Name: Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Dowiedz się, jak oceniać biokompatybilność polimerów zmodyfikowanych rekombinowanym CD47 za pomocą modelu pętlowego Chandlera ex vivo. Ta metoda pozwala zmniejszyć reakcję obcego ciała w implantach medycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Modyfikowanie powierzchni polimerowych za pomocą recCD47
UWAGA: Protokół jest schematycznie podsumowany na rysunku 1. Rysunek 1A ilustruje wytwarzanie powierzchni polimerowych reagujących z tiolem. Rysunek 1B ilustruje wytwarzanie reaktywnego tiolu recCD47.
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór PDT-BzPh (1 mg/ml) i wodorowęglanu potasu (KHCO3) (0,7 mg/ml) w sterylnej wodzie. Mieszać przez noc w temperaturze 4 °C (chronić przed światłem).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Pokrój rurki polimerowe na kawałki o długości 40 cm (wystarczająco długie, aby zmieściły się wokół obracających się kół).</li>
		<li>Namocz probówki w 0,1% wodnym roztworze heksacylopirydyny przez 90 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce lub na aparacie z pętlą Chandlera. Opłucz probówki sterylną wodą 3x po 90 minutowym moczeniu.</li>
		<li>Zakwasić roztwór PDT-BzPh od dnia 1 przez dodanie 15% wodnego roztworu fosforanu potasu jednozasadowego (KH2PO4 ). Dodać 50 μl KH2PO4 na ml PDT-BzPh, tworząc mętny roztwór micelarny.</li>
		<li>Zanurzyć probówki w zakwaszonym roztworze PDT-BzPh przez 40 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce lub na aparaturze.</li>
		<li>Przepłukać probówki rozcieńczonym kwasem octowym (1:1 000) jeden raz.</li>
		<li>Wystaw probówki na działanie promieniowania UV przez łączny czas 60 minut. Obracaj rurki o 1/4 obrotu co 15 minut, aby naświetlić całą powierzchnię.</li>
		<li>Zanurzyć probówki w roztworze 20 mg/ml wodorowęglanu potasu (KHCO3) przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce lub na aparacie.</li>
		<li>Przepłukać probówki sterylną wodą 3x i przechowywać w temperaturze 4 °C w sterylnej wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5 mg Sulfo-SMCC w 200 μl dimetyloformamidu (DMF) (Uwaga: Wykonywać w dygestorium).</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu Sulfo-SMCC przygotowanego w kroku 1 do 0,1 mg/ml roztworu polilizyny recCD47 i mieszać przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W ciągu 60 minut mieszania odgazować sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS) i odstawić na bok.</li>
		<li>Oczyszczanie Sulfo-SMCC przereagowało recCD47 przy użyciu kolumny odsalającej spin o masie cząsteczkowej 7K zgodnie z instrukcjami producenta. Zebrać końcowy przepływ (wysokiej jakości reaktywny tiolowo recCD47) i rozcieńczyć do objętości niezbędnej do pokrycia wnętrza probówki DPBS.</li>
		<li>Przepłucz probówki od 2 dnia sterylnym, odgazowanym DPBS 3x.</li>
		<li>Zmodyfikowaną powierzchnię probówek należy reagować roztworem 20 mg/ml z chlorowodorkiem tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) w odgazowanym DPBS przez mniej niż 2 minuty. Przepłukać probówki sterylnie odgazowanym DPBS 4x.</li>
		<li>Dodać recCD47 przereagowany sulfo-SMCC do probówek i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce lub na aparacie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja testu immunologicznego recCD47 na zmodyfikowanych powierzchniach
<ol>
	<li>Zmodyfikowane probówki, które mają być oznaczone ilościowo, należy przepłukać od dnia 3. za pomocą DPBS 3x. Probówki nieużywane do oznaczania ilościowego należy przechowywać w DPBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyj stempla do biopsji o średnicy 4 mm, aby wykonać zduplikowane próbki probówek i umieść stemple biopsyjne w studzienkach 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Przygotować kontrolę ujemną składającą się z niezmodyfikowanej próbki probówki, której nie poddawano działaniu przeciwciała wykrywającego. Przygotować kontrolę przeciwciał składającą się z niezmodyfikowanej próbki probówki poddanej działaniu przeciwciała wykrywającego. Przygotować zmodyfikowane próbki testowe przewodów potraktowane przeciwciałem wykrywającym.</li>
	<li>Blokować próbki 0,4% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS przez 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Po zablokowaniu odessać BSA i spłukać solą fizjologiczną z tris-buforem plus 1% Tween-20 (TBST) 3 razy po 10 minut na shakerze.</li>
	<li>Przygotować robocze rozcieńczenie przeciwciała w 0,4% BSA zgodnie z zalecanym przez producenta rozcieńczeniem do testów immunologicznych. Rozcieńczyć ludzkie przeciwciało CD47 B6H12-FITC w stosunku 1:100 w 0,4% BSA.</li>
