Name: Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia wirusa AAV do komór mózgowych noworodków myszy, umożliwiającą trwałą transdukcję neuronów. Technika ta pozwala na szerokie ekspresowanie genów w mózgu do celów badań neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Fundację Rodzinną Roberta A. i Rene E. Belferów, NIA R21 AG038856 (JLJ), grant badawczy na chorobę Alzheimera Fundacji BrightFocus A2010097 (JLJ) oraz grant NIA Biology of Aging Training T32 AG000183 (wsparcie dla SDG).

Wykonuj wszystkie procedury i protokoły z udziałem zwierząt zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Opisane tutaj procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
Niekompetentne wektory wirusa adenologicznego (AAV) do dostarczania transgenu do mózgu gryzoni są zatwierdzone do użytku na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1. Na stronie CDC można znaleźć publikację rządu USA "Biosafety in Microbiology and Biomedical Laboratories (BMBL)", która zawiera szczegółowe wymagania dotyczące właściwej ochrony i procedur postępowania z wirusami. Skontaktuj się z lokalnymi pracownikami weterynarii i bezpieczeństwa środowiskowego, aby dowiedzieć się, jakie są specyficzne wymagania instytucjonalne dotyczące procedur z wykorzystaniem wirusów. Przepisy dotyczące sal zabiegowych, kwarantanny i identyfikacji klatek stanowiących zagrożenie biologiczne różnią się w zależności od instytucji.
1. Przygotuj szczenięta P0 i matki zastępcze
<ol>
	<li>Zapewnij wysokotłuszczową karmę dla wszystkich kobiet w ciąży i karmiących, aby zaspokoić zapotrzebowanie energetyczne w okresie rozrodu i laktacji.</li>
	<li>Wieczorem ustaw klatkę hodowlaną, dodając jedną lub dwie zdrowe samice do klatki jednego osiadłego samca. Następnego ranka sprawdź, czy samice nie mają korka pasującego i oddziel samice od samców, jeśli jest obecna zatyczka.
	<ol>
		<li>Wykorzystaj matki zastępcze do wychowywania młodych z tła genetycznego o słabych cechach matczynych (na przykład C57BL/6 lub C3HeJ). Matki zastępcze przyjmują młode z innego miotu, jeśli przeniesione młode urodziły się w ciągu czterech dni od miotu matki zastępczej.</li>
		<li>Ustaw oddzielną klatkę kryciową, używając samic ICR lub FVB wraz z hodowcami doświadczalnymi, tak aby dwie grupy samic rodziły mniej więcej w tym samym czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Samice rodzą w ciągu 19 ±1 dni od daty założenia wtyczki, w zależności od szczepu tła. Trzy dni przed porodem (16 dni po dacie zatyczki) umieść ciężarną samicę w czystej klatce ze świeżym materiałem gniazdowym i zadaszonym schronieniem.</li>
	<li>Sprawdzaj, czy nie ma nowonarodzonych szczeniąt dwa razy dziennie, zaczynając 2 dni przed przewidywaną datą porodu (17 dni po dacie podłączenia do piersi). Zbadaj klatkę przy minimalnym stresie dla matek, zaglądając przez dno pod kątem obecności różowych noworodków. Myszy zazwyczaj rodzą młode rano, ale w rzadkich przypadkach rodzą po południu.</li>
	<li>Zaplanuj wykonanie zastrzyków, gdy tylko młode zaczną karmić piersią (co będzie widoczne po widocznych plamach mlecznych) lub w ciągu 6 godzin od urodzenia, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.</li>
</ol>
2. Przygotuj sprzęt do iniekcji
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 10 μl z igłą 32 G dla noworodków z ogólną liczbą P0. W przypadku wstrzykiwania stereotaktycznego należy zamontować strzykawkę na ramieniu manipulatora.</li>
	<li>W przypadku stosowania ramy stereotaktycznej do wstrzykiwań, należy schłodzić stadium noworodkowe do temperatury 4-8 °C, dodając 100% etanolu i suchego lodu do zbiornika na przednim końcu bloku. Utrzymuj temperaturę powyżej 1 °C, aby uniknąć odmrożeń szczeniąt.</li>
</ol>
3. Przygotuj rozcieńczenia wirusa do wstrzykiwań
<ol>
	<li>Przygotuj 1% roztwór niebieskiego barwnika trypanowego (20x bulion).</li>
	<li>Przygotować 5-25 μl podwielokrotności zapasu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2. Umieścić te podwielokrotności w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Unikaj dodatkowych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ powoduje to utratę skuteczności transdukcji wirusa.</li>
	<li>Wyjąć porcję AAV z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie do rozmrożenia.</li>
	<li>Przygotować roztwór wirusa do wstrzykiwań, rozcieńczając wirusa w lodowato zimnym 1x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Zacznij od dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia (1010 do 108 cząstek wirusa/półkulę) w celu wstępnej optymalizacji wzorca transdukcji.</li>
	<li>Dodaj 20x błękit trypanowy do roztworu AAV do końcowego stężenia 0,05%.</li>
</ol>
4. Przygotowanie nowonarodzonych szczeniąt do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Umieść mały aluminiowy talerz na lodzie, aby ostygł. Umieść suchą chusteczkę na wierzchu talerza, aby chronić skórę szczeniaka przed zimnym metalem. Służy to jako płaska, zimna powierzchnia do znieczulania i wstrzykiwania szczeniąt.</li>
	<li>Przygotuj podkładkę rozgrzewającą odpowiednią do utrzymywania ciepła u nowonarodzonych myszy przed i po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Gdy nowonarodzone szczenięta zaczną ssać, wyjmij około połowy z nich z klatki, a drugą połowę zostaw z matką. Umieść zebrane młode na podkładce rozgrzewającej w oczekiwaniu na wstrzyknięcie. 
	UWAGA: Jeśli biologiczna matka nie opiekuje się młodymi, należy natychmiast usunąć cały miot z klatki i umieścić młode na podkładce rozgrzewającej, aby czekały na wstrzyknięcie. Taka sytuacja może mieć miejsce w przypadku pierwszego miotu urodzonego przez samice C57BL/6 lub w przypadku innych szczepów wsobnych, które mają słabe cechy hodowlane. W takiej sytuacji plamy mleczne nie będą widoczne u nowonarodzonych szczeniąt.</li>
	<li>Przenieś jedno szczenię z podkładki rozgrzewającej na zimną metalową płytkę, aby wywołać znieczulenie hipotermią. Odczekaj 2-3 minuty, aż szczenię zostanie w pełni znieczulone. Potwierdź znieczulenie, bardzo delikatnie ściskając łapę i monitoruj brak ruchu lub oddychania.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie AAV noworodkom myszy
<ol>
	<li>Wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe AAV z wolnej ręki noworodkom myszy:
	<ol>
		<li>Do strzykawki iniekcyjnej załadować 5 μl rozcieńczonego AAV z 0,05% błękitem trypanowym.</li>
		<li>Delikatnie przetrzyj głowę znieczulonego szczeniaka wacikiem nasączonym 70% etanolem.</li>
		<li>Zidentyfikować miejsca wstrzyknięć w odległości 2/5 odległości od szwu lambda do każdego oka. Alternatywne miejsce wstrzyknięcia znajduje się około 0,8-1 mm z boku szwu strzałkowego, w połowie drogi między lambdą a bregmą. Te punkty orientacyjne są widoczne przez skórę w punkcie P0.</li>
		<li>Oznaczyć miejsce wstrzyknięcia nietoksycznym pisakiem laboratoryjnym.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę z widoczną skalą do monitorowania objętości dozowanego roztworu.</li>
		<li>Upewnij się, że kciuk może sięgać górnej części tłoka. Następnie zdjąć kciuk z tłoka, jednocześnie ustawiając igłę, aby uniknąć przypadkowego dozowania wirusa.</li>
		<li>Znajdź wygodną pozycję do podparcia ramienia do wstrzyknięcia, kładąc łokieć na ławce i opierając rękę o wiadro z lodem.</li>
		<li>Połóż szczeniaka na boku z głową bezpośrednio pod strzykawką. Obróć głowę szczeniaka tak, aby zaznaczone miejsce wstrzyknięcia było skierowane do góry i delikatnie, ale stanowczo przytrzymaj tę pozycję otwartą dłonią.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę prostopadle do powierzchni czaszki i wprowadzić igłę w zaznaczone miejsce wstrzyknięcia na głębokość około 3 mm. Wstrzykiwać igłę do momentu, gdy opór nieznacznie się zmniejszy, co oznacza, że igła wniknęła do komory bocznej. Jeśli potrzebne jest odniesienie, zaznacz 3 mm od końcówki igły nietoksycznym maszynką. Dostosuj głębokość iniekcji do wielkości i szczepu potomstwa w oparciu o ukierunkowanie barwnika na komory.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę sztywno, tak aby można było wcisnąć tłok bez wsuwania igły głębiej w mózg. Jeśli wstrzyknięcie zostanie przemieszczone do wzgórza, rozprzestrzenianie się wirusa będzie poważnie ograniczone.</li>
