Name: Test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Poznaj test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej w neuronach motorycznych myszy. Ta metoda umożliwia przesiewowe wykrywanie małych cząsteczek blokujących aktywność toksyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez Joint Science and Technology Office - Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) pod numerem projektu sponsora CCAR# CB3675 oraz National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 i 5 U01AI082051-05).

Płytka 20 000 zróżnicowanych mysich komórek ES (MES) / dobrze w 96-dołkowej płytce pokrytej lizyną Poly-D i utrzymuj w pożywce różnicującej końcówki neuronów ruchowych przez 5-7 dni.
1. Podawanie związków i zatrucie BoNT/A
Wykonaj wszystkie poniższe prace w obudowie BSL2, aby zachować zgodność z wytycznymi CDC/NIH.
<ol>
	<li>Przygotować 10 mM roztworów podstawowych każdego związku bibliotecznego w 100% DMSO w 96-dołkowych płytkach polipropylenowych. Użyć materiału podstawowego o wielkości 10 mM, aby przygotować pośrednią płytkę rozcieńczającą, która jest 10-krotnie większa niż pożądane stężenie przesiewowe. Przygotować płytkę pośrednią o wielkości 100 μM, dozując 10 μM bulionu do płytki 96-dołkowej i rozcieńczyć ją do 100 μM za pomocą pożywek hodowlanych. Dozować 10 μl związków na 90 μl pożywki na komórkach11. Przetestuj związki przy końcowym stężeniu 10 μm i upewnij się, że końcowa zawartość procentowa DMSO nie przekracza 0,5%.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie badania, w których wykorzystuje się żywe komórki i aktywną toksynę w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Zastąp stare podłoża w 96-dołkowych płytkach 80 μl świeżej pożywki do różnicowania końcowego za pomocą 12-kanałowej pipety ręcznej. Aspirację i dozowanie należy przeprowadzać krok po kroku, aby uniknąć narażenia komórek bez pożywki na działanie otaczającego powietrza.</li>
	<li>Przed zastosowaniem toksyny należy wstępnie potraktować komórki związkami poprzez dodanie 10 μl 10 x związków z płytki źródłowej za pomocą 12-kanałowej pipety, a następnie wymieszanie przez aspirację (dwukrotnie). Dla każdej płytki 96-dołkowej należy potraktować dwie kolumny po 6 dołków 10x DMSO rozcieńczonym w mediach, aby służyły jako regulatory wysokiego i niskiego sygnału. Kolumna bez obróbki BoNT wykazuje najwyższy poziom pełnej długości SNAP-25 (wysoka kontrola sygnału). Drugą kolumnę z samym BoNT (bez żadnych związków) należy traktować jako kontrolę niskiego sygnału. Użyj niskiej kontroli, aby obserwować skuteczność rozszczepienia BoNT SNAP-25 i jego wykrywanie za pomocą przeciwciała BACS (ryc. 2).</li>
	<li>Inkubować komórki ze związkami przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 6% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Przygotować neurotoksynę botulinową A ze źródła handlowego 1 mg / ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego 10-krotnego wywaru roboczego przez rozcieńczenie końcowymi pożywkami różnicującymi.</li>
	<li>Zatrucie należy rozpocząć poprzez dodanie 10 μl 10x zapasu BoNT/A do studzienek przeznaczonych do uzdatniania i kontroli niskiego sygnału za pomocą pipety wielokanałowej (ryc. 2). Studzienki oznaczone jako wysoka kontrola należy traktować samymi mediami.</li>
	<li>Odkazić wszystkie plastikowe wyroby i inne materiały jednorazowego użytku, które mają kontakt z BoNT/A podczas badania, zanurzając je w 0,825% roztworze podchlorynu w wodzie na co najmniej 20 minut. Wykonaj wszystkie procedury w komorach bezpieczeństwa biologicznego i odkaż obszary robocze zarówno przed, jak i po eksperymentach za pomocą 5% detergentu dezynfekującego środka czyszczącego, takiego jak roztwór MicroChem.</li>