	<li>Dodać 200 μl rozcieńczenia przeciwciał do odpowiednich studzienek. Inkubować kontrole ujemne tylko z 0,4% BSA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut na wytrząsarce (chronić przed światłem).</li>
	<li>Spłukać TBST 3x po 10 minut na shakerze. Odessać ostatnie płukanie TBST i dodać 200 μl DPBS do probówek na próbki.</li>
	<li>Zebrać końcowy przepływ, którym jest wysokiej jakości rekombinowany tiol rekombinowany CD47 i rozcieńczyć do objętości niezbędnej do pokrycia wnętrza probówek DPBS.</li>
	<li>Odczyt intensywności sygnału FITC za pomocą czytnika mikropłytek z ustawieniami wzbudzenia FITC (485 nm) i emisji (538 nm).</li>
	<li>Obliczyć recCD47 związany z powierzchnią polimeru na podstawie wartości standardowych, z uwzględnieniem autofluorescencji i niespecyficznego wiązania z próbki kontrolnej przeciwciała.</li>
</ol>
3. Protokół aparatu pętli Chandlera
Poproś Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) o zatwierdzenie protokołu pobierania krwi i dokumentów świadomej zgody przed rozpoczęciem pobierania próbek krwi ludzkiej. Uzyskanie świadomej zgody od dawcy krwi. 
UWAGA: Schemat przedstawiający urządzenie pokazano na rysunku 2.
<ol>
	<li>Napełnij łaźnię wodną wodą destylowaną, aż zanurzy się około 1/2 średnicy kół. Dodaj tyle wybielacza do łaźni wodnej, aby uzyskać 10% roztwór wybielacza. Ustawić łaźnię wodną na 37 °C i odczekać, aż temperatura się zrównoważy.</li>
	<li>Zbierz metalowe adaptery (pokazane na rysunku 1B), niezmodyfikowane rurki i zmodyfikowane rurki i zmontuj wokół kół aparatu, jak pokazano na rysunku 1C. Upewnij się, że rurka ściśle przylega do koła z założonym metalowym adapterem.</li>
	<li>Pobrać 30 ml próbki krwi przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez IRB, w fiolce wstępnie napełnionej 2 ml cytrynianu lub innego antykoagulantu i wymieszać przez odwrócenie, aby zapobiec krzepnięciu po pobraniu próbki.</li>
	<li>Dodaj około 10 ml krwi do każdej probówki za pomocą metalowego zaworu i strzykawki, pozostawiając trochę powietrza w probówce. Zabezpiecz nakrętkę zaworu i obracaj przez 3 godziny.</li>
	<li>Odcedź krew do zlewki na odpady potraktowanej 10% roztworem wybielacza (lub zgodnie z wymogami polityki instytucjonalnej).</li>
	<li>Delikatnie przepłucz wnętrze rurki za pomocą DPBS, aby usunąć wszelkie ślady krwi. Zebrać przepływ do zlewki na odpady. Utylizuj krew zgodnie z polityką instytucji.</li>
	<li>Zdezynfekuj aparaturę i wszelkie powierzchnie mające kontakt z krwią za pomocą 10% roztworu wybielacza lub zgodnie z polityką instytucji.</li>
	<li>Próbki należy przetwarzać do mikroskopii fluorescencyjnej lub skaningowej mikroskopii elektronowej w sposób opisany poniżej.</li>
</ol>
4. Mikroskopia fluorescencyjna i liczenie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) (Uwaga: Wykonuj w dygestorium).</li>
	<li>Inkubować rurki w 4% roztworze PFA przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji usuń 4% PFA i bardzo delikatnie spłucz folie DPBS.</li>
	<li>Pokrój rurkę na sekcje, aby odsłonić powierzchnię światła do barwienia.</li>
	<li>Zabarwić odcinek rurki kilkoma kroplami podłoża montażowego za pomocą 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (chronić przed światłem). Po zabarwieniu bardzo delikatnie przepłucz rurkę DPBS, aby zredukować sygnał tła DAPI.</li>
	<li>Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr DAPI i kamerę cyfrową do zliczania liczby komórek w 9 ślepo wybranych polach widzenia pod 200-krotnym powiększeniem.</li>
	<li>Rejestruj liczbę komórek w polu widzenia i wykonuj odpowiednie analizy statystyczne w celu określenia istotności statystycznej wyników.</li>
</ol>
5. Skaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Przygotuj 2% roztwór aldehydu glutarowego (Uwaga: Wykonuj w dygestorium).</li>
	<li>Inkubować rurki w 2% roztworze aldehydu glutarowego przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji delikatnie przepłucz rurkę 3x DPBS.</li>
	<li>Przygotować 1% roztwór tetratlenku osmu (Uwaga: Poważne zagrożenie wdychania! Stosować w dygestorium).</li>
	<li>Inkubować rurki w 1% roztworze tetratlenku osmu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie przepłucz rurkę 3x za pomocą DPBS.</li>
	<li>Przygotuj serię stężeń etanolu (25%, 50%, 75%, 95% i 100% etanolu).</li>
	<li>Odwodnić rurkę przez inkubację w serii stężeń etanolu. Inkubować w 25%, 50%, 75% i 95% etanolu przez 20 minut każdy. Inkubować w 100% etanolu przez 30 min.</li>
	<li>Punkt nadkrytyczny wysuszyć rurkę za pomocą CO2 przez 45 minut, aby usunąć całą wilgoć.</li>
	<li>Zamontuj odcinki rurki na króćcu próbki za pomocą pasty srebrnej lub grafitu.</li>
	<li>Pokryj sekcje rurki 12,5 nm złotem-palladem.</li>
	<li>Zbadaj w skaningowym mikroskopie elektronowym. </li>
</ol>

