Name: Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Naucz się izolacji pierwotnych kultur neuronów dopaminergicznych z mezencefalonu myszy embrionalnej. Ta metoda umożliwia badanie wrażliwości neuronów na stres w kontekście choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wspierane przez granty z CNRS i INSERM. Premier dziękuje za wsparcie ze strony Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC dziękuje za wsparcie ze strony Fondation de France.

Myszy użyte w tej pracy były pod opieką i traktowane zgodnie z wytycznymi Rady Unii Europejskiej (86/609/UE) dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie wymaganych rozwiązań
<ol>
	<li>Roztwory podstawowe
	<ol>
		<li>10x roztwór poli-L-ornityny (PLO): odważyć 10 mg bromowodorku PLO (masa cząsteczkowa = 30 000-70 000) i rozpuścić w 70 ml sterylnej wody. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>30% roztwór glukozy: odważyć 30 g D(+)-glukozy i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>5x Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych Szynka F-12: odważyć 6 g proszku z szynki DMEM/F-12 i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podsycić i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>7,5% roztwór wodorowęglanu sodu (NaHCO3): odważyć 7,5 g NaHCO3 i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>1 M roztwór HEPES: Odważyć 23,8 g HEPES i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>70% (v/v) Etanol: Rozcieńczyć 70 ml absolutnego etanolu w 30 ml sterylnej wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z glukozą i antybiotykami (PBS-GAB): dodać 10 ml 30% roztworu glukozy i 5 ml roztworu penicyliny i streptomycyny do 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami firmy Dulbecco. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inaktywowana płodowa surowica bydlęca (iFBS): Rozmrażać surowicę bydlęcą przez noc w temperaturze 4 °C i inaktywować w temperaturze 56 °C przez 30 min. Podwielokrotność porcji do 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Pożywka hodowlana: W sterylnej wodzie wymieszać kolejno 40 ml 5x DMEM/F12-Ham, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml 200 mM L-glutaminy, 2 ml penicyliny-streptomycyny, 4 ml 30% glukozy i 3 ml 7,5%NaHCO3 do końcowej objętości 180 ml. Przefiltrować i zużyć tego samego dnia.</li>
	<li>Mieszanka hormonów
	<ol>
		<li>Przygotować 180 ml pożywki hodowlanej. W tym podłożu rozpuścić 200 mg apo-transferyny.</li>
		<li>Odważyć 50 mg insuliny i rozpuścić w 2 ml 0,1 M HCl. Powoli dodawać 8 ml sterylnej wody, delikatnie mieszając. Rozcieńczyć ten roztwór w pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Odważyć 19,3 mg dichlorowodorku putrescyny i rozpuścić w 10 ml sterylnej wody. Dodać 10 ml roztworu do mieszanki hormonalnej.</li>
		<li>Przygotować 3 mM roztwór seleninu sodu w sterylnej wodzie i 2 mM roztwór progesteronu w absolutnym etanolu. Dodaj 20 μl każdego roztworu do mieszanki hormonalnej.</li>
		<li>Przefiltrować mieszaninę hormonów, porcjować do 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek i instrumentów hodowlanych
<ol>
	<li>Powlekanie płytek hodowlanych FBS: Dzień przed sekcją należy przygotować 180 ml pożywki hodowlanej. Dodać 10 ml iFBS do 90 ml pożywki hodowlanej. Dodać 300 μl/basenik pożywki hodowlanej/10% iFBS do wstępnie pokrytych poli-D-lizyną 24-dołkowych płytek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Pozostałe podłoża (z iFBS lub bez) przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wysterylizuj narzędzia i pipety Pasteura. Zbierz sprzęt wymieniony w tabeli materiałów, a także okap z przepływem laminarnym klasy II i inkubator CO2 .</li>
</ol>
3. Sekcja Mesencephalon myszy
<ol>
	<li>Złóż w ofierze ciężarną mysz E13.5 (zgodnie z wytycznymi instytucji). Oczyść brzuch myszy 70% etanolem i otwórz ścianę brzucha. Zbierz rogi macicy, otwórz je delikatnymi nożyczkami, wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy i usuń błony owodniowe. Umieścić zarodki na szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej sterylny PBS-GAB i umyć je przez przeniesienie w 3 kolejnych identycznych kąpielach za pomocą kleszczy. W celu przeprowadzenia sekcji należy umieścić zarodki w proporcjach 3 na sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Przesuń ostatnią szalkę Petriego pod mikroskop stereoskopowy. Nie ścinaj głów zarodków. Za pomocą nożyczek Vannas wytnij mózgi.
