Name: Koherentna mikroskopia rozpraszania Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) wizualizuje tabletki farmaceutyczne podczas rozpuszczania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj mikroskopię CARS do wizualizacji rozpuszczania tabletek farmaceutycznych w czasie rzeczywistym. Ta metoda łączy obrazowanie chemicznie selektywne z spektroskopią UV, umożliwiając korelację zmian powierzchni z profilem uwalniania leku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AF jest wspierany przez Holenderską Fundację Technologiczną STW, która jest działem nauk stosowanych NWO, oraz Program Technologiczny Ministerstwa Spraw Gospodarczych. (STW OTP 11114).

<img alt="Schemat układu spektroskopii optycznej; obejmuje laser, mikroskop, komorę przepływową; do badania absorpcji." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rycina 1. Schemat przedstawiający konfigurację mikroskopu CARS z wbudowanym układem rozpuszczania w przepływie. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fussell et al13.
1. Uruchamianie systemu
<ol>
	<li>Włącz laser CARS 1 064 nm z impulsem 20 psec i pozwól laserowi się rozgrzać (ok. 1,5 h).</li>
	<li>Włącz UV-owskie źródło światła z lampą deuterową i pozwól mu się rozgrzać (ok. 10 min).</li>
	<li>Otwórz migawkę w UV-owym źródle światła z lampą deuterową, ustawiając przełącznik migawki w pozycji „open”.</li>
	<li>Włącz komputer sterujący mikroskopem i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem.</li>
	<li>Włącz komputer spektrometru UV i uruchom oprogramowanie sterujące spektrometrem.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni obiektyw mikroskopu. Aby uzyskać wyniki przedstawione w niniejszej pracy, użyj obiektywu 20X/0.5 NA.</li>
	<li>Ustaw filtry w wieżyczce zestawu filtrów tak, aby przepuszczały lasery wzbudzające i odbijały sygnał CARS. Aby powtórzyć wyniki pokazane w tej pracy, wybierz lustro dichroiczne długoprzepustowe 775 nm oraz filtr przepustowy 650 nm 40 nm.</li>
	<li>Umieść przed detektorem w postaci lampy fotopowielającej (PMT) odpowiednie filtry, które przepuszczają sygnał CARS i odfiltrowują niepożądane światło. Aby odtworzyć eksperymenty przeprowadzone w tej pracy, filtruj światło za pomocą filtra krótkoprzepustowego 750 nm i filtra przepustowego 650 nm 40 nm.</li>
</ol>
3. Testowanie systemu
<ol>
	<li>Włączyć pompę perystaltyczną i przepompować medium do rozpuszczania przez kilka minut przez Z-kształtną przepływową kuwetę UV, aby usunąć pozostałości poprzedniego płynu z przewodów.</li>
	<li>Wyznaczyć szybkość przepływu pompy, ważąc ilość medium do rozpuszczania przepompowanego w ciągu 2 min. Regulować prędkość pompy aż do osiągnięcia pożądanej szybkości przepływu. W celu uzyskania wyników przedstawionych w niniejszej pracy, medium do rozpuszczania należy pompować z szybkością przepływu 5 ml/min.</li>
</ol>
4. Pomiar rozpuszczalności metodą UV
<ol>
	<li>W oprogramowaniu sterującym spektrometrem UV kliknij menu „File”, a następnie wybierz „New absorbance measurement”, aby otworzyć okno z listą wszystkich dostępnych spektrometrów.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni spektrometr UV, a następnie kliknij „Next”, aby otworzyć okno z parametrami akwizycji danych.</li>
	<li>Zdefiniuj czas całkowania oraz uśrednianie widma. Aby powtórzyć wyniki przedstawione w tej pracy, wybierz czas całkowania 150 msec i 200 uśrednień.</li>
	<li>Kliknij przycisk „Next”, aby wyświetlić ekran służący do rejestracji widma referencyjnego.</li>
	<li>Kliknij przycisk z ikoną żółtej żarówki, aby zarejestrować widmo referencyjne. Podczas tego pomiaru nieustannie pompuj medium do rozpuszczania.</li>
	<li>Zamknij migawkę źródła światła UV lampy deuterowej, ustawiając przełącznik w pozycji „closed”.</li>
	<li>Kliknij przycisk „Next”, aby wyświetlić ekran służący do rejestracji widma ciemnego.</li>
	<li>Kliknij przycisk z ikoną szarej żarówki, aby zarejestrować widmo ciemne. Podczas tego pomiaru nieustannie pompuj medium do rozpuszczania.</li>