<ol><li>Bruck, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+applications+of+polymeric+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Prog.+Technol%22%5BJournal%5D)">Medical applications of polymeric materials.</a> Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).</li>
<li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+body+reaction+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li>
<li>Levy, J. H., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+response+to+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Inflammatory response to cardiopulmonary bypass.</a> Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).</li>
<li>Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+blood+reactivity+to+hydroxylated+and+non-hydroxylated+polymer+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces.</a> Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).</li>
<li>Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hemocompatibility+of+self-assembled+monolayers+displaying+various+functional+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups.</a> Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).</li>
<li>Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVasita%2C+R+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22">Curr. Top. Med. Chem</a>. 8, 341-353 (2008).</li>
<li>Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-+and+cell+type-specific+interactions+between+CD47+and+human+SIRPalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha.</a> Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).</li>
<li>Tsai, R. K., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%27self%27+engulfment+through+deactivation+of+myosin-II+at+the+phagocytic+synapse+between+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells.</a> J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).</li>
<li>Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+%27self%27+recognition%3A+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).</li>
<li>Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li>
<li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).</li>
<li>Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).</li>
<li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).</li>
<li>Ravetch, J. V., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune inhibitory receptors.</a> Science. 290, 84-89 (2000).</li>
<li>Chandler, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+thrombotic+coagulation+of+blood%3A+a+method+for+producing+a+thrombus%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus.</a> Lab Invest. 7, 110-114 (1958).</li>
<li>Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bubble-induced+aggregation+of+platelets%3A+effects+of+gas+species%2C+proteins%2C+and+decompression%5BTitle%5D)+AND+%22Undersea+Hyperb+Med%22%5BJournal%5D)">Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression.</a> Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).</li>
<li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platlet+accumulations+around+%E2%80%9Cair+bubbles%E2%80%9D+in+blood+after+venous+air+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22Intl+J+of+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism.</a> Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).</li>
<li>Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).</li>
<li>Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+modified+chandler%2C+roller+pump%2C+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions%3A+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biomater%22%5BJournal%5D)">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> Int J Biomater. 2012, (2012).</li>
</ol>