		<li>Rozpocząć powolne wstrzykiwanie wirusa, monitorując objętość dozowaną ze strzykawki. Do każdej komory należy podać maksymalną objętość 2 μl. Jeśli igła znajduje się we właściwej pozycji, barwnik rozprzestrzeni się, wypełniając komorę.</li>
		<li>Powoli wyjmować igłę.</li>
		<li>Poczekaj, aż pierwsze miejsce wstrzyknięcia zamknie się przed wstrzyknięciem drugiej półkuli. 
		UWAGA: Nie należy wstrzykiwać tego samego miejsca więcej niż raz. Ponowne włożenie igły zmusza do wycieku wirusa, który został już wstrzyknięty, i powoduje obrażenia lub śmierć szczeniaka.</li>
		<li>Wstrzyknąć do przeciwległej komory, stosując tę samą procedurę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stereotaktyczne wstrzyknięcie AAV noworodkom myszy:
	<ol>
		<li>Załadować 5 μl rozcieńczonego AAV z 0,05% błękitem trypanowym do strzykawki iniekcyjnej trzymanej przez manipulator stereotaktyczny.</li>
		<li>Delikatnie umieść głowę szczeniaka między nausznikami ramy noworodka. Upewnij się, że głowica jest wypoziomowana w osi Y (od przodu do tyłu), sprawdzając, czy linia między lambdą a bregmą jest równoległa do stage. Upewnij się, że głowa jest wypoziomowana w osi X (z boku na bok), sprawdzając, czy wyobrażona linia między uszami lub linia między oczami jest równoległa do sceny.</li>
		<li>Delikatnie przetrzyj głowę znieczulonego szczeniaka bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem.</li>
		<li>Użyj manipulatora stereotaktycznego, aby ustawić strzykawkę powyżej lambda, a następnie wyzeruj współrzędne X i Y. Przesuń ramiona stereotaktyczne na (X, Y) = (0,8, 1,5) mm dla standardowych P0 pups. 
		UWAGA: Wielkość szczeniaka i współrzędne stereotaktyczne mogą się różnić w zależności od odmiany i wieku. Dostosuj współrzędne na podstawie wstrzyknięć barwnika w razie potrzeby, aby celować w komory boczne.</li>
		<li>Powoli opuścić igłę w miejscu wstrzyknięcia. Powierzchnia czaszki wgnieci się, a następnie zwolni, gdy igła wbije się w skórę. Wycofać igłę, aż czaszka odzyska swój normalny wklęsły kształt, ale należy utrzymać skos igły pod skórą. Wyzeruj współrzędną Z w tym punkcie.</li>
		<li>Włożyć igłę do Z = -1,7 mm, a następnie wycofać do -1,5 mm.</li>
		<li>Powoli wstrzyknij wirusa. Każda półkula może przyjąć do 2 μl roztworu.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę na miejscu przez 30-60 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia, a następnie powoli wycofywać igłę przez 1-2 minuty.</li>
		<li>Powtórzyć te czynności dla przeciwległej półkuli, używając ujemnych współrzędnych w osi X dla miejsca wstrzyknięcia. 
		UWAGA: Alternatywne współrzędne dla iniekcji to (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm i (1,2, 1,0, -1,5) mm. Pierwsze wstrzyknięcie należy wykonać przy (0,8, 2,0), następnie przejść do (0,8, -2,0), (1,2, 1,0) i na końcu (1,2, -1,0). Wstrzyknąć 1 μl roztworu w każde miejsce, w sumie 2 μl na półkulę. Szybko przechodź między wstrzyknięciami, aby zakończyć zabieg w czasie krótszym niż 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Opieka po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Po zakończeniu wstrzykiwań do obu półkul, umieść szczenię z powrotem na podkładce rozgrzewającej, aż temperatura jego ciała i kolor skóry powrócą do normy, a szczenię zacznie się poruszać.</li>
	<li>Jeśli używasz biologicznej matki do karmienia noworodków, którym wstrzyknięto, zwróć wstrzyknięte młode do biologicznej matki po tym, jak odzyskają normalne ruchy. Umieść pozostałe niewstrzyknięte szczenięta na podkładce rozgrzewającej. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie myszy zostaną wstrzyknięte.</li>
	<li>Jeśli korzystasz z usług matki zastępczej do karmienia noworodków, którym wstrzyknięto, przenieś wszystkie wstrzyknięte szczenięta do matki zastępczej w celu opieki po powrocie do normalnego ruchu.
	<ol>
		<li>Usunąć z klatki większość lub wszystkie szczenięta należące do matki zastępczej, aby zapewnić powodzenie zwierzętom, którym wstrzyknięto</li> implant.
		<li>Jeśli szczenięta matki zastępczej i szczenięta, którym wstrzyknięto zastrzyk, mają ten sam kolor oczu i skóry, oznacz szczenięta matki zastępczej długopisem laboratoryjnym, aby można je było później odróżnić.</li>
		<li>Umieść szczenięta matki zastępczej i część ich ściółki razem z wstrzykniętymi szczeniętami. Upewnij się, że wstrzyknięte szczenięta nabiorą zapachu swojego biologicznego potomstwa, aby poprawić akceptację nowych szczeniąt.</li>
		<li>Umieść tylko młode, którym wstrzyknięto się z powrotem w klatce matki zastępczej. Usuń wszystkie pozostałe szczenięta od przybranej matki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że matka opiekuje się i karmi młode, którym wstrzyknięto zastrzyk, w ciągu 10 minut od umieszczenia ich w klatce. Jeśli matka nie odbierze szczeniąt w tym czasie, przenieś je do innej matki zastępczej.</li>
	<li>Oznacz klatkę kartą zagrożenia biologicznego, aby pokazać, że zawiera zwierzęta, którym wstrzyknięto wirusa. Umieść klatkę w zatwierdzonym miejscu przez 72 godziny.</li>
	<li>Po 72-godzinnym okresie kwarantanny przenieś matkę i młode (ale bez ściółki lub innych przedmiotów z klatki) do czystej klatki. Wykonaj ten transfer w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2, aby uniknąć narażenia na jakąkolwiek ściółkę skażoną wirusem. Zwróć czystą klatkę z wstrzykniętymi zwierzętami do zwykłego obiektu dla myszy.</li>
	<li>Umieść brudną klatkę w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego, wysterylizuj w autoklawie, a następnie zwróć klatkę do wiwarium.</li>
</ol>
7. Sprzątanie
<ol>
	<li>Umieścić pozostały roztwór wirusa w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Wirus zachowuje zdolność transdukcji przez co najmniej 2 miesiące, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C8.</li>
	<li>Zdezynfekować igłę i strzykawkę 2% wybielaczem, a następnie kilkakrotnie spłukać w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Oczyść obszar roboczy 2% wybielaczem, a następnie 70% etanolem.</li>
	<li>Zbierz wszystkie jednorazowe przedmioty, w tym końcówki do pipet, probówki, maskę i rękawiczki, w plastikowej torbie na wypadek zagrożenia biologicznego. Materiały odpadowe należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami i politykami instytucjonalnymi (np. autoklawować lub spalać).</li>
</ol>
8. Przygotowanie mózgów myszy do obrazowania
<ol>
	<li>Umieść wstrzykniętą mysz w komorze eutanazji dwutlenku węgla po 3-4 tygodniach od wstrzyknięcia. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi prawidłowych procedur eutanazji. Nie należy perfuzjować zwierząt paraformaldehydem, ponieważ spowoduje to wygaszenie etykiety fluorescencyjnej.</li>
	<li>Usunąć cały mózg z czaszki i utrwalić na 3-12 godzin w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś unieruchomiony mózg do 30% sacharozy w celu krioprotekcji. Inkubować w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno.</li>
	<li>Zbierz wiadro drobno pokruszonego suchego lodu. Przetnij mózg na pół wzdłuż linii środkowej. Zakop połówki mózgu w suchym lodzie, aby zamarzły.</li>
	<li>Schłodzić etap mikrotomu, dodając suchy lód i 100% etanol.</li>
	<li>Przymocuj mózg do sceny linią środkową w dół za pomocą PBS i pozostaw do zamrożenia.</li>
	<li>Przekrój przez mózg o grubości 30-45 μm za pomocą mikrotomu zamrażająco-przesuwnego.</li>
	<li>Umieścić skrawki w 24-dołkowych płytkach zawierających roztwór przeciw zamarzaniu (250 ml glicerolu, 300 ml glikolu etylenowego, 500 ml 0,1 M buforu fosforanowego, pH 7,4). Przykryj płyty folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Zbierz skrawki z 1-4 dołków i umyj 3x w PBS.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych i szkiełku nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu.</li>
	<li>Obraz jest przesuwany przy użyciu odpowiednich filtrów dla natywnego YFP lub tdTomato, aby sprawdzić wzorzec transdukcji wirusa.</li>
</ol>

