Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita u myszy Apc Min/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia obserwację interakji komórek z guzami w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Ying Yu za genotypowanie myszy ApcMin/+. Badanie to było wspierane przez fundusze INSERM oraz granty (CA057621 i AI053194) z National Institutes of Health.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), UCSF. Wszystkie eksperymenty obrazowe były procedurami niemającymi na celu przeżycia, a zwierzęta zostały poddane eutanazji natychmiast po zakończeniu akwizycji obrazu.
1. Generacja myszy
UWAGA: Myszy ApcMin/+, posiadające mutację genu Apc, spontanicznie rozwijają 50-100 gruczolaków w jelicie cienkim.
<ol>
	<li>Skrzyżowanie myszy ApcMin / + z linią ACTB-ECFP, która wyraża ECFP pod promotorem aktyny, a następnie z linią c-fms-EGFP, która wyraża EGFP pod promotorem c-fms w celu wykrycia komórek szpikowych. Do wykrywania fluorescencji wykorzystuje się zwierzęta heterozygotyczne dla ACTB-ECFP i c-fms-EGFP.</li>
	<li>Użyj myszy w wieku 3-4 miesięcy, aby zobrazować wyraźnie wykrywalne gruczolaki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiałów przed operacją
UWAGA: Szczegóły konfiguracji mikroskopu zostały wcześniej opisane6,7.
<ol>
	<li>mikroskop
	<ol>
		<li>Włącz koc grzewczy. Włącz laser argonowy dla wzbudzenia 488 nm i lasery na ciele stałym 405 nm, 561 nm i 640 nm. Włącz mikroskop, jednostkę sterującą z obracającym się dyskiem, AOTF, jednostkę sterującą lasera i kontroler kamery.</li>
		<li>Otwórz migawkę mikroskopu, która zmieni kolor diody LED na czerwony. Włącz oprogramowanie komputera i aparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Platforma obrazowania
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wkładka sceniczna jest czysta. W przeciwnym razie wyczyść wodą z mydłem, a następnie wysusz.</li>
		<li>Weź dwa szkiełka nakrywkowe i użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować je do wkładki. Umieść wkładkę na stoliku i wyczyść ją chusteczkami nasączonymi alkoholem.</li>
		<li>Za pomocą taśmy laboratoryjnej przymocuj koc grzewczy po prawej stronie sceny.</li>
		<li>Sprawdź integralność gumowej membrany na stożku nosowym i wymień ją w razie potrzeby. Ustaw i zamocuj stożek nosowy do podania znieczulenia izofluranem zwierzęciu za pomocą gazy i taśmy laboratoryjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>System znieczulenia izofluranem
	<ol>
		<li>Uzupełnij zbiornik izofluranu.</li>
		<li>Włącz podciśnienie i ustaw na 1,2 l/min.</li>
		<li>Dodać wodę destylowaną do nebulizatora i podłączyć nebulizator do systemu izofluranu.</li>
		<li>Włącz analizator tlenu i podłącz go do układu izofluranu. Włącz zbiornik tlenu i upewnij się, że analizator tlenu pokazuje 100%. Wyreguluj przepływO2 na 0,2 l/min.</li>
		<li>Włącz zbiornik azotu i wyreguluj przepływ na 0,8 l/min. Upewnij się, że analizator tlenu pokazuje 21%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie narzędzi i platformy do zabiegów chirurgicznych
	<ol>
		<li>Wyczyść 2 pary kleszczy preparacyjnych i nożyczek wodą z mydłem.</li>
		<li>Włącz gorący sterylizator kulek i pozwól mu osiągnąć 250 °C. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne przez 30 sekund. Pozwól im ostygnąć.</li>
