Name: Analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę analizy sieci błon rurkowych w miocytach przedsionków i komór serca myszy. Technika obejmuje izolację komórek, barwienie fluorescencyjne i mikroskopię konfokalną z ilościową analizą obrazu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca otrzymała wsparcie poprzez Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (podprojekty A05 i B05 do S.E.L.) i KFO 155 (podprojekt 4 do S.E.L.), nagrodę Fundacji Halbach dla S.E.L. wspierającą E.W.; grant od Niemieckiego Towarzystwa Kardiologicznego dla S.B.; oraz program wymiany DAAD wspierający T.K. jako gościa na Uniwersytecie Maryland. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej FP7/2007-2013 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 1. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (do S.E.L.). S.E.L. jest głównym badaczem Niemieckiego Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (DZHK).

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
<li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li>
<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
<li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2%2B+signaling+during+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%2C+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Chociaż miocyty serca są izolowane i badane od dziesięcioleci32, niedawny przegląd wykazał, że konsekwentne izolacje komórek miocytów wysokiej jakości pozostają wyzwaniem27. Odzwierciedla to stosunkowo złożone protokoły izolacji pierwotnych miocytów serca w porównaniu z brakiem wspólnych standardowych podejść, wspólnych metadanych i przejrzystej dokumentacji jakości komórek. Protokoły izolacji komórek są zwykle dostosowywane przez poszczególne grupy, dają różne wyniki izolatów komórek, zależą od indywidualnych ustawień modelu (np. gatunku, wieku, współistniejących chorób serca) i są zwykle dostosowywane do określonych warunków eksperymentalnych. W kontekście przedstawionych tutaj ilościowych badań i protokołów błonowych TATS, istotny poziom oceny jakości i dokumentacji dotyczy mikroskopii konfokalnej lub nadrozdzielczej poszczególnych struktur błony komórkowej podatnych na zmiany metaboliczne i zależne od protokołu izolacji, zarówno w AM, jak i VM. Co ważne, nawet jeśli wysoka wydajność izolatów komórkowych sugeruje zdrowe, nienaruszone miocyty, badacze muszą dokładnie udokumentować i krytycznie ocenić każdą pojedynczą komórkę pod kątem morfologicznych kryteriów integralności powierzchni i błony TATS w porównaniu z niespecyficznymi uszkodzeniami spowodowanymi procedurami izolacji w porównaniu z określonymi zmianami spowodowanymi różnymi rodzajami interwencji w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Istotną zmienną podczas izolacji komórek serca jest specyficzna aktywność danej partii kolagenazy. Aby wybrać nową partię kolagenazy, należy przetestować aktywność enzymatyczną kilku próbek kolagenazy względem siebie, oceniając wydajność i jakość miocytów serca oraz zgodnie z instrukcjami producenta. Idealnie byłoby, gdyby nowa partia kolagenazy została zidentyfikowana z aktywnością kolagenazy podobną do poprzednio zastosowanych partii (w celu rozszerzonej oceny możliwej aktywności enzymatycznej należy zapoznać się z "narzędziem wyboru partii kolagenazy" w tabeli materiałów i metod). Podsumowując, ilościowe podejścia do wizualizacji błony TATS zależą w decydującym stopniu od jakości izolacji komórek i odwrotnie, Izolacje komórek serca prowadzące do niespecyficznego uszkodzenia błony, udokumentowane za pomocą mikroskopii TATS, powinny spowodować krytyczny przegląd i korektę procedur izolacji. Ponieważ jakość izolacji komórek oraz wizualizacja i kwantyfikacja błony TATS są ze sobą nierozerwalnie związane, protokoły omówione w tym artykule obejmują wszystkie główne aspekty jako strategię ciągłą.
Dodatkowym wyzwaniem i częstym problemem w badaniach kardiologicznych jest uszkodzenie komórek i/lub utrata komórek z powodu interwencji upośledzających metabolizm, np. po zawale mięśnia sercowego9, ale muszą być oceniane pod kątem potencjalnego niezamierzonego uszkodzenia, np. w wyniku niezauważonego zatoru powietrznego podczas izolacji komórek. Izolacja miocytów serca od chorych serc może prowadzić do dodatkowej, znacznej utraty komórek i zmniejszenia wydajności komórek. Dlatego porównanie całkowitej liczby izolowanych nienaruszonych komórek między sercami kontrolnymi i chorymi może być znaczące, jeśli izolacja i liczenie komórek są konsekwentnie stosowane za pomocą standardowych protokołów. W związku z tym bardzo ważne jest, aby ocenić integralność komórek przez odpowiednią grupę kontrolną, która odzwierciedla najlepszą możliwą jakość izolacji komórek miocytów. Co ważne, jakość poszczególnych komórek i mikroskopia żywych komórek zdrowych i chorych oraz miocytów przypadkowo uszkodzonych w wyniku procedury izolacji może znacząco wpłynąć na analizę sieci błonowych TATS. Przedstawione tutaj protokoły podkreślają zatem integralność i stabilność fizjologicznych składników błony podczas izolacji komórek i mikroskopii żywych komórek nienaruszonych błon. Cały przepływ pracy został zaprojektowany jako ciągła strategia mająca na celu osiągnięcie i zachowanie nienaruszonych komponentów błony TATS przy jednoczesnym wykluczeniu uszkodzonych komórek, ponieważ będą one wykazywać artefakty błonowe zależne od izolacji, takie jak przerwane kanaliki błonowe, pęcherzyki błonowe i zmienione sieci TATS błędnie w warunkach kontrolnych i zagrażać dalszej analizie ilościowej. I odwrotnie, te same strategie są kluczowe dla badań interwencyjnych, które mogą zakłócić błony TATS, które zależą w decydującym stopniu od znaczących kontroli porównawczych między prawdziwie zdrową a prawdziwą chorą komórką ze zmianami błony TATS.
