Name: Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sygnałów wapniowych w komórkach i całych roślinach Arabidopsis thaliana przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺. Technika ta umożliwia wizualizację odpowiedzi na stres abiotyczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni B. Stevensonowi za pomoc techniczną i Dr Marc R. Knight za dostarczenie transgenicznej linii Aequorin. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health Grant R01 GM059138.

1. Obrazowanie Ca2+ na bazie Aequorin przy użyciu systemu FAS
<ol>
	<li>Przygotuj sadzonki do obrazowania luminescencyjnego. Nasiona roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję Aequorin sterylizować 10% roztworem wybielacza zawierającym 0,01% Triton-100. Sterylne nasiona wysiewać na kwadratowym talerzu (kwadratowa szalka Petriego o wymiarach 10 x 10 cm z siatką) zawierającym pełną moc MS (mieszanina soli bazalnej Murashige i Skoog), 1% sacharozy i 1,2% agaru. Umieścić płytki pionowo w komorze wzrostowej po rozwarstwieniu w temperaturze 4 °C na 2 dni (ryc. 1A).</li>
	<li>Przenieś sadzonki na folię. Umieść folię samoprzylepną (Rysunek 1B) na wierzchu 7-10-dniowych sadzonek rosnących na talerzu. Delikatnie popchnij folię ręcznie, aby upewnić się, że sadzonki przylegają do folii (Rysunek 1C). Delikatnie obierz folię, aby sadzonki pozostały przyklejone do folii (Rysunek 1D i 1E)</li>
	<li>Inkubuj sadzonki z kofaktorem. Umieść przyklejone sadzonki na kwadratowej płytce (10 x 10 cm) zawierającej 15 ml 2 μg/ml h-CTZ (coelenterazine) w wodzie. Inkubuj sadzonki w temperaturze pokojowej przez 4 godziny do nocy (ryc. 1F).</li>
	<li>Przygotuj się do obrazowania luminescencyjnego. Wyjmij folię z roztworu h-CTZ i przetnij ją na środek, tworząc dwa kawałki. Umieść każdy kawałek folii z sadzonkami zadrukowaną do góry na dwóch różnych talerzach. Pozostaw talerze w ciemności na 5 minut.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów luminescencyjnych. W ciemności umieść dwie płytki obok siebie na stoliku systemu obrazowania luminescencyjnego (rysunek 1G). Obrazy należy uzyskać natychmiast po jednoczesnym dodaniu 20 ml roztworu bodźców do płytek.</li>
	<li>Analizuj obrazy luminescencyjne. Wybierz ten sam zakres wyświetlania dla wszystkich obrazów luminescencyjnych. Przytnij obszar zainteresowania (ROI) i wygeneruj obrazy jako pliki JPEG (Rysunek 2A). Alternatywnie można wyeksportować obrazy jako pliki w formacie SPE i zaimportować je do oprogramowania do analizy obrazów ImageJ. Ustaw pomiary w celu obliczenia średniej wartości szarości ROI. Wybierz ten sam rozmiar obszaru ROI i zmierz średnią szarość i przedstaw dane w postaci wykresów słupkowych (Rysunek 2B).</li>
</ol>
2. Obrazowanie konfokalne Ca2+ na żywych komórkach
<ol>
	<li>Przygotuj sadzonki do obrazowania konfokalnego. Nasiona Arabidopsis z ekspresją case12 wysterylizować 10% roztworem wybielacza zawierającym 0,01% Tritonu. Wysiewaj sterylne nasiona na talerzu zawierającym sole MS o pełnej mocy, 1% sacharozy i 1,2% agaru. Umieścić płytki pionowo w komorze wzrostowej po rozwarstwieniu w temperaturze 4 °C na 2 dni.</li>
	<li>Konfiguracja komór obrazowania
	<ol>
		<li>Zmontować komorę obrazowania za pomocą szkiełka i szkiełka nakrywkowego (komora A). Umieść kawałek nasączonej wodą waty na środku szkiełka. Następnie przenieś jedną lub dwie 5-dniowe sadzonki z talerza na wierzch nasączonej wodą waty. Przyklej małe kawałki gliny do każdego rogu szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu sadzonek, aby utworzyć szczelinę (komorę) między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem (ryc. 3A, lewy panel). Podłącz jeden koniec rurki polietylenowej (o średnicy 0,58 mm) do strzykawki o pojemności 1 ml, a drugi koniec probówki umieść bezpośrednio obok komory. Przytrzymaj rurkę na miejscu za pomocą taśmy (Rysunek 3A, prawy panel).</li>
		<li>Zmontować komorę obrazowania za pomocą komory z pleksi (komora B).