		<li>Umieść nasącz laboratoryjny na stole operacyjnym.</li>
		<li>Użyj styropianowej pokrywy jako platformy chirurgicznej. Przykryj kawałkiem nasączania laboratoryjnego. Przygotuj drugi kawałek nasączkacza laboratoryjnego do wymiany po ogoleniu myszy.</li>
		<li>Umieść stożek nosowy z linią znieczulenia na zakrytej styropianowej pokrywie i przymocuj go do styropianowej pokrywki (nie do nasączania laboratoryjnego) za pomocą taśmy i użyj dwóch igieł po obu stronach stożka nosowego, aby utrzymać go na miejscu.</li>
		<li>Zbierz betadynę, chusteczki nasączone alkoholem, sterylną gazę, super klej, szkiełka mikroskopowe, golarkę elektryczną i 4 kawałki taśmy laboratoryjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie zastrzyków
<ol>
	<li>Pod maską przygotuj strzykawkę insulinową (28 G x 1/2 cala) z 7 μl podstawowego przeciwciała Ly-6G (Gr1) sprzężonego z AF647 (1 mg / ml) w 100 μl 2,000 kDa rodaminy-dekstranu (4 mg / ml) do wstrzyknięcia zadoczodołowego. Wstrzyknięcie zaoczodołowe jest zalecane u myszy ApcMin/+, ponieważ niedokrwistość, która rozwija się u tych zwierząt, utrudnia wykrycie żył ogonowych przez skórę.</li>
	<li>Przygotować drugą strzykawkę insulinową z 1 mg/kg atropiny rozcieńczoną w 150 μl PBS do wstrzyknięcia podskórnego (s.c.) przed obrazowaniem w celu stłumienia ruchów perystaltycznych jelita.</li>
</ol>
4. Przygotowanie jelita do obrazowania
<ol>
	<li>Sprawdź, czy przewód anestezjologiczny do komory indukcyjnej jest otwarty, a przewody do stołu operacyjnego i mikroskopu są zamknięte.</li>
	<li>Przenieś zwierzę do komory anestezjologicznej. Zamknąć komorę anestezjologiczną i włączyć izofluran do 4% (z 21%O2).</li>
	<li>Gdy mysz oddycha głęboko i powoli (po 5-6 minutach), przenieś ją do etapu chirurgicznego na boku i wstrzyknij roztwór przeciwciała Gr1 i/lub roztwór dekstranu za orbitą.</li>
	<li>Otwórz linię anestezjologiczną połączoną z platformą chirurgiczną. Zamknij linię do komory anestezjologicznej i połóż mysz na plecach z nosem w stożku anestezjologicznym.</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu z 4% do 2,5%.</li>
	<li>Sprawdź, czy mysz jest dobrze znieczulona, ściskając jej opuszkę stopy i testując odruch rogówkowy.</li>
	<li>Dodaj okulistyczną maść nawilżającą na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Przymocuj kończyny myszy do etapu chirurgicznego, dodając taśmę laboratoryjną.</li>
	<li>Usuń włosy z powierzchni brzusznej za pomocą golarki elektrycznej. Usuń również włosy z lewej tylnej kończyny, aby ustawić pulsoksymetr przed akwizycją. Usuń nasącz laboratoryjny ze sceny chirurgicznej i zastąp go czystym, aby uniknąć zanieczyszczenia włosów.</li>
	<li>Zdezynfekuj powierzchnię brzuszną chusteczkami nasączonymi alkoholem i betadyną.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór atropiny (z 3.2) s.c. w jedną flankę myszy.</li>
	<li>Wykonaj 1 cm brzuszne nacięcie linii środkowej przez skórę i otrzewną za pomocą nożyczek i jednej pary kleszczy. Ostrożnie wyciągnij 3-4 cm jelita i zidentyfikuj jeden lub kilka guzów do zobrazowania.</li>
	<li>Weź szklane szkiełko mikroskopowe i umieść na nim pętlę jelita z guzem u góry.</li>