	<ol>
		<li>Ostrożnie usuń i wyrzuć przed- i tylne obszary mózgu. Po stronie rostralnej przeciętej blisko obszaru wzgórza, po stronie ogonowej przeciętej w okolicy przesmyku, usuń górny wzgórek.</li>
		<li>Po odizolowaniu brzusznego śródmózgowia ostrożnie usuń opony mózgowe za pomocą ultracienkich kleszczy. Zebrać wypreparowane segmenty, bez opon mózgowych, do sterylnej probówki o pojemności 13 ml wypełnionej PBS-GAB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść rurkę zawierającą śródmózgowie dokładnie 70% etanolem i umieść ją pod maską.</li>
</ol>
4. Dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Przemyć śródmózgowie 3x sterylnym PBS-GAB. Pozwól, aby fragmenty mózgu osiadły między każdym myciem i unikaj uszkodzenia tkanki. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usunąć jak najwięcej roztworu i inkubować segmenty mózgu w 3 ml trypsyny/EDTA przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Wypoleruj pipety Pasteura na gorąco, aby zmaksymalizować przeżycie neuronów, ponieważ końcówka pipety z niepolerowanego szkła jest ostra i może uszkodzić komórki podczas etapów dysocjacji. Nieznacznie zmniejsz średnicę końcówki (do 0,5 mm) pipety Pasteura podczas polerowania ogniowego.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć jak najwięcej roztworu trypsyny/EDTA i dodać 10 ml pożywki hodowlanej/10% iFBS. Umyj segmenty mózgu 3x pożywką hodowlaną/10% iFBS.</li>
	<li>Za pomocą wypolerowanej na gorąco pipety Pasteura rozpocząć dysocjację śródmózgowia w 6 ml pożywki hodowlanej/10% iFBS. Rozcierać 10x (unikać pęcherzyków powietrza), pozostawić kawałki do osiadania, a następnie zebrać pożywkę do nowej sterylnej probówki o pojemności 13 ml.</li>
	<li>Dodać 6 ml pożywki hodowlanej, powtórzyć poprzedni krok raz i zebrać pożywkę zawierającą zdysocjowane komórki w tej samej probówce o pojemności 13 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki w stężeniu 160 g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% mieszanką hormonów.</li>
</ol>
5. Poszycie komórek
<ol>
	<li>Policz komórki w zawiesinie w komórce Malasseza i dostosuj objętość pożywki do stężenia 600 000 komórek/ml. Z jednego śródmózgowia myszy można uzyskać około 1 700 000 komórek.</li>
	<li>Usuń pożywkę powlekającą zawierającą FBS z płytek 24-dołkowych i dodaj do każdej studzienki 1 ml zawiesiny komórek (600 000 komórek / studzienkę, 2-4% komórek TH+).</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2/95% powietrza. Nie jest konieczna żadna zmiana medium. Neurony dopaminergiczne osiągają dojrzałość po około 5-7 dniach in vitro (stała ekspresja transportera dopaminy). Utrzymuj komórki w hodowli do 15 dni bez wymiany pożywki.</li>
</ol>
6. Protokół immunofluorescencji
<ol>
	<li>Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Dzień przed rozbioru dodać 10 ml 1 M HCl do szalki Petriego. Połóż na powierzchni płynu 12-15 szklanych szkiełek nakrywkowych i odczekaj 15 minut.</li>
		<li>Zanurz szkiełko nakrywkowe w płynie i odczekaj 15 minut.</li>
		<li>Usuń HCl i przemyj 3x wodą.</li>
		<li>Szybko umyj szkiełka nakrywkowe czystym etanolem raz, a następnie dodaj czysty etanol do naczynia i odczekaj 30 minut.</li>
		<li>Pod maską usuń oczyszczone szkiełka nakrywkowe z etanolu i dodaj 1 szkiełko nakrywkowe na dołek 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej za pomocą wysterylizowanych kleszczy.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe umyć dwukrotnie sterylną wodą (1 ml/studzienkę). Następnie umyj je raz sterylnym PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Usunąć PBS i dodać 500 μl/basenik 2x PLO (rozcieńczony w PBS). Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
		<li>Usuń roztwór PLO i przemyj 3x sterylnym PBS.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 500 μl/basenik 20% iFBS/1 g/ml Lamininy. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie komórek w celu immunofluorescencji
	<ol>
		<li>Usunąć podłoże powlekające z płytek 12-dołkowych.</li>
		<li>Dodać 900 000 komórek/studzienkę w objętości 2 ml i hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Komórki mogą być trzymane w hodowli do 15 dni bez wymiany pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne
	<ol>
		<li>Usunąć podłoże z płytek 12-dołkowych i przemyć 500 μl/studzienkę DMEM podgrzanym w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 500 μl/basenik DMEM podgrzanego w temperaturze 37 °C, następnie delikatnie dodać 160 μl/studzienkę 8% paraformaldehydu (PFA, 2% stężenie końcowe) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usunąć PFA i przemyć 3x PBS/0,1 M glicyną przez 10 min.</li>
