Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób wygenerować pierwotną kulturę neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów myszy. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw mysich zarodków E 13,5. Drugim krokiem jest wypreparowanie embrionalnych mózgów myszy i wyizolowanie śródmózgowia.

Następnie do pobranego śródmózgowia stosuje się dysocjację enzymatyczną i mechaniczną. Ostatnim krokiem jest posiew zdysocjowanych komórek neuronalnych. Ostatecznie barwienie immunofluorescencyjne stosuje się w celu wykazania obecności neuronów dopaminergicznych w hodowli.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, takich jak schizofrenia, zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi czy choroba Parkinsona. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy sekcji i dysocjacji komórek są trudne do nauczenia, ponieważ wymagany jest precyzyjny gest i anatomiczna identyfikacja struktury, demonstrując procedurę, Florence otrzyma inżyniera z mojej grupy, aby rozpocząć tę procedurę. Po złożeniu w ofierze ciężarnej myszy E 13,5 oczyść jej brzuch 70% etanolem.

Następnie otwórz ścianę brzucha i zbierz rogi macicy. Wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy i usuń błony owodniowe. Następnie przenieś zarodki na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą sterylne P-B-S-G-A-B.

Umyj je, przenosząc do trzech kolejnych identycznych kąpieli. Następnie przenieś zarodki na 60-milimetrową sterylną szalkę Petriego w celu rozwarstwienia. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.

Następnie wytnij mózg za pomocą nożyczek Vanna. Ostrożnie usuń i wyrzuć cztery i tylne obszary mózgu. Wykonaj cięcie w pobliżu obszaru wzgórza po stronie rostralnej i kolejne cięcie w obszarze ssus po stronie dousznika.

Następnie usuń górny colus. Po odizolowaniu brzusznego śródmózgowia ostrożnie usuń opony mózgowe Za pomocą bardzo cienkich kleszczy zbierz wypreparowane segmenty bez opon mózgowych w sterylnej probówce o pojemności 13 mililitrów wypełnionej P-B-S-G-A-B. Dokładnie wyczyść probówkę zawierającą śródmózgowie 70% etanolem.

Następnie umieść go pod maską na tym etapie. Umyj śródmózgowie trzy razy sterylnym P-B-S-G-A-B. Pozwól fragmentom mózgu osiąść między każdym myciem i unikaj uszkodzenia tkanki po ostatnim praniu.

Ostrożnie usuń jak najwięcej roztworu i inkubuj segmenty mózgu w trzech mililitrach trypsyny EDTA przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. W międzyczasie wypoleruj pipety PE, aby zmaksymalizować przeżycie neuronów, ponieważ koniec pipety z niepolerowanego szkła jest ostry i może nieznacznie uszkodzić komórki podczas etapów dysocjacji. Zmniejsz średnicę końcówki pipety PE podczas polerowania jej ogniowo.

Teraz ostrożnie usuń jak najwięcej roztworu trypsyny EDTA. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej, 10% IFBS i umyj nią trzy razy segmenty mózgu. Używając wypolerowanej ogniowo pipety PEs, rozpocznij dysocjację śródmózgowia w sześciu mililitrach kultury.

Średni, 10% IFBS trier rate 10 razy i staraj się unikać pęcherzyków powietrza. Następnie pozwól kawałkom osiąść. Zbierz pożywkę do nowej sterylnej probówki o pojemności 13 mililitrów.

Dodaj sześć mililitrów kultury, pożywki i potrójnej dawki 10 razy więcej. Pozwól kawałkom osiąść i zbierz podłoże zawierające zdysocjowane komórki w tej samej 13-mililitrowej probówce. Następnie odwirować komórki w temperaturze 160 g przez pięć minut.

Następnie wyrzuć supernatant i resus. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% hormonem. Wymieszaj komórki zliczające w zawiesinie w komórce mase i dostosuj objętość pożywki do stężenia 600 000 komórek na mililitr.