	<li>Dodaj trochę super kleju w kilku miejscach wzdłuż jelita, aby przymocować go do szkiełka. Poczekaj minutę, aż klej wyschnie. Za pomocą markera narysuj na szkiełku linię wskazującą guz, aby ułatwić jego lokalizację za pomocą konfokalu.</li>
</ol>
5. Umiejscowienie myszy na stole montażowym i przygotowanie do akwizycji obrazu
<ol>
	<li>Usuń taśmę laboratoryjną z kończyn.</li>
	<li>Otwórz linię anestezjologiczną do stolika mikroskopowego i zamknij linię do platformy operacyjnej.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś mysz na stolik mikroskopu brzuszną stroną do dołu i nosem w stożku nosowym. Zabezpiecz linię anestezjologiczną taśmą laboratoryjną.</li>
	<li>Zmień położenie myszy i/lub szkiełka tak, aby jelito znalazło się pośrodku jednego z okienek z pokrywą. Delikatnie przyklej szkiełko taśmą laboratoryjną.</li>
	<li>Przymocuj sondę pulsoksymetru do lewej kończyny myszy, aby śledzić jej tętno i częstość oddechów oraz poziom nasycenia tlenem w tętnicach.</li>
	<li>Przykryj mysz kocem grzewczym, aby uniknąć hipotermii.</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu z 2,5% do 1-1,5% do obrazowania.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazów za pomocą oprogramowania μManager
<ol>
	<li>Zwiększ prędkość CSUX do 2,500 obr./min, aby poprawić jakość obrazu w ustawieniach konfiguracyjnych.</li>
	<li>Użyj menu rozwijanego Obiektyw, aby wybrać obiektyw Fluar 10X 0.5 NA lub 20X 0.75 NA Fluar.</li>
	<li>Wybierz laser 405 nm z menu rozwijanego Kolor.</li>
	<li>Kliknij na Na żywo i dostosuj ostrość za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Kliknij Auto, aby automatycznie dostosować maksymalną i minimalną intensywność pikseli wyświetlanego obrazu na podstawie ekstremalnych wartości pikseli na obrazie. Histogram intensywności pikseli wyświetlanego obrazu jest przedstawiony na wykresie w dolnej części okna głównego.</li>
	<li>Dostosuj ekspozycję kamery w oknie Panelu sterowania Piper, zmieniając liczbę zegarów (jeden zegar to 33,333 ms).</li>
	<li>Jeśli sygnał jest zbyt jasny przy najniższej ekspozycji, zmniejsz intensywność lasera za pomocą jednostki sterującej mikroskopu.</li>
	<li>Sprawdź natężenie sygnału dla linii laserowych 488 nm, 561 nm i 640 nm. Dostosuj intensywność lasera za pomocą własnej jednostki sterującej lasera (488 nm i 561 nm) lub jednostki sterującej mikroskopu.</li>
	<li>W oknie Multi D Acquisition zaznacz pole Punkty czasowe i wpisz liczbę punktów czasowych oraz żądany przedział czasu.</li>
	<li>Zaznacz pole Z-stacks, wybierz "względne Z" i zdefiniuj Z-start i Z-end względem bieżącej pozycji. 
	UWAGA: W przypadku obiektywów 10X lub 20X zacznij od 3 płaszczyzn Z, oddalonych od siebie odpowiednio o 8 μm lub 4 μm.</li>
	<li>Zaznacz pole Wiele pozycji (XY), aby zobrazować kilka lokalizacji, a następnie kliknij przycisk Edytuj listę pozycji, zaznacz od 4 do 6 różnych pozycji.</li>
	<li>Zaznacz pole Kanały i dodaj kanały z Nowy, a następnie wybierz linie laserów z menu rozwijanego i wpisz ekspozycję dla każdego kanału (w wielokrotności 33,333 ms).</li>
	<li>Zaznacz opcję Zapisz obrazy w oknie "Akwizycja Multi D".</li>
	<li>Wybierz folder, a wszystkie uzyskane obrazy zostaną automatycznie zapisane w tym folderze z podanym prefiksem nazwy. 
