Protokół mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) do badań biomarkerów
September 23rd, 2014
Protokół ma na celu optymalizację konstrukcji i jakości mikromacierzy tkankowych do badań nad biomarkerami. Obejmuje aspekty planowania i projektowania, patologii cyfrowej, wirtualnych adnotacji do slajdów i automatycznego układania tkanek.
Celem poniższej procedury jest skonstruowanie optymalnych lub ukierunkowanych mikromacierzy tkankowych do późniejszego wykorzystania w badaniach biomarkerów. W pierwszej kolejności tworzone jest cyfrowe archiwum preparatów z reprezentatywnych preparatów tkankowych. Histologiczne obszary zainteresowania są opisywane na szkiełkach cyfrowych, aby określić dokładne regiony odpowiednich bloków dawcy, które mają zostać przeniesione do bloku mikropromieniowania tkankowego.
Po utworzeniu projektu i układów mikromacierzy tkankowej, bloki dawcy są automatycznie dziurkowane, a przyczyna jest ładowana do mikromacierzy tkankowych. Dzięki temu precyzyjnemu, szybkiemu i zautomatyzowanemu podejściu nowej generacji, precyzyjne obszary histologiczne, a nawet poszczególne grupy komórek mogą być dokładnie uchwycone i przeniesione do mikromacierzy tkankowej. Główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi metodami mikropierścieniowania tkankowego, takimi jak użycie urządzenia domowego lub półautomatycznego, jest oczywiście dokładność histologiczna.
Osiąga się to poprzez połączenie mocnych stron patologii cyfrowej z wiedzą histologiczną, a także zautomatyzowanym mikropierścieniem tkankowym, który dziś demonstruje procedurę, Kalin Hamman i Jose Galvan. Dwie pomoce techniczne z naszego laboratorium Korzystanie z oprogramowania do skanowania. Najpierw wybierz tryb automatyczny dla skanowania w jasnym polu.
Następnie kliknij opcje skanowania, aby dostosować parametry jakości slajdu. Teraz wybierz, czy chcesz zapisać skany slajdów lokalnie, czy w Internecie, zakończ, klikając parametry serwera i ustaw miejsce docelowe skanowania na centrum sprawy. Teraz przygotuj slajdy przed załadowaniem slajdów do magazynu W przypadku skanera sprawdź, czy szkiełka są czyste.
W razie potrzeby wyczyść je Za pomocą etanolu do każdego magazynka można załadować do 25 szkiełek, a do skanera można załadować do 10 magazynków. Wiele magazynków jest ułożonych w stos po ich załadowaniu. Po załadowaniu slajdów podaj wszystkie slajdy, nazwy plików i ustaw folder zapisu w centrum przypadku.
Teraz rozpocznij skanowanie slajdu, klikając zieloną strzałkę. W tej sekcji miejsca, z których próbki tkanek są dziurkowane na szkiełku, są ustawiane za pomocą adnotacji do szkiełka cyfrowego. Zacznij od otwarcia folderu slajdów cyfrowych.
W oprogramowaniu do przeglądania można wprowadzać zmiany w samym folderze. Można dodawać notatki, zmieniać kolejność slajdów i ustawiać uprawnienia użytkowników oraz załączniki. Teraz rozpocznij dodawanie adnotacji do slajdów, klikając jeden z nich.
Pojawi się w przeglądarce. W przeglądarce. Użyj narzędzia do powiększania, aby ocenić slajd i znaleźć obszary zainteresowania do integracji z TMA nowej generacji.
Korzystając z narzędzia adnotacji TMA, wybierz rozmiar żądanego rdzenia i kolor adnotacji. Dołącz tę adnotację do slajdu, klikając slajd. Następnie przenieś adnotację do żądanych struktur histologicznych.
Adnotacje te oznaczają lokalizacje stempla na odpowiednim bloku tkanki. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie slajdy zostaną opatrzone adnotacjami. Alternatywną opcją dla przyczyny tkankowej jest wysłanie ich do 0,2 mililitrowej probówki PCR w celu analizy molekularnej.
Opisz slajdy, używając innego kolorowego znacznika, aby odróżnić te plamy od tych, które są TMA. Po utworzeniu wszystkich adnotacji zapisz plik arkusza kalkulacyjnego zawierający listę wszystkich slajdów wraz z odpowiadającymi im adnotacjami i kolorami adnotacji. Rozpocznij mikrorekonstrukcję tkanki od pobrania odpowiednich bloków tkanki parafinowej dla wszystkich szkiełek cyfrowych z adnotacjami, i dalej.
