Name: Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sygnałów wapniowych w komórkach i całych roślinach Arabidopsis thaliana przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺. Technika ta umożliwia wizualizację odpowiedzi na stres abiotyczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni B. Stevensonowi za pomoc techniczną i Dr Marc R. Knight za dostarczenie transgenicznej linii Aequorin. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health Grant R01 GM059138.

1. Obrazowanie Ca2+ na bazie Aequorin przy użyciu systemu FAS
<ol>
	<li>Przygotuj sadzonki do obrazowania luminescencyjnego. Nasiona roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję Aequorin sterylizować 10% roztworem wybielacza zawierającym 0,01% Triton-100. Sterylne nasiona wysiewać na kwadratowym talerzu (kwadratowa szalka Petriego o wymiarach 10 x 10 cm z siatką) zawierającym pełną moc MS (mieszanina soli bazalnej Murashige i Skoog), 1% sacharozy i 1,2% agaru. Umieścić płytki pionowo w komorze wzrostowej po rozwarstwieniu w temperaturze 4 °C na 2 dni (ryc. 1A).</li>
	<li>Przenieś sadzonki na folię. Umieść folię samoprzylepną (Rysunek 1B) na wierzchu 7-10-dniowych sadzonek rosnących na talerzu. Delikatnie popchnij folię ręcznie, aby upewnić się, że sadzonki przylegają do folii (Rysunek 1C). Delikatnie obierz folię, aby sadzonki pozostały przyklejone do folii (Rysunek 1D i 1E)</li>
	<li>Inkubuj sadzonki z kofaktorem. Umieść przyklejone sadzonki na kwadratowej płytce (10 x 10 cm) zawierającej 15 ml 2 μg/ml h-CTZ (coelenterazine) w wodzie. Inkubuj sadzonki w temperaturze pokojowej przez 4 godziny do nocy (ryc. 1F).</li>
	<li>Przygotuj się do obrazowania luminescencyjnego. Wyjmij folię z roztworu h-CTZ i przetnij ją na środek, tworząc dwa kawałki. Umieść każdy kawałek folii z sadzonkami zadrukowaną do góry na dwóch różnych talerzach. Pozostaw talerze w ciemności na 5 minut.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów luminescencyjnych. W ciemności umieść dwie płytki obok siebie na stoliku systemu obrazowania luminescencyjnego (rysunek 1G). Obrazy należy uzyskać natychmiast po jednoczesnym dodaniu 20 ml roztworu bodźców do płytek.</li>
	<li>Analizuj obrazy luminescencyjne. Wybierz ten sam zakres wyświetlania dla wszystkich obrazów luminescencyjnych. Przytnij obszar zainteresowania (ROI) i wygeneruj obrazy jako pliki JPEG (Rysunek 2A). Alternatywnie można wyeksportować obrazy jako pliki w formacie SPE i zaimportować je do oprogramowania do analizy obrazów ImageJ. Ustaw pomiary w celu obliczenia średniej wartości szarości ROI. Wybierz ten sam rozmiar obszaru ROI i zmierz średnią szarość i przedstaw dane w postaci wykresów słupkowych (Rysunek 2B).</li>
</ol>
2. Obrazowanie konfokalne Ca2+ na żywych komórkach
<ol>
	<li>Przygotuj sadzonki do obrazowania konfokalnego. Nasiona Arabidopsis z ekspresją case12 wysterylizować 10% roztworem wybielacza zawierającym 0,01% Tritonu. Wysiewaj sterylne nasiona na talerzu zawierającym sole MS o pełnej mocy, 1% sacharozy i 1,2% agaru. Umieścić płytki pionowo w komorze wzrostowej po rozwarstwieniu w temperaturze 4 °C na 2 dni.</li>
	<li>Konfiguracja komór obrazowania
	<ol>
		<li>Zmontować komorę obrazowania za pomocą szkiełka i szkiełka nakrywkowego (komora A). Umieść kawałek nasączonej wodą waty na środku szkiełka. Następnie przenieś jedną lub dwie 5-dniowe sadzonki z talerza na wierzch nasączonej wodą waty. Przyklej małe kawałki gliny do każdego rogu szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu sadzonek, aby utworzyć szczelinę (komorę) między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem (ryc. 3A, lewy panel). Podłącz jeden koniec rurki polietylenowej (o średnicy 0,58 mm) do strzykawki o pojemności 1 ml, a drugi koniec probówki umieść bezpośrednio obok komory. Przytrzymaj rurkę na miejscu za pomocą taśmy (Rysunek 3A, prawy panel).</li>