Ponadto zajmujemy się procedurami mającymi na celu osiągnięcie znacznie trudniejszej technicznie izolacji komórek AM. Pomimo postępu i ulepszonych protokołów, należy podkreślić, że odtworzenie wysokiej jakości izolacji komórek maszyn wirtualnych nie jest trywialne, a jeszcze mniej niezawodne w przypadku AM. Wynika to z ogólnej niższej wydajności komórek AM, gdzie nawet niewielkie błędy lub zmiany podczas izolacji komórek mogą prowadzić do całkowitego niepowodzenia izolacji komórek AM, podczas gdy łagodny stopień uszkodzenia komórek VM może być mniej widoczny w zawiesinie komórek ze względu na stosunkowo wysoką liczbę komórek w porównaniu z AM. Ponieważ ogniwa AM mogą ulec zakrzywieniu po izolacji, analiza za pomocą kilku ROI może być korzystna, jak opisano w kroku 4.3. Postępując zgodnie ze szczegółową procedurą etapów izolacji komórek, zapewniamy protokół bezpośredniego integralnego barwienia błonowego i konfokalnego lub STED obrazowania w nadrozdzielczości sieci TATS zarówno dla maszyn wirtualnych, jak i AM. Protokoły te umożliwiają zarówno analizę ilościową, jak i różnicowanie wybranych składników membran TATS na podstawie wcześniej ustalonych parametrów. W porównaniu z maszynami wirtualnymi, organizacja 3D i zachowania funkcjonalne przedsionkowej sieci TATS w AM są obecnie mniej zrozumiałe.
Procedury obrazowania błon TATS w żywych komórkach (kroki od 3.1 do 3.7) zostały opracowane przy użyciu komercyjnych mikroskopów konfokalnych (Tabela materiałów/sprzętu) i specjalnie zaprojektowanych mikroskopów fluorescencyjnych STED9. Aby zoptymalizować ustawienia mikroskopu do generowania obrazu fluorescencyjnego i ilościowej analizy TATS, następujące punkty mają ogólne znaczenie:
<ul>
	<li>Cel Aby ustalić drobne szczegóły struktur błony TATS, należy empirycznie przetestować, który obiektyw zapewnia najwyższą jakość obrazu przy ogniskowaniu na głębokości kilku mikrometrów w komórce. Niektóre mikroskopy konfokalne mogą działać lepiej z obiektywami wodnymi lub glicerolowymi, w przeciwieństwie do zastosowanych tutaj obiektywów olejowych 63X 1,4 NA. Obiektywy o powiększeniu 100X są używane do superrozdzielczej mikroskopii STED, zamieniając mniejsze pole widzenia na rozdzielczość nanometryczną34.</li>
	<li>Wzbudzenie i wzmocnienie Optymalne ustawienia mocy wzbudzenia i wzmocnienia detektora zależą od ścieżki światła mikroskopu, wydajności lasera i właściwości próbki. Idealnie byłoby, gdyby moc i wzmocnienie lasera były dostosowane tak, aby wykorzystać pełny zakres detektora, unikając przy tym nasycenia obrazu. Komercyjne pakiety oprogramowania do mikroskopii zwykle zawierają tabele przeglądowe, które wizualizują dolną i górną granicę zakresu dynamiki. Ponadto, aby zminimalizować bielenie barwnikiem, należy zastosować najniższą możliwą moc lasera, która nadal zapewnia wystarczające szczegóły strukturalne membrany TATS. Ponadto moc wzbudzenia powinna być wystarczająco niska, aby uniknąć skumulowanych uszkodzeń fotograficznych prowadzących do przykurczów miocytów i śmierci.</li>
	<li>Rozmiar w pikselach Użyj rozmiaru piksela zgodnego z próbkowaniem Nyquist, w przybliżeniu o połowę mniejszej rozdzielczości osiągniętej przy podanych ustawieniach. W przypadku obrazowania konfokalnego kompatybilny jest rozmiar piksela 100 nm x 100 nm, co również ograniczy wybielanie. Do mikroskopii nadrozdzielczej stosuje się znacznie mniejsze rozmiary pikseli, np. 20 nm x 20 nm dla mikroskopii STED9.</li>
	<li>Czas przebywania Mikroskopy konfokalne zapewniają funkcję uśredniania. Ogólnie rzecz biorąc, należy używać jak najkrótszego czasu przebywania pikseli, aby uniknąć wybielania w połączeniu z uśrednianiem sygnału, np. uśrednianiem linii ≥ 8, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Dokumentowanie zastosowanych ustawień mikroskopii za pomocą metadanych Po zoptymalizowaniu ustawień obrazowania szczegółów struktur membranowych TATS na konkretnym mikroskopie konfokalnym, zabezpiecz i/lub udokumentuj ustawienia (metadane protokołu). Uzyskaj wszystkie obrazy w (lub pomiędzy) grupami komórek o tym samym celu, mocy wzbudzenia, wzmocnieniu, rozmiarze piksela, czasie przebywania piksela i funkcji uśredniania. Jednakowe warunki obrazowania pozwalają na bezpośrednie porównanie i ocenę ilościową w obrębie grupy (lub pomiędzy) grupami komórek.</li>
	<li>Ogólne wskazówki i dalsze szczegóły dotyczące zasad i zastosowań mikroskopii konfokalnej można znaleźć w Podręczniku biologicznej mikroskopii konfokalnej (Pawley J.B., 3rd Edition, 2006, Springer Science+Business Media, LLC).</li>
</ul>
W przeciwieństwie do przedstawionych tutaj strategii analizy bezpośredniej, w poprzednich publikacjach opisujących błony TATS i zmiany związane z chorobą stosowano regionalne zagregowane odczyty gęstości kanalików T jako strategię ilościową16,17 lub pośrednie strategie regionalne oparte na analizie transformacji Fouriera sygnałów błony prążkowanej w celu oceny regularności składowej kanalikówT-tube 7. W przeciwieństwie do tego, opisane tutaj podejścia ilościowe są bezpośrednio związane z poszczególnymi komponentami TATS i dostarczają szeregu dodatkowych parametrów, w tym właściwości sieci membranowej i określonych składników, takich jak procent kanalików A. Co więcej, gęstość sieci TATS można określić ilościowo jako znormalizowaną długość całego wyodrębnionego szkieletu na obszar ROI. Liczba potrójnych połączeń trzech pojedynczych, stale połączonych elementów kanalików może być wykorzystana jako miara złożoności rozgałęzień sieci membranowej TATS. Zwracamy uwagę, że każda analiza najmniejszych składników TATS zależy od procedur barwienia. Z naszego doświadczenia wynika, że 800 μl roztworu di-8-ANEPPS o wielkości 50 μM wystarcza do barwienia całych sieci TATS w granulce ogniw zawierającej 50 000 ogniw VM9. Jeśli jednak osad komórkowy zawiera mniejszą liczbę miocytów serca, jeśli dostępne są silne detektory fluorescencji i jeśli interesujące jest obrazowanie konfokalne całego rozkładu sieci TATS, a nie najmniejszych szczegółów błony i zmian ilościowych, można zastosować niższe stężenia barwnika na podstawie badań empirycznych. Wreszcie, makro programowe napisane na potrzeby opisanej analizy może być wykorzystane do automatyzacji etapów przetwarzania obrazu w celu ułatwienia analizy większych zbiorów danych, co jest szczególnie przydatne do porównywania różnych grup leczenia (np. leków), typów komórek (np. AM kontra VM) i interwencji patofizjologicznych (np. pozorowanie a zawał mięśnia sercowego).
