Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

Celem poniższej procedury jest pomiar różnych aktywności biochemicznych zależnych od TP kompleksów przebudowujących chromatynę. Osiąga się to poprzez pomiar zależnego od TP przesuwania się pozycji nukleosomu z jednego końca cząsteczki DNA do bardziej centralnej pozycji na DNA za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej lub emsa. Podobną metodę opartą na EMSA można zastosować do monitorowania tworzenia stref mononukleo związanych z kompleksem remodelującym w celu oceny aktywności wiązania nukleosomów kompleksów przebudowujących chromatynę.

Dodatkowo, chromatografia cienkowarstwowa może być stosowana do pomiaru aktywności APA kompleksów remodelujących chromatynę zależnych od TP. Ostatecznie metody te mogą być wykorzystane do pomiaru zależnej od TP przebudowy chromatyny u człowieka w kompleksach O 80. W tym filmie zademonstrujemy testy biochemiczne badające kompleksy przebudowy chromatyny NO 80.

Podobną metodę można również zastosować do badania innych kompleksów przebudowy chromatyny, aby przeprowadzić test przebudowy nukleosomów zależny od TP. Najpierw przygotuj substraty nukleosomów po ustawieniu 100 mikrolitrowej reakcji PCR, jak opisano w tabeli. Przeprowadź reakcje PCR w termocyklerze, a następnie dwukrotnie przepuść produkty reakcji przez kolumny o swobodnym spinie nukleazy, aby usunąć wszelkie niewłączone nukleotydy.

Następnie wymieszaj dwa ole P 32 znakowane 6 0 1 fragmentów DNA z sześcioma mikrogramami nukleosomów wnęki w 50 mikrolitrach buforu i inkubuj mieszaninę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie kolejno rozcieńczyć mieszaninę do 0,8 molowego, 0,6 molowego i 0,4 molowego chlorku sodu przez dodanie odpowiednio 12,5 mikrolitra, 20,8 mikrolitra i 41,6 mikrolitra roztworu buforowego tris HCL uzupełnionego E-D-T-A-P-M-S-F i inkubować DTT przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza po każdym dodaniu, po ostatniej inkubacji w 125, a następnie 250 mikrolitrów buforu tris chlorowodorku. Dalej uzupełnione niezadłużonym glicerolem P 40 i PSA w dwóch kolejnych, 30-minutowych rozcieńczeniach w 30 stopniach Celsjusza odpowiednio do 0,2 mola i 0,1 mola chlorku sodu.

Następnie przechowuj substrat mononukleosomowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy przed ustawieniem testów odlanych z natywnych żeli poliakrylamidowych. Następnie dla każdej reakcji, która ma być przeprowadzona, połącz około 20 nanomoli w oh 80 z odpowiednią ilością buforu EB 100 wystarczającą do uzyskania objętości 4,75 mikrolitra we wstępnie schłodzonym silikonizowanym. 1,5 mililitrowa mikroprobówka wirówkowa natychmiast ponownie zamrozić wszelkie pozostałe frakcje zawierające NO 80, imp sproszkowany suchy lód.

Następnie dozuj 5,25 mikrolitra świeżo przygotowanego koktajlu głównego do każdej probówki reakcyjnej, dobrze mieszając, pipetując w górę iw dół. Następnie inkubuj reakcje w bloku grzewczym o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 1,5 mikrolitra świeżo przygotowanej mieszanki usuwającej do każdej probówki, aby zakończyć reakcje, a następnie wymieszać każdą probówkę reakcyjną.

Dobrze je odwiruj i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez kolejne 30 minut. W międzyczasie uruchom natywny żel poliakryloamidowy w pionowej jednostce elektroforezy o napięciu 100 woltów przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza, używając 0,5 XTBE jako bufora roboczego z magnetycznym prętem mieszającym wewnątrz dolnej komory, aby utrzymać stałą cyrkulację bufora pod koniec inkubacji z usuwającą mieszanką, wymieszać 2,5 mikrolitra matrycy ładującej z każdą reakcją. A po krótkim wirowaniu użyj końcówek ładujących, aby załadować próbki na żel.

Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 4,5 godziny w czterech stopniach Celsjusza z cyrkulacją buforową. Następnie przenieś żel na stos dwóch arkuszy bibuły filtracyjnej i upuść filtry bibuły z żelem na wierzchu, używając przezroczystej folii plastikowej, aby wykryć sygnał. Wystaw żel na ekran fosfonowy do przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez żądany czas, a następnie zeskanuj ekran za pomocą systemu skanera obrazowania izotopowego i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do wykonania testów APA zależnych od DNA i nukleosomów.