	<li>Kliknij przycisk „Finish”, aby rozpocząć pomiary absorbancji UV.</li>
</ol>
5. Film z rozpuszczania CARS
<ol>
	<li>W oprogramowaniu sterującym mikroskopem CARS kliknij przycisk umożliwiający wybór pomiaru „XYT”.</li>
	<li>Kliknij rozwijane menu i wybierz rozmiar obrazu w pikselach. Aby odtworzyć obrazy przedstawione w niniejszej pracy, wybierz rozmiar obrazu 512 x 512 pikseli.</li>
	<li>Przesuń suwak prędkości obrazowania do pozycji „fast” (szybka), „medium” (średnia) lub „slow” (wolna). Aby uzyskać wyniki pokazane w niniejszej pracy, zastosuj szybką prędkość skanowania (1,12 sec na obraz).</li>
	<li>Kliknij strzałki oznaczone jako „zoom”, aby dostosować poziom powiększenia. Wybierz powiększenie „2x”, aby uzyskać ten sam poziom powiększenia i pole widzenia (350 x 350 µm), które zastosowano w tych wynikach.</li>
	<li>Kliknij rozwijane menu i wybierz użyty obiektyw.</li>
	<li>Kliknij pole wprowadzania i wpisz liczbę klatek wymaganą dla filmu z rozpuszczania CARS (zależnie od długości eksperymentu). Aby odtworzyć wyniki pokazane w niniejszej pracy, przeprowadź rozpuszczanie przez około 15 min, rejestrując 900 klatek.</li>
</ol>
6. Strojenie długości fali CARS
<ol>
	<li>Za pomocą kontrolera oscylatora parametrycznego (OPO) dostrój ustawienia OPO, takie jak temperatura, pozycja piezoelektryka i pozycja filtra Lyota, aż do osiągnięcia maksymalnej mocy wyjściowej lasera przy żądanej częstotliwości Ramana. Ustaw OPO na 2,960 cm-1, aby uzyskać wyniki zgodne z tymi przedstawionymi w niniejszym artykule.</li>
</ol>
7. Eksperyment z rozpuszczania
<ol>
	<li>Umieść tabletkę w uchwycie na próbkę specjalnie zbudowanej celi przepływowej CARS, a następnie mocno dokręć uchwyt, aby zapobiec wyciekom.</li>
	<li>Podłącz rurki do celi przepływowej CARS, łącząc ją z zlewkiem zawierającym medium do rozpuszczania oraz z pompą perystaltyczną.</li>
	<li>Umieść celę przepływową CARS z tabletką na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Upewnij się, że cela przepływowa CARS jest połączona ze zlewkiem z medium do rozpuszczania, pompą perystaltyczną, Z-kształtną celą przepływową UV oraz zlewkiem na odpady.</li>
	<li>Kliknij przycisk „XY repeat”, aby uruchomić skanowanie systemu mikroskopowego w trybie ciągłym.</li>
	<li>Wyreguluj ostrość mikroskopu, przesuwając obiektyw, aż powierzchnia tabletki pojawi się w polu widzenia na ekranie komputera sterującego mikroskopem.</li>
	<li>Kliknij suwak w oprogramowaniu sterującym mikroskopem oznaczony jako „PMT”. Dostosuj czułość detektora, zwiększając lub zmniejszając napięcie PMT, aż na ekranie pojawi się satysfakcjonujący obraz (ani zbyt ciemny, ani nasycony). UWAGA: Należy uważać, aby nie przeciążyć PMT zbyt wysokim napięciem. W tej pracy zastosowano napięcie PMT w okolicy 600 V, jednak wartość ta może się różnić w zależności od użytego PMT.</li>
	<li>Kliknij „Stop” w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby zatrzymać skanowanie ciągłe.</li>
	<li>Jednocześnie (lub tak blisko siebie, jak to możliwe) rozpocznij pompowanie medium do rozpuszczania, rejestrację pojedynczego skanu XYT oraz zbieranie widm absorbancji UV.</li>
	<li>W trakcie eksperymentu z rozpuszczania monitoruj nagranie wideo i ręcznie reguluj ostrość mikroskopu, aby upewnić się, że tabletka pozostaje stale w polu ostrości.</li>
</ol>
8. Po rozpuszczeniu
<ol>
	<li>Wyłączyć pompę perystaltyczną.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym mikroskopem wybrać menu „File”, a następnie kliknąć „Save as video”, aby zapisać skan XYT jako plik wideo.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym spektrometrem wybrać menu „File”, kliknąć „Save”, a następnie „Stop Export”, aby zatrzymać gromadzenie widm absorpcji UV.</li>
	<li>Zdjąć celę przepływową CARS zy stołu mikroskopu i wyjąć tabletkę z celi przepływowej CARS.</li>
	<li>Umyć celę przepływową CARS wodą i etanolem, a następnie osuszyć ją za pomocą ręcznika papierowego.</li>
</ol>