		<ol>
			<li>Rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego wokół dwóch rurek polietylenowych (o średnicy 0,58 mm) i wciśnij powlekane rurki w kanały po obu stronach komory z pleksiglasu (Rysunek 3B lewy panel). Rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego na powierzchni komory, w której znajdują się rowki rurki i wciśnij szkiełko nakrywkowe w smar, aby uszczelnić (wyciąć) jedną stronę otworu komory.</li>
			<li>Przenieś pięciodniową sadzonkę z talerza do komory i umieść kawałek waty nasączonej wodą na wierzchu sadzonki. Rozprowadź smar silikonowy na drugiej powierzchni komory i dociśnij kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uszczelnić. Podłączyć koniec jednej z probówek do strzykawki o pojemności 1 ml. Pozostaw otwarty koniec drugiej rurki (Rysunek 3B prawy panel).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować komorę obrazowania za pomocą komorowego szkła nakrywkowego (komora C). Wysterylizuj szklaną pokrywę z komorą 70% etanolem i pozostaw ją na okapie do wyschnięcia. Dodać 0,6 ml lub 0,2 ml pożywki MS o pełnej mocy zawierającej 1% sacharozy i 0,5% fitamelu do każdej studzienki odpowiednio w komorze 2-dołkowej lub komorze 8-dołkowej (rysunek 3C prawy panel). Wysterylizuj nasiona i wysiewaj je bezpośrednio w komorze szklanej zawierającej cienką warstwę przezroczystego żelu i pozwól im rosnąć pionowo przez 5 dni (ryc. 3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby zastosować bodźce stresowe, takie jak sól, zimno lub nadtlenek, należy powoli wstrzyknąć około 200 μl 150 mM NaCl, lodowatej wody lub 1 mM H2O2 roztworu do komory (komory A lub B) tuż przed uzyskaniem obrazów lub delikatnie dodać 500 μl lub 100 μl roztworu bodźcowego do studzienki komory 2- lub 8-dołkowej, odpowiednio. Rób zdjęcia natychmiast po zastosowaniu roztworu stymulacyjnego za pomocą odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Nikon A1R z soczewką zanurzeniową 20X w wodzie (apertura numeryczna 0,75). Zbierz serię czasową obrazów w odstępach 4-sekundowych o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 500 - 550 nm oraz w rozdzielczości pikseli 512 x 512.</li>
	<li>Analiza obrazu 
	Korzystając z elementów firmy Nikon, narysowano zwrot z inwestycji wokół każdej komórki (lub obszaru) zainteresowania. Całkowita intensywność w ramach każdego zwrotu z inwestycji została zmierzona w czasie za pomocą okna dialogowego Pomiar czasu (zamiast tego można użyć ImageJ). Pomiary całkowitej intensywności zostały wyeksportowane i przetworzone w DataGraph. Amplituda kolca Ca2+ zdefiniowano jako intensywność szczytową minus intensywność spoczynkową, czas trwania jako czas między inicjacją a zakończeniem skoku, a okres jako odstęp czasu między sąsiednimi szczytami szczytów dwóch szczytów. Do porównania średnich użyto testu t.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zademonstrowaliśmy system FAS do rejestrowania przestrzenno-czasowej odpowiedzi Ca2+ siewek rzodkiewnika. Ten system rejestracji FAS Ca2+ zapewnia proste, czułe i solidne podejście, które można dostosować do pomiaru dynamiki Ca2+ wyzwalanej przez różne bodźce, oprócz bodźców stresu abiotycznego, które są tutaj przedstawione. Korzystając z tego systemu, możemy łatwo porównać przestrzenno-czasową dynamikę Ca2+ specyficzną dla tkanek lub bodźców na poziomie całej rośliny. Wysoka c...