	UWAGA: Każda ciągła akwizycja zostanie zapisana w osobnym podfolderze jako osobne pliki TIFF dla każdego wycinka Z w każdym kolorze w każdym punkcie czasowym.</li>
	<li>Zapisz wszystkie ustawienia, klikając przycisk Zapisz ustawienia w oknie Multi D Acquisition.</li>
	<li>Kliknij przycisk Acquire (Pobieranie) w oknie Multi-dimensional Acquisition (Akwizycja wielowymiarowa), aby rozpocząć pobieranie.</li>
	<li>Jeśli sonda pulsoksymetru nie jest używana lub przestaje działać dobrze (gdy puls nie jest stabilny lub trudny do wykrycia), sprawdzaj skuteczność znieczulenia co 15 minut podczas procedury obrazowania, ściskając podnóżek i sprawdzając odruch rogówkowy. Dostosuj znieczulenie, jeśli mysz reaguje na te bodźce.</li>
	<li>Po nabyciu należy poddać mysz eutanazji, zwiększając stężenie izofluranu do 5%. Gdy nie są wykrywalne żadne ruchy oddechowe, zdejmij mysz ze sceny i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
7. Analiza obrazów za pomocą oprogramowania Imaris
<ol>
	<li>Konwersja do plików .ims (Rysunek uzupełniający 1A)
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie aparatu, kliknij Plik, a następnie Konwerter wsadowy.</li>
		<li>Kliknij Dodaj pliki i wybierz pierwszy plik z pierwszej pozycji. Powtórz te czynności dla każdej pozycji.</li>
		<li>Dla każdego przesłanego pliku kliknij Ustawienia i sprawdź, czy ustawienia "t" dla czasu, "c" dla kanałów i "z" dla stosów Z pojawiają się w tej kolejności.</li>
		<li>Zapisz w żądanym folderze. Przeglądaj i utwórz nowy plik w takiej postaci, w jakiej został przekonwertowany.</li>
		<li>Kliknij Ustaw dla wszystkich i Start.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korekty (rysunek uzupełniający 1B)
	<ol>
		<li>Przejdź do określonego folderu Konwertowane i otwórz pierwszy plik.</li>
		<li>W oknie Display Adjustment (Regulacja wyświetlania) dostosuj odcięcie sygnału tła, modyfikując w razie potrzeby wartość minimalną dla każdego kanału.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj intensywność sygnału, modyfikując wartość maksymalną (im niższa wartość maksymalna, tym wyższa intensywność sygnału). 
		UWAGA: Regulacja intensywności sygnału/kontrastu umożliwia podświetlenie zachowania komórki lub przedziału, aby uzyskać ładniejszą wizualizację. Nie zmienia to samego wyniku.</li>
		<li>Kliknij Edytuj i Właściwości obrazu.</li>
		<li>Zmień wartości x, y i z (dla obiektywu 10X, x i y = 0,712, z = 8 μm; dla obiektywu 20X: x i y = 0,36, z = 4 μm).</li>
		<li>Kliknij Wszystkie równoodległe, aby dostosować punkty czasu. Dodaj datę i godzinę rozpoczęcia pozyskiwania. Dodać datę i godzinę zakończenia pobierania (rysunek uzupełniający 1C).</li>
		<li>Kliknij przycisk Odtwórz, aby obejrzeć film.</li>
		<li>Kliknij Edytuj i usuń punkty czasowe, aby usunąć rozmyte obrazy.</li>
		<li>Aby połączyć ze sobą dwa oddzielne nabytki w jeden film, przejdź do ostatniego punktu czasowego pierwszego filmu i kliknij Edytuj > Dodaj punkty czasowe, aby dodać drugi plik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisywanie jako film (Rysunek uzupełniający 1D)
	<ol>
		<li>Kliknij Nagraj, wybierz rozszerzenie .mov i współczynnik kompresji 0.</li>
		<li>Kliknij Zapisz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+myeloid+cells+by+the+tumor+microenvironment%3A+Open+questions+on+the+dynamics+and+plasticity+of+different+tumor-associated+myeloid+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations.</a> Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).</li>
<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+as+organs%3A+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).</li>
<li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).</li>
<li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088(2013).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li>
<li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+intestinal+neoplasia+caused+by+a+mutation+in+the+murine+homolog+of+the+APC+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene.</a> Science. 256 (5057), 668-670 (1992).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mucosal+homeostasis+via+single-+and+multiphoton+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy.</a> J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).</li>
<li>Haigis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation%2C+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li>
<li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+%28Smad4%29+and+Apc+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem dynamiki komórek szpikowych w guzach jelitowych przez kilka godzin u żywego zwierzęcia, obrazowanego od strony surowiczej jelita.