	<li>Płytki należy wyraźnie oznaczyć w celu wskazania stosowania toksyn i inkubować płytki poddane działaniu 1 nM/L BoNT/A przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 6% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych. Umieść odpowiednie oznakowanie, aby poinformować współpracowników, że toksyna jest używana w laboratorium.</li>
	<li>Zatrzymaj rozszczepienie proteolityczne BONT/A poprzez utrwalanie metanolu. Usuń pożywkę zawierającą toksyny i związki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety i wyrzuć do 10% roztworu wybielacza. Dodaj lodowaty metanol (100 μl) bezpośrednio do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować płytki przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby umożliwić utrwalenie.</li>
	<li>Po utrwaleniu należy bezpiecznie obchodzić się z wyrzuconymi odczynnikami (uważanymi za zneutralizowane) zgodnie z protokołami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 i odpowiednio wyrzucić.</li>
	<li>Wyrzuć metanol i użyj 100 μl PBS do umycia komórek i ponownego nawodnienia ich przed barwieniem immunologicznym. Wykonaj dwa dodatkowe mycia PBS.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu pozostawić PBS w studzienkach, uszczelnić płytki folią samoprzylepną do mikropłytek i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne
Procedura barwienia immunologicznego to pracochłonna, wieloetapowa operacja, która obejmuje powtarzalne cykle dozowania/aspiracji odczynników oraz intensywne mycie płytek, co może prowadzić do potencjalnego wprowadzenia znacznych zmian wewnątrz- i międzypłytkowych. Podejście półautomatyczne jest stosowane w celu zaoszczędzenia czasu personelu laboratoryjnego, zwiększenia przepustowości testu i zminimalizowania zmienności barwienia immunologicznego.
<ol>
	<li>Użyj zautomatyzowanej stacji roboczej wyposażonej w 96-dołkową głowicę zdolną do przenoszenia objętości do 250 μl i zintegrowanej z ramieniem chwytaka robota, aby przenieść sprzęt laboratoryjny w różne miejsca na modułowym pokładzie (patrz Materiały i sprzęt) dla tego protokołu.
	<ol>
		<li>Modułowy pokład został zaprojektowany tak, aby pomieścić różne rodzaje sprzętu laboratoryjnego i może obsługiwać do 11 przedmiotów jednocześnie. Zautomatyzowany wózek do mikropłytek jest wyposażony w układarkę mikropłytek z podwójnym magazynkiem, która umożliwia przechowywanie i manipulowanie nawet 50 płytkami w jednym cyklu.</li>
		<li>Zautomatyzowana stacja robocza znajduje się wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego klasy II przeznaczonej do urządzeń automatyki laboratoryjnej w celu zapewnienia sterylności i bezpieczeństwa. W przypadku automatycznego barwienia immunologicznego pokład jest ułożony tak, jak pokazano na rysunku 3, aby umożliwić dostęp do odczynnika w razie potrzeby i bez interwencji człowieka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępnie załaduj płyty zawierające stałe komórki do magazynu płytek i przenieś je na pokład w razie potrzeby w przypadku operacji obsługi cieczy. Użyj głowicy pipetowej 96 wyposażonej w końcówki o pojemności 250 μl, aby zassać PBS z dołków do 10 μl. Przepuszczalność błon komórkowych w celu ułatwienia wiązania przeciwciał z celami wewnątrzkomórkowymi za pomocą buforu permeabilizacji (0,1% Triton-X 100). Dozować bufor permeabilacyjny (100 μl) do każdego dołka przed powrotem płytek do drugiego magazynu układarki mikropłytek na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usunąć bufor permeabilizacyjny i przeprowadzić mycie płytki PBS (dwukrotnie), jak opisano wcześniej w kroku 1.13.</li>