<ol><li>Ku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Biopharmaceutical+Classification+System+in+Early+Drug+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of the Biopharmaceutical Classification System in Early Drug Development.</a> The AAPS Journal. 10, 208-212 (2008).</li>
<li>The United States Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22United+States+Pharmacopeial+Convention+32nd+ed%22">United States Pharmacopeial Convention 32nd ed</a>. , Rockville, MD. 1-8 (2009).</li>
<li>Florence, A. J., Johnston, A. Applications of ATR UV/vis spectroscopy in physical form characterisation of pharmaceuticals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlorence%2C+AJ+%22Spectrosc.+Eur%22">Spectrosc. Eur</a>. 4, John Wiley & Sons Ltd. (2004).</li>
<li>Aaltonen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+solvent-mediated+phase+transformations+during+dissolution+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of solvent-mediated phase transformations during dissolution testing.</a> J. Pharm. Sci. 95, 2730-2737 (2006).</li>
<li>Savolainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+understanding+of+dissolution+behaviour+of+amorphous+drugs+by+in+situ+solid-state+analysis+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Better understanding of dissolution behaviour of amorphous drugs by in situ solid-state analysis using Raman spectroscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71, 71-79 (2009).</li>
<li>Slipchenko, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+of+tablets+by+epi-detected+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analyst. 135, 2613-2619 (2010).</li>
<li>Parekh, S. H., Lee, Y. J., Aamer, K. A., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Cellular+Imaging+by+Broadband+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Label-Free Cellular Imaging by Broadband Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Biophys. J. 99, 2695-2704 (2010).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Visualization+of+Paclitaxel+Distribution+and+Release+by+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In Situ Visualization of Paclitaxel Distribution and Release by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 78, 8036-8043 (2006).</li>
<li>Kang, E., Robinson, J., Park, K., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+distribution+in+poly%28ethylene+glycol%29%2Fpoly%28lactide-co-glycolic+acid%29+blends+and+its+release+visualized+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel distribution in poly(ethylene glycol)/poly(lactide-co-glycolic acid) blends and its release visualized by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J. Controlled Release. 122, 261-268 (2007).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy+to+image+the+changes+in+a+paclitaxel-poly%28styrene-b-isobutylene-b-styrene%29+matrix+pre-+and+post-drug+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Application of coherent anti-stokes Raman scattering microscopy to image the changes in a paclitaxel-poly(styrene-b-isobutylene-b-styrene) matrix pre- and post-drug elution.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87A, 913-920 (2008).</li>
<li>Jurna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+to+monitor+drug+dissolution+in+different+oral+pharmaceutical+tablets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy to monitor drug dissolution in different oral pharmaceutical tablets.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2, 37-43 (2009).</li>
<li>Windbergs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Imaging+of+Oral+Solid+Dosage+Forms+and+Changes+upon+Dissolution+Using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical Imaging of Oral Solid Dosage Forms and Changes upon Dissolution Using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 81, 2085-2091 (2009).</li>
<li>Fussell, A., Garbacik, E., Offerhaus, H., Kleinebudde, P., Strachan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+dissolution+analysis+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+and+hyperspectral+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In situ dissolution analysis using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and hyperspectral CARS microscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85, 1141-1147 (2013).</li>
<li>Lua, Y. -Y., Cao, X., Rohrs, B. R., Aldrich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterizations+of+Spin-Coated+Films+of+Ethylcellulose+and+Hydroxypropyl+Methylcellulose+Blends.+%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Surface Characterizations of Spin-Coated Films of Ethylcellulose and Hydroxypropyl Methylcellulose Blends. </a> Langmuir. 23, 4286-4292 (2007).</li>
<li>Skoog,, Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C++%22Principles+of+Instrument+analysis.+6+ed%22">Principles of Instrument analysis. 6 ed</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2007).</li>
<li>Rodríguez-Hornedo, N., Lechuga-Ballesteros, D., Hsiu-Jean, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+and+heterogeneous%2Fepitaxial+nucleation+of+hydrated+and+anhydrous+theophylline+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Phase transition and heterogeneous/epitaxial nucleation of hydrated and anhydrous theophylline crystals.</a> Int. J. Pharm. 85, 149-162 (1992).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas przeprowadzania eksperymentów rozpuszczania mikroskopowego CARS istnieje kilka krytycznych aspektów, które muszą być monitorowane podczas eksperymentu. Po pierwsze, wprowadzenie pożywki do rozpuszczania do komory przepływowej CARS powoduje ruch ogniska. Oznacza to, że obraz jest natychmiast tracony i potrzeba kilku mikronów regulacji obiektywu, aby ponownie znaleźć powierzchnię. Po drugie, istnieje ryzyko wycieku cieczy z komory przepływowej CARS, jeśli szklana pokrywa pęknie podczas eksperymentu. Może to potencjalnie spowodować uszkodzenie optyki przez ciecze, dlatego ważne jest, aby nasłuchiwać, czy nie ma trzaskającego dźwięku, który może oznaczać pęknięcie szkła. Wreszcie, istnieje również niewielka szansa, że rurociąg może zostać zablokowany z powodu cząstek stałych w systemie podczas eksperymentu, może to być postrzegane jako nagła nietypowa zmiana widm UV, a także poprzez okresowe sprawdzanie przepływu podczas eksperymentu.
Zablokowanie przewodów w postaci cząstek stałych jest głównie problemem w przypadku tabletek, które zostały zaprojektowane tak, aby rozpadały się podczas rozpuszczania. Jest to jedno z ograniczeń tej techniki, ponieważ system ten wymaga, aby powierzchnia tabletki pozostała nienaruszona przez cały czas rozpuszczania, aby umożliwić obrazowanie. Oprócz rozpadających się tabletek, obecnie nie jest możliwe obrazowanie tabletek, które są zaprojektowane tak, aby pęcznieć podczas rozpuszczania, ponieważ może to prowadzić do pęknięcia komory przepływowej CARS.
Obrazowanie tabletek podczas rozpuszczania zapewnia lepsze zrozumienie tego, co dzieje się na powierzchni tabletki do rozpuszczania. Konwencjonalne farmaceutyczne metody rozpuszczania koncentrują się wyłącznie na zawartości leku rozpuszczonej w pożywce do rozpuszczania, która może określić, czy tabletka spełnia wymaganą normę, czy też nie. Jednak w przypadku nieudanego testu trudno jest określić, co było przyczyną awarii. Przypadek nieudanego testu rozpuszczania jest potencjalnie miejscem, w którym analiza rozpuszczalności in situ przy użyciu mikroskopii CARS może dostarczyć odpowiedzi.
Przyszłe zastosowania analizy rozpuszczania in situ przy użyciu mikroskopii CARS mogą obejmować badania z użyciem bardziej skomplikowanych tabletek zawierających więcej niż jeden lek lub substancję pomocniczą, w szczególności postaci dawkowania o przedłużonym lub kontrolowanym uwalnianiu bez pęcznienia podczas opracowywania preparatu. Ponadto możliwe jest badanie próbek przy użyciu bioistotnych pożywek do rozpuszczania, tworząc warunki bardziej zbliżone do warunków in vivo. 
Podsumowując, praca ta pokazuje, że mikroskopia CARS jest zdolna do szybkiego obrazowania specyficznego chemicznie w oparciu o częstotliwości drgań Ramana, co pozwala na selektywne obrazowanie leku w tabletce zawierającej zarówno lek, jak i substancję pomocniczą. Ponadto mikroskopia CARS w połączeniu ze spektroskopią absorpcyjną UV na linii produkcyjnej jest potężnym narzędziem zdolnym do monitorowania powierzchni tabletek ulegających rozpuszczaniu i korelowania zmian powierzchni obserwowanych za pomocą CARS ze zmianami szybkości rozpuszczania.