		<li>Zmontować komorę obrazowania za pomocą komory z pleksi (komora B).
		<ol>
			<li>Rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego wokół dwóch rurek polietylenowych (o średnicy 0,58 mm) i wciśnij powlekane rurki w kanały po obu stronach komory z pleksiglasu (Rysunek 3B lewy panel). Rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego na powierzchni komory, w której znajdują się rowki rurki i wciśnij szkiełko nakrywkowe w smar, aby uszczelnić (wyciąć) jedną stronę otworu komory.</li>
			<li>Przenieś pięciodniową sadzonkę z talerza do komory i umieść kawałek waty nasączonej wodą na wierzchu sadzonki. Rozprowadź smar silikonowy na drugiej powierzchni komory i dociśnij kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uszczelnić. Podłączyć koniec jednej z probówek do strzykawki o pojemności 1 ml. Pozostaw otwarty koniec drugiej rurki (Rysunek 3B prawy panel).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować komorę obrazowania za pomocą komorowego szkła nakrywkowego (komora C). Wysterylizuj szklaną pokrywę z komorą 70% etanolem i pozostaw ją na okapie do wyschnięcia. Dodać 0,6 ml lub 0,2 ml pożywki MS o pełnej mocy zawierającej 1% sacharozy i 0,5% fitamelu do każdej studzienki odpowiednio w komorze 2-dołkowej lub komorze 8-dołkowej (rysunek 3C prawy panel). Wysterylizuj nasiona i wysiewaj je bezpośrednio w komorze szklanej zawierającej cienką warstwę przezroczystego żelu i pozwól im rosnąć pionowo przez 5 dni (ryc. 3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby zastosować bodźce stresowe, takie jak sól, zimno lub nadtlenek, należy powoli wstrzyknąć około 200 μl 150 mM NaCl, lodowatej wody lub 1 mM H2O2 roztworu do komory (komory A lub B) tuż przed uzyskaniem obrazów lub delikatnie dodać 500 μl lub 100 μl roztworu bodźcowego do studzienki komory 2- lub 8-dołkowej, odpowiednio. Rób zdjęcia natychmiast po zastosowaniu roztworu stymulacyjnego za pomocą odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Nikon A1R z soczewką zanurzeniową 20X w wodzie (apertura numeryczna 0,75). Zbierz serię czasową obrazów w odstępach 4-sekundowych o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 500 - 550 nm oraz w rozdzielczości pikseli 512 x 512.</li>
	<li>Analiza obrazu 
	Korzystając z elementów firmy Nikon, narysowano zwrot z inwestycji wokół każdej komórki (lub obszaru) zainteresowania. Całkowita intensywność w ramach każdego zwrotu z inwestycji została zmierzona w czasie za pomocą okna dialogowego Pomiar czasu (zamiast tego można użyć ImageJ). Pomiary całkowitej intensywności zostały wyeksportowane i przetworzone w DataGraph. Amplituda kolca Ca2+ zdefiniowano jako intensywność szczytową minus intensywność spoczynkową, czas trwania jako czas między inicjacją a zakończeniem skoku, a okres jako odstęp czasu między sąsiednimi szczytami szczytów dwóch szczytów. Do porównania średnich użyto testu t.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zademonstrowaliśmy system FAS do rejestrowania przestrzenno-czasowej odpowiedzi Ca2+ siewek rzodkiewnika. Ten system rejestracji FAS Ca2+ zapewnia proste, czułe i solidne podejście, które można dostosować do pomiaru dynamiki Ca2+ wyzwalanej przez różne bodźce, oprócz bodźców stresu abiotycznego, które są tutaj przedstawione. Korzystając z tego systemu, możemy łatwo porównać przestrzenno-czasową dynamikę Ca2+ specyficzną dla tkanek lub bodźców na poziomie całej rośliny. Wysoka c...

