Protokół mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) do badań biomarkerów
23 września 2014
Protokół ma na celu optymalizację konstrukcji i jakości mikromacierzy tkankowych do badań nad biomarkerami. Obejmuje aspekty planowania i projektowania, patologii cyfrowej, wirtualnych adnotacji do slajdów i automatycznego układania tkanek.
Celem poniższej procedury jest skonstruowanie optymalnych lub ukierunkowanych mikromacierzy tkankowych do późniejszego wykorzystania w badaniach biomarkerów. W pierwszej kolejności tworzone jest cyfrowe archiwum preparatów z reprezentatywnych preparatów tkankowych. Histologiczne obszary zainteresowania są opisywane na szkiełkach cyfrowych, aby określić dokładne regiony odpowiednich bloków dawcy, które mają zostać przeniesione do bloku mikropromieniowania tkankowego.
Po utworzeniu projektu i układów mikromacierzy tkankowej, bloki dawcy są automatycznie dziurkowane, a przyczyna jest ładowana do mikromacierzy tkankowych. Dzięki temu precyzyjnemu, szybkiemu i zautomatyzowanemu podejściu nowej generacji, precyzyjne obszary histologiczne, a nawet poszczególne grupy komórek mogą być dokładnie uchwycone i przeniesione do mikromacierzy tkankowej. Główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi metodami mikropierścieniowania tkankowego, takimi jak użycie urządzenia domowego lub półautomatycznego, jest oczywiście dokładność histologiczna.
Osiąga się to poprzez połączenie mocnych stron patologii cyfrowej z wiedzą histologiczną, a także zautomatyzowanym mikropierścieniem tkankowym, który dziś demonstruje procedurę, Kalin Hamman i Jose Galvan. Dwie pomoce techniczne z naszego laboratorium Korzystanie z oprogramowania do skanowania. Najpierw wybierz tryb automatyczny dla skanowania w jasnym polu.
Następnie kliknij opcje skanowania, aby dostosować parametry jakości slajdu. Teraz wybierz, czy chcesz zapisać skany slajdów lokalnie, czy w Internecie, zakończ, klikając parametry serwera i ustaw miejsce docelowe skanowania na centrum sprawy. Teraz przygotuj slajdy przed załadowaniem slajdów do magazynu W przypadku skanera sprawdź, czy szkiełka są czyste.
W razie potrzeby wyczyść je Za pomocą etanolu do każdego magazynka można załadować do 25 szkiełek, a do skanera można załadować do 10 magazynków. Wiele magazynków jest ułożonych w stos po ich załadowaniu. Po załadowaniu slajdów podaj wszystkie slajdy, nazwy plików i ustaw folder zapisu w centrum przypadku.
Teraz rozpocznij skanowanie slajdu, klikając zieloną strzałkę. W tej sekcji miejsca, z których próbki tkanek są dziurkowane na szkiełku, są ustawiane za pomocą adnotacji do szkiełka cyfrowego. Zacznij od otwarcia folderu slajdów cyfrowych.
W oprogramowaniu do przeglądania można wprowadzać zmiany w samym folderze. Można dodawać notatki, zmieniać kolejność slajdów i ustawiać uprawnienia użytkowników oraz załączniki. Teraz rozpocznij dodawanie adnotacji do slajdów, klikając jeden z nich.
Pojawi się w przeglądarce. W przeglądarce. Użyj narzędzia do powiększania, aby ocenić slajd i znaleźć obszary zainteresowania do integracji z TMA nowej generacji.
Korzystając z narzędzia adnotacji TMA, wybierz rozmiar żądanego rdzenia i kolor adnotacji. Dołącz tę adnotację do slajdu, klikając slajd. Następnie przenieś adnotację do żądanych struktur histologicznych.
Adnotacje te oznaczają lokalizacje stempla na odpowiednim bloku tkanki. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie slajdy zostaną opatrzone adnotacjami. Alternatywną opcją dla przyczyny tkankowej jest wysłanie ich do 0,2 mililitrowej probówki PCR w celu analizy molekularnej.
Opisz slajdy, używając innego kolorowego znacznika, aby odróżnić te plamy od tych, które są TMA. Po utworzeniu wszystkich adnotacji zapisz plik arkusza kalkulacyjnego zawierający listę wszystkich slajdów wraz z odpowiadającymi im adnotacjami i kolorami adnotacji. Rozpocznij mikrorekonstrukcję tkanki od pobrania odpowiednich bloków tkanki parafinowej dla wszystkich szkiełek cyfrowych z adnotacjami, i dalej.
Nazywa się to blokami dawców. Posortuj bloki w tej samej kolejności, co slajdy cyfrowe. Sprawdź, czy każdy blok ma grubość co najmniej czterech milimetrów.
Jeśli nie, tkanka będzie musiała zostać wynaleziona na nowo przy komputerze. Otwórz mikromacierz tkankową oprogramowania i podaj nazwę projektu. Przejdź do wymiany narzędzi i wybierz żądaną średnicę narzędzia.