		<li>Usunąć PBS, dodać 300 μl/studzienkę PBS/0,05% Triton X-100/20% surowicy koziej i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć pożywkę, dodać 300 μl/studzienkę pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w PBS/0,05% Triton X-100/1% surowicy koziej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przeciwciała pierwszorzędowe, które można wykorzystać do wykrywania neuronów dopaminergicznych i charakterystyki hodowli, są wskazane w tabeli Materiały. Trzymaj 1 studzienkę bez przeciwciał pierwszorzędowych, aby ocenić tło różnych przeciwciał drugorzędowych.</li>
		<li>Usunąć podłoże i przemyć 3x żelatyną PBS/0,2% przez 10 min.</li>
		<li>Usunąć pożywkę, dodać 300 μl/studzienkę przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w PBS/0,05% Triton X-100/1% surowicy koziej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności. Zastosowane przeciwciała drugorzędowe są wskazane w tabeli Materiały.</li>
		<li>Usunąć podłoże i przemyć 3x żelatyną PBS/0,2% przez 10 min.</li>
		<li>Usuń podłoże i przemyj 3x PBS.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach szklanych stroną do dołu w kropli VECTASHIELD. Trzymaj szkiełka w temperaturze pokojowej przez noc, aby podłoże montażowe wyschło, a następnie przechowuj je w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu z kontrastem fazowym wyposażonego w epifluorescencję. Reprezentatywne obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego UV Leica SP2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+transmission+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum.</a> Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).</li>
<li>Iversen, S. D., Iversen, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine%3A+50+years+in+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine: 50 years in perspective.</a> Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).</li>
<li>Dahlstroem, A., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Existence+of+Monoamine-Containing+Neurons+in+the+Central+Nervous+System+I.+Demonstration+of+Monoamines+in+the+Cell+Bodies+of+Brain+Stem+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand+Suppl.+SUPPL%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons.</a> Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).</li>
<li>Chinta, S. J., Andersen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).</li>
<li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+systems+in+the+brain%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li>
<li>Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons%3A+a+review+of+the+molecular+circuitry+that+regulates+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development.</a> Dev Biol. 379, 123-138 (2013).</li>
<li>Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 363, 1783-1793 (2004).</li>
<li>Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+signaling+in+Parkinson%27s+disease+prevents+L-DOPA-induced+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia.</a> Sci Signal. 2, (2009).</li>
<li>Ohlin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+is+upregulated+by+L-dopa+in+the+parkinsonian+brain%3A+implications+for+the+development+of+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia.</a> Brain. 134, 2339-2357 (2011).</li>
<li>Obeso, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missing+pieces+in+the+Parkinson%27s+disease+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle.</a> Nat Med. 16, 653-661 (2010).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li>
<li>Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+needs+of+dopamine+neurons+for+stimulation+in+order+to+survive%3A+implication+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease.</a> FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease-from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. , (2013).</li>
<li>Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+center+median-parafascicular+complex+of+the+thalamus+has+efficient+anti-parkinsonian+action+associated+with+widespread+cellular+responses+in+the+basal+ganglia+network+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).</li>
<li>Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28, 24-30 (2013).</li>
<li>di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+striatal+cells+on+in+vitro+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurones+grown+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions.</a> Nature. 288, 370-373 (1980).</li>
<li>Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+heterogeneity+may+define+the+three-dimensional+shape+of+mouse+mesencephalic+dopaminergic+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones.</a> Nature. 307, 641-643 (1984).</li>