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, w ramach nagrody o numerze R21 EB015612 (SJS) oraz National Heart, Lung, and Blood Institute, pod numerem nagrody T32 HL007915 (JBS i RJL), National Institute of Health.

Chemia fotoaktywacji (podsumowana na rysunku 1) pozwala na modyfikację praktycznie każdej powierzchni polimeru, która ma wystarczającą ilość węglowodorów, aby ułatwić przyłączenie PDT-BzPh, a następnie naświetlanie promieniowaniem UV w celu fotoaktywacji PDT-BzPh. Funkcjonalizacja powierzchni polimeru za pomocą reaktywnych grup tiolowych pozwala na późniejsze przyłączenie szeregu badanych cząsteczek do testowania. W naszych badaniach wybraliśmy rekombinowany CD4711-13. Szczególna chemia koniug...

Wiele procedur klinicznych, takich jak krążenie pozaustrojowe i dializa nerek, wymaga użycia polimerowych przewodów krwiopochodnych i często wiąże się z powikłaniami pozabiegowymi1. Po perfuzji z krwią polimery te wywołują reakcję na ciało obce (FBR), co skutkuje adsorpcją białek krwi i płytek krwi, adhezją monocytów/makrofagów oraz uwalnianiem cytokin prozapalnych, z których wszystkie przyczyniają się do powikłań pozabiegowych i/lub awarii urządzenia2,3. W związku z tym strategie mające na celu rozwiązanie tego problemu pozostają ważnym i ciągłym obszarem badań nad biomateriałami. Badacze próbowali rozwiązać ten problem, modyfikując powierzchnie mające kontakt z krwią za pomocą bioaktywnych lub bioobojętnych cząsteczek4-6. Badania w naszym laboratorium koncentrowały się na dołączaniu rekombinowanego CD47 (recCD47) do biomateriałów polimerowych jako strategii łagodzenia FBR i zwiększania skuteczności tych materiałów. CD47 jest wszechobecnym białkiem transbłonowym o znanej roli w unikaniu odporności, nadając status "siebie" ekspresji komórek7-10 i wykazuje obiecującą zdolność do nadawania biokompatybilności po dołączeniu do powierzchni polimerowych11-13. Białko regulatorowe sygnału alfa (SIRPα), pokrewny receptor CD47 i członek rodziny białek transbłonowych zawierających immunoreceptor oparty na motywie hamującym na bazie tyrozyny (ITIM), ulega ekspresji w komórkach pochodzenia szpikowego14. Wcześniej wykazaliśmy, że CD47, poprzez sygnalizację komórkową za pośrednictwem SIRPα, obniża odpowiedź immunologiczną na poliuretan (PU) i polichlorek winylu (PVC) w modelach in vitro, ex vivo i in vivo 11-13.
Centralnym elementem naszych badań jest stosunkowo nowa chemia fotoaktywacji, opisana tutaj, w której chemicznie reaktywne grupy tiolowe są kowalencyjnie dołączane do rurki polimerowej poprzez reakcję rurki z wielofunkcyjnym polimerem (PDT-BzPh), składającym się z 2-pirydylditio (PDT), fotoreaktywnego benzofenonu (BzPh) i modyfikowanej karboksylowo polialliloaminy11-13. Redukcja kowalencyjnie dołączonych grup PDT za pomocą chlorowodorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)11 daje tiolowaną powierzchnię, która może być następnie reagowana z ugrupowaniami terapeutycznymi. Szczegółowo opisany w niniejszym i poprzednio12,13, recCD47, dodatkowo zmodyfikowany przez dodanie C-końcowego ogona polilizynowego12,13, reaguje z sulfosuccinimidylo-4-[N-maleimidometylo]cykloheksano-1-karboksylanem (sulfo-SMCC) przez 1 godzinę w celu wytworzenia grup reagujących z tiolem, co pozwala na utworzenie wiązania monosiarczkowego między rurką a recCD4711. Zdolność przeciwzapalna powierzchni funkcjonalizowanych CD47 została przetestowana, ex vivo, przy użyciu aparatu pętli Chandlera z pełną krwią ludzką, która została pierwotnie opisana w 1958 roku jako model in vitro krzepnięcia zakrzepowego15. Aparat opiera się na zamkniętym systemie rurek częściowo wypełnionych powietrzem i silniku obrotowym, który cyrkuluje krew przez rurkę15. Ten eksperymentalny model daje możliwość zbadania wpływu ekspozycji na krew na zmodyfikowane i niezmodyfikowane powierzchnie, a także wpływu tych modyfikacji powierzchni na fizjologię komórek krwi.