Podczas opracowywania doustnych form dawkowania farmaceutycznego, takich jak tabletki i kapsułki, kładzie się duży nacisk na testowanie rozpuszczania. Doustne postacie dawkowania muszą się rozpuścić, zanim będą mogły zostać wchłonięte w celu uzyskania skuteczności terapeutycznej. Leki słabo rozpuszczalne na ogół mają problemy z osiągnięciem odpowiedniego stężenia, co sprawia, że badanie rozpuszczalności jest szczególnie ważne1. Metody rozpuszczania farmakopealnego są najczęściej stosowane do analizy rozpuszczania. W większości przypadków wymaga to przygotowania leku w postaci tabletki lub kapsułki, którą następnie umieszcza się w zlewce z przepływającym podłożem do rozpuszczania. Stężenie rozpuszczonego leku jest następnie oznaczane poprzez analizę próbek pożywki do rozpuszczania przy użyciu standardowej techniki spektroskopowej, takiej jak spektroskopia absorpcyjna UV2. Te tradycyjne farmaceutyczne metody rozpuszczania nie zapewniają żadnej bezpośredniej analizy próbki ani żadnych zmian, które mogą wystąpić na powierzchni rozpuszczania postaci dawkowania. Bezpośrednia analiza próbki podczas rozpuszczania może dostarczyć więcej informacji na temat postaci dawkowania rozpuszczania i potencjalnie zidentyfikować problemy powodujące niepowodzenie testu rozpuszczania.
Bezpośrednia analiza form dawkowania wymaga użycia technik analitycznych in situ, które są w stanie monitorować proces rozpuszczania. Aby prowadzić rejestrację in situ podczas rozpuszczania, na technikę analityczną nie może mieć wpływu obecność pożywki do rozpuszczania, a technika ta wymaga wysokiej rozdzielczości czasowej, aby wiarygodnie zmierzyć zmiany w postaci rozpuszczania w ciągu kilku sekund. Wykazano, że spektroskopia UV z całkowitym odbiciem jest odpowiednia do pomiaru zmian podczas rozpuszczania, ale brakuje jej rozdzielczości przestrzennej zapewnianej przez techniki obrazowania3. Tradycyjne techniki obrazowania farmaceutycznego, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i spontaniczne mapowanie Ramana, mają czynniki ograniczające, które uniemożliwiają ich stosowanie in situ do rozpuszczania.
Obrazowanie SEM to technika szybkiego obrazowania o wysokiej rozdzielczości, zdolna do obrazowania powierzchni farmaceutycznych form dawkowania. Jednak obrazowanie SEM jest zwykle wykonywane w warunkach próżni i wymaga powlekania próbki, co czyni je nieodpowiednim do obrazowania rozpuszczania in situ. Spontaniczna spektroskopia Ramana sprzężona z włóknami w połączeniu z spektroskopią absorpcyjną przepływu przez komórki i przepływem UV została przeprowadzona w celu monitorowania różnych systemów leków in situ podczas rozpuszczania, w tym teofiliny4, karbamazepiny i indometacyny5. Spektroskopia Ramana była w stanie zidentyfikować zmiany powierzchniowe zachodzące podczas rozpuszczania, ale nie dostarczyła żadnych informacji przestrzennych na temat tego, gdzie zachodzą zmiany powierzchni. Spontaniczne mapowanie Ramana wykorzystuje widma Ramana i dostarcza informacji przestrzennych o powierzchni próbki, ale obrazowanie trwa od kilku minut do godzin w zależności od obszaru obrazu, co czyni je nieodpowiednim do obrazowania rozpuszczania in situ.
Mikroskopia z koherentnym rozpraszaniem Ramanowskim (CARS) jest techniką szybkiego obrazowania, a w połączeniu z inline spektroskopią absorpcyjną UV, pozwoliła nam rozwinąć technikę zdolną do analizy rozpuszczania in situ. Mikroskopia CARS zapewnia szybkie, selektywne chemicznie obrazowanie, na które nie ma wpływu obecność pożywki do rozpuszczania, co czyni ją odpowiednią techniką do analizy rozpuszczania in situ. Techniki CARS są z grubsza podzielone na dwie grupy w zależności od czasu trwania impulsu laserów; jeden z nich to wąskopasmowe CARS (pikosekundowe lasery impulsowe), a drugi to szerokopasmowe CARS (lasery impulsowe femtosekundowe). Typowy system mikroskopowy CARS składa się z dwóch impulsowych źródeł laserowych i mikroskopu odwróconego. Aby wytworzyć sygnał CARS, jeden z laserów impulsowych musi być przestrajany tak, aby istniała różnica częstotliwości między dwoma laserami, która odpowiada wibracjom Ramana. Dodatkowo oba lasery muszą nakładać się na siebie w przestrzeni (przestrzennie) i czasie (czasowe), przy czym impulsy z obu laserów docierają do tego samego obszaru próbki w tym samym czasie. Ponieważ drgania Ramana są specyficzne chemicznie, a sygnał CARS jest generowany tylko w obrębie ogniskowej mikroskopu, mikroskopia CARS jest zdolna do chemicznie selektywnego obrazowania z rozdzielczością aż do granicy dyfrakcji.
Wąskopasmowa mikroskopia CARS wykorzystująca pojedynczy tryb wibracji Ramana pozwala na około 100x szybsze obrazowanie w porównaniu do technik spontanicznego mapowania Ramana6. Szerokopasmowe obrazy mikroskopowe CARS w szerszym zakresie spektralnym (600-3,200 cm-1 vs. ~4 cm-1), ale mają niższą rozdzielczość spektralną (około 10 cm-1 vs. ~4 cm-1) i wolniejszą prędkość obrazowania (50 ms/piksel vs. ~5 μs/piksel) w porównaniu z wąskopasmową mikroskopią CARS7.
Wąskopasmowa mikroskopia CARS została użyta do zobrazowania uwalniania leków z niektórych systemów farmaceutycznych. W dziedzinie preparatów farmaceutycznych Kang i wsp. 8-10 obrazowanych filmów polimerowych załadowanych lekiem. Początkowo zobrazowali rozkład załadowanego leku, a następnie zobrazowali uwalnianie leku z pożywki do rozpuszczania statycznego. Jurna i wsp. 11 oraz Windbergs i wsp.12 poszedł o krok dalej i najpierw zobrazował rozkład teofiliny w postaci dawkowania lipidów, a następnie obrazował rozpuszczanie leku za pomocą dynamicznego podłoża do rozpuszczania.
Opracowaliśmy nową metodę analityczną do jednoczesnego monitorowania zmian powierzchni tabletki przechodzącej rozpuszczanie za pomocą wąskopasmowej mikroskopii CARS, podczas jednoczesnego rejestrowania stężenia rozpuszczonego leku za pomocą spektroskopii absorpcyjnej UV. Ilustrujemy zastosowanie tej metody tabletek do obrazowania zawierających modelowy lek teofilinę w połączeniu z etylocelulozą poddawaną rozpuszczaniu z wodą jako medium do rozpuszczania.