<li>Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).</li>
<li>Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+toxicity+toward+cultured+mesencephalic+dopaminergic+neurons+is+induced+by+the+synergistic+effects+of+energetic+metabolism+impairment+and+NMDA+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation.</a> J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).</li>
<li>Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+in+culture+by+low-level+stimulation+of+voltage-gated+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels.</a> J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).</li>
<li>Toulorge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+midbrain+dopamine+neurons+by+nicotine+is+gated+by+cytoplasmic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2.</a> FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).</li>
<li>Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Iron-Binding+Protein+Lactoferrin+Protects+Vulnerable+Dopamine+Neurons+from+Degeneration+by+Preserving+Mitochondrial+Calcium+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis.</a> Mol Pharmacol. 84, (2013).</li>
<li>Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitriol+imparts+neuroprotection+in+vitro+to+midbrain+dopaminergic+neurons+by+upregulating+GDNF+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression.</a> PLoS One. 8 (e62040), (2013).</li>
<li>Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I+inhibition+is+not+required+for+dopaminergic+neuron+death+induced+by+rotenone%2C+MPP%2B%2C+or+paraquat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).</li>
<li>Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of neurodegenerative diseases.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).</li>
<li>Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+microglial+NADPH+oxidase-derived+free+radicals+in+the+in+vitro+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease.</a> FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Parkinson%27s+disease-related+mutant+alpha-synuclein+in+the+midbrain+dopaminergic+neurons+causes+progressive+neurodegeneration+and+degradation+of+transcription+factor+nuclear+receptor+related+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1.</a> J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).</li>
<li>Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+dating+of+midbrain+dopamine+neurons+identifies+A9+enriched+tissue+for+transplantation+into+parkinsonian+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice.</a> Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).</li>
<li>Ramonet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+loss%2C+reduced+neurite+complexity+and+autophagic+abnormalities+in+transgenic+mice+expressing+G2019S+mutant+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2.</a> PLoS One. 6 (e18568), (2011).</li>
<li>Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+axon+guidance%3A+which+makes+what%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic axon guidance: which makes what.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li>
<li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li>
<li>Rayport, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+postnatal+mesolimbic+dopamine+neurons+in+culture%3A+morphology+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology.</a> J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).</li>
<li>Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+GABA+receptors+in+cultured+substantia+nigra+neurons%3A+correlation+of+electrophysiology+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 78, 759-769 (1997).</li>
<li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+allows+context-specific+isolation+of+progenitors+of+GABAergic+or+dopaminergic+neurons+during+neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+expression+of+Cdh2+is+essential+for+efficient+neural+differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W protokole tym przedstawiono procedury i odczynniki niezbędne do przygotowania pierwotnej hodowli neuronów śródmózgowia od myszy embrionalnej oraz procedurę immunofluorescencji w celu wykrycia neuronów dopaminergicznych. Krytycznymi etapami procedury są preparacja zarodków i mechaniczna dysocjacja pobranych fragmentów mózgu. Wysokiej jakości narzędzia preparacyjne pomagają opanować technikę preparacji. Neurony DA stanowią niewielką część śródmózgowia. W związku z tym pobranie prawej części brzusznego śródmózgowia jest n...