Aby uniknąć stanu zapalnego i uzyskać optymalne warunki fizjologiczne, obrazowanie jelita musi być wykonane na nienaruszonym narządzie. Jednak obrazowanie od strony surowiczej jelita jest trudne, ponieważ światło musi przejść przez różne warstwy tkanki, takie jak mięśnie gła...

Przytłaczające dowody pokazują teraz, że mikrośrodowisko guza, składające się z heterogenicznych populacji komórek, w tym fibroblastów, komórek śródbłonka, komórek immunologicznych i zapalnych, macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników rozpuszczalnych, odgrywa kluczową rolę w inicjacji i progresji guzów litych, przyczyniając się do prawie wszystkich cech charakterystycznych raka1. Rzeczywiście, podczas progresji guza zachodzą ciągłe dynamiczne interakcje między przekształconymi komórkami rakowymi a komórkami zrębu, które ewoluują, aby wytworzyć mikrośrodowisko korzystne dla nowotworuzłośliwego 2. Wśród komórek odpornościowych, które infiltrują mikrośrodowisko guza, najliczniej występują komórki szpikowe3. Składające się z makrofagów związanych z nowotworem (TAM), komórek supresorowych pochodzenia szpikowego (MDSC), komórek dendrytycznych (DC) i neutrofili (PMN), komórki szpikowe są rekrutowane ze szpiku kostnego i stopniowo naciekają guzy, uwalniając cytokiny, czynniki wzrostu i proteazy, które mogą sprzyjać wzrostowi guza i rozprzestrzeniać się4. Wzajemne oddziaływanie między komórkami rakowymi a komórkami szpikowymi jest złożone, ale dynamiczne. W związku z tym zrozumienie natury ich interakcji ma kluczowe znaczenie dla ustalenia, dlaczego komórki te sprzyjają progresji raka, zamiast uczestniczyć w przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej, i mogą pomóc w znalezieniu nowych celów do jej kontrolowania.
Bezpośrednia obserwacja za pomocą mikroskopii przyżyciowej dostarcza informacji na temat dynamiki komórek w tkankach żywych myszy5. Czterokolorowy, wieloobszarowy, mikrosoczewkowy system konfokalny z wirującym dyskiem został zaprojektowany do badania komórek zrębu w guzach sutka6. Takie podejście umożliwia długotrwałe, ciągłe obrazowanie i ma kilka zalet, takich jak (a) szybka akwizycja obrazów w celu zminimalizowania artefaktów ruchu, (b) długoterminowe znieczulenie, (c) akwizycja czterech kolorów w celu śledzenia różnych typów komórek, (d) znakowanie fluorescencyjne różnych składników nowotworowych oraz (e) obserwacja różnych mikrośrodowisk guza u tej samej myszy w celu uniknięcia zmienności między myszami7-9. Dzięki tej technologii odnotowano różne zachowania komórek w modelu onkogenu środkowego T (PyMT) napędzanego promotorem wirusa guza sutka (MMTV), który wykazuje postępujące stadia nowotworzenia. Limfocyty T regulatorowe (Treg, wizualizowane przez transgen Foxp3EGFP) migrują preferencyjnie w pobliżu naczyń krwionośnych, podczas gdy DC (CD11c-DTR-EGFP), fibroblasty związane z rakiem (Fsp1+/+-EGFP) i komórki szpikowe (c-fms-EGFP) wykazują większą ruchliwość na obrzeżach guza niż w masie guza. W stanie ostrego niedotlenienia ogólnoustrojowego komórki migrowały inaczej: limfocyty Treg przestają migrować w przeciwieństwie do komórek szpikowych, które nadal się poruszają6. Ponadto w tym samym modelu mysim wykazano, że wrażliwość na doksorubicynę zmienia się wraz ze stadium nowotworu, dystrybucja leku jest związana z odpowiedzią na lek, a leczenie doksorubicyną prowadzi do zależnej od CCR2 rekrutacji komórek szpikowych do guzów. W związku z tym obrazowanie na żywo może być również wykorzystane do uzyskania wglądu w reakcje leków in situ i biologię chemiooporności10,11.