Nazywa się to blokami dawców. Posortuj bloki w tej samej kolejności, co slajdy cyfrowe. Sprawdź, czy każdy blok ma grubość co najmniej czterech milimetrów.
Jeśli nie, tkanka będzie musiała zostać wynaleziona na nowo przy komputerze. Otwórz mikromacierz tkankową oprogramowania i podaj nazwę projektu. Przejdź do wymiany narzędzi i wybierz żądaną średnicę narzędzia.
Teraz załaduj do 12 bloków odbiorców do maszyny. Zanotuj nazwy bloków. Wszystkie powinny być oznaczone przy użyciu tego samego systemu numeracji w celu zapewnienia spójności.
Następnie w oprogramowaniu przypisz odpowiednią nazwę do każdego z bloków, aby stworzyć układ TMA. Najpierw wykonaj nowy projekt TMA, przypisując liczbę rzędów, kolumn, pustych linii i odstępów między stemplami. Zapisz układ i przypisz go do bloku.
Następnie powtórz proces dla następnego bloku. W przypadku nowego układu lub tego samego układu rozmiary rdzeni można zmieniać między blokami odbiorców. Następnie załaduj do 60 bloków dawcy do maszyny.
W każdym rzędzie mieści się do 10 bloków. Od A do F. Pozostałe bloki dawcy zostaną załadowane później w oprogramowaniu. Nadaj każdemu blokowi darczyńców imię i nazwisko identyfikujące.
Obraz każdego bloku zostanie uzyskany automatycznie. Teraz wyrównaj szkiełka cyfrowe z odpowiadającymi im blokami dawcy. Najpierw wybierz blok.
Następnie kliknij slajd i porównaj obrazy slajdów i bloków obok siebie. Wybierz punkty odniesienia na obrazie bloku dawczego, które odpowiadają określonym punktom na odpowiednim slajdzie cyfrowym. Następnie kliknij Dalej, a adnotacje przejdą na obraz bloku dawcy.
Jeśli adnotacje są poprawne, kliknij każdą z nich, aby potwierdzić jej lokalizację. Następnie kliknij przycisk Start. To skłania mikromacierz do wywiercenia otworu w punkcie odniesienia w bloku biorczym, a następnie wybicia otworu z bloku dawcy w tym samym miejscu i przeniesienia rdzenia do bloku biorczego.
Aby zebrać rdzenie do probówki do PCR, kliknij narzędzie PCR dla bloku. Można użyć do czterech adnotacji, aby dostarczyć tkankę do probówki. Po ich ustawieniu kliknij start, a dawca zostanie wezwany, a rurka załadowana.
Po tym, jak maszyna wywierci i wykrawa, rdzenie, zaktualizuj obraz bloku dawcy. Kontynuuj powtarzanie wyrównywania i dodawania adnotacji do następnego bloku. Następnie wydrąż go.
Rób to dla każdego bloku dawców. To będzie w TMA. Kiedy pierwszy zestaw 60 bloków dawcy zostanie skompletowany, rozładuj je i załaduj kolejne 60 bloków.
Kontynuuj proces, aż wszystkie bloki dawcy zostaną ustawione w układzie. Po pobraniu około 500 rdzeni wyczyść wiertło, a narzędzie do wykrawania zostanie wykrawane. Po zakończeniu tworzenia tablic wyeksportuj projekt.
Plik arkusza kalkulacyjnego z danymi projektu będzie znajdował się w folderze eksportu. Pokazuje lokalizację każdej próbki w każdym bloku TMA. Następnie zapisz obrazy bloku dawcy z nałożonymi adnotacjami jako pliki JPEG do folderu eksportu.
Na tym kończy się proces generowania bloku TMA. Ten układ TMA przedstawia sześć bloków NG TMA, które zostały skonstruowane w dwóch kopiach dla 12 końcowych bloków wypełniających tablicę. Każdy blok guza zawierał 402 plamki tkankowe, a każdy normalny blok tkanki zawierał 268 plamek.
Po tym, jak 60 bloków dawców zostało opatrzonych adnotacjami, przyczyna została wybita. Czas transferu rdzenia wynosił około 12 sekund. Straty rdzenia były minimalne, a całkowity czas potrzebny na wykonanie macierzy w tym projekcie wyniósł łącznie około 24 godzin.
