Name: Nanocząsteczki hydrożelu pobierane z osocza lub moczu w celu wykrycia białek o niskiej liczebności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę izolacji biomarkerów o niskiej liczebności z osocza lub moczu przy użyciu nanocząsteczek hydrożelu. Technika ta znacząco zwiększa czułość detekcji białek w diagnostyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Michael Henry, Dublin City University, uprzejmie pomógł w zbieraniu i analizie danych pokazanych na rysunku 5. Prace te były częściowo wspierane przez: (1) Uniwersytet George'a Masona, (2) włoski IstitutoSuperiore di Sanita' w ramach umowy o współpracy między Departamentem Zdrowia i Opieki Społecznej USA, Uniwersytetem George'a Masona a włoskim Ministerstwem Zdrowia Publicznego, (3) NIH, granty programu IMAT 1R21CA137706-01 i 1R33CA173359-01 dla LAL, oraz (4) Ceres Nanosciences, Inc.

Ludzkie osocze i mocz zostały pobrane od zdrowych ochotników, za pisemną świadomą zgodą, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez George Mason University Institutional Review Board. Dawcy zostali równo rozdzieleni między mężczyzn i kobiety rasy kaukaskiej w wieku od 25 do 42 lat. Próbki były analizowane indywidualnie i nie były łączone.
1. Przetwarzanie nanocząsteczek próbek surowicy lub osocza
Potencjalne nisko obfite biomarkery w osoczu są wychwytywane, w roztworze, za pomocą nanocząsteczek hydrożelu. Cząstki dodaje się do osocza, inkubuje, rozdziela przez wirowanie, przemywa, a wychwycone białka są eluowane. Wymyte białka są suszone pod wpływem przepływu azotu w celu sekwencjonowania i identyfikacji spektrometrii mas.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 500 μl surowicy w stosunku 1:2 w 50 mM TrisHCl pH 7 (500 μl surowicy + 500 μl TrisHCl) w probówce mikrowirówkowej.</li>
	<li>Dodać 500 μl nanocząstek rdzeniowych poli(NIPAm/AAc). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować próbkę w temperaturze 16 100 x g, 25 °C przez 10 minut w wirówce wyposażonej w wirnik o stałym kącie nachylenia. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Dodać 500 μl tiocyjanianu sodu (25 mM) do osadu. Ponownie zawiesić nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół.</li>
	<li>Wirować próbkę w temperaturze 16 100 x g, 25 °C przez 10 minut w wirówce z wirnikiem o stałym kącie nachylenia. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Dodać 500 μl wody MilliQ do granulki nanocząstek. Ponownie zawiesić nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół.</li>
	<li>Wirować próbkę w temperaturze 16 100 x g, 25 °C przez 10 minut w wirówce z wirnikiem o stałym kącie nachylenia. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Przygotować świeży bufor elucyjny: Dodać 700 μl acetonitrylu do 300 μl wodorotlenku amonu w czystej probówce. Uwaga: Wodorotlenek amonu jest. Stosować przy odpowiedniej wentylacji. Uwaga: Bufor elucyjny należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Nie przechowywać buforu elucyjnego.</li>
	<li>Dodać 300 μl buforu elucyjnego do osadu nanocząstek. Ponownie zawiesić nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować próbkę w temperaturze 16 100 x g, 25 °C przez 10 minut w wirówce z wirnikiem o stałym kącie nachylenia. Usunąć eluat i zachować go w czystej, oznakowanej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.9 – 1.10. Połączyć dwa eluaty w jednej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Wysuszyć eluaty pod przepływem azotu w kolektorze parownika azotu w temperaturze 42,1 °C, przy przepływie powietrza ustawionym na 8 (rysunek 2F).</li>
	<li>Przechowywać wysuszony eluat w temperaturze pokojowej w celu przechowywania O/N lub w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania, przed spektrometrią mas, western blot lub testami ELISA (opcjonalnie).</li>
</ol>
2. Przetwarzanie nanocząsteczek próbek moczu
Normalny mocz zawiera mniej niż 30 mg/dl białka i mniej niż 1+ krwi. Jednak wiele chorób/stanów może zmieniać normalny poziom białka w moczu i krwi. Aby pomóc w określeniu optymalnej objętości nanocząstek, które należy dodać do próbki moczu, przed pobraniem nanocząstek przeprowadza się analizę moczu. Biomarkery moczu mogą występować w bardzo niskich stężeniach, co może wymagać optymalizacji stosunku nanocząsteczek do objętości moczu. Procedura ta opisuje pobieranie nanocząstek z próbek moczu do dalszej analizy western blot.
<ol>
	<li>Próbki moczu należy pobrać do czystego, suchego plastikowego kubka. Wymagana jest minimalna objętość 22 ml. Próbki moczu należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do analizy.</li>
	<li>Rozmrozić zamrożony mocz w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C O/N. Krótko wymieszać na mieszadle wirowym. Wlać co najmniej 22 ml moczu do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem.</li>
	<li>Wirować mocz w wirówce z odchylanym rotorem o sile 3 700 x g przez 15 minut. Zdekantować mocz, nie naruszając osadu, do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem. Wyrzuć granulkę.</li>
	<li>Wykonaj analizę moczu za pomocą wieloanalitowego paska odczynnika "pasek do moczu". Uwaga: paski odczynnika należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku, z dala od bezpośredniego światła słonecznego i wilgoci17, 18.
	<ol>
		<li>Połóż pasek odczynnika stroną zadrukowaną do góry na czystym, suchym ręczniku papierowym.</li>
		<li>Za pomocą jednorazowej pipety odessać 1 ml moczu przygotowanego w kroku 2.3.</li>