<ol><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).</li>
<li>Sun, B., Gan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+expression+in+the+central+nervous+system+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors.</a> Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).</li>
<li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Passini, M. A., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+gene+delivery+and+structure-specific+patterns+of+expression+in+the+brain+after+intraventricular+injections+of+neonatal+mice+with+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector.</a> J Virol. 75, 12382-12392 (2001).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+%28AAV1%29+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77, 7034-7040 (2003).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+formulations+that+enhance+physical+stability+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy.</a> Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).</li>
<li>Bauer, H. C., Bauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+of+the+blood-brain+barrier%3A+still+an+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma.</a> Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).</li>
<li>Cearley, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+repertoire+of+AAV+vector+serotypes+mediate+unique+patterns+of+transduction+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy wszechstronną procedurę manipulowania ekspresją genów neuronalnych przy użyciu AAV jako nośnika do powszechnego dostarczania do mózgu noworodków myszy. W porównaniu z innymi metodami transgenezy neuronalnej, takimi jak elektroporacja inutero1 lub stereotaktyczne wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe2,3, iniekcja wirusa u noworodków jest stosunkowo łatwa i prosta. Podstawową procedurę można wykonać w ciągu kilku minut za pomocą tylko wiadra z lodem i strzykawki o pojemności mikrolitrów. Optymaln...