<table><tbody><tr><td>Paladin 1,064 nm laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>Prototyp model nie na sprzedaż</td></tr><tr><td>Levante Emerald Optyczny oscylator parametryczny</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 300 Lampa</td> fotopowielacza <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R3896</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optyka wolnostojąca / filtry</td><td>Thorlabs i Chroma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reglo pompa perystaltyczna</td><td>Spektrometr ISMATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB2000+</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła DT-MINI-2-GS</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIA-Z-SMA-TEF w kształcie litery Z</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QP400-2-SR-BX światłowód</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka z tworzywa sztucznego</td><td>Komora</td> przepływowa do tabletek rozpuszczających ISMATEC <td></td><td></td></tr><tr><td>CARS</td> Zbudowany w domu na uniwersytecie - zaprojektowany do przechowywania tabletek o średnicy 12 mm i grubości 3 mm.<td></td><td></td><td> Komora przepływowa ma głębokość kanału około 0,5 mm.</td></tr><tr><td>Zlewki szklane</td><td>VWR</td><td>D108980</td><td></td></tr><tr><td>Teofilina bezwodna</td><td>BASF</td><td>30058079</td><td></td></tr><tr><td>Etyloceluloza</td><td>Colorcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

koherentna mikroskopia rozpraszania ramana przeciwko stokesowi (cars) wizualizuje tabletki farmaceutyczne podczas rozpuszczania

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Tradycyjne farmaceutyczne testy rozpuszczania określają ilość leku rozpuszczonego w czasie, mierząc zawartość leku w pożywce do rozpuszczania. Ta metoda dostarcza niewiele bezpośrednich informacji o tym, co dzieje się na powierzchni rozpuszczonej tabletki. Ze względu na to, że skład i struktura powierzchni tabletki mogą ulec zmianie podczas rozpuszczania, konieczne jest monitorowanie jej podczas badania rozpuszczania. W niniejszej pracy spójna mikroskopia rozpraszania Ramana Stokesa jest wykorzystywana do obrazowania powierzchni tabletek podczas rozpuszczania, podczas gdy spektroskopia absorpcyjna UV zapewnia jednocześnie analizę inline stężenia rozpuszczonego leku dla tabletek zawierających 50% mieszaninę bezwodnego teofiliny i etylocelulozy. Pomiary wykazały, że mikroskopia CARS in situ jest w stanie selektywnie obrazować teofilinę w obecności etylocelulozy. Dodatkowo, bezwodny teofilina przekształcał się w monohydrat teofiliny podczas rozpuszczania, przy czym kryształy w kształcie igieł rosły na powierzchni tabletki podczas rozpuszczania. Konwersja bezwodnego teofiliny do monohydratu w połączeniu ze zmniejszoną ekspozycją leku na przepływające pożywkę do rozpuszczania skutkowała zmniejszeniem szybkości rozpuszczania. Nasze wyniki pokazują, że mikroskopia CARS in situ w połączeniu ze spektroskopią absorpcyjną UV inline jest w stanie monitorować rozpuszczanie tabletek farmaceutycznych i korelować zmiany powierzchni ze zmianami szybkości rozpuszczania.