	<li>Po ostatnim etapie płukania należy usunąć bufor PBS i dozować 100 μl buforu blokującego zawierającego 1% surowicy końskiej i 0,1% Tween 20 w PBS do wszystkich mikropłytek przed powrotem do magazynka płytek na 1 godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do barwienia immunologicznego należy użyć dwóch podstawowych przeciwciał: króliczego poliklonalnego przeciwciała przeciw-mysiego BACS do wykrywania pełnej długości SNAP-25 oraz mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-III tubuliny do wykrywania neuronów (patrz Materiał i sprzęt). Po 60 minutach inkubacji usunąć bufor blokujący i dozować 50 μl 4ug/ml przeciwciała BACS i 0,5 μg/ml buforu blokującego do wszystkich płytek.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 3 razy 100 μl PBS zawierającego 0,05% Tween (PBST).</li>
	<li>Użyj anty-mysiej IgG znakowanej Alexa Fluor 647, aby uwidocznić tubulinę -III i anty-króliczą IgG oznaczoną Alexa Fluor 568, aby uwidocznić przeciwciało BACS. Przygotować oba przeciwciała w postaci rozcieńczenia 2 μg/ml w buforze blokującym i dozować 50 μl mieszaniny do każdej studzienki. 
	UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe wybrane do barwienia immunologicznego są znakowane różnymi fluoroforami, aby umożliwić wykrycie emitowanego przez nie światła fluorescencyjnego na różnych długościach fal przy użyciu różnych kanałów w detektorze High Content Imager.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać przeciwciała drugorzędowe i przemyć 3 razy 100 μl PBST.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu dodać 100 μl PBS zawierającego barwnik Hoechst (32 μM) w celu wybarwienia DNA w celu wykrycia jąder.</li>
	<li>Uszczelnij płytki nieprzepuszczalną dla światła folią, aby chronić fluorofory przed fotowybielaniem. Płyty mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez tygodnie bez znacznej utraty sygnału.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
UWAGA: Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą systemu obrazowania o wysokiej zawartości (patrz Materiały i sprzęt).
<ol>
	<li>Specyfikacja definicji imagerów o wysokiej zawartości:
	<ol>
		<li>Wybierz typ płyty, układ, liczbę pól, cel: Greiner u clear, format 96 dołków, odpowiednio 16, 20X wody.</li>
		<li>Wybierz kanały: wzbudzenie jądra EX: 405 nm jako kanał 4; cytoplazma EX: 644 nm jako kanał 2; kanał przeciwciała specyficznego dla antygenu EX: 561 nm jako kanał 3 i ustaw moc wzbudzenia każdego lasera, ustaw eksperyment jako 2 ekspozycje, Ekspozycja 1 z jednym wzbudzeniem przy 644 nm, Ekspozycja 2 z dwoma wzbudzeniami przy 405 nm i 561 nm. Wybierz kategoryzację jako Bin2.</li>
		<li>Użyj wysokich studzienek kontrolnych do optymalizacji ekspozycji z maksymalną intensywnością jako kanału SNAP-25 i niskich studzienek kontrolnych do minimalnej intensywności.</li>
		<li>Dostosuj ekspozycję tak, aby intensywność każdego kanału wynosiła około połowy poziomu nasycenia (2,000-2,500 jednostek względnych).</li>
		<li>Zidentyfikuj optymalną płaszczyznę Z na kanale maski komórki za pomocą skryptu korekcji delta. Patrz rycina 5, aby zapoznać się z wynikami po barwieniu immunologicznym i obrazowaniu. Eksportuj dane na serwer, na którym znajduje się oprogramowanie do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu (Rysunek 6)