Obejmowało to czas potrzebny na wybicie przyczyny do późniejszej analizy molekularnej po procesie N-G-T-M-A. Inne metody, takie jak immunohistochemia w hybrydyzacji cyto, a nawet specjalne barwienia, można zastosować do tych mikromacierzy tkankowych, aby odpowiedzieć na niektóre pytania, takie jak to, które geny lub białka są wyrażane lub nawet zmieniane w różnych tkankach.
Przegląd
Ten protokół opisuje budowę i optymalizację mikrotablic tkankowych do badań nad biomarkerami. Integruje patologię cyfrową i zautomatyzowane układanie tablic tkankowych w celu poprawy dokładności histologicznej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Badania nad biomarkerami
- Technologia mikrotablic tkankowych
- Patologia cyfrowa
Tło
- Mikrotablice tkankowe są niezbędne do wysokowydajnej analizy biomarkerów.
- Cyfrowe archiwa ślizgów ułatwiają precyzyjne oznaczanie obszarów histologicznych.
- Zautomatyzowane procesy poprawiają wydajność i dokładność pobierania próbek tkankowych.
- Doświadczenie histologiczne jest kluczowe dla optymalnego doboru tkanek.
Cel badania
- Aby skonstruować ukierunkowane mikrotablice tkankowe do badań nad biomarkerami.
- Aby poprawić dokładność pobierania próbek tkankowych poprzez automatyzację.
- Aby usprawnić proces oznaczania cyfrowych ślizgów i transferu tkanek.
Zastosowane metody
- Tworzenie cyfrowych archiwów ślizgów z reprezentatywnych ślizgów tkankowych.
- Oznaczanie interesujących obszarów histologicznych na cyfrowych ślizgach.
- Zautomatyzowane wybijanie brył donorskich w celu stworzenia mikrotablic tkankowych.
- Wykorzystanie oprogramowania do projektowania TMA i zarządzania układem.
Główne wyniki
- Udana konstrukcja mikrotablic tkankowych o wysokiej dokładności histologicznej.
- Efektywny transfer ukierunkowanych próbek tkankowych do brył odbiorczych.
- Ulepszony przepływ pracy poprzez automatyzację i integrację patologii cyfrowej.
- Stworzenie kompleksowej tabeli danych projektu do dalszej analizy.
Wnioski
- Protokół znacznie poprawia jakość mikrotablic tkankowych.
- Łączenie patologii cyfrowej ze zautomatyzowanymi technikami daje precyzyjne wyniki.
- To podejście jest korzystne w porównaniu z tradycyjnymi metodami budowy mikrotablic tkankowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Next-generation tissue microarray (ngTMA) technology addresses the critical need for precise, reproducible tissue sampling in biomarker discovery and validation. By integrating digital pathology with automated arraying, ngTMA enhances histological accuracy and throughput, directly supporting target validation and assay development workflows. This approach reduces biological noise in preclinical models, improving predictive confidence in lead identification and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing specific histological regions such as tumor center, invasion front, and metastatic sites for functional target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise annotation of tissue zones, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating standardized tissue spots from annotated regions, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated punching and digital slide matching, ensuring consistent sample preparation across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by incorporating multiple tissue types/histological zones (e.g., tumor, lymph node, liver metastases, normal tissue) from patient samples.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by producing multiple ngTMA copies for parallel analysis in immunohistochemistry, in situ hybridization, and special stains.
Pipeline & Workflow Integration
ngTMA integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work by providing quantitative, spatially resolved tissue outputs that support hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through precise capture of histological areas of interest via digital annotation.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via automated arraying of annotated regions producing standardized tissue spots.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions through digital slide annotation and project data export for further analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by enabling application of IHC, ISH, and special stains on ngTMAs to assess protein/gene expression across tissue zones.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through the production of multiple ngTMA copies and digital slide archiving for future studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, digital pathology, and tissue microarray design.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including automated tissue arrayer, slide scanner, and web-based annotation platform.
- Cross-team standardization requirements for annotation protocols, block labeling, and data management.
- Adaptation considerations across model systems such as varying tissue types, core sizes, and patient sample volumes.
- Practical limitations supported by source material including annotation time (2-3 min/case), scanning requirements (3 overnight runs for 134 patients), and arraying time (15-20 hr).