Tradycyjne metody modyfikacji ekspresji genów neuronalnych wymagają czasochłonnych i kosztownych manipulacji linią zarodkową. Alternatywne metody de novo, takie jak elektroporacja in utero lub stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusa, dają szybsze wyniki i są mniej kosztowne, ale mają tę wadę, że wymagają złożonej interwencji chirurgicznej1-3. Co więcej, ekspresja transgenu ma ograniczony zakres przestrzenny w przypadku tych metod. W niniejszym artykule opisujemy szybką, łatwą i ekonomiczną metodę powszechnej manipulacji neuronami poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do mózgu noworodka myszy. Metoda została po raz pierwszy opisana przez Johna Wolfe'a i Marco Passiniego w 2001 roku, gdzie zasugerowali, że mały rozmiar cząstek AAV pozwala mu dyfundować w płynie mózgowo-rdzeniowym, gdy przechodzi z komór bocznych przez niedojrzałą barierę wyściordzą i do miąższu mózgu4,5. Dokomorowe wstrzyknięcie AAV w ciągu pierwszych 24 godzin po urodzeniu powoduje rozległą transdukcję wirusa w podzbiorach nerwowych obejmujących każdy obszar mózgu, od opuszki węchowej do pnia mózgu6,7. Transgeny dostarczane przez wirusa ulegają ekspresji i są aktywne w ciągu kilku dni od wstrzyknięcia i utrzymują się do roku po transdukcji. Tak więc ta wszechstronna manipulacja umożliwia badania od wczesnego rozwoju mózgu po starzenie się i degenerację u dorosłych.
Dostosowując technikę do naszych specyficznych potrzeb eksperymentalnych, skupiliśmy się przede wszystkim na serotypie AAV8, ponieważ jest on najbardziej efektywny w transdukcji neuronów6. Pokazujemy, że miano wirusa można rozcieńczyć w celu kontrolowania gęstości transdukowanych neuronów w eksperymentach testujących wewnętrzne konsekwencje manipulacji genetycznej dla komórek. Ponadto wykazaliśmy, że dwa wirusy mogą być wstrzykiwane jednocześnie w celu wytworzenia wzorców ekspresji, które są stronnicze w kierunku odrębnych lub nakładających się zestawów neuronów, w zależności od serotypów wybranych do pakowania wirusa. Nasza praca rozszerza wszechstronność tej techniki do zastosowania w szerokim zakresie eksperymentalnych warunków neuronauki.