		<li>Ustaw minutnik na 2 minuty, ale go nie uruchamiaj. Szybko dozuj 1-2 krople moczu na każdą podkładkę testową paska odczynnika. Natychmiast uruchom timer. Uwaga: Nie zanurzaj paska odczynnika bezpośrednio w pojemniku na mocz. Barwniki/wskaźniki chemiczne w pasku odczynnika mogą potencjalnie wypłukiwać się z paska odczynnika do pojemnika na mocz.</li>
		<li>W czasie wskazanym na pojemniku z paskiem odczynnika zapisz wyniki jakościowe dla różnych analitów na pasku odczynnika, porównując kolor poszczególnych pasków odczynnika z odpowiadającymi im kolorowymi wskaźnikami na pojemniku z odczynnikiem. Typowe normalne wyniki moczu to: (normalne lub ujemne) dla krwi, białka, leukocytów, azotynów, glukozy, ketonów, bilirubiny i urobilinogenu; pH moczu (5,5 - 7,0); ciężar właściwy (1,001 - 1,020). Uwaga: Wysoki poziom białka w próbce moczu może konkurować z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania o miejsca wiązania na nanocząstkach. Aby zmaksymalizować zbieranie białek za pomocą nanocząstek, stosunek objętości nanocząstek do objętości moczu można dostosować tak, aby ograniczyć konkurencję ze strony białek o wysokiej obfitości lub zoptymalizować je w celu zebrania białek, które występują w bardzo niskich stężeniach. Jeśli wartość białka w moczu wynosi 1+ lub więcej, dodaj 2x objętości nanocząstek w kroku 2.5 poniżej. Jeśli analit będący przedmiotem zainteresowania jest białkiem o bardzo niskiej obfitości, może być konieczne zwiększenie objętości nanocząstek do 2 ml (ryc. 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 20 ml oczyszczonego moczu z kroku 2.3 do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem. Nie przeszkadzaj żadnym resztkom/granulkom, które mogą znajdować się na dnie rurki na mocz. Dodać 200 μl nanocząstek do 20 ml próbki moczu. Wymieszaj krótko na mikserze wirowym. Uwaga: Jeśli wartość białka w moczu wynosi 1+ lub więcej, dodaj 400 μl nanocząsteczek do 20 ml moczu.</li>
	<li>Mieszaninę moczu/nanocząstek inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, bez kołysania/mieszania.</li>
	<li>Zawiesinę moczu/nanocząstek należy obracać w wirówce wyposażonej w odchylany rotor o wymiarach 3 700 x g przez 10 minut. Uwaga: Jeśli po odwirowaniu nie widać osadu, należy wirować próbki przez dodatkowe 2 – 7 minut.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Dodać 500 μl wody MilliQ do granulki nanocząstek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół. Przenieść roztwór nanocząstek do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Obracaj nanocząstki w wirówce wyposażonej w wirnik o stałym kącie nachylenia 16 100 x g przez 10 minut. Uwaga: Jeśli po odwirowaniu nie widać osadu, należy obracać próbki przez dodatkowe 2 – 7 minut.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.8 i 2.11 (dwukrotnie) z 200 μl 18 MilliQ wody, aby przemyć nanocząstki.</li>
	<li>Przygotować świeży bufor elucyjny: Dodać 970 μl acetonitrylu do 30 μl wodorotlenku amonu w czystej probówce. Uwaga: Wodorotlenek amonu jest. Stosować przy odpowiedniej wentylacji. Uwaga: Bufor elucyjny należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Nie przechowywać buforu elucyjnego.</li>
	<li>Dodać 20 μl buforu elucyjnego do osadu nanocząstek. Ponownie zawiesić nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obracać próbki nanocząstek w temperaturze 16 100 x g przez 10 minut. Usunąć i zachować supernatant w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Nie zakłócaj osadu nanocząstek. Wyrzuć granulki do kosza na zagrożenia biologiczne.</li>
	<li>Umieść próbki w stojaku w dygestoriach chemicznych. Otworzyć nakrętki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Alternatywnie, umieścić próbki pod strumieniem azotu w temperaturze 40 °C do wyschnięcia (1-2 godziny).</li>
	<li>Dodać 15 μl buforu do próbek tris-glicyny SDS (2x) do próbek. Ogrzewać w temperaturze 100 °C w suchym bloku grzewczym przez 5 minut z otwartymi nakrętkami lub do momentu, gdy objętość pozostała w probówce nie przekroczy 20 μl. Uwaga: nie używaj wrzącej kąpieli wodnej. Wilgoć z łaźni wodnej zapobiegnie parowaniu bufora.</li>
	<li>Umieść nakrętkę na probówkach. Wyjmij rurki z bloku grzewczego. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C lub natychmiast wykorzystana do dalszej analizy western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Gerszten, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+translating+plasma+proteomics+from+bench+to+bedside%3A+update+from+the+NHLBI+Clinical+Proteomics+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).</li>
<li>Merrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+low-abundance%2C+low-molecular-weight+serum+proteins+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry.</a> J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).</li>
<li>Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+selective+isolation+and+enrichment+of+carrier+protein-bound+low-molecular+weight+proteins+and+peptides+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).</li>
<li>Geho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+serum+components+using+nanoporous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of serum components using nanoporous substrates.</a> Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).</li>
<li>Sennels, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+human+blood+serum+using+peptide+library+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads.</a> J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).</li>