Komórka roślinna reaguje na otoczenie za pomocą sygnalizacji, która koordynuje działania komórki. Wczesnym zdarzeniem sygnalizacji komórkowej w odpowiedzi na bodźce środowiskowe jest przejściowy wzrost Ca2 +. Wzorzec lub sygnatura przejściowego wzrostu stężenia wolnego Ca2+ charakteryzuje się jego amplitudą, częstotliwością i czasem trwania. Wyraźne czasoprzestrzenne sygnatury Ca2+ regulują różne aktywności komórkowe1. Określone bodźce, takie jak ciepło, zimno, sól, susza, światło lub hormony roślinne, mogą precyzyjnie dostroić czasoprzestrzenną aktywność kanałów Ca2 + zlokalizowanych w błonie i / lub transporterów, co skutkuje specyficznymi sygnaturami Ca2 +. Chociaż transportery Ca2 + zostały dobrze scharakteryzowane, niewiele wiadomo o tożsamości molekularnej i funkcjach kanałów Ca2 + w roślinach1. Genetyczne badania przesiewowe dla mutantów ze zmienioną reakcją Ca2 + na bodźce stresowe mogą być skutecznym podejściem do identyfikacji składników składających się na sygnatury Ca2 +. Ostatnio opracowano kilka systemów wykrywania Ca2 + opartych na Aequorin, które ułatwiają genetyczne badania przesiewowe składników sygnałowych Ca2 + w odpowiedzi na atak patogenów i stres abiotyczny2-4.
Aequorin został po raz pierwszy użyty do wykrywania sygnałów Ca2+ w roślinach na początku lat 90.5. Od tego czasu Aequorin jest ukierunkowany na różne przedziały komórkowe, takie jak cytoplazma5, jądro6, chloroplasty7, tonoplast8, mitochondria9 i zrąb10, a także na różne typy komórek w korzeniu w celu monitorowania specyficznych dla komórki sygnałów Ca2 + 11. Pomiary Ca2+ oparte na Aequorin ujawniają przestrzenną i czasową odpowiedź Ca2+ populacji komórek na bodźce stresowe. Jednak w większości przypadków odpowiedzi Ca2 + pojedynczych komórek są niezsynchronizowane w reagującej tkance4. Dlatego zapis Aequorin Ca2+ niekoniecznie zgłasza sygnał Ca2+ w poszczególnych komórkach. W ostatnich latach genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + na bazie białek fluorescencyjnych (FP), takie jak żółty kameleon (YCs)12 i CASEs1213, zostały wykorzystane do badania sygnalizacji Ca2 + z wysoką rozdzielczością subkomórkową. YC to wskaźniki Ca2 + oparte na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), zawierające warianty CFP i YFP połączone białkiem wiążącym Ca2 + kalmoduliną i peptydem wiążącym kalmodulinę M13. Kalmodulina ulega zmianie konformacyjnej, ponieważ wiąże się z Ca2+, zbliżając w ten sposób CFP i YFP do siebie, co skutkuje zwiększonym transferem energii (wzmocniony FRET). Poziom FRET w czasie, obliczony w przybliżeniu jako stosunek intensywności sygnału YFP do CFP, odzwierciedla wewnątrzkomórkową dynamikę Ca2 +. W roślinach zastosowano kilka wersji YC. YC3.6 był ukierunkowany na cytozol14,15, jądro16, mitochondria17 i błonę plazmatyczną18, a YC4.6 i D4ER były ukierunkowane na ER15,19, a D3cpv był ukierunkowany na peroksysomy20. Rośliny transgeniczne wykazujące ekspresję YC umożliwiają obrazowanie dynamiki Ca2 + w żywych komórkach w różnych przedziałach komórkowych różnych typów komórek. CASE (przypuszczalnie Calcium sensor) to pojedyncze białka fluorescencyjne z permutacją kołową (cpFP) zawierające kalmodulinę i peptyd wiążący kalmodulinę M13. Po związaniu się z Ca2+ CASE ulegają zmianom konformacyjnym, co prowadzi do wzrostu intensywności fluorescencji. Korelacja między reakcją fluorescencyjną CASE a stężeniem Ca2+ pozwala na ilościowy pomiar wewnątrzkomórkowej dynamiki Ca2 +. Wariant Case12 ma 12-krotnie zwiększoną fluorescencję w formach nasyconych Ca2+. Rośliny N. benthiminana przejściowo eksprymujące Case12 lub rośliny Arabidopsis stabilnie eksprymujące Case 12 wykorzystano do badania sygnalizacji Ca2 + w obronie i stresie abiotycznym4,21 . Asynchroniczne przestrzenne i czasowe oscylacje Ca2 + w komórkach reagujących na atak patogenu lub stres odwodnienia ujawniono za pomocą obrazowania Ca2 + opartego na Case12.
Tutaj prezentujemy szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania luminescencyjnego na podstawie Aequorin dynamiki Ca2+ specyficznej dla tkanek i bodźców u siewek rzodkiewnika, oraz dla konfokalnego obrazowania cytozolowej i jądrowej dynamiki Ca2+ w komórkach korzenia rzodkiewnika wykazujących ekspresję Przypadku 12. Obrazowanie luminescencyjne FAS można dostosować do analizy dynamiki Ca2 + wywołanej stresem w nienaruszonych roślinach lub tkankach nieopisanych tutaj, lub do badania przesiewowego mutagenizowanych populacji roślin Arabidopsis pod kątem mutantów ze zmienionymi sygnałami Ca2 + wywołanymi stresem. Konfiguracja obrazowania Ca2 + na żywych komórkach może być dostosowana do analizy dynamiki Ca2 + w różnych przedziałach subkomórkowych lub w różnych typach komórek przy użyciu innych wskaźników Ca2 +.