Komórka roślinna reaguje na otoczenie za pomocą sygnalizacji, która koordynuje działania komórki. Wczesnym zdarzeniem sygnalizacji komórkowej w odpowiedzi na bodźce środowiskowe jest przejściowy wzrost Ca2 +. Wzorzec lub sygnatura przejściowego wzrostu stężenia wolnego Ca2+ charakteryzuje się jego amplitudą, częstotliwością i czasem trwania. Wyraźne czasoprzestrzenne sygnatury Ca2+ regulują różne aktywności komórkowe1. Określone bodźce, takie jak ciepło, zimno, sól, susza, światło lub hormony roślinne, mogą precyzyjnie dostroić czasoprzestrzenną aktywność kanałów Ca2 + zlokalizowanych w błonie i / lub transporterów, co skutkuje specyficznymi sygnaturami Ca2 +. Chociaż transportery Ca2 + zostały dobrze scharakteryzowane, niewiele wiadomo o tożsamości molekularnej i funkcjach kanałów Ca2 + w roślinach1. Genetyczne badania przesiewowe dla mutantów ze zmienioną reakcją Ca2 + na bodźce stresowe mogą być skutecznym podejściem do identyfikacji składników składających się na sygnatury Ca2 +. Ostatnio opracowano kilka systemów wykrywania Ca2 + opartych na Aequorin, które ułatwiają genetyczne badania przesiewowe składników sygnałowych Ca2 + w odpowiedzi na atak patogenów i stres abiotyczny2-4.
Aequorin został po raz pierwszy użyty do wykrywania sygnałów Ca2+ w roślinach na początku lat 90.5. Od tego czasu Aequorin jest ukierunkowany na różne przedziały komórkowe, takie jak cytoplazma5, jądro6, chloroplasty7, tonoplast8, mitochondria9 i zrąb10, a także na różne typy komórek w korzeniu w celu monitorowania specyficznych dla komórki sygnałów Ca2 + 11. Pomiary Ca2+ oparte na Aequorin ujawniają przestrzenną i czasową odpowiedź Ca2+ populacji komórek na bodźce stresowe. Jednak w większości przypadków odpowiedzi Ca2 + pojedynczych komórek są niezsynchronizowane w reagującej tkance4. Dlatego zapis Aequorin Ca2+ niekoniecznie zgłasza sygnał Ca2+ w poszczególnych komórkach. W ostatnich latach genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + na bazie białek fluorescencyjnych (FP), takie jak żółty kameleon (YCs)12 i CASEs1213, zostały wykorzystane do badania sygnalizacji Ca2 + z wysoką rozdzielczością subkomórkową. YC to wskaźniki Ca2 + oparte na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), zawierające warianty CFP i YFP połączone białkiem wiążącym Ca2 + kalmoduliną i peptydem wiążącym kalmodulinę M13. Kalmodulina ulega zmianie konformacyjnej, ponieważ wiąże się z Ca2+, zbliżając w ten sposób CFP i YFP do siebie, co skutkuje zwiększonym transferem energii (wzmocniony FRET). Poziom FRET w czasie, obliczony w przybliżeniu jako stosunek intensywności sygnału YFP do CFP, odzwierciedla wewnątrzkomórkową dynamikę Ca2 +. W roślinach zastosowano kilka wersji YC. YC3.6 był ukierunkowany na cytozol14,15, jądro16, mitochondria17 i błonę plazmatyczną18, a YC4.6 i D4ER były ukierunkowane na ER15,19, a D3cpv był ukierunkowany na peroksysomy20. Rośliny transgeniczne wykazujące ekspresję YC umożliwiają obrazowanie dynamiki Ca2 + w żywych komórkach w różnych przedziałach komórkowych różnych typów komórek. CASE (przypuszczalnie Calcium sensor) to pojedyncze białka fluorescencyjne z permutacją kołową (cpFP) zawierające kalmodulinę i peptyd wiążący kalmodulinę M13. Po związaniu się z Ca2+ CASE ulegają zmianom konformacyjnym, co prowadzi do wzrostu intensywności fluorescencji. Korelacja między reakcją fluorescencyjną CASE a stężeniem Ca2+ pozwala na ilościowy pomiar wewnątrzkomórkowej dynamiki Ca2 +. Wariant Case12 ma 12-krotnie zwiększoną fluorescencję w formach nasyconych Ca2+. Rośliny N. benthiminana przejściowo eksprymujące Case12 lub rośliny Arabidopsis stabilnie eksprymujące Case 12 wykorzystano do badania sygnalizacji Ca2 + w obronie i stresie abiotycznym4,21 . Asynchroniczne przestrzenne i czasowe oscylacje Ca2 + w komórkach reagujących na atak patogenu lub stres odwodnienia ujawniono za pomocą obrazowania Ca2 + opartego na Case12.