Rozpocząć od połączenia od 10 do 50 nanomolowych podkompleksów oczyszczonych immunologicznie z ilością buforu eeb 100 wystarczającą do uzyskania objętości 2,2 mikrolitra w jednej wstępnie schłodzonej, nasmarowanej 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej na każdą reakcję, a następnie natychmiast ponownie zamrozić wszelkie frakcje zawierające NO 80 w sproszkowanym suchym lodzie. Następnie delikatnie wymieszaj 2,8 mikrolitra świeżo przygotowanego subkoktajlu zawierającego nukleosomy DNA lub żadne z nich z probówkami reakcyjnymi zawierającymi enzymy z pipetowaniem w górę iw dół i przenieś probówki do bloku grzewczego o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie za pomocą ołówka narysuj bardzo jasną linię co najmniej 1,5 centymetra od dolnej krawędzi polietylenu o wymiarach 20 na 10.

Mam na myśli chromatografię cienkowarstwową lub płytkę TLC. Następnie umieść 0,5 mikrolitra każdej mieszaniny reakcyjnej na linii w 5, 15, 30 i 60 minutach po inkubacji, natychmiast zwracając każdą próbkę do bloku grzewczego, dzięki czemu można pobrać wiele punktów czasowych z jednej probówki. Po nałożeniu ostatniej próbki należy wysuszyć płytkę za pomocą suszarki do włosów, a następnie przenieść płytkę do szklanej komory zawierającej wystarczającą ilość wody.

0,375 molowego fosforanu potasu, aby umożliwić zanurzenie dolnych 0,5 centymetra płytki TLC w roztworze. Przykryj komorę i rozwijaj reakcję, aż czoło fazy ciekłej osiągnie górną część płytki TLC, w którym to momencie płytkę należy natychmiast wysuszyć i wystawić na działanie sita fosfonowego do przechowywania w temperaturze pokojowej. Na koniec zeskanuj ekran za pomocą systemu skanera do obrazowania izotopowego, aby określić ilość radioaktywnej substancji chemicznej, substratu TP i produktu DP.

Ten pierwszy eksperyment pokazuje, że kompleks jest oczyszczany przez flagę IES dwie flagi, N-O-A-T-E i flagę NO 80 delta N mają podobne działania ślizgowe nukleosomów, co wskazuje, że koniec NO 80 N i / lub związane z nim podjednostki są zbędne do przebudowy nukleosomów przez kompleks NO 80. W przeciwieństwie do tego, kompleks jest oczyszczany przez flagę NO 80 delta n delta HSA są nieaktywne w tym teście, co wskazuje, że aktywność remodelingowa zależy od domeny HSA NO 80 APA i / lub powiązanych z nimi podjednostek. Korzystając z modyfikacji procedury testu ślizgowego NUCLEOSOME, można zmierzyć aktywność wiązania nukleosomów przez kompleksy przebudowujące chromatynę.

W tym eksperymencie inkubacja nukleosomów z rosnącą ilością nienaruszonych kompleksów NO 80 oczyszczonych przez podjednostkę NO 80 E doprowadziła do zależnego od dawki zaniku pasma odpowiadającego wolnym strefom mononukleo i pojawienia się nowego przesuniętego gatunku, który migrował w pobliżu górnej części żelu. W przeciwieństwie do tego, podczas gdy nukleosomy inkubowano z mniejszymi kompleksami, które zostały oczyszczone przez NO 80 delta N i które nie miały podzbioru podjednostek NO 80, przesunięte gatunki migrowały szybciej, co sugeruje, że względna ruchliwość super przesuniętego pasma zależy od wielkości testu kompleksów. W tym ostatnim eksperymencie przedstawiono wyniki testu porównującego aktywność APA aktywowanych DNA i NUKLEOSOMAMI dwóch różnych podkompleksów NO 80.

Wolniej migrujące plamki odpowiadają początkowemu alfa 32 P oznaczonemu jako TP, a szybciej migrujące gatunki są produktami reakcji A DP z obszarami wskazującymi kierunek migracji rozpuszczalnika. Podczas korzystania z tych procedur należy pamiętać o wykonywaniu testów, które różnią się długością i zawierają różne stężenia enzymu. Zapewni to, że pomiary są wykonywane, gdy krzywe czasu produktu i odpowiedzi na dawkę są liniowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować wiązanie nukleosomów w TPA i poślizg nukleosomów w oczyszczonych kompleksach przebudowujących chromatynę. Nie zapominaj, że praca z materiałami radioaktywnymi może być niebezpieczna. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i ochrony oczu, monitorowanie pod kątem skażenia radioaktywnego i właściwe usuwanie odpadów radioaktywnych.