Test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie fenotypowego testu przesiewowego, w którym IES botulina pośredniczy w rozszczepieniu substratu SNAP 25 w celu identyfikacji małych cząsteczek, które hamują funkcję toksyny podczas normalnej sygnalizacji nerwowej. Potencjał czynnościowy powoduje, że SNAP 25 wiąże pęcherzyk synaptyczny z błoną plazmatyczną zakończenia neuronu ruchowego, co powoduje uwolnienie neuroprzekaźnika. Jednak gdy neurotoksyna botulinowa jest obecna, jest wychwytywana przez endocytozę i uwalniana w butonie synaptycznym, gdzie rozszczepia SNAP 25, a tym samym zakłóca uwalnianie neuroprzekaźnika, powodując paraliż.

Test ten identyfikuje cząsteczki, które mogą hamować aktywność toksyny botulinowej, a tym samym zapobiegać rozszczepieniu SNAP 25 w obecności toksyny botulinowej, a tym samym przywracać uwalnianie neuroprzekaźników w złączu nerwowo-mięśniowym. Test obrazowania o wysokiej zawartości przeprowadzony na mysich neuronach ruchowych służy do wykazania zachowania SNAP 25, co skutkuje identyfikacją małych cząsteczek, które mogą hamować aktywność proteazy metalowej neurotoksyny botulinowej. Główną zaletą tej technologii lub istniejących metod, takich jak bezkomórkowy test biochemiczny, jest to, że wiele fenotypowych punktów końcowych może być wychwytywanych jednocześnie z jednej studzienki zawierającej neurony ruchowe poddane działaniu związków przesiewowych i toksyny.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania napotykane podczas badań przesiewowych w bibliotekach, takie jak kwantyfikacja aktywności komórkowej i cytotoksyczność. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zatrucia botuliną, ponieważ może ona zidentyfikować inhibitory, które działają albo bezpośrednio, blokując aktywność proteazy metalu, albo pośrednio, zapobiegając przetwarzaniu toksyn lub ewentualnie innym mechanizmom. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ optymalizacja warunków barwienia immunologicznego niezbędnych do wykrycia SNAP 25 może być wyzwaniem.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap barwienia immunologicznego jest trudny do udoskonalenia, ponieważ silnik wokół siebie jest dość delikatny. Etapy odstawiania i mycia są kluczem do uzyskania wysokiej jakości obrazów wymaganych do dalszej analizy. Wszystkie badania, w których wykorzystuje się żywe komórki i aktywną toksynę, są przeprowadzane w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego, należy odkazić obszary robocze zarówno przed, jak i po tych eksperymentach za pomocą 5% detergentu dezynfekującego środka czyszczącego, takiego jak roztwór mikrochemiczny

Po różnicowaniu embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy użyć 12-kanałowej pipety ręcznej, aby zastąpić stare podłoże. Na 96 dołkach z 80 mikrolitrami świeżej końcowej pożywki różnicującej przeprowadzaj etapy aspiracji i dozowania rząd po rzędzie, aby zminimalizować narażenie komórek na otaczające powietrze. Następnie, za pomocą 12-kanałowej pipety, dodać 10 mikrolitrów 10 x badanych związków z płytki źródłowej, a następnie dwukrotnie zassać, aby wymieszać x.

Potraktuj dwie kolumny po sześć studzienek 10 X-D-M-S-O rozcieńczonymi w mediach, aby służyły jako regulatory wysokiego i niskiego sygnału. Inkubuj komórki ze związkami przez 30 minut w temperaturze siedmiu stopni Celsjusza i 6% dwutlenku węgla. Następnie rozcieńczyć neurotoksynę botulinową A w PBS za pomocą końcowych pożywek różnicujących, aby uzyskać końcowy 10 X zapas roboczy za pomocą pipety wielokanałowej, dodać 10 mikrolitrów 10 x neurotoksyny botulinowej do studzienek przeznaczonych do leczenia, a także do studzienek kontrolnych o niskim sygnale.