<table><tbody><tr><td>Myszy niekrewniacze ICR</td><td>Harlan</td><td>Hsd:ICR (CD-1)</td><td>Ten szczep jest również znany jako</td></tr><tr><td>myszy wsobne CD-1 FVB</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>1800</td><td>w wieku 5-6 tygodni</td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Lab Supply</td><td>NESTLETS</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd shacks</td><td>Lab Supply</td><td>SS-mouse</td><td></td></tr><tr><td>Wysokotłuszczowa karma dla gryzoni</td><td>Purina Mills</td><td>PicoLab Mouse diet 20, #5058</td><td>To jest nasza standardowa karma hodowlana</td></tr><tr><td>Wysokotłuszczowa karma dla gryzoni (alternatywa)</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Teklad Global 19% białkowa dieta dla gryzoni #2019S</td><td>Jeśli niski poziom fitoestrogenów, potrzebna jest dieta autoklawowalna</td></tr><tr><td>Strzykawka do wstrzykiwań</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Strzykawka 10 ml</td></tr><tr><td>Igły iniekcyjne</td><td>Hamilton</td><td>7803-04, RN 6PK PT4, 0,375"</td><td>32 G, do standardowych iniekcji P0</td></tr><tr><td>Metalowa płytka do krioanezjozyjność</td><td>McMaster Carr</td><td>8975K439</td><td>Surowa płyta aluminiowa, 6 "x 12", 0,25 cala, będzie musiała zostać pocięta na 3 równe części, a krawędzie przeszlifowane przez lokalny warsztat mechaniczny</td></tr><tr><td>Urządzenie stereotaktyczne dla małych zwierząt z cyfrowym odczytem</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny uchwyt na strzykawkę ze stopką podporową</td><td>igły David Kopf Instruments</td><td>Model 1772-F1</td><td></td></tr><tr><td>Rama dla noworodków</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Oficjalnie nazywana adaptacją myszy i noworodka szczura</td></tr><tr><td>Worki na utylizację zagrożeń biologicznych ze sterylnym wskaźnikiem</td><td>VWR</td><td>14220-030</td><td>Ważne! &ndash; Skontaktuj się z lokalnymi weterynarzami i personelem ds. bezpieczeństwa środowiska, aby dowiedzieć się więcej o swoim instytucie" Protokół usuwania odpadów stwarzających zagrożenie biologiczne</td></tr></tbody></table>