<li>Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+low+molecular+weight+serum+peptidome+using+ultrafiltration+and+a+hybrid+ion+trap-Fourier+transform+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer.</a> J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).</li>
<li>Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+serum+proteins+underlies+the+mass+spectral+fingerprinting+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction.</a> J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+Preservation+of+Very+Low+Abundance+Biomarkers+in+Urine%2C+such+as+Human+Growth+Hormone+%28hGH%29%2C+by+Cibacron+Blue+F3G-A+Loaded+Hydrogel+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles.</a> Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+hydrogel+particles%3A+biomarker+harvesting%3A+one-step+affinity+purification%2C+size+exclusion%2C+and+protection+against+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation.</a> Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).</li>
<li>Patanarut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+hydrogel+particles+containing+Cibacron+Blue+F3G-A%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+A+Physicochem+Eng+Asp%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A.</a> Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).</li>
<li>Tamburro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+core-shell+nanoparticles%3A+discovery+of+previously+invisible+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+amplifying+the+effective+sensitivity+of+biomarker+detection+to+create+a+urine+test+for+hGH%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Test+Anal%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH.</a> Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-shell+hydrogel+particles+harvest%2C+concentrate+and+preserve+labile+low+abundance+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers.</a> PLoS One. 4 (3), e4763(2009).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Analyte+Harvesting+Nanoparticle+Technology+to+the+Measurement+of+Urinary+HGH+in+Healthy+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sports+Med+Doping+Stud%22%5BJournal%5D)">Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals.</a> J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (7), 264(2007).</li>
<li>Bosch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+urinary+human+growth+hormone+%28hGH%29+using+hydrogel+nanoparticles+and+isoform+differential+immunoassays+after+short+recombinant+hGH+treatment%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results.</a> J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ovarian+and+prostate+cancer+peptidome+for+candidate+early+detection+markers+using+a+novel+nanoparticle+biomarker+capture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology.</a> AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biomarker+harvesting+nanotechnology+identifies+Bak+as+a+candidate+melanoma+biomarker+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum.</a> Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).</li>
<li>Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+Addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).</li>
<li>Douglas, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+hydrogel+microparticles+to+sequester+and+concentrate+bacterial+antigens+in+a+urine+test+for+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease.</a> Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).</li>
<li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+reproducibility+of+selective+reaction+monitoring+assays+using+multiple+upfront+analyte+enrichment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies.</a> J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).</li>
<li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+lipocalin-2+and+visfatin+levels+in+patients+with+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease.</a> Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).</li>
<li>Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+%28PDGF%29%3A+actions+and+mechanisms+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle.</a> Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).</li>
<li>Izycki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+IGF-I+and+IGF-II+in+patients+with+lung+cancer+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy.</a> Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).</li>
<li>Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methylprednisolone+and+mitoxantrone+on+CCL5-induced+migration+of+lymphocytes+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis.</a> Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).</li>
<li>Kitazume, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+beta-galactoside+alpha2%2C6-sialyltransferase+secretion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo.</a> Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+hepatic+NKT+cells+in+leukocyte+cell-derived+chemotaxin+2-deficient+mice+contributes+to+severe+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).</li>
<li>Struyf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARC%2FCCL18+is+a+plasma+CC+chemokine+with+increased+levels+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).</li>
<li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li>
</ol>