Studzienki oznaczone jako wysoka kontrola należy traktować samymi mediami, odkazić całe zużycie tworzyw sztucznych i inne materiały jednorazowego użytku, które mają kontakt z neurotoksyną botulinową. A przez zanurzenie w 0,825% roztworze podchlorynu w wodzie na co najmniej 20 minut. Oznacz płytki wyraźnie, aby wskazać użycie toksyny i inkubuj płytki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 6% dwutlenku węgla po inkubacji.

Użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć pożywkę zawierającą toksynę i związki z każdej studzienki i wyrzuć ją do 10% roztworu wybielacza. Następnie dodaj 100 mikrolitrów lodowatego metanolu bezpośrednio do każdej studzienki, aby zatrzymać neurotoksynę botulinową. Rozszczepienie proteolityczne.

Następnie inkubuj płytki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utrwalenie. Po utrwaleniu należy obchodzić się z wyrzuconymi zneutralizowanymi odczynnikami zgodnie z protokołami pierwszego poziomu bezpieczeństwa biologicznego i odpowiednio wyrzucić. Po wyrzuceniu metanolu umyj komórki trzykrotnie 100 mikrolitrami PBS, aby je nawodnić przed barwieniem immunologicznym.

Barwienie immunologiczne wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej jest wykonywane przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej ustawionej tak, aby umożliwić dostęp do odczynnika w razie potrzeby i bez interwencji człowieka. Załaduj płytki zawierające stałe komórki do magazynu PLATE i przenieś je do pokładu w razie potrzeby do operacji obsługi cieczy. Za pomocą głowicy pipetowej 96 wyposażonej w końcówki o pojemności 250 mikrolitrów, stacja robocza zasysa PBS ze studzienek do 10 mikrolitrów.

Stacja robocza dozuje 100 mikrolitrów buforu blokującego zawierającego 1% surowicy końskiej i 0,1% tween 20 w PBS do wszystkich mikropłytek. Następnie należy umieścić płytki z powrotem w magazynie płytek na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć bufor blokujący i dozować 50 mikrolitrów po cztery mikrogramy na mililitr przeciwciała BS i 0,5 mikrograma na mililitr tubuliny beta trzy w buforze blokującym do wszystkich płytek.

Inkubować płytki przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć trzykrotnie 100 mikrolitrami PBST. Przygotować dwa mikrogramy na mililitr, rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych znakowanych różnymi czwórkami fluorowymi, jak opisano w protokole tekstowym. Dozować 50 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej Po inkubacji odessać przeciwciała drugorzędowe i przemyć trzykrotnie 100 mikrolitrami PBST.

Następnie w 100 mikrolitrach PBS zawierających 32 mikromolowe haczyki barwnik barwi DNA w celu wykrycia jąder. Na koniec uszczelnij płytki nieprzepuszczalną dla światła folią, aby chronić czwórki fluorowe przed fotowybielaniem. Płytki mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tygodnie bez znaczącej utraty sygnału.

W systemie akwizycji obrazu określ typ płyty jako szlifierka u. Wyczyść układ jako 96. Dobrze sformatuj liczbę pól jako 16, a cel jako 20 x woda.

Następnie wybierz kanały do wzbudzenia jądra o długości 405 nanometrów. Wybierz kanał czwarty do wzbudzenia cytoplazmy o długości 640 nanometrów. Wybierz kanał drugi dla wzbudzenia kanału przeciwciała specyficznego dla antygenu 561 nanometrów wybierz kanał trzeci.

Następnie ustaw moc wzbudzenia każdego lasera. Eksperyment będzie miał dwie ekspozycje, ustawioną ekspozycję, jeden do jednego wzbudzenia na 640 nanometrach i ustawioną ekspozycję od dwóch do dwóch wzbudzeń na 405 nanometrach i 561 nanometrach. Wybierz Benning jako pojemnik drugi.