In situ analiza rozpuszczania z wykorzystaniem mikroskopii CARS została przeprowadzona na tabletkach (średnica 12 mm, płaskie powierzchnie) zawierających mieszaninę 50:50 modelowego leku – teofiliny bezwodnej oraz etylocelozoy, przy zastosowaniu wody destylowanej pompowanej z prędkością 5 ml/min jako medium rozpuszczającego. Obrazy CARS (512 x 512 pikseli) gromadzono co 1,12 s przy częstotliwości drgań Ramanowskich 2 960 cm-1, która jest selektywna dla zawartości teofiliny w tabletce, przez cały czas trwania eksperymentu rozpuszczania. Rysunek 2 przedstawia wybrane klatki z filmu z rozpuszczania. Na początku rozpuszczania (Rysunek 2, czas 0 s) widoczne są zielone obszary wskazujące zawartość teofiliny w tabletce oraz ciemne obszary, w których na powierzchni tabletki obecna jest tylko etyloceloza. W ciemnych obszarach na powierzchni tabletki można słabo dostrzec zawartość etylocelozy. Wynika to z faktu, że zgłasza się, iż etyloceloza posiada częstotliwości drgań Ramanowskich z maksimami około 2 930 i 2 975 cm-1 14. Po około 60 s wydaje się następować początek wzrostu kryształów monohydratu teofiliny na powierzchni, co objawia się jako wąskie, igłowate kryształy rosnące na zewnątrz od co najmniej jednego zarodka kryształu w centrum klatki (Rysunek 2, czas 60 s). Wzrost kryształów monohydratu jest znacznie wyraźniejszy po 130 s (Rysunek 2, czas 130 s). Dodatkowo w punkcie czasowym 130 s można zauważyć, że kryształy monohydratu nie rozprzestrzeniły się całkowicie po powierzchni tabletki. Wydaje się, że obecność obszarów etylocelozy fizycznie zablokowała wydłużanie się igieł monohydratu. Po 250 s widać, że pokrycie powierzchni monohydratem nie jest tak wyraźne, co sugeruje, że same kryształy monohydratu zaczynają się rozpuszczać.
<img alt="Mikroskopia poklatkowa krystalizacji białka w czasie 250 sekund; analiza mikroskopowa." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Klatki z filmu z rozpuszczania metodą CARS. Wybrane obrazy CARS (2 960 cm-1) z filmu z rozpuszczania tabletki z bezwodnikiem teofiliny z etylocelulozą. Obraz z 0 s został zarejestrowany w jednym obszarze próbki, natomiast obrazy z 60, 130 i 250 s zostały zarejestrowane w innym obszarze próbki. Film CARS jest dostępny jako materiał uzupełniający. Pasek skali wynosi 50 µm.
Spektroskopia ultrafioletowa (UV) jest rodzajem spektroskopii absorpcyjnej, w której jako źródła wzbudzenia wykorzystuje się światło UV. Spektroskopia UV mierzy przejścia elektronowe ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego15. Teofilina wykazuje szeroki pik z maksimum około 270 nm, podczas gdy etyloceluloza jest praktycznie nierozpuszczalna w medium do rozpuszczania, w związku z czym nie oczekuje się, aby wpływała na rejestrowane widmo UV. Analiza medium do rozpuszczania przy użyciu zintegrowanej z linią przepływu celi UV w kształcie litery z pozwala na ilościowe oznaczenie ilości leku rozpuszczonego podczas procesu rozpuszczania. Rysunek 3 przedstawia profil rozpuszczania UV dla tabletki zawierającej bezwodną teofilinę i etylocelulozę. Profil rozpuszczania UV (Rysunek 3) wykazuje, że rozpuszczanie bezwodnej teofiliny rozpoczyna się szybko, osiągając maksymalne stężenie około 90 µg/ml w ciągu 120 sec; po tym czasie szybkość rozpuszczania zaczyna spadać. Spadek szybkości rozpuszczania może wynikać z obecności kryształów monohydratu teofiliny (rozpuszczalność 6 mg/ml przy 25 °C 16) na powierzchni, które są mniej rozpuszczalne niż bezwodna teofilina (rozpuszczalność 12 mg/ml przy 25 °C 16) i są wyraźnie widoczne w filmie z rozpuszczania CARS (Rysunek 2>) w tym punkcie czasowym. Stopniowy spadek szybkości rozpuszczania można również częściowo wyjaśnić ograniczeniem kontaktu teofiliny z przepływającym medium. Ograniczenie to następuje, ponieważ etyloceluloza jest praktycznie nierozpuszczalna w wodzie, zatem w miarę rozpuszczania teofiliny pozostała etyloceluloza utrudnia dostęp teofiliny do medium do rozpuszczania.
<img alt="Wykres stężenia w funkcji czasu, pokazujący szczyt i spadek, istotny dla analizy kinetyki reakcji." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Profil rozpuszczania UV. Wykres stężenia w funkcji czasu dla tabletki zawierającej bezwodny teofilinian w połączeniu z etylocelulozą, przedstawiający stężenie teofiliny w medium do rozpuszczania podczas eksperymentu rozpuszczania.

Mikroskopia CARS (Coherent anti-Stokes Raman scattering) jest połączona z wewnętrznym układem rozpuszczania przepływowego, aby umożliwić wizualizację in situ i w czasie rzeczywistym powierzchni tabletek farmaceutycznych ulegających rozkładowi. Korzystając z tej niestandardowej konfiguracji, możliwe jest skorelowanie filmów CARS z profilami rozpuszczania leków zarejestrowanymi za pomocą wbudowanej spektroskopii absorpcyjnej UV.