Do analizy obrazu sieci TATS stosuje się następującą sekwencję podstawowych kroków: 1) odejmowanie tła toczącej się kuli (4.5.1) w celu usunięcia przestrzennych różnic w intensywności tła; 2) miejscowe wzmocnienie kontrastu (4.5.2.); 3) wygładzanie obrazu (4.5.3); 4) scalanie regionów statystycznych (4.5.4); 5) określenie progu binaryzacji obrazu (4.5.6); oraz 6) obliczanie danych szkieletowych (4.5.8). Krytycznym krokiem podczas szkieletyzacji fluorescencyjnych obrazów TATS jest binaryzacja obrazu pokazana na rysunku 6. Powiązane kroki progowania ostatecznie określają, które prawdziwe struktury membranowe są wykrywane jako reprezentujące podstawowe komponenty TATS, a które potencjalnie fałszywe struktury zidentyfikowane przez błąd na podstawie szumu tła. Identyfikacja prawidłowego progu dla binarnej analizy obrazu powinna odpowiadać rzeczywistym strukturom membranowym TATS, które zależą od wystarczająco wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR) dla podejść do mikroskopii konfokalnej i nadrozdzielczej. W związku z tym należy najpierw ustalić wystarczającą jakość obrazu, a następnie połączyć ją z krytyczną oceną jakości poszczególnych komórek, w tym dokumentacją za pomocą obrazów w jasnym polu, jak pokazano. Alternatywne opcje dostosowania protokołu segmentacji obrazu do danych wyjściowych mikroskopu i/lub pytań fizjologicznych obejmują dekonwolucję obrazu i inne procedury progowania, takie jak "Otsu" lub "Iso-data", dostępne jako wtyczki ImageJ. Niezależnie od końcowej procedury segmentacji, uważamy, że porównanie danych wyodrębnionych i surowych za pomocą nałożenia obrazu jest obowiązkowym etapem kontroli jakości. Podsumowując, integralność morfologiczna i błonowa poszczególnych izolowanych miocytów, wystarczające barwienie wewnątrzkomórkowych błon TATS, optymalizacja parametrów obrazowania fluorescencyjnego oraz kontrola nakładek na wyodrębnione dane szkieletowe przyczynią się do poprawy jakości fluorescencyjnych obrazów TATS i wyników ilościowych.
Jeśli do izolacji komórek wykorzystuje się gatunki większe niż myszy, protokoły można łatwo dostosować w razie potrzeby. W przypadku kolejnych większych gatunków serca szczurów można kaniulować kaniulą 14 G (średnica zewnętrzna 2,1 mm) i perfundować z prędkością 8 ml/min. Znacznie starsze lub chore serca mogą wymagać jeszcze większych rozmiarów kaniuli. Ogólnie rzecz biorąc, perfuzja serca może być prowadzona albo przy stałym ciśnieniu, np. przy użyciu słupa wody o wysokości 1 m między zbiornikiem a aortą, albo przy stałym przepływie za pomocą pompy perystaltycznej. W przypadku izolacji komórek z małych serc gryzoni, takich jak myszy i szczury, korzystny może być stały przepływ, ponieważ trawienie kolagenazy ostatecznie zakłóci naczynia oporowe naczyń wieńcowych, prowadząc do nadmiernych szybkości perfuzji z nieszczelnych łożysk naczyniowych, które będą do pewnego stopnia kontrolowane przez protokoły stałego przepływu. W przeciwieństwie do tego, perfuzja pod stałym ciśnieniem jest korzystna, jeśli priorytetem jest monitorowanie natężenia przepływu i prawidłowa kaniulacja, co jest korzystne dla modeli interwencyjnych ze zmienionymi zachowaniami oporu naczyń krwionośnych, a także dla szkolenia procedur izolacji komórek.
Jak wspomniano powyżej, wystarczająca jakość komórek jest bardzo ważna dla badań ilościowych endogennych systemów błonowych. Jednak podczas perfuzji serca i trawienia kolagenazy wiele czynników może krytycznie wpływać na jakość izolacji komórek, czego nigdy nie należy lekceważyć podczas optymalizacji protokołu lub rozwiązywania problemów27. W szczególności aktywność danej partii kolagenazy powinna być określona dla określonej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, np. przedsionków lub komór przed przeprowadzeniem eksperymentalnych badań prowadzonych w dobrej wierze, w celu ustalenia warunków izolacji, które mają być utrzymane przez pozostałą część badania. Co więcej, jakość wody, pH, temperatura, optymalizacja i czyszczenie układu perfuzyjnego zminimalizują ryzyko niezamierzonego uszkodzenia przez zanieczyszczenia i zatorowość, a potencjalnie dodatkowe czynniki muszą być monitorowane w celu ustalenia optymalnych warunków homeostatycznych podczas izolacji komórek. BDM (2,3-butanodione-monoksym), odwracalny inhibitor mostków krzyżowych ATPazy miozyny, jest powszechnie stosowany podczas sekcji tkanek i trawienia w celu utrzymania rozluźnienia mięśnia sercowego, co zwiększa wydajność izolacji komórek. Niemniej jednak badacze muszą mieć świadomość, że BDM może wywierać niespecyficzne działania fosfatazy, co prowadzi do efektów niezamierzonych, np. hamowania prądów wymiany Na+/Ca2+ w pewnych warunkach33. W przypadku niektórych eksperymentów korzystne może być zastąpienie BDM blebbitatyną jako roztworem kardioplegicznym, inhibitorem o wysokim powinowactwie do miozyny w stężeniach mikromolowych, który jest jednak toksyczny i stosunkowo drogi oraz może mieć inne skutki niezgodne z celem. Zdrowe kardiomiocyty w stanie spoczynku nie powinny wykazywać żadnych skurczów przy braku stymulacji elektrycznej i takie komórki powinny być wyłączone z dalszej analizy. Z drugiej strony, skurcz i rozluźnienie miocytów serca w odpowiedzi na stymulację elektryczną przy fizjologicznych zewnątrzkomórkowych stężeniach Ca2 + można wykorzystać do ustalenia normalnego zachowania skurczowego jako dodatkowy środek do oceny funkcjonalnej jakości komórek i / lub nieprawidłowego zachowania w chorobach serca w porównaniu ze zdrowymi komórkami kontrolnymi.