Teraz załaduj do 12 bloków odbiorców do maszyny. Zanotuj nazwy bloków. Wszystkie powinny być oznaczone przy użyciu tego samego systemu numeracji w celu zapewnienia spójności.
Następnie w oprogramowaniu przypisz odpowiednią nazwę do każdego z bloków, aby stworzyć układ TMA. Najpierw wykonaj nowy projekt TMA, przypisując liczbę rzędów, kolumn, pustych linii i odstępów między stemplami. Zapisz układ i przypisz go do bloku.
Następnie powtórz proces dla następnego bloku. W przypadku nowego układu lub tego samego układu rozmiary rdzeni można zmieniać między blokami odbiorców. Następnie załaduj do 60 bloków dawcy do maszyny.
W każdym rzędzie mieści się do 10 bloków. Od A do F. Pozostałe bloki dawcy zostaną załadowane później w oprogramowaniu. Nadaj każdemu blokowi darczyńców imię i nazwisko identyfikujące.
Obraz każdego bloku zostanie uzyskany automatycznie. Teraz wyrównaj szkiełka cyfrowe z odpowiadającymi im blokami dawcy. Najpierw wybierz blok.
Następnie kliknij slajd i porównaj obrazy slajdów i bloków obok siebie. Wybierz punkty odniesienia na obrazie bloku dawczego, które odpowiadają określonym punktom na odpowiednim slajdzie cyfrowym. Następnie kliknij Dalej, a adnotacje przejdą na obraz bloku dawcy.
Jeśli adnotacje są poprawne, kliknij każdą z nich, aby potwierdzić jej lokalizację. Następnie kliknij przycisk Start. To skłania mikromacierz do wywiercenia otworu w punkcie odniesienia w bloku biorczym, a następnie wybicia otworu z bloku dawcy w tym samym miejscu i przeniesienia rdzenia do bloku biorczego.
Aby zebrać rdzenie do probówki do PCR, kliknij narzędzie PCR dla bloku. Można użyć do czterech adnotacji, aby dostarczyć tkankę do probówki. Po ich ustawieniu kliknij start, a dawca zostanie wezwany, a rurka załadowana.
Po tym, jak maszyna wywierci i wykrawa, rdzenie, zaktualizuj obraz bloku dawcy. Kontynuuj powtarzanie wyrównywania i dodawania adnotacji do następnego bloku. Następnie wydrąż go.
Rób to dla każdego bloku dawców. To będzie w TMA. Kiedy pierwszy zestaw 60 bloków dawcy zostanie skompletowany, rozładuj je i załaduj kolejne 60 bloków.
Kontynuuj proces, aż wszystkie bloki dawcy zostaną ustawione w układzie. Po pobraniu około 500 rdzeni wyczyść wiertło, a narzędzie do wykrawania zostanie wykrawane. Po zakończeniu tworzenia tablic wyeksportuj projekt.
Plik arkusza kalkulacyjnego z danymi projektu będzie znajdował się w folderze eksportu. Pokazuje lokalizację każdej próbki w każdym bloku TMA. Następnie zapisz obrazy bloku dawcy z nałożonymi adnotacjami jako pliki JPEG do folderu eksportu.
Na tym kończy się proces generowania bloku TMA. Ten układ TMA przedstawia sześć bloków NG TMA, które zostały skonstruowane w dwóch kopiach dla 12 końcowych bloków wypełniających tablicę. Każdy blok guza zawierał 402 plamki tkankowe, a każdy normalny blok tkanki zawierał 268 plamek.
Po tym, jak 60 bloków dawców zostało opatrzonych adnotacjami, przyczyna została wybita. Czas transferu rdzenia wynosił około 12 sekund. Straty rdzenia były minimalne, a całkowity czas potrzebny na wykonanie macierzy w tym projekcie wyniósł łącznie około 24 godzin.
Obejmowało to czas potrzebny na wybicie przyczyny do późniejszej analizy molekularnej po procesie N-G-T-M-A. Inne metody, takie jak immunohistochemia w hybrydyzacji cyto, a nawet specjalne barwienia, można zastosować do tych mikromacierzy tkankowych, aby odpowiedzieć na niektóre pytania, takie jak to, które geny lub białka są wyrażane lub nawet zmieniane w różnych tkankach.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje konstrukcję i optymalizację mikrotablic tkankowych w badaniach nad biomarkerami. Integruje on patologię cyfrową oraz zautomatyzowane tworzenie tablic tkankowych w celu zwiększenia dokładności histologicznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad biomarkerami
- Technologia mikrotablic tkankowych
- Patologia cyfrowa
Wstęp
- Macierze tkanek są niezbędne do wysokoprzepustowej analizy biomarkerów.
- Cyfrowe archiwa preparatów ułatwiają precyzyjną adnotację obszarów histologicznych.
- Zautomatyzowane procesy zwiększają wydajność i dokładność pobierania próbek tkanek.
- Wiedza z zakresu histologii jest kluczowa dla optymalnego wyboru tkanek.
Cel badania
- W celu przygotowania celowanych macierzy tkankowych (TMA) do badań nad biomarkerami.
- W celu zwiększenia dokładności pobierania próbek tkankowych poprzez automatyzację.