recCD47 może być dołączany do różnych powierzchni polimerowych za pomocą tej chemii fotoaktywacji, a jego zdolność przeciwzapalna może być oceniana za pomocą klinicznie istotnego modelu ex vivo naśladującego perfuzję krwi na powierzchniach polimerowych11,12. Przewody krwionośne klasy klinicznej zmodyfikowane recCD47 wykazują znacznie mniejsze przyłączanie płytek krwi i komórek zapalnych w porównaniu z niemodyfikowanymi polimerami po wystawieniu na działanie ludzkiej krwi w aparacie. Opis krok po kroku tego procesu modyfikacji znajduje się poniżej.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehydu (PFA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>58906</td><td>Uwaga! Stosować w dygestoriach</td></tr><tr><td>25% aldehydu glutarowego</td><td>VWR</td><td>AAA17876-AP&nbsp;</td><td>ostrożność! Zastosowanie w dygestorii</td></tr><tr><td>2-pirydyloditionio,benzofenon (PDT-BzPH)</td><td>Zsyntetyzowany w laboratorium</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian</td><td>Sigma</td><td>S5770-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Leica</td><td>DC500</td><td>Poza produkcją</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547-100ML</td><td>Uwaga! Stosować w dygestoriach</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>Uwaga! Stosować w dygestoriach</td></tr><tr><td>Human CD47 (B6H12) &ndash; Przeciwciało FITC</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-12730</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Acros Organics</td><td>197450050</td><td>Uwaga! Stosować w dygestoriach</td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu (KHCO3)</td><td>Sigma</td><td>237205-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Rurka PVC Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>(zestaw do zabiegów sercowo-naczyniowych)</td><td>Terumo Cardiovascular Systems</td><td>60050</td><td>Większość rurek klasy klinicznej będzie działać</td></tr><tr><td>Skanowanie elektronu Mikroskop</td><td>JEOL</td><td>JSM-T330A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Spectramax Gemini EM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Sigma</td><td>M6035-10MG</td><td>Wrażliwy na wilgoć!</td></tr><tr><td>tris (2-karboksyetylo)fosfina (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield z DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>H-1200</td><td>Wrażliwy na światło!</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba Spin &ndash; 7 K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>89891</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie aparatury pętlowej chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Reakcja ciała obcego zachodzi, gdy syntetyczna powierzchnia jest wprowadzana do ciała. Charakteryzuje się adsorpcją białek krwi, a następnie przyłączaniem i aktywacją płytek krwi, adhezją monocytów/makrofagów oraz zdarzeniami sygnalizacji komórek zapalnych, co prowadzi do powikłań pozabiegowych. Aparat pętli Chandlera to eksperymentalny system, który pozwala naukowcom badać interakcje molekularne i komórkowe, które zachodzą, gdy duże objętości krwi są perfuzjowane przez przewody polimerowe. W tym celu aparatura ta została wykorzystana jako model ex vivo pozwalający na ocenę właściwości przeciwzapalnych różnych modyfikacji powierzchni polimerów. Nasze laboratorium wykazało, że przewody krwionośne, kowalencyjnie modyfikowane za pomocą chemii fotoaktywacyjnej z rekombinowanym CD47, mogą nadawać biokompatybilność powierzchniom polimerowym. Dołączanie CD47 do powierzchni polimerowych może być skutecznym sposobem na zwiększenie skuteczności polimerowych przewodów krwionośnych. Poniżej przedstawiono metodologię szczegółowo opisującą chemię fotoaktywacji stosowaną do dołączania rekombinowanego CD47 do klinicznie istotnych polimerowych przewodów krwiopochodnych oraz wykorzystanie pętli Chandlera jako modelu eksperymentalnego ex vivo do badania interakcji krwi ze zmodyfikowanymi i kontrolnymi przewodami CD47.