Podsumowując, opisane tutaj protokoły izolacji pojedynczych komórek i ilościowej analizy obrazu zostały z powodzeniem zastosowane do mikroskopii konfokalnej i nadrozdzielczej sieci błonowej TATS w komórkach VM9 i AM21 , a także do analizy ilościowej sieci mikrotubul w utrwalonych miocytach serca (dane nie pokazane). Te i przyszłe zastosowania protokołów mogą otworzyć drogę do różnych pytań eksperymentalnych, takich jak charakterystyka błon TATS na różnych etapach rozwoju lub analiza struktur białkowych lub organelli związanych z błoną, które kontaktują się z siecią TATS w celu wywierania wysoce zlokalizowanych, specyficznych dla domeny funkcji sygnalizacyjnych w komórkach AM i VM.

W zdrowych komórkach mięśni prążkowanych występuje wiele rurowych struktur błonowych o "poprzecznej" orientacji (kanaliki T) prostopadłych do głównej osi komórki. W związku z tym kanaliki T zostały scharakteryzowane jako ciągłe przedłużenia głównej "bocznej" błony powierzchniowej komórki mięśniowej (sarcolemma), które głęboko wnikają w cytozol w kierunku środka komórki. Fizjologiczną rolą kanalików T ciągłych z zewnętrzną błoną powierzchniową jest szybkie sprzężenie elektryczne odległych przedziałów wewnątrzkomórkowych utworzonych przez domeny kontaktowe organelli SER w całej stosunkowo dużej objętości komórek mięśnia sercowego poprzez nanometryczne sprzężenie zbliżeniowe aktywowanych napięciem kanałów Ca2+ typu L (Cav1.2) prąd wewnętrzny (ICa) aktywujący sąsiedni receptor ryanodine (RyR2) SER Ca2+ Zwalnia. W miocytach komorowych (VM) uważa się, że nieciągłe kontakty błonowe ("połączenia") między domenami połączeniowymi SER a kanalikami T kontrolują tysiące indywidualnych wewnątrzkomórkowych nanodomen uwalniających Ca2 + w każdej komórce1.
Dla każdej domeny kontaktowej, zestawione ze sobą części błony T-kanalika i obwodowego (połączeniowego) SER są blisko siebie oddalone o około 15 nm, stąd zdefiniowane jako nanodomena. W ten sposób segregowane są bardzo małe indywidualne podprzestrzenie cytoplazmatyczne, które umożliwiają quasi-autonomiczne zachowania kompartmentów. Gdy przychodzący potencjał czynnościowy aktywuje kanały Cav1.2 w kanalikach T maszyn wirtualnych, stosunkowo mały prąd wewnętrzny Ca2+ szybko zwiększy stężenie podprzestrzeni Ca2+ [Ca2 +] S w nanodomenie1 o wielkości attolitra. Następnie wzrost [Ca2 +] S aktywuje bramkowane Ca2+ receptory ryanodine (RyR2) w odległości nanometrów w zestawieniu błonowym SER, a proces ten zachodzi we wszystkich elektrycznie sprzężonych nanodomenach miocytów. RyR2 występują jako gęste wielokanałowe klastry z szacowaną stechiometrią 1 kanału Cav1.2 na 5-10 kanałów RyR22. Ponieważ gradient SER-to-cytozol [Ca2+] jest bardzo stromy (stosunek 104:1), a RyR2s funkcjonują jako kanały uwalniania Ca2+ o wysokiej przewodności w funkcjonalnie sprzężonych klastrach, aktywacja RyR2 powoduje ilościowo duży prąd uwalniania Ca2+ z domen SER sprzężonych z kanalikami T, zwiększając lokalną podprzestrzeń [Ca2+] S do 100 μM lub więcej w ciągu 1-2 ms3,4. To zachowanie wzmocnienia sygnału serca jest również określane jako uwolnienie Ca2 + indukowane Ca2 + (CICR). Podsumowując, kanaliki T są niezbędnymi strukturami błonowymi, które szybko aktywują sygnały uwalniające Ca2 + poprzez połączeniowe kontakty SER w nanodomenie i CICR w całej komórce podczas sprzężenia wzbudzenie-skurcz (EC).
Oprócz kanalików T, kanaliki osiowe (A-kanaliki) o znacznie różniącej się orientacji równoległej do głównej (podłużnej) osi komórki zostały udokumentowane za pomocą mikroskopii elektronowej (EM), konfokalnej i mikroskopii 2-fotonowej. Na przykład, ciągłą sieć A kanalików A między miofibrylami połączonymi z kanalikami T w pobliżu linii Z sarkomeru wykazano za pomocą znaczników zewnątrzkomórkowych i obrazowania EM utrwalonych VM świnki morskiej5. Korzystając z zewnątrzkomórkowego barwienia fluoresceiną sprzężoną z dekstranem i obrazowania na żywo 2-fotonowych maszyn wirtualnych szczurów, zwizualizowano złożoną siatkowatą sieć kanalików 3D składającą się z ~60% kanalików T i ~40% kanalików A6. Badanie to nie tylko doprowadziło do wizualizacji 3D licznych kanalików A, ale także do uświadomienia sobie, że sekcje do wizualizacji EM są z natury ograniczone do analizy złożonych i dynamicznych sieci błonowych, takich jak system kanalików poprzeczno-osiowych (TATS). W związku z tym opracowano konfokalne obrazowanie żywych komórek błon TATS bezpośrednio barwionych di-8-ANNEPS. Jeśli sieci TATS aktywnych komórek są analizowane za pomocą transformacji Fouriera, regularne pojawianie się składników kanalików T w przestrzeni w pobliżu linii Z sarkomeru jest odzwierciedlone przez zespołowe widmo mocy z obszaru sygnałów prążkowanych7. Ta strategia analizy pośredniej została wykorzystana do wykrycia regionalnych zmian w całej komórce w regularności składowej TATS w modelach choroby7. Na przykład knock-down junktofiliny-2 za pośrednictwem shRNA spowodował niewydolność serca, a niedobór białka specyficznego dla izoformy spowodował reorganizację kanalików T z dysfunkcją uwalniania nanodomeny Ca2 + 8. Niedawno rozszerzyliśmy analizę sieci błonowych TATS poprzez bezpośrednie podejścia ilościowe, a następnie za pomocą mikroskopii nadrozdzielczej pojedynczych składników TATS w mysich maszynach wirtualnych przy użyciu nanoskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED)9. Nanometryczna rozdzielczość obrazu pozwoliła na bezpośrednią analizę mniejszych pojedynczych komponentów TATS, które przybliżają rozkład 50:50 orientacji kanalików poprzecznych i osiowych, ilościowo potwierdzając dwa liczne, ale różnie zorientowane indywidualne składniki TATS w zdrowych sercach myszy9. Strategie te zostaną szczegółowo opisane w poniższej sekcji dotyczącej protokołu.