Mutacje genu gruczolakowatej polipowatości coli (Apc) często występują w ludzkich gruczolakach i rakach jelita grubego12, a mutacja pojedynczej kopii genu Apc powoduje rodzinną polipowatość gruczolakowatą (FAP), która wiąże się z bardzo wysokim ryzykiem raka jelita grubego13. Mysi szczep ApcMin/+ jest nosicielem mutacji skróconej w kodonie 850 genu Apc i spontanicznie rozwija mnogie gruczolaki jelitowe w całym jelicie cienkim14-16. Długoterminowe obrazowanie przyżyciowe jelita jest trudne ze względu na inwazyjność zabiegu, ponieważ do dostępu do jelita konieczne jest otwarcie jamy otrzewnej. Krótkoterminowe badania obrazowe na żywo zostały wcześniej opublikowane na zdrowym jelicie17,18, ale nie zgłoszono długoterminowej bezpośredniej obserwacji guzów jelitowych. Zaprojektowano i udoskonalono procedurę chirurgiczną w celu wizualizacji guzów przez surowiczą powierzchnię jelita, przy użyciu systemu mikroskopii krążkowej przyżyciowej, używanej wcześniej do obrazowania guzów piersi6,10. W tym artykule opisano protokół, który pozwala śledzić zachowanie komórek szpikowych w guzach jelita cienkiego za pomocą myszy ApcMin/+.

<table><tbody><tr><td>ApcMin/+ myszy</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>myszy cfms-EGFP</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa Dekstran, sprzężony z rodaminą</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Butler Zaopatrzenie zdrowotne zwierząt</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Azot</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tlen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF zakład</td><td></td><td></td>hodowli</tr><tr><td>komórkowych Bufor soli</td><td>fizjologicznej UCSF zakład</td><td></td><td></td>hodowli komórkowej</tr><tr><td>UCSF AF647</td><td>UCSF Rdzeń</td><td></td> przeciwciała monoklonalnego <td>Stock 1 mg / ml. Stosować przy 7 &mu; g/mysz</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Stosować w dawce 1 mg/kg myszy</td></tr><tr><td>Chusteczki nasączone alkoholem</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 cala strzykawka insulinowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium Szkło osłonowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koc grzewczy</td><td>Gaymar Branże</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek</td><td>Narzędzia do nauki o naczyniu</td><td>18000-45</td><td>Włącz 30 minut przed użyciem</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką 6-calowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Wkładka stolikowa Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz Ox pulsoksymetr, oprogramowanie i czujniki</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizer</td><td>Summit Anestezjologiczne wsparcie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mu; </td><td>Kierownik Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Oprogramowanie open source</td></tr><tr><td>Kamera ICCD</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Wirujący dysk konfokalna głowica sakowa</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita apcmin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Komórki mieloidalne są najliczniejszymi komórkami odpornościowymi w nowotworach i wykazano, że sprzyjają progresji nowotworu. Nowoczesne techniki obrazowania przyżyciowego umożliwiają obserwację żywego zachowania komórek wewnątrz narządu, ale mogą być trudne w niektórych typach raka ze względu na dostępność