Dopamina, jeden z podstawowych neuroprzekaźników mózgowych1,2, jest głównie uwalniana przez neurony dopaminergiczne (DA) śródmózgowia. Większość neuronów DA znajduje się w brzusznej części śródmózgowia2-6. Schematycznie neurony DA śródmózgowia można podzielić na trzy anatomicznie i funkcjonalnie odrębne systemy projekcyjne: szlaki mezostriatalne, mezolimbiczne i mezokortykalne2,5. Szlak nigrostriatalny jest zaangażowany w zachowania motoryczne, szlaki mezolimbiczne odgrywają ważną rolę we wzmacnianiu, motywacji i uczeniu się, podczas gdy szlaki dopaminergiczne rzutujące do kory przedczołowej są zaangażowane w poznanie2.
Neurony DA są zaangażowane w kilka zaburzeń neurologicznych człowieka, takich jak schizofrenia, deficyt uwagi, zespół nadpobudliwości i choroba Parkinsona (PD)2,4. PD charakteryzuje się postępującą i selektywną degeneracją neuronów DA łączących istotę czarną pars compacta (SNc) z prążkowiem. Utrata neuronów DA nigro-prążkowia powoduje poważne wyczerpanie dopaminy w prążkowiu, które jest odpowiedzialne za objawy motoryczne PD (bradykinezja, drżenie spoczynkowe i sztywność)7. Pierwotna przyczyna idiopatycznej choroby Parkinsona nie została ustalona, a obecne leczenie jest jedynie objawowe, mające na celu przywrócenie poziomu dopaminy w prążkowiu. Najczęściej przepisywanym lekiem jest L-Dopa (lewodopa), naturalny prekursor dopaminy. Chociaż podawanie lewodopy kompensuje utratę dopaminy przez pewien czas, powikłania motoryczne występują po długotrwałym leczeniu (dyskinezy i stany włączenia/wyłączenia)8,9.
Badania nad neuronami dopaminergicznymi i PD są w ciągłym postępie i podejmowane są intensywne wysiłki w celu opracowania terapii opartych na transplantacji komórek, terapii genowej lub środkach neuroprotekcyjnych10,11. Jednak główny problem pozostaje niewyjaśniony: jaka jest przyczyna ekstremalnej wrażliwości neuronów DA? Część odpowiedzi można znaleźć w aktywności neuronów DA. Zmniejszenie aktywności elektrycznej i pobudliwości neuronów DA wydaje się zwiększać ich skłonność do degeneracji12. Niemniej jednak złożoność patogenezy PD wymaga dalszych badań w celu zidentyfikowania mechanizmów zaangażowanych w degenerację neuronów DA13-15.
Kultury pierwotne są szczególnie istotne do badania właściwości neuronów DA16-19 i do wyzywania tych neuronów na różne stresy w celu oceny czynników neuroprotekcyjnych20-24. Najczęściej stosuje się modele hodowli szczurów, ponieważ rozwarstwienie śródmózgowia zarodka szczura jest łatwiejsze w porównaniu z myszą, a u szczura można uzyskać większą ilość neuronów. Jednak generacja transgenicznych mysich modeli choroby25 znacznie zwiększyła zainteresowanie społeczności neurobiologów pierwotnymi kulturami myszy26-29. Chociaż można stosować kultury przygotowane z nowonarodzonych zwierząt, lepiej jest przygotować je z zarodków w stadium postmitotycznym (E13.5 dla neuronów śródmózgowia), kiedy neurony zachowały zdolność różnicowania się. Poniższy protokół przedstawia izolowane neurony śródmózgowia w hodowli pierwotnej z zarodków myszy (E13.5), które są najtrudniejsze do przygotowania. Warto zauważyć, że udostępniamy protokół wykorzystujący pożywkę hodowlaną bez surowicy w celu uzyskania lepszej odtwarzalności. Dwa najważniejsze etapy przygotowania hodowli (rozbiór i dysocjacja mechaniczna) zostaną szczegółowo opisane w powiązanym filmie.