Benjamin Espina jest pracownikiem firmy Ceres Nanosciences, Inc., która produkuje odczynniki użyte w tym artykule. Lance Liotta, Alessandra Luchini i Virginia Espina posiadają patenty (patent amerykański 7,935,518 i/lub 8,497,137) na technologię nanocząstek wykorzystaną w tym artykule. Jako pracownicy uczelni są uprawnieni do otrzymywania opłat licencyjnych z tych patentów zgodnie z polityką uczelni. Lance Liotta i Alessandra Luchini są udziałowcami Ceres Nanosciences i zasiadają w Naukowej Radzie Doradczej.

Znaczenie kliniczne
Uważa się, że próbka surowicy lub osocza zawiera krążące białka i peptydy o niskiej obfitości, które mogą stanowić bogate źródło informacji dotyczących stanu organizmu jako całości. Pomimo obiecujących właściwości proteomiki surowicy, istnieją trzy podstawowe i poważne bariery fizjologiczne, które uniemożliwiają odkrywanie biomarkerów i ich translację na korzyści kliniczne10, 11, 16, 25.
1. Ważne biomarkery diagnostycz...

Pomimo zakończenia sekwencjonowania ludzkiego genomu, nie poczyniono znaczącego postępu w identyfikacji biomarkerów predykcyjnych wczesnego stadium choroby, lub korelujących z wynikiem terapeutycznym, lub rokowaniem1. Jedną z przyczyn tego braku postępów jest fakt, że istnieje wiele potencjalnie istotnych biomarkerów w stężeniu poniżej granicy wykrywalności konwencjonalnej spektrometrii mas i innych platform odkrywania biomarkerów. Spektrometria mas (MS) i monitorowanie reakcji wielokrotnych (MRM) mają czułość wykrywania zwykle większą niż 50 ng/ml, podczas gdy większość analitów mierzonych za pomocą testów immunologicznych w laboratorium klinicznym mieści się w zakresie od 50 pg/ml do 10 ng/ml. Oznacza to, że wiele biomarkerów, szczególnie we wczesnym stadium choroby, nie może być wykrytych przez konwencjonalne stwardnienie rozsiane i MRM2. Ponadto obecność białek o wysokiej liczebności, takich jak albumina i immunoglobulina, w złożonych płynach biologicznych często maskuje miliard-krotny nadmiar białek i peptydów o niskiej liczebności i niskiej masie cząsteczkowej3, 4. Z tego powodu przed sekwencjonowaniem i identyfikacją spektrometrii mas wymaganych jest kilka etapów przygotowania próbki. Jednym z takich etapów przygotowawczych jest zubożenie białek o wysokiej obfitości za pomocą dostępnych na rynku kolumnzubożających 5-8. Niestety, ten krok prowadzi do zmniejszenia wydajności potencjalnych biomarkerów, ponieważ często są one niekowalencyjnie związane z białkami nośnikowymi, które są usuwane. Kolejnym wyzwaniem jest stabilność potencjalnych biomarkerów ex vivo po pobraniu próbek. Białka ulegają degradacji przez endogenne lub egzogenne proteazy9. Nanocząstki hydrożelu mogą przezwyciężyć te krytyczne wyzwania, zwiększając przypuszczalne stężenie biomarkera do poziomu w zakresie testu, jednocześnie chroniąc białko przed degradacją10-13.
Ważne jest, aby zauważyć, że białka LMW we krwi są mieszaniną małych, nienaruszonych białek, jak również fragmentów dużych białek. Białka pochodzenia tkankowego większe niż 60 kDa są zbyt duże, aby biernie dostać się do krwiobiegu przez błonę podstawną naczyń krwionośnych, ale mogą być reprezentowane we krwi jako peptydy lub fragmenty białek14. Naszym celem jest zmierzenie nowych krążących biomarkerów, które mogą być kandydatami do wczesnego wykrywania choroby, stratyfikacji pacjentów do terapii i monitorowania odpowiedzi na terapię. Nasze nanocząstki są tworzone w celu selektywnego wykluczania immunoglobulin i albumin o wysokiej obfitości, przy jednoczesnym wychwytywaniu mniejszych białek i peptydów oraz zagęszczaniu ich do 100-krotnie, w zależności od objętości wyjściowej.
Nasza grupa zidentyfikowała zestaw małych organicznych barwników, które mogą z powodzeniem działać jako przynęty molekularne o wysokim powinowactwie dla białek i peptydów. Uważa się, że wiązanie białka z barwnikiem jest spowodowane połączeniem oddziaływań hydrofobowych i elektrostatycznych. Pierścienie aromatyczne na barwniku przeplatają się z białkami poprzez hydrofobowe kieszenie na powierzchni białka11.
Przynęty, w zależności od ich składu chemicznego, wykazują szczególne powinowactwo do wybranych klas analitów. Przynęty konkurują z białkami nośnikowymi, takimi jak albumina, o białka lub peptydy. Białka/peptydy o niskiej masie cząsteczkowej zostają uwięzione w cząstce. Białka o dużej masie cząsteczkowej, takie jak albumina i immunoglobulina, nie mogą dostać się do cząstki ze względu na zdolność przesiewania ze względu na ograniczające pory hydrożelu11 (ryc. 1).
Nanocząsteczki hydrożelu są syntetyzowane przez polimeryzację wytrącającą zainicjowaną przez nadsiarczan amonu11. N-izopropyloakrylamid (NIPAm), komonomery kwasu akrylowego (AAc) i alliloaminy (AA) oraz sieciujący N,N'-metylenobisakryloamid (BIS) dopuszcza się do reakcji w temperaturze 70 °C przez 6 godzin w rozcieńczonych warunkach11, 13. Wysokie powinowactwo do wiązania białek nanocząstek poli(N-izopropylacrylamidu-ko-akrylowego) (poli(NIPAm-co-AAc) uzyskuje się poprzez kowalencyjne włączenie barwników zawierających aminy (tj. sulfoninianononitryzynowych barwników) do nanocząstek w wyniku reakcji amidacji przeprowadzanej w rozpuszczalnikach wodnych lub organicznych w zależności od hydrofilowych/hydrofobowych właściwości barwników11, 13. Nukleofilowe podstawienie grup aminowych w nanocząstce atomem chlorku barwnika antrachinonotriazynowego wykorzystuje się do wytworzenia nanocząstek poli(NIPAm-co-Alliloaminy) (AA)zawierających barwnik 11, 12. Dwuetapowy proces polimeryzacji jest wykorzystywany do tworzenia nanocząstek hydrożelu zawierających zewnętrzną powłokę kwasu winylosulfonowego (VSA)11, 13.
Nanocząsteczki hydrożelu mogą być stosowane do różnych płynów biologicznych, w tym krwi pełnej, osocza, surowicy, płynu mózgowo-rdzeniowego, potu i moczu. W jednym etapie, w roztworze, nanocząstki dokonują szybkiej (w ciągu kilku minut) sekwestracji i koncentracji niskocząsteczkowych analitów10, 11, 13, 15-18. Białka są następnie eluowane z nanocząstek i wykrywane za pomocą western blot19-21, spektrometrii mas10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, testów immunologicznych/ELISA10, 11, 15, 18 lub testów mikromacierzy białek z odwróconymi fazami16, 24. Nanocząstki funkcjonalizowane przynętą chemiczną i prezentujące architekturę rdzenia lub skorupy rdzenia, wychwytują i koncentrują białka w oparciu o właściwości fizykochemiczne przynęty/skorupy. Różne barwniki włączone do nanocząstek będą zatem wychwytywać różne podzbiory białek z różną wydajnością w zależności od powinowactwa do barwnika, pH roztworu oraz obecności/braku konkurencyjnych białek o wysokiej obfitości13. Ponadto ilość nanocząstek w stosunku do objętości roztworu będzie miała wpływ na wydajność białka z nanocząstek. Te aspekty pozyskiwania nanocząstek hydrożelu zademonstrowano przy użyciu trzech różnych przynęt nanocząsteczkowych do zbierania białek z próbek osocza, które zawierają duże ilości białka, oraz z próbek moczu, które zazwyczaj nie zawierają dużych ilości białka. W tym protokole demonstrujemy pobieranie i koncentrację czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFα) z próbek osocza przy użyciu poli(NIPAm-co-AAc), Poly(NIPAm / barwnik) i nanocząstek powłoki rdzeniowej (Poly(NIPAm-co-VSA)). Wykazano, że nanocząstki poli(NIPAm / barwnik) koncentrują antygen gatunku Mycobacterium, który został dodany do próbek ludzkiego moczu, aby naśladować osoby zakażone Mycobacterium tuberculosis.