Generowanie polimerowych powierzchni reaktywnych wobec grup tiolowych przy użyciu PDT-BzPh i TCEP wraz z recCD47 poli-lizyną reaktywną wobec grup tiolowych za pomocą SMCC umożliwia przyłączenie recCD47 do powierzchni polimerowych. Proces modyfikacji przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. Zaletą tego procesu modyfikacji jest możliwość jego zastosowania do wielu różnych białek i wielu różnych powierzchni polimerowych, pod warunkiem, że białko może zostać zmodyfikowane odpowiednią liczbą chemicznie reakt...

Kontakt krwi z polimerowymi kanałami krwionośnymi inicjuje reakcję ciała obcego, która jest związana z klinicznymi powikłaniami. Tutaj opisano Aparat Pętli Chandlera, eksperymentalne narzędzie naśladujące perfuzję krwi przez te przewody. Wyrostek rekombinowanego CD47 powoduje zmniejszenie dowodów reakcji ciała obcego na tych przewodach.

Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena biokompatybilności polimerów modyfikowanych rekombinowanym CD 47 przy użyciu modelu obfitości krwi w pętli Chandlera. Osiąga się to poprzez uprzednią modyfikację polimerów rekombinowanym CD 47. Wykorzystując chemię aktywacji fotograficznej jako drugi krok, zmodyfikowane polimery są wystawiane na działanie ludzkiej krwi w pętli Chandlera, aby naśladować perfuzję krwi na wszczepionych materiałach.Następnie przyłączone komórki są utrwalane i barwione w celu policzenia liczby przylegających komórek jako miary biokompatybilności. Wyniki pokazują, że rekombinowany CD 47 sprzyja biokompatybilności polimerów i zmniejsza odrzucenie ciała obcego w oparciu o obserwację, że znacznie mniej komórek przylega do rekombinowanych polimerów zmodyfikowanych CD 47 w porównaniu z polimerami niemodyfikowanymi. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak zapobieganie odrzuceniu wszczepionych wyrobów medycznych.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zapobiegania awariom wszczepialnych urządzeń, ponieważ rekombinowany CD 47 jest obiecujący w promowaniu biokompatybilności i zapobieganiu reakcji ciała obcego

the-use-ex-vivo-chandler-loop-apparatus-to-assess-biocompatibility

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Opisujemy zaprojektowany przez nas model komory przepływowej in vitro, który pozwala na badanie przylegania bakterii do przeszczepionych tkanek.

Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu

Ten protokół opisuje kompleksową ocenę hemokompatybilności urządzeń mających kontakt z krwią za pomocą laserowo wycinanych implantów nerwowo-naczyniowych. Model pętli przepływu ze świeżą, heparynizowaną krwią ludzką jest stosowany w celu naśladowania przepływu krwi. Po perfuzji różne markery hematologiczne są analizowane i porównywane z wartościami uzyskanymi bezpośrednio po pobraniu krwi w celu oceny hemokompatybilności badanych urządzeń.

Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Ten protokół pozwala na ilościowe określenie in vivo podatności i rozciągliwości żył za pomocą cewnikowania i angiografii 3D jako procedury przetrwania, co pozwala na różnorodność potencjalnych zastosowań.

Kwantyfikacja podatności i rozciągliwości żyły głównej dolnej w modelu owiec in vivo przy użyciu angiografii 3D

Dowiedz się, jak oceniać biokompatybilność polimerów zmodyfikowanych rekombinowanym CD47 za pomocą modelu pętlowego Chandlera ex vivo. Ta metoda pozwala zmniejszyć reakcję obcego ciała w implantach medycznych.

Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych

Przeglądaj więcej filmów