<table><tbody><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Lonza</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L glukozy z L-glutaminą</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowa</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, roztwór 200 mM</td><td>Technologie</td> <td>życia</td><td></td>25030123</tr><tr><td>Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 Szynka</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D0547</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Laminin - 1 mg/ml w buforowanym Tris NaCl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-ornityny</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Insulina z trzustki świni</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferyna ludzka</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek putrescyny</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7126</td><td>Roztwór podstawowy 1 M w wodzie</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9391</td><td>Roztwór podstawowy 2% (w/v) w wodzie</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% w wodzie</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Merck Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza, monohydrat</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda - Aqua B. Braun</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol NORMAPUR odczynnik analityczny</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura ze szkła zwykłego - Wilhem Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczająca Malassez</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Acrodisc do surowicy z membraną Supor, sterylny, GF/0,2 i mikro; m, 37 mm</td><td>PALL Life science</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne - proste, ostro-ostre, o długości 14,5 cm</td><td>Narzędzia do</td> nauki <td>14002-14</td><td>Do otwierania ściany brzucha</td></tr><tr><td>Nożyczki - Proste, spiczaste, delikatne, o długości 10 cm</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>Do otwierania ściany macicy</td></tr><tr><td>Kleszcze - Zakrzywione, zwykłe, ząbkowane szczęki 1 mm</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>Do manipulowania zarodkami</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas - Zakrzywione, spiczaste, ostrza 7 mm</td><td>MORIA</td><td>MC50</td><td>Do wyjmowania śródmózgowia</td></tr><tr><td>Ultra cienkie kleszcze - Zakrzywione, delikatne, o długości 13 cm</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>Do usuwania opon</td></tr><tr><td>mózgowych BD BioCoat Poli-D-Lizyna 24-dołkowe płytki wielodołkowe</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaskie dno z pokrywką</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe SuperFrost, szlifowane krawędzie 90&ordm;</td><td>MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne szkła nakrywkowe o grubości nr 1,5H okrągłe 18 mm i Oslash;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało przeciwko białku 2 związanemu z mikrotubulami królika (MAP2)</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Monoklonalne mysie przeciwciało antyglutaminianu dekarboksylazy (GAD67), klon 1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Monoklonalne szczurze przeciwciało antydopaminowe (DAT), klon DAT-Nt&nbsp;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Monoklonalne mysie przeciwciało</td><td></td><td></td> anty-5-HT <td>1/8,000 - Hojny prezent od Yves Charnay (Szwajcaria, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td></tr><tr><td>Kozia surowica, Nowa Zelandia Origin</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Kozia przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Anti-Rat Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11007</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Carl Zeiss Palnik</td> Bunsena <td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>FIREBOY</td><td>VWR</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Neurony dopaminergiczne stanowią mniej niż 1% całkowitej liczby neuronów w mózgu. Ta niewielka ilość neuronów reguluje ważne funkcje mózgu, takie jak kontrola motoryczna, motywacja i pamięć robocza. Nigrostriatalne neurony dopaminergiczne ulegają selektywnej degeneracji w chorobie Parkinsona (PD). Ta postępująca utrata neuronów jest jednoznacznie związana z objawami motorycznymi patologii (bradykinezja, drżenie spoczynkowe i sztywność mięśni). Główny czynnik odpowiedzialny za zwyrodnienie neuronów dopaminergicznych jest nadal nieznany. Jednak neurony te wydają się być niezwykle wrażliwe w różnych warunkach. Kultury pierwotne stanowią jeden z najistotniejszych modeli do badania właściwości i cech neuronów dopaminergicznych. Kultury te mogą być poddawane różnym czynnikom stresowym, które naśladują patologię PD oraz związkom neuroprotekcyjnym w celu zatrzymania lub spowolnienia degeneracji neuronów. Liczne transgeniczne mysie modele PD, które zostały wygenerowane w ciągu ostatniej dekady, jeszcze bardziej zwiększyły zainteresowanie naukowców hodowlami neuronów dopaminergicznych. W tym przypadku protokół wideo skupia się na delikatnej sekcji embrionalnych mózgów myszy. Precyzyjne wycięcie śródmózgowia brzusznego jest kluczowe dla uzyskania kultur neuronalnych wystarczająco bogatych w komórki dopaminergiczne, aby umożliwić późniejsze badania. Protokół ten może być realizowany na embrionalnych myszach transgenicznych i nadaje się do barwienia immunofluorescencyjnego, ilościowego PCR, kwantyfikacji drugiego przekaźnika lub oceny śmierci/przeżycia neuronów.

