zawieszania siRNA</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>#B-002000-UB-100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowana surowica Technologie o średniej</td><td>żywotności</td><td>51985-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>45000</td><td>VWR</td></tr><tr><td>TrypLE (trypsyna)</td><td>Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>1x FLAG Peptide</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do chromatografii mikro biospinowej</td><td>Bio-Rad</td><td>737-5021</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra (50k MWCO)</td><td>Amicon</td><td>UFC805024</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-FLAG M2, mysie</td><td>przeciwciało Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2, królik</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>benzonaza</td><td>Novagen</td><td>70664</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Wyposażenie</td></tr><tr><td>Wirnik JS-4.2 w wirówce J6</td><td>Wirnik Beckman-Coulter</td><td>339080</td><td></td></tr><tr><td>JA-17</td><td>Rurki poliwęglanowe Beckman-Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Butelki z poliwęglanu</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>70 ml Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Typ 45 Ti</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Typ 70.1 Ti Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Mieszalnik nutatorów</td><td>BD Diagnostyka</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>Rotator probówek/fiolek VWR Glas-Col</td><td>Glas-Col</td><td>099A RD4512</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler do PCR Inkubator do butelek rolkowych PTC 200</td><td></td><td></td><td>MJ Bellco</td></tr><tr><td></td><td>biotechnology</td><td>353348</td><td></td></tr><tr><td>Membrana transferowa Immobilon-FL 7 x 8,4</td><td>miliporów</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>smarowane probówki</td> <td>do mikrowirówek 1,5 mlGwiazda</td><td>3207</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę ino80

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Kompleksy przebudowujące chromatynę INO80 regulują dynamikę nukleosomów i dostępność DNA poprzez katalizowanie zależnej od ATP przebudowy nukleosomów. Ludzkie kompleksy INO80 składają się z 14 podjednostek białkowych, w tym Ino80, ATPazy podobnej do SNF2, która służy zarówno jako podjednostka katalityczna, jak i rusztowanie do składania kompleksów. Funkcje innych podjednostek i mechanizmy, za pomocą których przyczyniają się one do aktywności remodelującej chromatynę kompleksu INO80, pozostają słabo poznane, częściowo ze względu na wyzwanie generowania podzespołów INO80 w komórkach ludzkich lub heterologicznych systemach ekspresji. Ten protokół JOVE opisuje procedurę, która umożliwia oczyszczanie ludzkich podkompleksów przebudowujących chromatynę INO80, które nie mają podjednostki lub podzbioru podjednostek. N-końcowe cDNA Ino80 znakowane epitopem FLAG są stabilnie wprowadzane do linii komórkowych ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) 293 za pomocą rekombinacji za pośrednictwem Flp. W przypadku, gdy podzbiór podjednostek kompleksu INO80 ma zostać usunięty, zamiast tego ulega ekspresji zmutowanych białek Ino80, które nie mają platformy potrzebnej do złożenia tych podjednostek. W przypadku, gdy pojedyncza podjednostka ma zostać uszczuplona, transfekuje siRNA ukierunkowane na tę podjednostkę do linii komórkowej HEK 293 stabilnie eksprymującej ATPazę Ino80 znakowaną FLAG. Przygotowuje się ekstrakty jądrowe i przeprowadza się immunoprecypitację flagi w celu wzbogacenia frakcji białkowych zawierających pochodne Ino80. Skład oczyszczonych podkompleksów INO80 można następnie analizować przy użyciu metod takich jak immunoblotting, barwienie srebrem i spektrometria mas. Podkompleksy INO80 i INO80 wygenerowane zgodnie z tym protokołem mogą być dalej analizowane za pomocą różnych testów biochemicznych, które są opisane w dołączonym protokole JOVE. Opisane tutaj metody można zaadaptować do badań właściwości strukturalnych i funkcjonalnych dowolnych kompleksów przebudowujących i modyfikujących chromatynę wielopodjednostkową u ssaków.

Rycina 1 przedstawia schemat blokowy podsumowujący procedury wykorzystane do generowania, oczyszczania i charakteryzacji ludzkich kompleksów przebudowy chromatyny zależnych od ATP INO80.
Jak pokazano na rysunkach 2 i 3, procedury te umożliwiają generowanie zarówno kompleksu INO80 typu dzikiego, jak i subkompleksów INO80 pozbawionych różnych podjednostek, co pozwala na późniejsze analizy biochemiczne w celu określenia roli brakujących podjednos...

Ten protokół opisuje procedurę generowania i oczyszczania dzikich i zmutowanych wersji ludzkiego kompleksu przebudowującego chromatynę INO80. Oznakowane epitopami wersje podjednostek INO80 ulegają stabilnej ekspresji w komórkach HEK293, a kompletne kompleksy i kompleksy pozbawione określonych zestawów podjednostek są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa immunologicznego.

Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Celem niniejszej procedury jest wytworzenie i oczyszczenie wersji dzikiego typu oraz mutantów wielopodjednostkowego kompleksu przebudowy chromatyny NO80. Jest to osiągane poprzez wstępną izolację jąder z komórek ekspresyjących białka NO80 z oznakowaniem epitopem Flag. W drugim kroku przygotowuje się ekstrakty jądrowe, a następnie oczyszcza kompleksy przebudowy chromatyny NO80 człowieka (typu dzikiego lub mutanty) za pomocą chromatografii powinowactwa Anti-Flag. Ostatecznie skład podjednostek oczyszczonych kompleksów NO80 można przeanalizować za pomocą western blotu lub barwienia srebrem.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób podjednostki wielobiałkowych kompleksów przebudowy chromatyny wpływają na ich ogólną aktywność. Metoda ta została zaprojektowana specjalnie do badania wersji typu dzikiego oraz mutantów kompleksu przebudowy chromatyny NO 80, ale może być również stosowana do badania innych wielopodjednostkowych kompleksów jądrowych, takich jak mediator.Najbardziej krytycznym etapem procedury jest ekstrakcja jąder komórkowych. Często pojawiają się problemy, ponieważ podczas etapu ekstrakcji solnej sól jest dodawana zbyt szybko lub zbyt gwałtownie. Po hodowli w butelkach z rolkami przenieść komórki HEC 2 9 3 do odpowiednio dobranej miarowej probówki stożkowej i odwirować przez 10 minut przy 1000 ×g w temperaturze 4 °C. Po usunięciu nadsączu zmierzyć objętość osadu komórkowego, a następnie zawiesić osad w pięciokrotnej objętości osadu komórkowego buforu A, delikatnie pipetując, i inkubować komórki na lodzie dokładnie przez 10 minut.Po ponownym odwirowaniu komórek, zmierz osad komórkowy po raz drugi; jego objętość powinna zwiększyć się nawet dwukrotnie. Tym razem resuspenduj komórki w objętości buforu A odpowiadającej dwukrotnej objętości osadu, a następnie przenieś zawiesinę do homogenizatora tkankowego o odpowiedniej wielkości i homogenizuj zawiesinę za pomocą szklanego tłuczka do momentu, aż 90% komórek wykaże pozytywne barwienie błękitem trypanu. Odwiruj zhomogenizowane komórki w 45 ml probówce do wirówki wysokich obrotów przez 20 minut przy 25 000 ×g i 4 °C w rotorze kątowym. Następnie usuń nadsącz zawierający białka cytozolowe z osadu jądrowego, aby przystąpić do ekstrakcji jąder za pomocą soli.Następnie dodać do osadu 2,5 ml buforu C na każde trzy ml początkowej objętości upakowanych komórek. Następnie, używając pipety serologicznej, odczepić osad od ścianki probówki i przenieść całą mieszaninę do homogenizatora tłuczka o odpowiednim rozmiarze. Zhomogenizować mieszaninę dwoma ruchami luźnego tłuczka w celu resuspensji jąder, a następnie przenieść resuspensowaną frakcję jądrową do schłodzonego zlewka o takim rozmiarze, aby zawiesina wypełniła go na głębokość co najmniej 0,5 cm.Następnie, oblicz objętość pięciomolarnego chlorku sodu potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 0,42 M chlorku sodu zgodnie z poniższym wzorem. Teraz stopniowo dodawaj obliczoną objętość roztworu soli kropla po kropli, delikatnie mieszając zawiesinę szklaną rurką w lodzie, aby zwiększyć stężenie soli w zawiesinie, aż do dodania całego chlorku sodu i momentu, gdy roztwór stanie się bardzo lepki. Następnie ostrożnie przelej lepką zawiesinę do probówek poliwęglanowych o pojemności 70 ml w rotorze typu TI 45 z zestawem nakrętek i użyj miksatora, aby powoli kołysać zamkniętymi probówkami w temperaturze 4 °C. Po 30 minutach poddaj próbki ultrawirówce w rotorze TI 45 przez 30 minut przy 40 000 ×g i w temperaturze 4 °C, a następnie przelej nadsącz zawierający ekstrakt jądrowy do jednego plastikowego pojemnika.Następnie należy podzielić roztwór ekstraktu jądrowego na odpowiedniej wielkości alikwoty, zamrozić je gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby przygotować kuleczki Anti-Flag aros do immunopuryfikacji, należy za pomocą pipety 200 µL z odciętą końcówką przenieść 200 µL 50% zawiesiny kuleczek Anti-Flag aros do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wstępnie przemyte kuleczki należy przenieść do probówki stożkowej zawierającej 10 ml świeżo rozmrożonego ekstraktu jądrowego, inkubować przez 4 godziny w temperaturze 4 °C przy powolnym obracaniu na rotatorze laboratoryjnym, a następnie zebrać kuleczki flag aros poprzez wirowanie przez 5 minut