Tutaj prezentujemy szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania luminescencyjnego na podstawie Aequorin dynamiki Ca2+ specyficznej dla tkanek i bodźców u siewek rzodkiewnika, oraz dla konfokalnego obrazowania cytozolowej i jądrowej dynamiki Ca2+ w komórkach korzenia rzodkiewnika wykazujących ekspresję Przypadku 12. Obrazowanie luminescencyjne FAS można dostosować do analizy dynamiki Ca2 + wywołanej stresem w nienaruszonych roślinach lub tkankach nieopisanych tutaj, lub do badania przesiewowego mutagenizowanych populacji roślin Arabidopsis pod kątem mutantów ze zmienionymi sygnałami Ca2 + wywołanymi stresem. Konfiguracja obrazowania Ca2 + na żywych komórkach może być dostosowana do analizy dynamiki Ca2 + w różnych przedziałach subkomórkowych lub w różnych typach komórek przy użyciu innych wskaźników Ca2 +.

<table><tbody><tr><td>Kwadratowa szalka Petriego 10 cm x 10 cm</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>2-komorowa szklana pokrywa&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe szkło nakrywkowe</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania luminescencyjnego</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>elementów firmy Nikon&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>Nie dotyczy</td><td>DataGraph 3.1.1 to najnowsza wersja</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz uniwersalny</td><td>Dowolny sklep</td><td>lokalny Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS sól</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów ca2+ u rzodkiewnika

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Sygnały rozwojowe i środowiskowe wywołują fluktuacje Ca2+ w komórkach roślinnych. Specyficzne dla bodźca przestrzenno-czasowe wzorce Ca2 + są wyczuwane przez komórkowe białka wiążące Ca2 +, które inicjują kaskady sygnalizacyjne Ca2 +. Jednak nadal niewiele wiemy o tym, w jaki sposób generowane są specyficzne dla bodźca sygnały Ca2+. Specyfikę sygnału Ca2+ można przypisać wyrafinowanej regulacji aktywności kanałówCa2+ i/lub transporterów w odpowiedzi na dany bodziec. Aby zidentyfikować te składniki komórkowe i zrozumieć ich funkcje, kluczowe jest użycie systemów, które umożliwiają czułe i niezawodne rejestrowanie sygnałów Ca2+ zarówno na poziomie tkankowym, jak i komórkowym. Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 +, które są ukierunkowane na różne przedziały komórkowe, zapewniły platformę do obrazowania konfokalnego żywych komórek komórkowych sygnałów Ca2 +. Poniżej opisujemy instrukcje dotyczące korzystania z dwóch systemów detekcjiCa2+: obrazowania luminescencyjnego Ca2+ FAS (sadzonki kleju foliowego) na bazie aequoryny oraz obrazowania fluorescencji konfokalnej Ca2+ opartej na case12. Obrazowanie luminescencyjne za pomocą systemu FAS zapewnia proste, niezawodne i czułe wykrywanie przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ na poziomie tkankowym, podczas gdy obrazowanie konfokalne żywych komórek za pomocą Case12 zapewnia jednoczesne wykrywanie cytozolowych i jądrowych sygnałów Ca2+ w wysokiej rozdzielczości.