<table><tbody><tr><td>Nanocząstki hydrożelu</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap Cząstki ESP</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm woda</td><td></td><td></td><td>Typ 1 odczynnik Woda</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7,0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>Dostępne w VWR</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>Dostępne w firmie VWR, oznaczane na 28–30% NH3</td></tr><tr><td>Tiocyjanian sodu 25 mM</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Do próbek surowicy/osocza</td></tr><tr><td>Paski odczynników do moczu z wieloma analitami</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>Do próbek moczu</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Tris-Glycine SDS (2X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>Stosować w temperaturze pokojowej, aby zapobiec wytrącaniu się SDS</td></tr><tr><td>Inkubator do suchej kąpieli (100 oC) z blokiem grzewczym</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>Nie zastępuj kąpieli wodnej wrzącej</td></tr><tr><td>Kolektor parownika azotu</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>Do próbek surowicy/osocza</td></tr><tr><td>Wirówka, rotor wychylny</td><td>Sorvall</td><td>Seria Legend</td><td>Probówka o pojemności 50 ml, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Wirówka, rotor o stałym kącie</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Pojemność mikrowirówki 1,7 mL, RCF 16 000 x g</td></tr><tr><td>Wirówka stożkowa 50 ml&nbsp; probówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Z nakrętkami do próbek moczu</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Mikser Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Sekundy/minuty</td></tr></tbody></table>

nanocząsteczki hydrożelu pobierane z osocza lub moczu w celu wykrycia białek o niskiej liczebności

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Odkrycie nowych biomarkerów odgrywa kluczową rolę w dostarczaniu bardziej czułych i specyficznych metod wykrywania chorób. Niestety, wiele biomarkerów o niskiej liczebności, które występują w płynach biologicznych, nie może być łatwo wykrytych za pomocą spektrometrii mas lub testów immunologicznych, ponieważ są one obecne w bardzo niskim stężeniu, są labilne i często są maskowane przez białka o wysokiej obfitości, takie jak albumina lub immunoglobulina. Przynęta zawierająca nanocząstki na bazie poli(N-izopropyloakrylamidu) (NIPAm) są w stanie pokonać te bariery fizjologiczne. W jednym kroku są w stanie wychwycić, skoncentrować i zachować biomarkery z płynów ustrojowych. Anality o niskiej masie cząsteczkowej dostają się do rdzenia nanocząstki i są wychwytywane przez różne organiczne barwniki chemiczne, które działają jak przynęty białkowe o wysokim powinowactwie. Nanocząstki są w stanie skoncentrować interesujące białka o kilka rzędów wielkości. Ten współczynnik stężenia jest wystarczający do zwiększenia poziomu białka tak, że białka mieszczą się w granicy wykrywalności obecnych spektrometrów masowych, western blotting i testów immunologicznych. Nanocząstki mogą być inkubowane z mnóstwem płynów biologicznych i są w stanie znacznie wzbogacić stężenie białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej, wykluczając albuminy i inne białka o dużej masie cząsteczkowej. Nasze dane pokazują, że można osiągnąć 10 000-krotne zwiększenie stężenia danego analitu, umożliwiając spektrometrię mas i testy immunologiczne w celu wykrycia wcześniej niewykrywalnych biomarkerów.

Rozmiar i jednorodność nanocząsteczek hydrożelu
Cząstki Poly(NIPAm-AAc) były wytwarzane z niezwykle wysoką wydajnością i powtarzalnością między partiami oraz w obrębie jednej partii. Cząstki wykazują bardzo dobrą stabilność koloidalną w temperaturze pokojowej (RT) przez czas niezbędny do wychwytywania, przechowywania i elucji białek (co najmniej 48 hr), a nie zaobserwowanoy precypitacji nanocząstek (Rycina 1)11. Stabilność koloidalna może mieć klucz...

Kilka patologicznych biomarkerów nie może być łatwo wykrytych przez obecne techniki ze względu na ich niskie stężenie w płynach biologicznych, obecność enzymów rozkładających i duże ilości białek o dużej masie cząsteczkowej. Chemicznie funkcjonalizowane nanocząstki hydrożelu mogą zbierać, konserwować i koncentrować białka o niskiej liczebności, umożliwiając wykrywanie wcześniej niewykrywalnych biomarkerów.

Nanocząsteczki hydrożelu pobierane z osocza lub moczu w celu wykrycia białek o niskiej liczebności