- W celu usprawnienia procesu cyfrowej adnotacji preparatów i przenoszenia tkanek.
Zastosowane Metody
- Tworzenie cyfrowych archiwów preparatów na podstawie reprezentatywnych skrawków tkanek.
- Adnotacja histologicznych obszarów zainteresowania na preparatach cyfrowych.
- Zautomatyzowane wycinanie rdzeni z bloków dawców w celu stworzenia macierzy tkankowych (TMA).
- Wykorzystanie oprogramowania do projektowania TMA i zarządzania układem preparatów.
Główne wyniki
- Skuteczne przygotowanie macierzy tkankowych (TMA) o wysokiej precyzji histologicznej.
- Efektywny transfer wybranych próbek tkanek do bloków biorczych.
- Usprawnienie procesu pracy dzięki automatyzacji i integracji z patologią cyfrową.
- Stworzenie kompleksowej arkusza danych projektu do dalszej analizy.
Wnioski
- Protokół ten znacząco poprawia jakość mikrotablic tkankowych.
- Połączenie patologii cyfrowej z technikami zautomatyzowanymi pozwala na uzyskanie precyzyjnych wyników.
- Podejście to jest korzystniejsze od tradycyjnych metod konstruowania mikrotablic tkankowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technologia mikroarrayów tkankowych nowej generacji (ngTMA) odpowiada na krytyczną potrzebę precyzyjnego i powtarzalnego pobierania próbek tkanek w procesach odkrywania i walidacji biomarkerów. Dzięki integracji patologii cyfrowej z zautomatyzowanym tworzeniem macierzy, ngTMA zwiększa dokładność histologiczną oraz przepustowość, bezpośrednio wspierając procesy walidacji celów i opracowywania testów diagnostycznych. Podejście to redukuje szum biologiczny w modelach przedklinicznych, zwiększając pewność predykcyjną w identyfikacji wiodących kandydatów oraz w translacyjnych badaniach nad biomarkerami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pobieranie specyficznych regionów histologicznych, takich jak centrum guza, front inwazyjny oraz miejsca przerzutów, w celu funkcjonalnej walidacji punktów uchwycenia.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki precyzyjnej adnotacji stref tkankowych, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad oddziaływaniem z punktem uchwycenia.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie ustandaryzowanych wycinków tkanek z opisanych obszarów, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje problem standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zautomatyzowanemu wycinaniu i cyfrowemu dopasowaniu preparatów, zapewniając spójne przygotowanie próbek w ramach poszczególnych serii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie znaczenia dla choroby i dopasowania biomarkerów translacyjnych poprzez włączenie wielu typów tkanek/stref histologicznych (np. guza, węzła chłonnego, przerzutów do wątroby, tkanki prawidłowej) z próbek pacjentów.
- Wartość operacyjna: Opis ciągłości procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez przygotowanie wielu kopii ngTMA do równoległej analizy w immunohistochemii, hybrydyzacji in situ i barwieniach specjalnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
ngTMA integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnej fazy odkrywania (Early Discovery) po identyfikację wiodącego związku (Lead Identification) i prace przedkliniczne – dostarczając ilościowe, rozdzielcze przestrzennie wyniki analizy tkanek, które wspierają testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera weryfikację hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych lub ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez precyzyjne wyodrębnianie obszarów histologicznych zainteresowania za pomocą adnotacji cyfrowych.
- Przesiewy: Opisuje gotowość do analizy, powtarzalność lub wyniki ilościowe, o ile artykuł na to pozwala, poprzez zautomatyzowany układ adnotowanych obszarów, co pozwala na uzyskanie standaryzowanych punktów tkankowych.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, odczyty lub wyniki statystyczne, które pomagają zespołom porównywać warunki dzięki cyfrowym adnotacjom slajdów i eksportowi danych projektowych do dalszej analizy.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów tylko wtedy, gdy źródło to wspiera, umożliwiając zastosowanie IHC, ISH i barwień specjalnych na ngTMA w celu oceny ekspresji białek/genów w różnych strefach tkankowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalną zdolność, a nie technikę jednorazową, poprzez wytwarzanie wielu kopii ngTMA oraz archiwizację cyfrowych slajdów na potrzeby przyszłych badań.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu histologii, patologii cyfrowej oraz projektowania macierzy tkankowych (TMA).
- Potrzeby w zakresie instrumentacji i infrastruktury analitycznej, w tym automatycznego urządzenia do tworzenia macierzy tkankowych, skanera do slajdów oraz internetowej platformy do adnotacji.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w odniesieniu do protokołów adnotacji, etykietowania bloków i zarządzania danymi.
- Rozważania dotyczące adaptacji w różnych systemach modelowych, takich jak zróżnicowane typy tkanek, rozmiary rdzeni oraz objętości próbek pacjentów.
- Ograniczenia praktyczne poparte materiałem źródłowym, obejmujące czas adnotacji (2-3 min/przypadek), wymagania dotyczące skanowania (3 uruchomienia nocne dla 134 pacjentów) oraz czas tworzenia macierzy (15-20 hr).