Mannitol, NaCl i H2O2 wykorzystano odpowiednio jako substytuty bodźców stresu dehydratacyjnego, zasolenia oraz stresu oksydacyjnego. Aby sprawdzić, czy jony ciężkiego metalu Cu2+ wykazują efekt synergistyczny z którymkolwiek z tych trzech bodźców stresowych, porównano odpowiedź Ca2+ na każdy z bodźców w obecności lub w nieobecności Cu2+. Jak pokazano na Rysunku 2, obrazowanie luminescencyjne FAS ujawniło, że siewki Arabidoposis różnie reagowały na de...

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metody monitorowania sygnałów wapniowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i całej rośliny. Osiąga się to poprzez pierwszą uprawę sadzonek na płytce agarowej MS lub bezpośrednio w komorze obrazowania. Drugim krokiem jest przeniesienie sadzonek na folię samoprzylepną lub trzymanie ich w komorze obrazowania.Następnie na sadzonki nakładane są bodźce w celu wywołania sygnałów wapniowych. Ostatecznie obrazowanie luminescencyjne lub fluorescencyjne stylu życia służy do pokazania odpowiedzi całej sadzonki lub cytozolowej jądrowej odpowiedzi wapnia odpowiednio na różne bodźce. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak występowanie pojedynczej rośliny, jest to, że test sadzonek kleju foliowego jest prosty, czuły i wytrzymały.W związku z tym technikę tę można dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku mutantów ze zmienionymi odpowiedziami na sygnał wapniowy. Ponadto, w porównaniu z płaskim obrazowaniem wapnia, zastosowanie genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia opartego na GFP pozwala uniknąć skomplikowanych ustawień mikroskopowych i obliczeń. Metoda ta zapewnia wgląd w sygnalizację wapniową podczas reakcji na stres u rzodkiewnika, ale może być również stosowana w innych kontekstach, takich jak rozwój lub obrona w innych modelach roślinnych.Zademonstrowanie tej metody będzie błyszczące. Student z naszego laboratorium Aby rozpocząć tę procedurę, wysterylizuj nasiona roślin królika wyrażających quain za pomocą 10% roztworu wybielacza zawierającego 0,01%Triton 100, wysiewaj nasiona na kwadratowej płytce zawierającej pełną moc MS 1% sacharozy i 1,2% agaru. Następnie umieść płytki pionowo w komorze wzrostowej po rozwarstwieniu czterech stopni Celsjusza na dwa dni.Następnie przenieś sadzonki na folię. Umieść folię samoprzylepną na wierzchu siedmiodniowych do 10-dniowych sadzonek rosnących na talerzu. Delikatnie popchnij folię ręcznie, aby upewnić się, że sadzonki przylegają do folii.Następnie delikatnie obierz folię, aby sadzonki przylegały do folii. Następnie inkubuj sadzonki z kofaktorem, umieszczając sadzonki przylegające do A na kwadratowej płytce zawierającej 15 mililitrów dwóch mikrogramów na mililitr HCTZ w wodzie. Inkubuj sadzonki w temperaturze pokojowej przez cztery godziny do nocy.Aby przygotować się do obrazowania luminescencyjnego, wyjmij folię z roztworu HCTZ i przytnij ją na środek, aby utworzyć dwie części. Umieść dwa kawałki folii sadzonkami skierowanymi do góry na dwóch różnych talerzach. Następnie pozostaw płytki w ciemności na pięć minut, aby uzyskać obrazy luminescencyjne w ciemności.Umieść dwie płytki obok siebie na stoliku systemu obrazowania luminescencyjnego. Uzyskuj obrazy natychmiast po jednoczesnym dodaniu 20 mililitrów roztworu bodźców do płytek. Aby przeanalizować obrazy luminescencji, wybierz ten sam zakres wyświetlania dla wszystkich obrazów luminescencji, przytnij ROI i wygeneruj obrazy jako pliki jpeg.Alternatywnie można wyeksportować obrazy jako pliki w formacie SPE