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie, zagęszczenie i zachowanie biomarkerów o niskiej liczebności i niskiej masie cząsteczkowej z płynów biologicznych w odpowiednich stężeniach. W przypadku standardowych testów białkowych osiąga się to poprzez dodanie najpierw chemicznie funkcjonalizowanych nanocząstek hydrożelu do płynu biologicznego o niskiej masie cząsteczkowej. Anality dostają się do rdzenia nanocząstki i są wychwytywane przez różne organiczne barwniki chemiczne, które działają jak przynęty białkowe o wysokim powinowactwie.Drugim krokiem jest oddzielenie cząstek od biopłynu przez odwirowanie. Nanocząstki koncentrują interesujące białka o kilka rzędów wielkości. Nanocząstki są następnie przemywane wodą w celu usunięcia obcych białek.Ostatnim krokiem jest wymycie wychwyconych białek z nanocząstek. Ostatecznie western blotting, spektrometria mas lub testy aminowe są stosowane w celu wykazania obecności i/lub stężenia wcześniej niewykrywalnych zebranych biomarkerów o niskiej liczebności. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ nanocząstki muszą zostać umyte, a resus zawieszony.Bez zatykania końcówki pipety, nanocząstki nie zawieszają się tak łatwo jak komórka, P.So należy energicznie pipetować w górę iw dół, aby odpowiednio zawiesić nanocząstki po pierwszej inkubacji. W przypadku nanocząstek ważne jest, aby przepłukać ścianki rurki w celu zebrania wszelkich pozostałości nanocząstek, które mogą przylegać do rurki. Aby przeprowadzić przetwarzanie nanocząstek w próbkach surowicy, rozcieńcz 500 mikrolitrów ludzkiej surowicy od jednego do dwóch za pomocą 50 milimolowych tris, HCL pH siedem w mikroprobówce wirówkowej.Dodać 500 mikrolitrów poli i izop akryloamidu propylu lub monomerów poli nipam co nanocząstek rdzenia kwasu akrylowego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wiruj próbkę w temperaturze 16, 100 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. W wirówce wyposażonej w wirnik o stałym kącie wyjąć i wyrzucić natynkę SUP przed dodaniem 500 mikrolitrów tiocyjanianu sodu do roztworu do osadu, ponownie zawiesić nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół.Odwirować próbkę jak poprzednio i wyrzucić supernatant przed dodaniem 500 mikrolitrów wody mili Q do granulki nanocząstek. Po raz kolejny resus zawiesił nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół. Po ponownym odwirowaniu próbki otrzymałem 300 mikrolitrów świeżego elucianu, bufor i ponowne zawieszenie przy użyciu zademonstrowanej techniki.Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po ostatnim odwirowaniu próbki należy wyjąć EIT i przechowywać go w czysto oznakowanej probówce z mikrowirówki. Eluuj po raz drugi i połącz oba EIT w jedną mikrowirówkę. Dwa.Następnie wysusz EIT pod przepływem azotu i kolektorem parownika azotu w temperaturze 42,1 stopni Celsjusza z przepływem powietrza ustawionym na sześć. Przechowuj wysuszony EIT w temperaturze pokojowej do przechowywania przez noc lub dodaj ujemne 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania przed spektrometrią mas, Western blotting lub testami EISA w celu przeprowadzenia przetwarzania nanocząstek próbek moczu. Zbierz minimalną objętość 22 mililitrów i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do analizy.Zammrożony mocz rozmrozić w temperaturze pokojowej lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po rozmrożeniu krótko wymieszać na mikserze wirowym. Następnie wlej co najmniej 22 mililitry moczu do 50-mililitrowej stożkowej dolnej rurki polipropylenowej.Następnie odwiruj mocz w wirówce z odchylanym wirnikiem pod kątem 3 700 razy G przez 15 minut, nie naruszając osadu. Przelej mocz do czystej 50-mililitrowej stożkowej probówki polipropylenowej i wyrzuć granulkę. Wykonaj analizę moczu za pomocą wieloanalitowego paska odczynnika do pomiaru moczu.Połóż pasek odczynnika stroną zadrukowaną do góry na czystym, suchym ręczniku papierowym. Użyj jednorazowej pipety, aby odessać jeden mililitr moczu. Szybko dozuj jedną do dwóch kropli moczu na każdą podkładkę testową paska odczynnika.Natychmiast