UWAGA: Poniższe kroki opisują zastosowanie algorytmów oprogramowania Columbus.
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni algorytm do segmentacji obiektów pierwotnych (jąder). W razie potrzeby dostosuj parametry progu tła i kontrastu. Oprogramowanie Columbus zapewnia 4 metody wykrywania jąder. Wybrać metodę, która dokładnie dzieli jądra na segmenty, dokonując oględzin jąder podzielonych na segmenty (w rys.6a wybrano metodę M).</li>
	<li>Wybierz algorytm neurytów (CSIRO Neurite Analysis 2), aby podzielić neuryty na segmenty W razie potrzeby dostosuj próg tła i parametry kontrastu, aby usunąć tło. Na rysunku 6b przedstawiono parametry używane do wykrywania neurytów.</li>
	<li>Zidentyfikuj regiony neurytów (segmenty neurytów) na podstawie obiektów drugorzędnych (neurytów) za pomocą rozszerzenia o -3 piksele kanału tubuliny β-III (Alexa Flour 640) jako maski (ryc. 6c).</li>
	<li>Oblicz intensywność kanałów sygnałowych (SNAP-25, (Alexa Flour 568) dla regionu neurytów i kanału tubuliny β-III (ryc. 6d i 6e).</li>
	<li>Wybierz żądane parametry do eksportu, takie jak długość neurytu, średnia intensywność SNAP-25, tubulina β-III, liczba jąder, liczba segmentów neurytów itp. (Rysunek 6f).</li>
	<li>Przenieś płyty z układarki płyt za pomocą robota i załaduj je do imagera o wysokiej zawartości w celu uzyskania obrazu.</li>
</ol>
5. Analiza danych:
Aby ocenić solidność zaprojektowanego testu, oblicz następujące parametry z eksperymentu na płytce.
<ol>
	<li>Sygnał (S) do tła (B): S/B = średnia intensywność kontroli wysokiego sygnału) / średnia intensywność kontroli niskiego sygnału</li>
	<li>Współczynnik zmienności (CV) sygnału i tła (do pomiaru jednorodności określonego sygnału): CV = (odchylenie standardowe (SD) / średnia próbki)*100(%), w celu określenia zmienności w obchodzeniu się z cieczą, odczynnikami itp.</li>
	<li>Sygnał do szumu: S = (średnie natężenie sygnału – średnie natężenie kontroli niskiego sygnału) / SD niskiej kontroli
	<ol>
		<li>Obliczyć współczynnik Z' przy zatruciu jedną połową płytki 96-dołkowej i pozorowanym zatruciem drugiej połowy. Z' = 1 - 3 * (SD kontroli wysokiego sygnału + SD kontroli niskiego sygnału) / (średnia kontroli wysokiego sygnału - średnia kontroli niskiego sygnału). W celu dalszej analizy danych przesiewowych należy znormalizować niektóre z podstawowych parametrów surowca na podstawie płytki, aby umożliwić porównanie między płytkami i między różnymi dniami eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procent rozszczepienia, odzwierciedlający redukcję sygnału związanego z SNAP-25 o pełnej długości wykrytej przez swoiste przeciwciało (BACS): % Rozszczepienie = 100% * (średnia intensywność kontroli wysokiego sygnału - intensywność próbki) / średnia intensywność kontroli wysokiego sygnału.</li>
	<li>Procent zahamowania rozszczepienia: % Zahamowania = 100% * (intensywność próbki - średnia intensywność kontroli niskiego sygnału) / (średnia intensywność kontroli wysokiego sygnału - średnia intensywność kontroli niskiego sygnału).</li>
</ol>