i zaimportować je do oprogramowania do analizy obrazu J. Ustaw pomiary do obliczenia średniej szarej wartości ROI, wybierz ten sam rozmiar obszaru ROI. Następnie zmierz średnią wartość szarości i przedstaw dane w postaci wykresów słupkowych.Aby przygotować sadzonki do obrazowania konfokalnego. Wysterylizuj nasiona roślin opsis w przypadku 12 za pomocą 10% roztworu wybielacza zawierającego 0,01% Tritonu. Tak więc sterylne nasiona na talerzu zawierającym sole MS o pełnej mocy, 1% sacharozy i 1,2% agaru.Następnie umieść płytki pionowo w komorze wzrostowej po rozwarstwieniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwa dni. W międzyczasie zmontuj komorę obrazowania ze szkiełkiem podstawowym i szkiełkiem nakrywkowym. Umieść kawałek waty nasączonej wodą na górze zjeżdżalni.Następnie przenieś jedną lub dwie pięciodniowe sadzonki z talerza na środek szkiełka. Następnie przyklej małe kawałki gliny do każdego rogu szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe na sadzonkach, aby utworzyć szczelinę między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Następnie podłącz jeden koniec rurki polietylenowej do jednomililitrowej strzykawki i umieść drugi koniec rurki bezpośrednio obok komory.Przytrzymaj rurkę na miejscu za pomocą taśmy, aby zmontować komorę obrazowania z komorą z pleksi. Rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego wokół dwóch rurek polietylenowych i wciśnij powlekane rurki w kanały po obu stronach komory z pleksi. Następnie rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego na powierzchni komory, w której znajdują się rowki rurki i umieść szkiełko nakrywkowe na smarze, aby uszczelnić jedną stronę otworu komory.Następnie przenieś pięciodniową sadzonkę z talerza do komory i połóż na niej kawałek waty nasączonej wodą. Rozprowadź smar silikonowy na drugiej powierzchni komory i dociśnij kolejne szkiełko nakrywkowe na górze, aby uszczelnić. Następnie podłącz koniec jednej z probówek do jednomililitrowej strzykawki i pozostaw koniec drugiej probówki otwarty.Aby przygotować komorę obrazowania z komorowym szkłem nakrywkowym, najpierw wysterylizuj komorę nakrywkową 70% etanolem i pozostaw ją w kapturze do wyschnięcia w temperaturze 0,6 mililitra lub 0,2 mililitra o pełnej mocy MS. Pożywka zawierająca 1% sacharozy i 0,5% żelu bojowego do każdej studzienki odpowiednio w komorze dwudołkowej lub ośmiodołkowej. Następnie wysterylizuj nasiona i wysiewaj je bezpośrednio na komorze szklanej zawierającej cienką warstwę przezroczystego żelu i pozwól im rosnąć pionowo przez pięć dni. Do akwizycji obrazu.Za pomocą mikroskopu konfokalnego stosuje bodźce stresowe poprzez powolne wstrzykiwanie 200 mikrolitrów 150-milimolowego chlorku sodu, lodowatej wody lub jednego milimolowego roztworu nadtlenku wodoru do komory tuż przed uzyskaniem obrazów. Uchwyć obrazy natychmiast po zastosowaniu roztworu stymulacyjnego. Korzystanie z odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 20-krotną soczewką zanurzeniową w wodzie.Zbierz serię czasową obrazów w czterosekundowych odstępach czasu z długościami fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 4 88 nanometrów i 500 do 550 nanometrów oraz rozdzielczością AIX 5 12 na pięć 12 lub analizą obrazu przy użyciu elementów firmy Nikon. Zwroty akcji są rysowane wokół każdej komórki zainteresowania. Całkowita intensywność w ramach każdego zwrotu z inwestycji jest mierzona w czasie za pomocą okna dialogowego pomiaru czasu.Następnie pomiary całkowitej intensywności są eksportowane i