narządów i guzów, takich jak jelito. Bezpośrednia obserwacja nowotworów jelit nie była wcześniej zgłaszana. Opisana tutaj procedura chirurgiczna umożliwia bezpośrednią obserwację dynamiki komórek szpikowych w guzach jelitowych u żywych myszy przy użyciu transgenicznych fluorescencyjnych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników lub przeciwciał. W tym celu wykorzystano czterokolorowy, wieloobszarowy, mikrosoczewkowy mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem, który umożliwia długotrwałe ciągłe obrazowanie z szybką akwizycją obrazu. Myszy ApcMin / +, u których rozwijają się mnogie gruczolaki w jelicie cienkim, krzyżuje się z myszami c-fms-EGFP w celu wizualizacji komórek szpikowych oraz z myszami ACTB-ECFP w celu wizualizacji komórek nabłonka jelitowego krypt. Opisano również procedury znakowania różnych składników guza, takich jak naczynia krwionośne i neutrofile, oraz procedurę pozycjonowania guza do obrazowania przez powierzchnię surowiczości. Filmy poklatkowe skompilowane z kilku godzin obrazowania pozwalają na analizę zachowania komórek szpikowych in situ w mikrośrodowisku jelitowym.

Dzięki zastosowaniu konfokalnej mikroskopii dyskowej (spinning disk) możliwe jest obrazowanie tkanek nietumorowych i tumorowych w jelicie cienkim myszy ApcMin/+;ACTB-ECFP;c-fms-ECFP od strony powierzchni surowiczej. Po wykonaniu obrazowania wykorzystuje się oprogramowanie kamery do analizy i dostosowania parametrów akwizycji (Rycina uzupełniająca 1). Po dożylnym (i.v.) wstrzyknięciu fluorescencyjnego dekstranu-rodaminy 2 000 kDa oraz przeciwciała sprzężonego...

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja dynamiki komórek szpikowych w guzach jelitowych żywego zwierzęcia. Osiąga się to poprzez pierwsze wstrzyknięcie cząsteczek fluorescencyjnych i atropiny myszom PC min. W drugim etapie jelito jest przygotowywane do obrazowania, a mysz jest umieszczana na stoliku mikroskopowym.W ostatnim etapie uzyskuje się obrazy guza w żywym zwierzęciu, ostatecznie obracając się konfokalem dysku. Mikroskopia może być wykorzystana do wizualizacji zachowania komórek szpikowych w guzach żywych myszy PC min przez kilka godzin. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak: jaka jest rola komórek ludzkich w raku jelita grubego?Zacznij od użycia taśmy laboratoryjnej, aby przymocować dwa szkiełka nakrywkowe do wkładki stolika platformy do obrazowania mikroskopu. Następnie umieść wkładkę na stoliku i wyczyść ją chusteczkami nasączonymi alkoholem. Następnie przekręć sterylizator gorących kulek na 250 stopni Celsjusza, a następnie sterylizuj narzędzia chirurgiczne przez 30 sekund, podczas gdy narzędzia stygną.Umieść tę styropianową pokrywkę między dwoma namaczami laboratoryjnymi na stole operacyjnym. Następnie, gdy mysz oddycha

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Przedstawiamy protokół chirurgicznego wszczepienia stabilizowanego okna optycznego do obrazowania w subkomórkowej rozdzielczości mysiej trzustki, umożliwiając seryjne i podłużne badania zdrowej i chorej trzustki.

Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj metodę obrazowania dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita u myszy Apc Min/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia obserwację interakji komórek z guzami w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita Apc^Min/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Przeglądaj więcej filmów