<ol><li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+most+poisonous+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li>
<li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li>
<li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+ground%3A+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li>
<li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li>
<li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li>
<li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+Research%22%5BJournal%5D)">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets%3A+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain%2C+P.+falciparum+malaria%2C+and+the+Ebola+filovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+2%2C5-bis%284-amidinophenyl%29thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li>
<li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+targeting%2C+internalization%2C+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li>
<li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel%2C+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li>
</ol>

Krishna P Kota jest pracownikiem firmy Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, która produkuje instrumenty i oprogramowanie użyte w tym manuskrypcie. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych, Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych, Departamentu Armii Stanów Zjednoczonych lub instytucji i firm powiązanych z autorami.

Wysoka siła działania neurotoksyn botulinowych i względna łatwość ich uzbrajania spowodowały, że amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób zaklasyfikowały je jako czynniki zagrożenia biologicznego kategorii A (najwyższy priorytet). Niestety, nie ma zatwierdzonych przez FDA środków terapeutycznych przeciwdziałających zatruciu BoNT po internalizacji toksyny przez neurony ruchowe. Każdy mechanizm, który sprzyja regeneracji neuronów po zatruciu BoNT, może prowadzić do opracowania potencjalnej terapii chroniącej zarówno...

Bakteria Clostridium botulinum wytwarza neurotoksynę botulinową, jedną z najsilniejszych toksyn biologicznych znanych człowiekowi1. Istnieje 7 różnych serotypów BoNT (BoNT/A-G). BoNT/A-Gall indukuje paraliż na złączu nerwowo-mięśniowym z powodu proteolizy kompleksu SNARE 2,3. Proteoliza SNARE zapobiega fuzji pęcherzyków neuroprzekaźników z błoną, a tym samym blokuje egzocytozę neuroprzekaźników4. Specyficzny cel SNARE zależy od konkretnego serotypu BoNT biorącego udział w procesie zatrucia. BoNT/A i BoNT/E rozszczepiają SNAP-25, podczas gdy BoNT/C rozszczepiają zarówno SNAP-25, jak i składnię5. Pozostałe serotypy rozszczepiają synaptobrevin (zwane również białkiem błonowym związanym z pęcherzykami (VAMP). Do opracowania testu wybrano BoNT/A, ponieważ jest on odpowiedzialny za wysoki odsetek naturalnie występującego zatrucia jadem kiełbasianym i ma najdłuższy czas działania6. Opracowanie małocząsteczkowych środków terapeutycznych przeciwko BoNT/A jest głównym celem naszego programu odkrywania leków i wykorzystaliśmy tradycyjne metody oparte na celach do identyfikacji inhibitorów proteolitycznych miejsca aktywnego 7,8-10. Jednak stworzenie inhibitorów miejsca aktywnego o szerokim spektrum działania przeciwko wielu serotypom i skuteczności poekspozycyjnej będzie prawdopodobnie wyzwaniem.
Dlatego wdrożyliśmy innowacyjne, fenotypowe podejście do odkrywania leków, które wykorzystuje rozszczepienie BoNT SNAP-25 jako funkcjonalny punkt końcowy do identyfikacji małych cząsteczek, które mogą blokować zatrucie neuronem ruchowym za pośrednictwem BoNT. SNAP-25 jest wymagany do uwalniania neuroprzekaźników, ponieważ degradacja SNAP-25 jest predyktorem paraliżu i śmiertelności in vivo. Na przykład badania przesiewowe oparte na komórkach mogą prowadzić do odkrycia nowych modulatorów czynników komórkowych odpowiedzialnych za inaktywację toksyn lub hamowanie szlaków toksyn w docelowych komórkach. Ważnym czynnikiem w rozwoju testów fenotypowych jest wybór fizjologicznie istotnych modeli biologicznych. My i inni opisaliśmy neurony ruchowe pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych myszy (ES), które podsumowują immunologiczny charakter pierwotnych neuronów ruchowych, w tym ekspresję SNAP-2511-13. Co ważne, te układy komórkowe są bardzo wrażliwe na zatrucie BoNT/A i wykazują zależne od dawki rozszczepienie SNAP-25 w odpowiedzi na rosnące stężenia toksyny11,12. Zróżnicowane neurony ruchowe są również wytwarzane w ilościach wystarczających do wysokoprzepustowej analizy opartej na płytkach i umożliwiły zaprojektowanie szeregu testów komórkowych.
Test fenotypowy to metoda immunofluorescencji wykorzystująca dwa różne przeciwciała do ilościowego określenia rozszczepienia endogennie wyrażonego SNAP-25 o pełnej długości podczas zatrucia BoNT/A hodowli neuronów ruchowych myszy. Przeciwciało wrażliwe na rozszczepienie BoNT/A (BACS) o końcu karboksylowym, które rozpoznaje tylko SNAP-25 o pełnej długości, umożliwia ocenę proteolizy ekspresji SNAP-25 za pośrednictwem BoNT / A w neuronach ruchowych myszy10. Schematyczny schemat testu HCI przedstawiono na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>Neurotoksyna botulinowa A&nbsp;</td><td>Metabiologics</td><td>NA</td><td>Brak numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Płytki do mikromiareczkowania</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655946</td><td>Poli-D-lizyna 96-dołkowe płytki</td></tr><tr><td>BAC przeciwciało</td><td>Lampire Biological</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microchem</td><td>National&nbsp;</td><td>0255</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A412-20</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>PE JANUS MDT Mini Automatyczna Stacja Robocza</td><td>Perkin Elmer</td><td>AJMDT01</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>BIII przeciwciało tubulinowe</td><td>R& D Systems</td><td>BAM1195</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342dye&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Anti Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td></td></tr> Anti <tr><td>rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Spotfire</td><td>Perkin</td><td>Elmer Ver 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz Clorox</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-861-284</td><td></td></tr><tr><td>Stos</td><td></td><td></td><td></td> płyt</tr></tbody></table>