<table><tbody><tr><td>Kwadratowa szalka Petriego 10 cm x 10 cm</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>2-komorowa szklana pokrywa&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe szkło nakrywkowe</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania luminescencyjnego</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>elementów firmy Nikon&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>Nie dotyczy</td><td>DataGraph 3.1.1 to najnowsza wersja</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz uniwersalny</td><td>Dowolny sklep</td><td>lokalny Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS sól</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów ca2+ u rzodkiewnika

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Sygnały rozwojowe i środowiskowe wywołują fluktuacje Ca2+ w komórkach roślinnych. Specyficzne dla bodźca przestrzenno-czasowe wzorce Ca2 + są wyczuwane przez komórkowe białka wiążące Ca2 +, które inicjują kaskady sygnalizacyjne Ca2 +. Jednak nadal niewiele wiemy o tym, w jaki sposób generowane są specyficzne dla bodźca sygnały Ca2+. Specyfikę sygnału Ca2+ można przypisać wyrafinowanej regulacji aktywności kanałówCa2+ i/lub transporterów w odpowiedzi na dany bodziec. Aby zidentyfikować te składniki komórkowe i zrozumieć ich funkcje, kluczowe jest użycie systemów, które umożliwiają czułe i niezawodne rejestrowanie sygnałów Ca2+ zarówno na poziomie tkankowym, jak i komórkowym. Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 +, które są ukierunkowane na różne przedziały komórkowe, zapewniły platformę do obrazowania konfokalnego żywych komórek komórkowych sygnałów Ca2 +. Poniżej opisujemy instrukcje dotyczące korzystania z dwóch systemów detekcjiCa2+: obrazowania luminescencyjnego Ca2+ FAS (sadzonki kleju foliowego) na bazie aequoryny oraz obrazowania fluorescencji konfokalnej Ca2+ opartej na case12. Obrazowanie luminescencyjne za pomocą systemu FAS zapewnia proste, niezawodne i czułe wykrywanie przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ na poziomie tkankowym, podczas gdy obrazowanie konfokalne żywych komórek za pomocą Case12 zapewnia jednoczesne wykrywanie cytozolowych i jądrowych sygnałów Ca2+ w wysokiej rozdzielczości.