Podczas gdy fizjologiczna rola obfitych składników A-kanalików w sercu dorosłego pozostała enigmatyczna, badania EM udokumentowały struktury błony SER związane z kanalikami A, co sugeruje endogenne nanodomeny uwalniające Ca2+ w VMs świnki morskiej i szczura5,10. Analiza konfokalna Cav1.2 i RyR2 wykazała wysoki stopień kolokalizacji w połączeniach A-kanalików10. Ponieważ ~ 20% spontanicznych iskier Ca2 + w maszynach wirtualnych szczurów pochodziło stosunkowo daleko od prążków linii Z, w których zwykle występują kanaliki T, jednym z argumentów było to, że nanodomeny związane z kanalikami A mogą rzeczywiście istnieć i funkcjonować jako miejsca uwalniania Ca2 + 11,12. Co ciekawe, tworzenie i dojrzewanie kanalików T następuje dopiero po urodzeniu i przebiega równolegle ze wzrostem komórek serca, np. poprzez kiełkowanie prekursorowych wgłębień sarkolemmalnych w P5 i niedojrzałych rozgałęzionych zespołów sieci TATS w P10 u myszy13. Wydaje się, że Junctophilin-2 jest szczególnie ważna dla poporodowej dojrzałości sieci TATS, ponieważ knock-down shRNA uniemożliwił zakotwiczenie błon kanalików T w połączeniach SER, co prowadzi do opóźnionego uwalniania Ca2 + i patologicznej organizacji TATS zgodnej z niedojrzałymi architekturami zdominowanymi przez kanaliki A w maszynach wirtualnych13. Obserwacje te mogą ostatecznie doprowadzić do dowodu słuszności koncepcji, że kanaliki T powstają w wyniku procesów wgłębiania błony, podczas gdy kanaliki A mogą przekształcać się poprzez dodatkowe lub nawet alternatywne mechanizmy wewnątrzkomórkowe14.
Charakterystyka zmian błony TATS w chorobach serca stała się ważnym obszarem badawczym dla zagadnień patofizjologicznych. Wstępne doniesienia w psim modelu niewydolności serca wywołanej stymulacją wykazały utratę kanalików T i prądu Cav1.2 (ICa)15. Świński model kardiomiopatii niedokrwiennej wykazał zmniejszoną gęstość kanalików T i zmniejszoną synchronizację wewnątrzkomórkowego uwalniania Ca2 + 16. Wykorzystując szczurzy model spontanicznie nadciśnieniowy (SHR) niewydolności serca, utrata kanalików T wiązała się ze zmniejszonym sprzężeniem nanodomen Cav1.2 i RyR2 przez proponowany mechanizm "osierocenia RyR2"7. Utrata kanalików T wykazano również w ludzkich VM z próbek kardiomiopatii niedokrwiennej, poszerzonej i przerostowej17. Ponadto odnotowano wzrost liczby kanalików A w skrawkach tkanek ludzkiej kardiomiopatii rozstrzeniowej18. Po zawale mięśnia sercowego wykazaliśmy zróżnicowany mechanizm reorganizacji TATS w mysich maszynach wirtualnych ze znaczącymi spadkami kanalików T w przeciwieństwie do wzrostów składowych kanalików A9. Co ważne, poprawa lokalnego kontrastu błonowego osiągnięta dzięki mikroskopii STED z superrozdzielczością żywych komórek umożliwiła szczegółową analizę składników ilościowych za pomocą pomiarów bezpośrednich, które wykazały znaczną proliferację kanalików A przy ogólnym wzroście długości sieci TATS i złożoności rozgałęzień9. Ponadto wykazano, że trening fizyczny może odwrócić przebudowę kanalików T u szczurów po zawale mięśnia sercowego19 oraz że terapia resynchronizująca serce może prowadzić do odwrotnej przebudowy kanalików T u psów z niewydolnością serca wywołaną tachypacingiem przedsionkowym20. Podsumowując, badania zarówno na chorych ludziach, jak i zwierzętach, a także potencjalne interwencje terapeutyczne prawdopodobnie skorzystają na wysokiej jakości procedurach izolacji komórek i szczegółowych strategiach analizy ilościowej, jak opisano w poniższych sekcjach protokołu i wyników.