uruchom timer, który był wcześniej ustawiony na dwie minuty, o godzinie wskazanej na pojemniku z odczynnikiem. Zapisz wyniki jakościowe dla różnych analitów w pasku odczynnika, porównując kolor poszczególnych pasków odczynnika z odpowiednimi wskaźnikami oznaczonymi kolorami na pojemniku odczynnika. Typowe normalne wyniki moczu charakteryzują się pH od 5,5 do 7,0 i ciężarem właściwym od 1,001 do 1,020.Mocz powinien być ujemny dla białka krwi, leukocytów, azotynów, glukozy, ketonów, bilirubiny i urobilinogenu. Następnie przenieś 20 mililitrów oczyszczonego moczu do czystej 50-mililitrowej stożkowej dolnej rurki polipropylenowej. Nie należy naruszać żadnych osadów, które mogą znajdować się na dnie rurki moczowej, z której usuwasz mocz.Dodaj 200 mikrolitrów nanocząstek do 20-mililitrowej próbki moczu i krótko wymieszaj w mikserze wirowym. Następnie inkubuj mieszaninę nanocząstek moczu przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez kołysania lub mieszania. Wirować zawiesinę nanocząstek moczu w wirówce wyposażonej w odchylany wirnik pod ciśnieniem 3 700 razy G przez 10 minut.Po usunięciu i odrzuceniu supernatantu dodać 500 mikrolitrów wody Milli Q do granulki nanocząstek. Ponownie zawiesić nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół. Przenieś roztwór nanocząstek do czystej mikrorurki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.Następnie wiruj nanocząstki w wirówce wyposażonej w wirnik o stałym kącie nachylenia 16, 100 razy G przez 10 minut. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad przed powtórzeniem tych czynności z wodą. Aby umyć nanocząstki, dodaj 20 mikrolitrów świeżego buforu elucyjnego do granulki nanocząstek i ponownie zawieś nanocząstki, energicznie pipetując wielokrotnie w górę iw dół.Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie odwiruj próbki nanocząstek przed usunięciem snat bez przerywania osadu nanocząstek i zapisywania supernatantu w czystej 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Wyrzuć granulki do kosza na zagrożenia biologiczne.Umieść próbki w stojaku w dygestoriach chemicznych. Otwórz nakrętki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Alternatywnie należy umieścić próbki pod strumieniem azotu w temperaturze 40 stopni Celsjusza, aż wyschną.Do próbek dodać 15 mikrolitrów buforu do próbek tris glicyny SDS. Podgrzewać w temperaturze 100 stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym przez pięć minut z otwartymi nakrętkami lub do momentu, gdy objętość pozostała w probówce nie przekroczy 20 mikrolitrów. Umieść nasadkę na rurkach i wyjmij rurki z bloku grzewczego.Próbka może być przechowywana w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub natychmiast wykorzystana do dalszej analizy Western blot. Elektroforeza w żelu 1D wybarwiana srebrem wykazuje wychwytywanie nanocząstek i stężenie czynnika martwicy nowotworu alfa z ludzkiego osocza. Prążek reprezentujący czynnik martwicy nowotworu alfa jest obecny tylko w nanocząstkach EIT oznaczonych literą P dla cząstek, ale nie w supernatantowych nanocząstkach Funkcjonalizowane dwiema różnymi przynętami chemicznymi, kwasem akrylowym lub powłoką rdzeniową VSA są w stanie zbierać różne stężenia IL 17 z zachodniego osuszania osocza supernatantu i nanocząstki.EIT wyraźnie wykazuje obecność IL 17 w paśmie 17,5 kilodaltonu w eit, ale nie w nanocząstkach supernatantów. Pobieranie próbek moczu może ujawnić antygeny bakteryjne i cytokiny na tej poplamionej srebrem stronie SDS. Analiza próbek moczu próbek na torach U czwartym i U szóstym to nanocząstki EIT z próbek moczu zawierające RET ESAT 6, białko związane z prątkami gruźlicy i IL dwie A.Białka te są przedstawione przez wydatne prążki o średnicy 15 kilodaltonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób nanocząstki żelu mogą być wykorzystywane do zbierania, koncentrowania i zachowywania niskiego poziomu porzuconych biomarkerów w płynach biologicznych, jednocześnie wykluczając niechciane porzucone cząsteczki, co znacznie zwiększa czułość wykrywania obecnych metod analitycznych.