Koherentna mikroskopia rozpraszania Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) wizualizuje tabletki farmaceutyczne podczas rozpuszczania

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie chemicznie selektywnego obrazowania na powierzchni tabletki poddawanej rozpuszczaniu farmaceutycznemu przy użyciu analizy rozpuszczania in situ w samochodzie. Osiąga się to poprzez uprzednie dostrojenie systemu laserowego samochodu do częstotliwości selektywnej dla substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania w tabletce i ustawienie spektrometru absorpcji UV do rejestrowania widm. Drugim krokiem jest umieszczenie tabletki w komorze przepływowej rozpuszczania samochodu i szczelne przykręcenie.Następnie komora przepływowa rozpuszczania samochodu jest umieszczana na stoliku mikroskopu, a orurowanie łączy ją z pompą i medium rozpuszczającym. Ostatnim krokiem jest jednoczesne nagranie filmu rozpuszczania samochodu przy jednoczesnym pompowaniu medium rozpuszczającego i rejestrowaniu widm absorpcji UV. Ostatecznie analiza rozpuszczania in situ car jest wykorzystywana do pokazania, że zmiany powierzchni podczas rozpuszczania mogą być wizualizowane i korelowane ze zmianami szybkości rozpuszczania.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak metody rozpuszczania w farmakopii, jest to, że analiza rozpuszczania w init car dostarcza szczegółowych informacji o powierzchni tabletki, która może się zmieniać podczas rozpuszczania. Aby rozpocząć, włącz laser samochodowy i źródło światła ultrafioletowego lub UV lampy deuterowej i pozwól mu się rozgrzać. Otwórz migawkę na źródle światła UV lampy deuterowej, ustawiając przełącznik migawki w pozycji otwartej.Następnie włącz komputer sterujący mikroskopem i otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem. Włącz komputer spektrometru UV i otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem. Wybierz żądany obiektyw mikroskopu.Ustaw filtry w wieżyczce zestawu filtrów, aby transmitowały lasery wzbudzenia i odbijały sygnał samochodu. Umieść odpowiednie filtry przed detektorem rurki powielacza zdjęć, aby przesyłać sygnał samochodu i filtrować niepożądane światło. W celu przetestowania systemu włącz pompę perystaltyczną i przepompuj medium do rozpuszczania przez komórkę przepływową UV w kształcie litery V na kilka minut, aby usunąć poprzednią ciecz z rurociągu.Określić natężenie przepływu pompy, ważąc ilość roztworu przepompowywanego przez dwie minuty. Dostosuj prędkość pompy, aż do osiągnięcia żądanego natężenia przepływu. Aby zmierzyć rozpuszczanie promieniowania UV w oprogramowaniu sterującym spektrometrem UV, kliknij menu file.Następnie kliknij przycisk Nowy pomiar absorbancji, aby otworzyć okno z listą wszystkich dostępnych spektrometrów. Kliknij właściwy spektrometr UV, a następnie kliknij dalej, aby otworzyć okno, w którym wyświetlane są parametry akwizycji danych. Zdefiniuj zarówno czas całkowania, jak i uśrednianie widmowe.Kliknij przycisk oznaczony obok, aby wyświetlić ekran używany do nagrywania widma referencyjnego. Kliknij przycisk, który pojawia się jako żółta żarówka, aby w sposób ciągły rejestrować medium do rozpuszczania pompy widma referencyjnego. Podczas tego pomiaru zamknij przesłonę na źródle światła UV lampy deuterowej, ustawiając przełącznik w pozycji zamkniętej.Kliknij przycisk oznaczony obok, aby wyświetlić ekran używany do nagrywania ciemnego spektrum. Kliknij przycisk, który pojawia się jako szara żarówka, aby w sposób ciągły nagrywać medium do rozpuszczania pompy o ciemnym spektrum. Podczas tego pomiaru kliknij przycisk z napisem Zakończ, aby rozpocząć pomiary absorbancji UV w oprogramowaniu sterującym mikroskopem samochodowym, kliknij przycisk, który wybiera pomiar XYT.Kliknij pole rozwijane i wybierz rozmiar obrazu w pikselach. Przeciągnij suwak szybkości obrazowania do pozycji szybkiej, średniej lub wolnej. Kliknij strzałki oznaczone jako powiększenie, aby dostosować poziom powiększenia.Następnie kliknij listę rozwijaną i wybierz zastosowany cel. Kliknij pole wprowadzania i wpisz liczbę klatek wymaganą do nagrania wideo z rozpuszczania samochodu Korzystając z optycznego oscylatora parametrycznego lub kontrolera OPO, dostosuj ustawienia OPO, takie jak temperatura, pozycja pazo i pozycja filtra LEO, aż do osiągnięcia maksymalnej mocy lasera przy żądanej częstotliwości ramen. Umieść tabletkę w uchwycie na próbkę w specjalnie zbudowanej celi przepływowej samochodu i mocno przykręć uchwyt próbki.Aby zapobiec wyciekom, należy podłączyć przewody rurowe do komory przepływowej samochodu, łącząc komorę przepływową samochodu ze zlewką zawierającą medium do rozpuszczania i pompą perystaltyczną. Umieść celę przepływową samochodu zawierającą tabletkę na stoliku mikroskopu. Sprawdzić, czy komora przepływowa samochodu jest podłączona do zlewki z roztworem do rozpuszczania.Pompa perystaltyczna, komora przepływowa UV w kształcie litery V i zlewka do zbierania odpadów. Kliknij przycisk XY repeat, aby rozpocząć skanowanie systemu mikroskopu w trybie skanowania ciągłego. Dostosuj ostrość mikroskopu, przesuwając obiektyw do momentu, gdy powierzchnia tabletu znajdzie się w polu view na ekranie komputera sterującego mikroskopem.Kliknij suwak w oprogramowaniu sterującym mikroskopem oznaczonym PMT. Dostosuj czułość detektora, zwiększając lub zmniejszając napięcie PMT, aż na ekranie pojawi się zadowalający obraz. Kliknij przycisk stop w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby jednocześnie zatrzymać skanowanie ciągłe.Rozpocząć pompowanie roztworu do rozpuszczania. Rozpocznij nagrywanie pojedynczego skanu XYT i rozpocznij zbieranie widm absorbentu UV. Podczas eksperymentu rozpuszczania monitoruj nagranie wideo i ręcznie wyreguluj ostrość mikroskopu.Aby upewnić się, że tablet jest stale ostry. Zatrzymaj pompę perystaltyczną, wyłączając ją. Kliknij menu Plik, a następnie kliknij polecenie Zapisz jako wideo w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby zapisać skan XYT jako wideo w oprogramowaniu sterującym spektrometrem, kliknij menu Zapisz w menu Plik, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj eksport.Aby zatrzymać zbieranie widm absorpcyjnych UV, należy usunąć celę przepływową samochodu ze stolika mikroskopu i wyjąć tabletkę z komory przepływowej samochodu. Na koniec umyj komorę przepływową samochodu za pomocą wody i etanolu, a następnie wysusz za pomocą bibuły. Wybrane klatki z filmu z rozpadu samochodu są pokazane tutaj na początku rozpadu.Znajdują się tam zielone obszary wskazujące zawartość teofiliny w tabletce. Ciemne obszary to miejsca, w których na powierzchni tabletki obecna jest tylko etyloceluloza. Po około 60 sekundach na powierzchni obserwuje się początek wzrostu kryształów monohydratu teofiliny w postaci wąskich kryształów w kształcie igieł wyrastających na zewnątrz z co najmniej jednego jądra kryształu w środku ramy.Wzrost kryształów monohydratu jest wyraźnie widoczny po 130 sekundach. W tym czasie kryształ monohydratu nie rozprzestrzenił się całkowicie po powierzchni tabletki. Obecność regionów etylocelulozy może fizycznie blokować wydłużanie igieł monohydratu.Po 250 sekundach można zauważyć, że pokrycie monohydratu na powierzchni nie jest tak widoczne, co sugeruje, że kryształy monohydratu zaczynają rozpuszczać się w promieniowaniu UV Profil rozpuszczania anhy teofiliny z tabletką etylocelulozy pokazuje, że rozpuszczenie bezwodnika teofiliny szybko osiąga maksymalne stężenie około 90 mikrogramów na mililitr w ciągu 120 sekund. Po tym czasie szybkość rozpuszczania zaczyna się zmniejszać. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę rozpuszczania in situ za pomocą mikroskopii cos.Technika ta pozwala lepiej zrozumieć proces rozpuszczania poprzez monitorowanie powierzchni rozpuszczającej się tabletki za pomocą chemicznie selektywnego obrazowania.

coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-microscopy-visualizes

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Źródło: Zhang, M. i in., Szybkie testy podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana inkorporacji deuteru w pojedynczej bakterii. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje zastosowanie stymulowanej mikroskopii rozpraszającej Ramana do oceny podatności na antybiotyki poprzez śledzenie aktywności metabolycznej oznaczanej deuterem. Poprzez monitorowanie sygnałów węgla–deuteru metoda umożliwia szybkie wykrywanie populacji bakterii odpornych i podatnych.

Wykrywanie podatności na antybiotyki bakteryjne za pomocą stymulowanego mikroskopu rozpraszającego Ramana

Źródło: McCullagh, E. A., et al. Koherentna spektroskopia Ramana Antystokesa (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne i koherentną spektroskopię Ramana antystokesa (CARS) w celu wizualizacji architektury neuronalnej w tkance mózgowej gryzoni. Barwienie Nissl znakuje ciała komórkowe poprzez wiązanie się z rybosomalnym RNA, podczas gdy obrazowanie CARS celuje w mielinę bogatą w lipidy za pomocą sygnałów indukowanych...

Koherentna spektroskopia Ramana antystokesa do wizualizacji mielinizowanych neuronów w tkance mózgowej myszy

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Opisana jest spójna metodologia obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowego oznaczania związków farmaceutycznych w skórze. W artykule opisano przygotowanie tkanki skórnej (ludzkiej i mysiej) i miejscowe stosowanie preparatów, akwizycję obrazu w celu ilościowego określenia czasoprzestrzennych profili stężeń oraz wstępną analizę farmakokinetyczną w celu oceny miejscowego dostarczania leków.

Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Wizualizacja mielinizacji jest ważnym celem dla wielu badaczy zajmujących się układem nerwowym. CARS to technika kompatybilna z immunofluorescencją, która może natywnie obrazować lipidy w tkankach, takich jak mózg, oświetlając wyspecjalizowane struktury, takie jak mielina.

Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Poznaj mikroskopię CARS do wizualizacji rozpuszczania tabletek farmaceutycznych w czasie rzeczywistym. Ta metoda łączy obrazowanie chemicznie selektywne z spektroskopią UV, umożliwiając korelację zmian powierzchni z profilem uwalniania leku.

Koherentna mikroskopia rozpraszania Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) wizualizuje tabletki farmaceutyczne podczas rozpuszczania

Przeglądaj więcej filmów