Użyj wysokich dołków kontrolnych do optymalizacji ekspozycji z maksymalną intensywnością jako kanału SNAP 25 i użyj niskich dołków kontrolnych, aby uzyskać minimalną intensywność. Dostosuj ekspozycję tak, aby intensywność każdego kanału wynosiła około połowy poziomu nasycenia lub około 2000 do 2 500 jednostek względnych. Następnie zidentyfikuj optymalną płaszczyznę Z w kanale maski komórki za pomocą skryptu korekcji różnicowej.

W oprogramowaniu do analizy obrazu wybierz algorytm neurytów, aby podzielić neuryty na segmenty. Zidentyfikuj regiony neurytów na podstawie obiektów drugorzędnych, neurytów, używając rozszerzenia kanału beta trzech tubuliny na minus trzy piksele jako maskę. Oblicz intensywność kanałów sygnałowych dla regionu neurytów i kanału tubuliny beta trzy.

Wybierz żądane parametry do eksportu, takie jak długość neurytu, średnie intensywności SNAP 25 beta three, liczba jąder tubuliny i liczba segmentów neurytów. Po zakończeniu konfiguracji. Przenieś płyty z układarki płyt za pomocą robota, załaduj je do imagera o wysokiej zawartości i rozpocznij akwizycję obrazu.

Pokazano tutaj analizę wykresu pudełkowego procentowego rozszczepienia obliczonego na podstawie studzienek kontrolnych. Różowy reprezentuje kontrolę wysokiego sygnału, czyli studnie z samymi mediami i bez toksyn. W tych studniach obserwuje się bardzo małe rozszczepienie.

Kolor niebieski reprezentuje kontrolę niskiego sygnału, czyli studzienki zawierające tylko toksynę i brak związku próbki. Studnie te zarejestrowały znaczne rozszczepienie. Te rozkłady histogramów wartości kontrolnych pokazują odległość między dwiema populacjami kontrolnymi.

Celem procesu badań przesiewowych jest znalezienie związków w populacji próbki o wartościach bliższych populacji kontroli dodatniej. Rozkład 192 próbek poddanych działaniu związków, które zawierały również neurotoksynę botulinową A, pokazano tutaj na zielono. Większość z tych studni wykazywała znaczne rozszczepienie.

Było jednak kilka statystycznie istotnych wartości odstających, które nie wykazały znaczącego rozszczepienia w porównaniu z grupą kontrolną. Wartości kontrolne są ponownie pokazane przez różowe i niebieskie paski w tym rozkładzie histogramu. Zielone słupki pokazywały nakładanie się wartości próbki z wartościami kontrolnymi.

Wartości próby uznane za trafienia zostały wybrane spośród wartości odstających, których procentowe wartości rozszczepienia są niższe niż trzy odchylenia standardowe od mediany populacji próby. Te cztery trafienia mają podobne wartości do kontroli wysokiego sygnału i reprezentują ten sam związek, który jest znaną neurotoksyną botulinową, inhibitorem synanonu, który blokuje rozszczepienie SNAP 25. Inhibitor ten wykazał silną ochronę SNAP 25 przed neurotoksyną botulinową A, ponieważ studzienki zarówno z toksyną, jak i tym inhibitorem zachowywały się podobnie do studzienek bez toksyny i niepodobnie do studzienek z toksyną, ale bez inhibitora Po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w ciągu czterech do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uwzględnieniu wielu kontroli w celu obliczenia wydajności statystycznej eseju i umożliwienia decyzji o negatywnym wyniku dla każdej indywidualnej płytki przesiewowej Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak biochemiczne testy proteolityczne, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ocena trafień przesiewowych jako bezpośrednich lub pośrednich inhibitorów Bot.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak zautomatyzować fenotypowy test przesiewowy, który wykorzystuje kwantyfikację SNAP 25 za pomocą barwienia immunologicznego jako pierwszorzędowy punkt końcowy. Nie zapominaj, że praca z neurotoksynami botulinowymi może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej i wdrażanie odpowiednich procedur odkażania i usuwania botiny, może wymagać środków ostrożności. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przyjmować neurotoksynę.