Ponadto, jak ostatnio wykazano na przykładzie transportu izoform kanału kanału KATP 21 na powierzchni bocznej w porównaniu z błoną TATS, ważne jest, aby rozważyć miocyty przedsionkowe (AM) jako biologicznie odrębne, a także porównawczy model komórek serca w porównaniu z VMs. Kanaliki T zostały ostatnio udokumentowane u owiec i ludzi AM22. Obecne dowody sugerują, że niewiele kanalików T istnieje w komórkach AM i zazwyczaj u większych ssaków, takich jak owce i ludzie, ale nie u małych gryzoni. W przeciwieństwie do maszyn wirtualnych, w AM wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2 + wydaje się zachodzić z powierzchni komórki rozchodząc się przez dyfuzję w kierunku środka komórki, co powoduje wyraźne przestrzenne i czasowe gradienty Ca2 + 23. W tym kontekście ważne wydaje się wyjaśnienie mechanizmów wewnątrzkomórkowej niestabilności sygnalizacji Ca2 + dla powszechnych postaci chorobowych, takich jak migotanie przedsionków24. Podsumowując, zarówno izolacja komórek AM, jak i VM, a także każda z nich dla zdrowych i chorych serc są powszechnie stosowanymi protokołami. Tylko wtedy, gdy izolacja komórek zostanie przeprowadzona prawidłowo, zgodnie z oceną wynikającą z dokumentacji mikroskopowej o wystarczającej jakości komórek, próbki AM i VM powinny być przenoszone do ilościowej analizy TATS. W związku z tym poniższe sekcje protokołu są krytycznie zależne od wysokiej jakości izolatów komórkowych od myszy lub innych gatunków, a następnie mikroskopii żywych komórek w celu analizy nienaruszonych błon TATS. Jak wskazano wcześniej, charakterystyka membran TATS jest wymagającym obszarem badawczym ze skłonnością do artefaktów utrwalania i preparacji6, zmianami błony spowodowanymi zmianami osmotycznymi i ograniczeniami rozdzielczości konwencjonalnej mikroskopii świetlnej9. Zwracamy uwagę, że najnowsze najnowocześniejsze protokoły izolacji ludzkich AM do obrazowania Ca2 + i patch-clamp oraz szczurzych maszyn wirtualnych do hodowli komórkowych zostały wcześniej opublikowane w tym czasopiśmie25,26.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Chemikalia i enzymy</td></tr><tr><td>2,3-butanodionu monoksymus</td><td>Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca bydlęca</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>SH30073</td><td>Triple 0.1 &micro; m sterylne przefiltrowane.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy</td><td>21115</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:10 w wodzie MQ w celu uzyskania 100 mM stężenia CaCl2 stock.</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Niemcy</td><td>na życzenie</td><td>Aktywność enzymatyczna zależy od poszczególnych partii kolagenazy. Kolagenaza II i inne aktywności enzymatyczne (kazeinaza, clostripaina, tryptyk) można ocenić w "narzędziu do wyboru partii kolagenazy". Określ wydajność i jakość komórek indywidualnie dla każdej nowej partii kolagenazy.</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Rotexmedica, Trittau, Niemcy</td><td>PZN-03862340</td><td>Rozcieńczony w 0,9% NaCl i wstrzyknięty podskórnie w skórę brzucha.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Forene 100% (V/V)</td><td>Abbott, Libertyville, IL, USA</td><td>B506</td><td>Substancja czynna: izofluran, 250 ml. Użyć około 2 Vol% w przyrządzie dozującym powietrze/tlen.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Laminina (2 mg/ml)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy</td><td>354232</td><td>Laminowanie opisano w kroku 2.1.</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dyes</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>D-3167</td><td>Roztwór podstawowy 2 mM w DMSO</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy</td><td>T8154</td><td>Błękit trypanowy delikatnie miesza się 1:1 za pomocą pipety z tworzywa sztucznego o pojemności 1 ml z zawiesiną komórek przed zliczeniem komórek w cytometrze Neubauera.</td></tr><tr><td colspan="4">Langendorff Perfusion Setup</td></tr><tr><td>Termostat cyrkulacyjny</td><td>Lauda, Lauda-K&ouml; nigshofen, Niemcy</td><td></td><td>Proszę zapoznać się z Louch et al. (JMCC 2011). Podgrzej termostat i w rurkach perfuzyjnych do 37 & stopni; C 15 min przed użyciem.</td></tr><tr><td>Elastyczna rurka silikonowa Tygon do pompy perystaltycznej</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>224-2252</td><td>Rurkę należy regularnie wymieniać.</td></tr><tr><td>Elastyczna rurka silikonowa Tygon do termostatu</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>228-4340</td><td></td></tr><tr><td>Wężyk perfuzyjny otaczający wężownicę grzewczą</td><td>Rettberg, G&ouml; ttingen, Niemcy</td><td>wykonane na zamówienie</td><td>Wężownicę grzewczą i rurki należy po użyciu dokładnie wyczyścić wodą MQ. Nie używaj detergentów. Elementy szklane należy regularnie kąpać&nbsp; w 10 mM NaOH przez noc.</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Ismatec, Wertheim, Niemcy</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>Zawór odcinający trójdrożny Discofix C Luer Lock 10 cm</td><td>Braun, Melsungen, Szwajcaria</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>Kurek odcinający trójdrożny Discofix 3SC</td><td>Braun, Melsungen, Szwajcaria</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>42 mm szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Menzel Gl&auml; ser via Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>na zamówienie</td><td>Grubość 0,13-0,16 mm</td></tr><tr><td>Kaniula 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td><td>304432</td><td>Przyciąć na długość ~5 mm, zszorstkować papierem ściernym.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do cytometru Neubauer 24 x 24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser via Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>na zamówienie</td><td>Grubość 0,38-0,42 mm</td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe, końcówki 0,5 mm, lekka krzywizna</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Carl Zeiss, Jena, Niemcy</td><td></td><td>63X 1,4 NA</td></tr><tr><td>Ulepszony cytometr olejowy Neubauer</td><td>Labor Optik, Friedrichsdorf, Niemcy</td><td>1100000</td><td>Procedura liczenia: Przetrzeć cytometr i szkiełko nakrywkowe dostarczone z komorą liczenia 70 % etanolem. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do komory liczenia, tak aby dwie szklane powierzchnie stykały się i można było zaobserwować pierścienie Newtona. Następnie 10-20 i mikro; Zawiesinę komórek L można nałożyć na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby została zassana do pustki przez działanie kapilarne. Policz nienaruszone i ubyte miocyty za pomocą kwadratów siatki cytometru, która odzwierciedla 100 nl. Powtórz procedurę liczenia na drugiej siatce znajdującej się na cytometrze. Oblicz gęstość komórek w oryginalnej zawiesinie komórek, biorąc pod uwagę wszelkie rozcieńczenia i skróty liczenia.