test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Białko związane z synaptosomalami-25 (SNAP-25) jest składnikiem rozpuszczalnego kompleksu receptora białka przyłączającego NSF (SNARE), który jest niezbędny do uwalniania neuroprzekaźników synaptycznych. Serotyp A neurotoksyny botulinowej (BoNT/A) jest metaloproteazą, która blokuje egzocytozę neuroprzekaźnika poprzez rozszczepienie składnika SNAP-25 kompleksu SNARE. Obecnie nie ma zarejestrowanych leków stosowanych w leczeniu zatrucia BoNT/A po internalizacji toksyny przez neurony ruchowe. Opracowanie skutecznych środków terapeutycznych w celu przeciwdziałania zatruciu BoNT/A było ograniczone, częściowo ze względu na brak solidnych, wysokoprzepustowych testów do badań przesiewowych bibliotek małych cząsteczek. W tym miejscu opisujemy test obrazowania o wysokiej zawartości (HCI) z przydatnością do identyfikacji inhibitorów BoNT / A. Początkowe działania optymalizacyjne koncentrowały się na poprawie odtwarzalności wyników między płytkami w wielu, niezależnych eksperymentach. Stwierdzono, że automatyzacja barwienia immunologicznego, akwizycji obrazów i analizy obrazów zwiększa spójność testów i minimalizuje zmienność, umożliwiając jednocześnie wieloparametrową ocenę związków eksperymentalnych w systemie mysich neuronów ruchowych.

Dane z kontroli wysokiej i niskiej utworzyły dwie odrębne populacje, w których różnica między medianami przekraczała 3 odchylenia standardowe (Rysunek 7A). Celem procesu przesiewowego jest znalezienie w populacji próbek związków o wartościach bliższych populacji kontrolnej pozytywnej, przy założeniu rozkładu normalnego w populacji próbek (Rysunek 7B, (i)). Punkty danych oddalone o 3 odchylenia standardowe od średniej uznaje się za statystycznie różne od szumu i klasyfikuje jako aktywny „...

Neurotoksyna botulinowa jest jedną z najsilniejszych toksyn wśród czynników zagrożenia biologicznego kategorii A, jednak terapia poekspozycyjna nie jest dostępna. Metoda obrazowania o wysokiej zawartości jest potężną metodologią identyfikacji nowych inhibitorów, ponieważ umożliwia wieloparametrowe badania przesiewowe z wykorzystaniem biologicznie istotnych neuronów ruchowych, które są głównym celem tej toksyny.