przy 1000 ×g i 4 °C.Następnie przemyć ekstrakt z kulek P w 10 mililitrach buforu lysis 4-50 przez pięć minut w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc na rotatorze. Po odwirowaniu mieszaniny ekstraktu z kulek, powtórz czynność. Zawiesić osad w 100 do 150 mikrolitrów świeżego buforu lysis 4-50, a następnie przenieść kuleki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.Należy kontynuować płukanie stożkowej probówki 15 ml za pomocą 100 do 150 µl Lysol 50, aż wszystkie kuleczki zostaną przeniesione do probówki do mikrowirówki. Po odwirowaniu kuleczków w mikrowirówce, należy przemyć je trzykrotnie 1 ml Lysol 50 oraz raz 1 ml buforu EB 100. Następnie, aby eluować związane białka, należy dodać 200 µl buforu EB 100 zawierającego peptyd flag i inkubować próbkę w temperaturze 4 °C na statywie.Po pół godzinie odwiruj kuleczki w mikrocentryfudze, a następnie przenieś nadsącz zawierający elowany kompleks OAC C do nowej probówki do mikrocentryfugi. Po powtórzeniu elucji jeszcze cztery razy, przepuść zebrany eluat przez pustą kolumnę wirówkową, aby usunąć pozostałe kuleczki flag-aero z frakcji białkowej. Na koniec użyj urządzenia do ultrafiltracji odśrodkowej z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 50 000, aby skoncentrować eluowaną frakcję białkową około 10-krotnie.Jak pokazano na tej rycini, czystość kompleksów NO 80 przygotowanych z użyciem wskazanych podjednostek z etykietą flag, tak jak właśnie zademonstrowano, można ocenić za pomocą żeli SDS-PAGE barwionych srebrem. Wszelkie białka pojawiające się na tej ścieżce kontrolnej są zanieczyszczeniami, które wiążą się niespecyficznie z flag aeros. Te etykiety wskazują prążki odpowiadające testowanym podjednostkom NO 80, a te wskazują mobilność markerów masy cząsteczkowej.Położenie typu dzikiego NO 80 jest zaznaczone czarnym kwadratem, a położenia mutantów NO 80 są zaznaczone pustymi kółkami. Ścieżki oddzielone czarną linią pochodzą z osobnych żeli. Skład kompleksów można ocenić za pomocą analizy Western blot z użyciem przeciwciał przeciwko różnym podjednostkom NO 80.Na przykład, oceniono podjednostki modułu domeny końcowej, modułu powiązanego z centrum helikazy oraz modułu SNF2. Po opanowaniu tej techniki cały proces może zostać ukończony w ciągu jednego dnia, począwszy od zbioru komórek, a kończąc na oczyszczaniu kompleksów.Technika ta pozwoli badaczom na oczyszczanie wielopodjednostkowych kompleksów oraz subkompleksów z komórek ssaków w celu zbadania ich funkcji. Po obejrzeniu tego filmu lepiej zrozumieją Państwo sposób oczyszczania kompleksów remodelujących chromatynę oraz innych wielopodjednostkowych kompleksów białkowych z ludzkich linii komórkowych lub innych linii komórkowych ssaków.

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelacji chromatyny INO80

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania dynamicznych zmian w matrycy chromatyny, które regulują transkrypcję indukowaną przez szlak przekazywania sygnału.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Tutaj opisujemy testy biochemiczne, które mogą być użyte do scharakteryzowania zależnych od ATP enzymów przebudowujących chromatynę pod kątem ich zdolności do 1) katalizowania przesuwania się nukleosomów zależnych od ATP, 2) angażowania się w substraty nukleosomów i 3) hydrolizy ATP w sposób zależny od nukleosomu lub DNA.

Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Protokół ten opisuje procedury przeprowadzania imunoprecipitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP) w celu identyfikacji białek i RNA związanych z określonym regionem genomu.

Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający osiągnąć rozdzielczość oddziaływań białko-DNA w pobliżu par zasad. Uzyskuje się to poprzez traktowanie egzonukleazą fragmentów DNA selektywnie wzbogaconych przez immunoprecypitację chromatyny (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości.

Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.

Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę wytwarzania i oczyszczania ludzkich kompleksów INO80 z komórek HEK293 przy użyciu chromatografii immunoafinitycznej. Technika ta umożliwia analizę składu podjednostek i badanie mechanizmów remodelowania chromatyny.

Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

Przeglądaj więcej filmów