Ogólnie rzecz biorąc, z jednego śródmózgowia myszy można uzyskać około 1 700 000 komórek. Teraz usunąć podłoże powlekające zawierające FBS z płytki 24-dołkowej. Dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego.

Cóż, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla 95% powietrza, neurony dopaminergiczne dojrzewają po około pięciu do siedmiu dniach in vitro, a komórki można przechowywać w hodowli do 15 dni bez wymiany pożywki. Dzień przed sekcją dodaj 10 mililitrów jednego molowca HCL do szalki Petriego. Umieść od 12 do 15 szklanych szkiełek nakrywkowych na powierzchni płynu i odczekaj 15 minut.

Następnie wciśnij pokrywkę do płynu i odczekaj kolejne 15 minut. Następnie usuń HCL i umyj pokrywę Slips trzy razy wodą, a następnie jedno szybkie umycie czystym etanolem. Następnie dodaj czysty etanol do naczynia i odczekaj 30 minut pod maską.

Usuń oczyszczone szkiełka nakrywkowe z etanolu. Następnie przenieść szkiełka nakrywkowe na 12-dołkową płytkę do hodowli komórkowych. Szkiełka nakrywkowe należy umyć dwukrotnie sterylną wodą, a następnie raz umyć je sterylnym PBS.

Następnie usuń PBS i dodaj dwa XPLO w ilości 500 mikrolitrów na studzienkę, inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla Po czterech godzinach. Usunąć roztwór PLO i przemyć trzykrotnie sterylnym PBS. Następnie usuń PBS i dodaj 500 mikrolitrów 20% lamininy IFBS w ilości jednego mikrograma na mililitr do każdej studzienki inkubowanej przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla.

Do immunofluorescencji. Usunąć podłoże powlekające z płytki 12-dołkowej. Dodaj dwa mililitry komórek w 900 000 komórek na studzienkę i hoduj je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Komórki mogą być trzymane w hodowli do 15 dni bez wymiany pożywki. Pokazano. Oto obrazy z kontrastem fazowym kultury na różnych etapach rozwoju. Rysunek ten przedstawia barwienie hydroksylazą tyrozynową neuronów dopaminergicznych w DIV osiem neuronów D wykryto przy użyciu przeciwciała anty TH.

Liczba neuronów TH dodatnich w hodowli śródmózgowia jest funkcją wieku kultury. Oto reprezentatywne neurony i astrocyty w kulturze. W DIV 4 neurony dopaminergiczne wykryto za pomocą przeciwciała anty DAT lub anty TH i neuronów GABA-ergicznych.

Neurony serotoninergiczne i astrocyty wykryto odpowiednio za pomocą przeciwciał anty serotoninowych anty 67 i anty GFAP. Komórki neuronalne przebarwiono przeciwciałem anty MAP Two. Oto reprezentatywne barwienie kilku populacji komórek kultury śródmózgowia.

Neuron dopaminergiczny został wykryty przez barwienie DAT w DIV dziewięć, a te neurony GABA-ergiczne zostały uwidocznione przez barwienie 67 w DIV 9. Neuron serotoninergiczny został przebarwiony przeciwciałem antyserotoninowym w DI dziewięć. Neurony zostały zidentyfikowane za pomocą mapy do barwienia Po jego rozwoju na początku lat osiemdziesiątych.

Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania rozwoju komórek dopaminergicznych w hodowli pierwotnej i może być wykorzystana do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw fizjologicznych i patologicznych stanów neuronów dopaminergicznych. Brak filmu przedstawiającego delikatną sekcję mógł skłonić badacza do opracowania tego modelu hodowli myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak precyzyjnie odizolować funkcjonalny od embrionalnego mózgu myszy i przeprowadzić dedykowane kroki dysocjacji, aby uzyskać ładną pierwotną hodowlę dopaminergicznych myszy.