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Wraz z szybkim wzrostem postępu naukowego, potrzebne są nowe metody dla eksperymentalnej neuronauki, aby szybko i łatwo manipulować ekspresją genów w mózgu myszy. Tutaj opisujemy technikę wprowadzoną po raz pierwszy przez Passiniego i Wolfe'a do bezpośredniego wewnątrzczaszkowego dostarczania transgenów kodowanych wirusowo do mózgu noworodka myszy. W najbardziej podstawowej formie procedura wymaga jedynie wiadra z lodem i strzykawki o pojemności mikrolitrów. Jednak protokół może być również dostosowany do użytku z ramkami stereotaktycznymi, aby poprawić spójność dla badaczy nowych w tej technice. Metoda opiera się na zdolności wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do swobodnego przemieszczania się z komór mózgowych do miąższu mózgu, podczas gdy wyściółka wyściółki jest jeszcze niedojrzała w ciągu pierwszych 12-24 godzin po urodzeniu. Dokomorowe wstrzyknięcie AAV w tym wieku powoduje rozległą transdukcję neuronów w mózgu. Odciąganie rozpoczyna się w ciągu kilku dni po wstrzyknięciu i utrzymuje się przez całe życie zwierzęcia. Miano wirusa można dostosować w celu kontrolowania gęstości transdukowanych neuronów, podczas gdy koekspresja białka fluorescencyjnego zapewnia istotną etykietę transdukowanych komórek. Wraz z rosnącą dostępnością urządzeń do rdzeni wirusowych, które zapewniają zarówno gotowe, wstępnie zapakowane odczynniki, jak i niestandardowe preparaty wirusowe, podejście to oferuje szybką metodę manipulowania ekspresją genów w mózgu myszy, która jest szybka, łatwa i znacznie tańsza niż tradycyjna inżynieria linii zarodkowej.