Test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie fenotypowego testu przesiewowego, w którym IES botulina pośredniczy w rozszczepieniu substratu SNAP 25 w celu identyfikacji małych cząsteczek, które hamują funkcję toksyny podczas normalnej sygnalizacji nerwowej. Potencjał czynnościowy powoduje, że SNAP 25 wiąże pęcherzyk synaptyczny z błoną plazmatyczną zakończenia neuronu ruchowego, co powoduje uwolnienie neuroprzekaźnika. Jednak gdy neurotoksyna botulinowa jest obecna, jest wychwytywana przez endocytozę i uwalniana w butonie synaptycznym, gdzie rozszczepia SNAP 25, a tym samym zakłóca uwalnianie neuroprzekaźnika, powodując paraliż.Test ten identyfikuje cząsteczki, które mogą hamować aktywność toksyny botulinowej, a tym samym zapobiegać rozszczepieniu SNAP 25 w obecności toksyny botulinowej, a tym samym przywracać uwalnianie neuroprzekaźników w złączu nerwowo-mięśniowym. Test obrazowania o wysokiej zawartości przeprowadzony na mysich neuronach ruchowych służy do wykazania zachowania SNAP 25, co skutkuje identyfikacją małych cząsteczek, które mogą hamować aktywność proteazy metalowej neurotoksyny botulinowej. Główną zaletą tej technologii lub istniejących metod, takich jak bez

a-high-content-imaging-assay-for-identification-botulinum-neurotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A (BoNT/A LC) to metaloproteaza, która dostaje się do neuronów ruchowych, rozszczepia ich substrat SNAP-25 i zakłóca neurotransmisję, powodując tym samym porażenie wiotkie. Wykorzystując wysokoprzepustowy test oparty na FRET, duże biblioteki małych cząsteczek mogą być badane pod kątem ich wpływu na aktywność enzymatyczną BoNT/A LC.

Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

Testy wykrywania neurotoksyny botulinowej (BoNT) BoTest Matrix szybko oczyszczają i kwantyfikują BoNT z różnych matryc próbek. Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego BoNT zarówno z matryc stałych, jak i ciekłych oraz demonstrujemy test z BOTOXEM, pomidorami i mlekiem.

Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje prostą metodę mikromacierzy białkowej do profilowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej na 7-pleksowy panel wysoce oczyszczonych antygenów Clostridium difficile w surowicach ludzkich. Protokół może zostać rozszerzony w celu określenia swoistych odpowiedzi przeciwciał w preparatach poliklonalnej immunoglobuliny dożylnej.

Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Opisujemy użycie chromatografii cienkowarstwowej, bezpośredniego testu bioautografii i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas do identyfikacji naturalnych produktów mikrobiologicznych, które wykazują antagonizm wobec patogenów grzybowych, używając patogenu Sclerotinia sclerotiorum i biopestycydowych izolatów Bacillus jako systemu modelowego.

Identyfikacja produktów naturalnych pod kontrolą biologiczną za pomocą chromatografii cienkowarstwowej - bioautografia bezpośrednia

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

W niniejszym artykule opisano techniki wykonywania funkcjonalnego obrazowania rezonansu magnetycznego o wysokiej rozdzielczości z próbkowaniem 1,2 mm w obrębie ludzkiego śródmózwia i struktur podkorowych przy użyciu skanera 3T. Jako przykład przedstawiono zastosowanie tych technik do opracowania map topograficznych stymulacji wzrokowej w ludzkim wzgórzu górnym (SC).

Metody funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym o wysokiej rozdzielczości dla ludzkiego śródmózgowia

Badania funkcjonalne układu słuchowego u ssaków były tradycyjnie prowadzone przy użyciu technik skoncentrowanych na przestrzeni, takich jak zapisy elektrofizjologiczne.  Poniższy protokół opisuje metodę wizualizacji wielkoskalowych wzorców wywołanej aktywności hemodynamicznej w korze słuchowej kota za pomocą funkcjonalnego rezonansu magnetycznego.

Funkcjonalne obrazowanie kory słuchowej u dorosłych kotów przy użyciu fMRI o wysokim polu

Poznaj test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej w neuronach motorycznych myszy. Ta metoda umożliwia przesiewowe wykrywanie małych cząsteczek blokujących aktywność toksyny.

Test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej

Przeglądaj więcej filmów