</td></tr><tr><td>Komora obrazowania POC-R2</td><td>Pecon, Erbach, Niemcy</td><td></td><td>Objętość zawieszenia komórek: 800 i mikro; l; pożądana gęstość poszycia: ~1,000 AM i ~10,000 VM</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe, ostrza 8 mm proste,</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze studenckie dumont #7, inox</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów dla studentów, zakrzywione, 11,5 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów dla studentów, proste, 11.5 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do chirurgii studenckiej, proste, ostre, 12 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek, 1 x 2 zęby, cienkie, 10 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>11023-10</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

W miocytach serca złożona sieć kanalików błonowych - system kanalików poprzeczno-osiowych (TATS) - kontroluje głębokie funkcje sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Podczas gdy zewnętrzna błona powierzchniowa i związane z nią składniki błony TATS wydają się być ciągłe, istnieją znaczne różnice w zawartości lipidów i białek. W miocytach komorowych (VM) niektóre składniki TATS są bardzo liczne, przyczyniając się do prostoliniowych sieci kanalików i regularnych rozgałęzionych architektur 3D. Uważa się, że obwodowe składniki TATS propagują potencjały czynnościowe z powierzchni komórki do tysięcy odległych wewnątrzkomórkowych domen kontaktowych błony siateczki sarkoendoplazmatycznej (SER), aktywując w ten sposób wewnątrzkomórkowe jednostki uwalniające Ca2 + (CRU). W przeciwieństwie do maszyn wirtualnych, organizacja i funkcjonalna rola błon TATS w miocytach przedsionków (AM) jest znacząco inna i znacznie mniej poznana. Podsumowując, ilościowa charakterystyka strukturalna sieci błonowych TATS w zdrowych i chorych miocytach jest niezbędnym warunkiem wstępnym do lepszego zrozumienia plastyczności funkcjonalnej i patofizjologicznej reorganizacji. W tym miejscu przedstawiamy strategiczną kombinację protokołów do bezpośredniej analizy ilościowej sieci membranowych TATS w działających maszynach wirtualnych i AM. W tym celu towarzyszymy pierwotnym izolacjom komórek mysich maszyn wirtualnych i/lub AM z krytycznymi etapami kontroli jakości i protokołami bezpośredniego barwienia błon do obrazowania fluorescencyjnego membran TATS. Korzystając ze zoptymalizowanego przepływu pracy do konfokalnego lub superrozdzielczego przetwarzania obrazów TATS, generowane są binaryzowane i szkieletowe dane do analizy ilościowej sieci TATS i jej komponentów. W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanych strategii pośredniej regionalnej analizy zagregowanych obrazów, nasze protokoły umożliwiają bezpośrednią charakterystykę określonych składników i wyprowadzanie złożonych właściwości fizjologicznych sieci błonowych TATS w żywych miocytach dzięki wysokiej przepustowości i otwartym dostępowi narzędzi programowych. Podsumowując, strategia protokołu łączonego może być z łatwością stosowana w ilościowych badaniach sieci TATS podczas fizjologicznej adaptacji miocytów lub zmian chorobowych, porównania różnych typów komórek serca lub mięśni szkieletowych, fenotypowania modeli transgenicznych oraz interwencji farmakologicznych lub terapeutycznych.

W miocytach serca struktury błony kanalikowej tworzą sieci wewnątrzkomórkowe. Opisujemy zoptymalizowane protokoły i) izolacji miocytów z serca myszy, w tym kontroli jakości, ii) barwienia żywych komórek do najnowocześniejszej mikroskopii fluorescencyjnej oraz iii) bezpośredniej analizy obrazu w celu ilościowego określenia złożoności składników i plastyczności sieci błon wewnątrzkomórkowych.

Analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza sieci błon kanalikowych w miocytach przedsionkowych i komorowych. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie miocytów przedsionkowych i komorowych z serca dorosłej myszy. W drugim etapie poprzeczny system kanalików osiowych lub tats jest barwiony w nienaruszonych żywych izolowanych miocytach serca.Następnie sieć membranowa tats jest wizualizowana za pomocą mikroskopii konfokalnej lub fluorescencji stacjonarnej, a następnie składniki sieci są analizowane ilościowo. Ostatecznie różnice między sieciami błonowymi różnych typów komórek lub między grupami pozorowanymi a leczonymi można ujawnić za pomocą ilościowej analizy obrazu tats. Główną zaletą tej techniki izolacji i analizy komórek jest to, że kompleksowy przebieg procesu izolacji prowadzi do bezpośredniego obrazowania fluorescencyjnego miocytów, co pozwala na ilościową analizę danych sieci błony dotykowej.Metoda ta może zapewnić wgląd w organizację złożonych sieci błonowych u żywych, zdrowych kardiomiocytów, ale może być również stosowana do miocytów zwierząt chorych lub transgenicznych. Nowicjusze w tym protokole skorzystają z dodatkowego szkolenia wprowadzającego, aby osiągnąć spójną izolację wysokiej jakości miocytów serca i ważny warunek wstępny do wykonania tej techniki: Aby wyizolować miocyty, zacznij od perfuzji serca myszy w wieku 12 tygodni lub starszej za pomocą natlenionego buforu perfuzyjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery minuty, gdy tylko możliwe jest usunięcie narządu. Następnie obserwuj serce buforem trawiennym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem do 10 minut, monitorując postęp trawienia tkanek w celu zwiększenia nieprzezroczystości, miękkości i kwasowości na całej widocznej powierzchni serca.Po strawieniu odchyl prawy uszek przedsionka i rozetnij prawy przedsionek tuż nad zastawkami komorowymi przedsionków. Kontynuuj sekcję z lewym przedsionkiem, a następnie wypreparuj i wyrzuć włóknisty aparat zastawkowy. Zakończ preparację, uwalniając lewą i prawą wolną ścianę komory oraz przegrodę i mniejsze części tkanek w razie potrzeby.Następnie przenieś całą tkankę komorową na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 2,5 mililitra buforu trawiennego, a następnie pokrój tkankę na około milimetrowe kawałki sześcienne. Powoli zjadaj kawałki tkanek za pomocą pipety transferowej, aby delikatnie zdysocjować miocyty komorowe na zawiesinę pojedynczej komórki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków lub uszkodzenia strumienia płynu. Następnie dodaj 7,5 mililitra buforu zatrzymującego do zawiesiny komórek.Równolegle pokrój strawioną tkankę przedsionkową na około milimetrowe kawałki sześcienne w jednym mililitrze trawienia, buforuj na 60-milimetrowej szalce Petriego, a następnie delikatnie trytuj miocyty przedsionków, jak właśnie pokazano. Po mechanicznym wymieszaniu dodać cztery mililitry buforu zatrzymującego, aby zatrzymać resztkową aktywność kolagenazy w zawiesinie miocytów przedsionkowych. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i pozwól pozostałym fragmentom tkanki osiadać przez 15 sekund przed pobraniem izolowanych miocytów z frakcją supinatową.Po jednym etapie mycia delikatnie Resus zawiesił miocyty przedsionkowe w pięciu mililitrach buforu perfuzyjnego i podzielił zawiesinę komórkową na 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe w przybliżeniu 10 razy do trzech podwielokrotności komórek, aby zabarwić błony miocytów komorowych. Najpierw pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie przez osiem minut, a następnie wyślij 1,5-mililitrową rurkę reakcyjną do barwienia miocytów przedsionkowych, odrzuć komórki na dwie minuty w temperaturze 20 razy G w temperaturze pokojowej dla dowolnego typu komórek. Następnie ostrożnie usuń supinat, uważając, aby uniknąć niepotrzebnego poruszenia osadu komórkowego.Następnie delikatnie ponownie zawieś komórki w 800 mikrolitrach specyficznego dla błony barwnika tyle dye dye osiem i eps natychmiast przenieś miocyty na szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą w komorze obrazowania po 15-minutowej inkubacji w ciemnym praniu. Okładka ślizga się raz, a następnie przykryj je jednym mililitrem buforu perfuzyjnego. Wykonaj przykładowy obraz centralnego wewnątrzkomórkowego przekroju miocytów, a następnie użyj funkcji przycinania, aby dostosować okno przycinania i ostateczny rozmiar piksela do 100 na 100 nanometrów.Aby wybrać ostateczną płaszczyznę obrazowania, użyj pojedynczych klatek obrazu, aby ręcznie wybrać najbardziej odpowiednią płaszczyznę obrazowania w kierunku Z. Upewnij się, że sieć membranowa TA obejmuje zarówno elementy rurki t, jak i rurki i jest wizualnie widoczna w płaszczyźnie ogniskowej. Należy zauważyć, że typowa płaszczyzna obrazowania wewnątrzkomórkowego może zawierać jądro jako centralny wewnątrzkomórkowy punkt odniesienia.Aby przeanalizować sieć membranową tats i jej komponenty, otwórz teraz plik obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby wyznaczyć obszar zainteresowania, wykluczając zewnętrzną błonę powierzchniową i uwzględniając wewnątrzkomórkowe części sieci membranowej tats, jak pokazano na tym obrazie. Następnie użyj poleceń edytuj i wyczyść na zewnątrz, aby wygenerować wybrany zwrot z inwestycji w taki sposób, aby wybrany obszar wewnątrzkomórkowy zawierał tylko części błony wewnątrzkomórkowej sieci tats, ale nie żadne części błony powierzchniowej.Teraz kliknij proces i odejmij tło i ustaw promień toczącej się piłki na pięć pikseli. Następnie wybierz proces i zwiększ kontrast lokalny. I ustaw rozmiar bloku na 49, pojemniki histogramu na 256, maksymalne nachylenie na trzy, a maskę na brak.Kliknij process and smooth w obszarze wtyczek, wybierz segmentację i scalanie regionów statystycznych i ustaw parametr na Q 100. Następnie kliknij pokaż średnie. Następnie wybierz typ obrazu i osiem bitów, a następnie wybierz regulację obrazu i próg, zaczynając od progu 40.Należy pamiętać, że prawidłowy wybór progu powinien wytwarzać tylko określone struktury membranowe TATS, a nie sygnały fałszywie dodatnie spowodowane szumem tła. Następnie w obszarze wtyczki wybierz szkielet i szkielet 2D 3D i zapisz szkieletowany obraz 2D jako plik adoptywny. Teraz ponownie wybierz wtyczki i przeanalizuj szkielet 2D 3D, aby przeanalizować szkieletowy plik obrazu w celu uzyskania danych ilościowych.Następnie wybierz brak dla metody cyklu przycinania i potwierdź automatyczne wygenerowanie wynikowej tabeli danych. Teraz użyj kierunkowości wtyczki Fidżi, aby przeanalizować indywidualne orientacje odpowiednich komponentów sieci podatkowej na podstawie szkieletowych danych obrazu. W polu Metoda wybierz komponenty FURIERA, przedziały końcowe 180 i początek histogramu minus 45 stopni.Na koniec sprawdź tabelę wyświetlania i wygeneruj histogram kierunkowości. Na tym pierwszym rysunku pokazano reprezentatywny szkieletowy obraz tats w zdrowym miocycie komorowym złożonym z elementów poprzecznych, które są prostopadłe do osi X obrazu i składników osiowych, które są równoległe do osi x, zastosowanie wtyczki kierunkowości skutkuje histogramem orientacji dla tatów komorowych z porównywalnymi pikami przy zerowych stopniach, reprezentujące proporcję osiową i pod kątem 90 stopni reprezentujące poprzeczną. W przeciwieństwie do tego, reprezentatywny szkieletowy obraz tats w miocytach przedsionków składa się przede wszystkim ze składników osiowych, które są równoległe do osi X obrazu.W związku z tym odpowiedni histogram orientacji wykazuje dominujący pik wokół przedziału zerowego stopnia reprezentujący osiową proporcję tats i tylko mały pik pod kątem 90 stopni, reprezentujący proporcję poprzeczną tats Podczas próby tej procedury ważne jest, aby sprawdzić jakość komórek na każdym etapie po izolacji komórki, podczas obrazowania i, co najważniejsze, tuż przed analizą obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób złożone struktury błonowe, sieci tes i potencjalnie białka związane z błoną są w pełni zróżnicowane. Dorosłe miocyty serca można obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej i analizować ilościowo.Nie zapominaj, że praca z oczami z błoną lipofilową, enzymami trawiennymi i potencjalnie zakaźnym pacjentem kardiologicznym może stanowić zagrożenie i że podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak ochrona skóry przed żelazem.

analysis-tubular-membrane-networks-cardiac-myocytes-from-atria

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Ten protokół przedstawia nowatorską metodę tworzenia przestrzennie szczegółowego modelu elementów skończonych wewnątrzkomórkowej architektury kardiomiocytów na podstawie obrazów z mikroskopii elektronowej i mikroskopii konfokalnej. Moc tego szczegółowego przestrzennie modelu została zademonstrowana na podstawie studiów przypadków z zakresu sygnalizacji wapniowej i bioenergetyki.

Stworzenie strukturalnie realistycznego modelu geometrycznego kardiomiocytów metodą elementów skończonych w celu zbadania roli architektury komórkowej w biologii układów kardiomiocytów

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca2+) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Poznaj metodę analizy sieci błon rurkowych w miocytach przedsionków i komór serca myszy. Technika obejmuje izolację komórek, barwienie fluorescencyjne i mikroskopię konfokalną z ilościową analizą obrazu.

Analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór

Przeglądaj więcej filmów