przetwarzane na pokazanym wykresie danych. Oto porównanie przestrzennej czasowej odpowiedzi wapniowej sadzonek 10-dniowych. Różne bodźce stresowe to szeregi czasowe luminescencji, obrazy sadzonek poddanych działaniu 400 milimolowego mannitolu i 400 milimolowego ole plus jeden milimolowy chlorek miedzi, 75 milimolowy chlorek sodu i 75 milimolowy chlorek sodu plus jeden milimolowy chlorek miedzi i jeden milimolowy nadtlenek wodoru lub jeden milimolowy nadtlenek wodoru plus jeden milimolowy chlorek miedzi.Górny i dolny panel to obrazy luminescencyjne uzyskane odpowiednio w ciągu pierwszych 40 sekund i drugich 40 sekund. A oto wykres słupkowy średniej intensywności luminescencji siewek w odpowiedzi na wskazane bodźce stresowe pokazane tutaj jako cytozolowa i jądrowa oscylacja wapnia. W odpowiedzi na stres solny, obrazy konfokalne pokazują, że przypadek 12 ulega ekspresji w cytoplazmie i jądrach komórek korzeniowych oraz komórkach liści roślin transgenicznych wykazujących ekspresję przypadku 12.Wyłania się ten obraz, obraz czerwonej, autofluorescencji chloroplastów i zielonej fluorescencji przypadku 12. Te dwa wykresy pokazują oscylacje wapnia wywołane stresem solnym w cytozolu, jądrze komórek korzenia. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu dobrze wyrośniętych sadzonek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować dyny zarówno na poziomie komórkowym, jak i na poziomie całej rośliny.

measuring-spatial-and-temporal-ca2-signals-in-arabidopsis-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Ten protokół opisuje metodę testowania hipotezy, że odwrócenie efektywnego pola geomagnetycznego (GMF) indukuje różnicową ekspresję genów i zmienia morfologię Arabidopsis thaliana. Trójosiowy ośmiokątny układ par cewek Helmholtza został wykorzystany do sztucznego generowania odwróconych warunków GMF w komorze wzrostu roślin.

Pole geomagnetyczne (Gmf) i ewolucja roślin: badanie wpływu odwrócenia GMF na rozwój Arabidopsis thaliana i ekspresję genów

Ten protokół przedstawia prostą metodę analizy sygnałów wapniowych w roślinach, generowanych przez karmienie owadów pluskwiaków, takich jak mszyce. Arabidopsis thaliana przekształcony za pomocą biosensora wapnia GCaMP3 GFP pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym in vivo z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Rejestrowanie w czasie rzeczywistym sygnałów wapniowych Arabidopsis podczas żerowania owadów za pomocą biosensora fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Czujnik percepcji gibereliny 1 (GPS1) jest pierwszym biosensorem opartym na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru poziomów komórkowych fitohormonów gibereliny z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten przedstawia metodę wizualizacji i ilościowego określania poziomów gibereliny komórkowej przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora nlsGPS1 w hipokotylach Arabidopsis i wierzchołkach korzeni.

Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak załadować CFDA do różnych miejsc w dolnych częściach Arabidopsis. Następnie przedstawiamy wynikowy wzór rozmieszczenia mukowiscydozy w pędach.

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Poznaj metodę pomiaru sygnałów wapniowych w komórkach i całych roślinach Arabidopsis thaliana przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺. Technika ta umożliwia wizualizację odpowiedzi na stres abiotyczny.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca²⁺ u rzodkiewnika

Przeglądaj więcej filmów