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Ten manuskrypt opisuje protokół izolowania egzosomów z ludzkiego moczu przy użyciu zmodyfikowanej techniki wytrącania.

Zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu

Ten protokół pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowych białek w 10 μL pełnej krwi w ciągu 30 minut. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu elektroprzędzonych mat nanowłóknistych zintegrowanych w lab-on-a-disc, który oferuje dużą powierzchnię, a także skuteczne mieszanie i mycie w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.

W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Ten protokół opisuje syntezę i formułowanie wstrzykiwalnych, supramolekularnych biomateriałów hydrożelowych polimerowo-nanocząsteczkowych (PNP). Przedstawiono zastosowania tych materiałów do dostarczania leków, stabilizacji biofarmaceutycznej oraz enkapsulacji i dostarczania komórek.

Supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe do wstrzykiwań do zastosowań w dostarczaniu komórek i leków

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Protokół ten standaryzuje analizę SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania korona białek na nanocząstkach, umożliwiając powtarzalne, skalowalne i niskokosztowe wykrywanie sygnatur specyficznych dla raka. Zaprojektowany do wczesnej diagnozy gruczolakoraka przewodowego trzustki, oferuje praktyczną, PEWNĄ alternatywę dla złożonych metod proteomicznych zarówno w badaniach, jak i klinicznych.

Standaryzowany przepływ SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Poznaj metodę izolacji biomarkerów o niskiej liczebności z osocza lub moczu przy użyciu nanocząsteczek hydrożelu. Technika ta znacząco zwiększa czułość detekcji białek w diagnostyce.

Nanocząsteczki hydrożelu pobierane z osocza lub moczu w celu wykrycia białek o niskiej liczebności

Przeglądaj więcej filmów