Skuteczna dostraszczylna iniekcja wirusowa zapewnia rozległą i silną ekspresję neuronalną. W niniejszej pracy oceniliśmy transdukcję wirusową przy użyciu fluorescencyjnych genów YFP lub tdTomato pod kontrolą promotora kurzej beta-aktyny (promotor CBA). Konstrukty te zostały zapakowane do AAV8 i wstrzyknięte do komór bocznych noworodków myszy ICR (P0). Wysokie miana wirusa (1010 cząsteczek na półkulę) doprowadziły do gęstego znakowania cebulki węchowej, prążkowia, kory mózgowej, hipokampa i móżdżku (Rys...

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy. Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Ogólnym celem tej procedury jest wirusowa transdukcja neuronów w całym mózgu. Osiąga się to poprzez krioznieczulenie nowonarodzonych szczeniąt, a następnie przeniesienie noworodka do schłodzonego etapu w celu wstrzyknięcia. Następnie należy określić miejsce wstrzyknięcia, w którym należy celować w boczne komory między szwem Lambda a każdym okiem lub boczne od szwu strzałkowego w połowie drogi między Lambda a Bgma.Ostatnim krokiem jest włożenie igły na odpowiednią głębokość i powolne wlewanie do dwóch mikrolitrów roztworu wirusa do bocznej komory każdej półkuli. Ostatecznie znacznik fluorescencyjny lub immunofluorescencja dla genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wykorzystywana do pokazania wzorca ekspresji transgenu wynikającego z wstrzyknięcia dokomorowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej techniki, będą miały trudności z dokładnym celowaniem w komory boczne.Technika ta jest demonstrowana zarówno poprzez wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe z wolnej ręki, jak i wstrzyknięcie stereotaktyczne, co pokazuje, że technika odręczna zostanie wykorzystana przez innego postdoca w moim laboratorium. Na początek przygotuj strzykawkę do wstrzykiwań o poj

intracerebroventricular-viral-injection-neonatal-mouse-brain-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Ten film opisuje skuteczną technikę wywoływania glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o charakterystyce histopatologicznej ludzkiego GBM.

Indukcja glejaka za pomocą transpozycji za pośrednictwem SB: technika generowania nowego modelu myszy przy użyciu integracji plazmidu SB za pośrednictwem transpozonu z mózgiem noworodka myszy

Ten film demonstruje proces wstrzykiwania do komory mózgowej w celu zbadania dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii (MCMV) w mózgu noworodka myszy. MCMV, zaprojektowany do ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) zapewniającego widoczność, jest wstrzykiwany do bocznej komory mózgu szczeniaka myszy. Wstrzyknięty wirus krąży w płynie mózgowo-rdzeniowym, infekując komórki w okolicy okołokomorowej, w tym w strefie brzeżnej, splocie naczyniówkowym i strefie podkomorowej.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe w celu analizy dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii w mózgu noworodka myszy

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.

Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa

Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.

Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2

Poznaj metodę wstrzyknięcia wirusa AAV do komór mózgowych noworodków myszy, umożliwiającą trwałą transdukcję neuronów. Technika ta pozwala na szerokie ekspresowanie genów w mózgu do celów badań neurobiologicznych.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Przeglądaj więcej filmów