Mannitol, NaCl i H2O2 wykorzystano odpowiednio jako substytuty bodźców stresu dehydratacyjnego, zasolenia oraz stresu oksydacyjnego. Aby sprawdzić, czy jony ciężkiego metalu Cu2+ wykazują efekt synergistyczny z którymkolwiek z tych trzech bodźców stresowych, porównano odpowiedź Ca2+ na każdy z bodźców w obecności lub w nieobecności Cu2+. Jak pokazano na Rysunku 2, obrazowanie luminescencyjne FAS ujawniło, że siewki Arabidoposis różnie reagowały na de...

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metody monitorowania sygnałów wapniowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i całej rośliny. Osiąga się to poprzez pierwszą uprawę sadzonek na płytce agarowej MS lub bezpośrednio w komorze obrazowania. Drugim krokiem jest przeniesienie sadzonek na folię samoprzylepną lub trzymanie ich w komorze obrazowania.Następnie na sadzonki nakładane są bodźce w celu wywołania sygnałów wapniowych. Ostatecznie obrazowanie luminescencyjne lub fluorescencyjne stylu życia służy do pokazania odpowiedzi całej sadzonki lub cytozolowej jądrowej odpowiedzi wapnia odpowiednio na różne bodźce. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak występowanie pojedynczej rośliny, jest to, że test sadzonek kleju foliowego jest prosty, czuły i wytrzymały.W związku z tym technikę tę można dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku mutantów ze zmienionymi odpowiedziami na sygnał wapniowy. Ponadto, w porównaniu z płaskim obrazowaniem wapnia, zastosowanie genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia opartego na GFP pozwala uniknąć skomplikowanych ustawień mikroskopowych i obliczeń. Metoda ta zapewnia wgląd w sygnalizację w

measuring-spatial-and-temporal-ca2-signals-in-arabidopsis-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Ten protokół opisuje metodę testowania hipotezy, że odwrócenie efektywnego pola geomagnetycznego (GMF) indukuje różnicową ekspresję genów i zmienia morfologię Arabidopsis thaliana. Trójosiowy ośmiokątny układ par cewek Helmholtza został wykorzystany do sztucznego generowania odwróconych warunków GMF w komorze wzrostu roślin.

Pole geomagnetyczne (Gmf) i ewolucja roślin: badanie wpływu odwrócenia GMF na rozwój Arabidopsis thaliana i ekspresję genów

Ten protokół przedstawia prostą metodę analizy sygnałów wapniowych w roślinach, generowanych przez karmienie owadów pluskwiaków, takich jak mszyce. Arabidopsis thaliana przekształcony za pomocą biosensora wapnia GCaMP3 GFP pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym in vivo z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Rejestrowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych Arabidopsis podczas żerowania owadów za pomocą biosensora fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Czujnik percepcji gibereliny 1 (GPS1) jest pierwszym biosensorem opartym na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru poziomów komórkowych fitohormonów gibereliny z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten przedstawia metodę wizualizacji i ilościowego określania poziomów gibereliny komórkowej przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora nlsGPS1 w hipokotylach Arabidopsis i wierzchołkach korzeni.

Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak załadować CFDA do różnych miejsc w dolnych częściach Arabidopsis. Następnie przedstawiamy wynikowy wzór rozmieszczenia mukowiscydozy w pędach.

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Poznaj metodę pomiaru sygnałów wapniowych w komórkach i całych roślinach Arabidopsis thaliana przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺. Technika ta umożliwia wizualizację odpowiedzi na stres abiotyczny.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca²⁺ u rzodkiewnika

Przeglądaj więcej filmów