Zilustrowany schemat blokowy etapów hodowli śródmózgowia przedstawiono na Rysunku 1. W skrócie, po pobraniu embrionów E13.5 od ciążnej myszy szwajcarskiej, z całego embrionu wycina się brzuszna część śródmózgowia. Wyizolowane fragmenty mózgu poddaje się kolejno trawieniu enzymatycznemu i dysocjacji mechanicznej. Zdysocjowane komórki są pelletowane przez wirowanie, resuspenderowane w pożywce hodowlanej i wysiewane na uprzednio powlekane płytki 12- lub 24-dołkowe. Komórki utrzymuje się do 15 dni bez wymian...

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu generowania pierwotnej hodowli neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów myszy. Jest to realizowane poprzez najpierw pobranie embrionów myszy w stadium E 13.5. Drugim krokiem jest wypreparowanie embrionalnych mózgów myszy i wyizolowanie śródmózwia.Następnie zebranym śródmózgiem poddaje się dysocjacji enzymatycznej oraz mechanicznej. Ostatnim krokiem jest wysiew dysocjowanych komórek neuronalnych. Na koniec zastosowano barwienie immunofluorescencyjne, aby wykazać obecność neuronów dopaminergicznych w hodowli.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, takich jak schizofrenia, zespół nadpobudliwości z deficytem uwagi oraz choroba Parkinsona. Wizualna demonstracja tej metody jest krytyczna, ponieważ etapy sekcji i dysocjacji komórkowej są trudne do opanowania ze względu na wymaganą precyzję gestów i anatomiczną identyfikację struktury; procedura zostanie zaprezentowana przez inżyniera z mojej grupy. Aby rozpocząć tę procedurę, po uśmierceniu ciężarnej myszy w dniu E 13.5, należy oczyścić jej brzuch 70% etanolem.Następnie należy rozciąć ścianę brzuc

primary-culture-of-mouse-dopaminergic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pierwotna kultura dopaminergicznych neuronów mysich

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia umożliwiają badanie charakterystyki presynaptycznej neuronów dopaminergicznych. Mogą one być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym kinetyki uwalniania dopaminy oraz poziomów białek/mRNA regulatorów egzocytozy dopaminy. W niniejszym materiale przedstawiamy sposób przygotowania tych hodowli z noworodków gryzoni.

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Ten film przedstawia metodę hodowli neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy. Proces ten obejmuje leczenie śródmózgowia enzymem proteolitycznym, odłączenie komórek i wyhodowanie ich na pokrytych polimerem szkiełkach nakrywkowych w pożywce bogatej w składniki odżywcze z antybiotykami dla ich wzrostu i długoterminowej żywotności.

Hodowla i utrzymanie neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Naucz się izolacji pierwotnych kultur neuronów dopaminergicznych z mezencefalonu myszy embrionalnej. Ta metoda umożliwia badanie wrażliwości neuronów na stres w kontekście choroby Parkinsona.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Przeglądaj więcej filmów