Name: Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj metody wykrywania i śledzenia anastazy w komórkach ssaków za pomocą mikroskopii komórek żywych i biosensorów fluorescencyjnych. Technika ta pozwala obserwować odwrócenie apoptozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Wielebnemu Dr. Ralphowi Bohlmannowi i Wielebnemu Dr. Jamesowi Voelzowi za zasugerowanie słowa "anastasis" do opisania odwrócenia apoptozy; Douglas R. Green dla komórek HeLa stabilnie eksprymujących cytochrom c-GFP; Charlesa M. Rudina i Erica E. Gardnera za komórki H446; Heather Lamb za pomoc w rysowaniu kreskówek w filmie; Yee Hui Yeo za cenne omówienie tego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez stypendium Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), stypendium Fulbrighta 007-2009 (H.L.T.), stypendium Fundacji Badań nad Naukami Przyrodniczymi (H.L.T.), granty NIH NS037402 (J.M.H.) i NS083373 (J.M.H.) oraz University Grants Committee of the Hong Kong AoE/B-07/99 (M.C.F.). Ho Lam Tang jest stypendystką Fundacji Nauk Przyrodniczych (Life Sciences Research Foundation) i Kay Curci.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Anastaza odnosi się do zjawiska, w którym komórki, które aktywowały szlak śmierci komórki, następnie odwracają proces umierania i przeżywają. Tutaj wykazaliśmy, że obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do potwierdzenia, że te same pojedyncze komórki w rzeczywistości mogą odwrócić proces apoptotycznej śmierci komórki na późnym etapie, a następnie kontynuować przeżywanie i rozmnażanie. Nasze protokoły opisują kilka zoptymalizowanych warunków leczenia specyficznych dla typu komórki w celu wywołania apoptozy i umo...

Apoptoza (po grecku "upadek na śmierć") jest ogólnie uważana za jednokierunkowy proces kończący się samobójstwem komórki1-7. Genetyczne zakłócenie genów pro-śmierci powoduje przeżycie dodatkowych komórek, które w przeciwnym razie umarłyby u całych zwierząt, w tym komórek, które już zainicjowały szlak apoptozy8,9. Podobnie, manipulacje genetyczne pozwalają zdrowym komórkom ssaków, które sztucznie wyświetlają sygnały "zjedz mnie" lub które tracą przyczepność do swojej macierzy zewnątrzkomórkowej, uniknąć śmierci odpowiednio przez fagocytozę lub entozę całych komórek. Jednak my i inni wykazaliśmy, że bez manipulacji genetycznej normalne, zdrowe komórki i linie komórkowe ssaków mogą również odzyskać siły po wczesnych stadiach apoptozy12-15. Korzystając z narzędzi do śledzenia pojedynczych komórek, wykazaliśmy ponadto powrót do zdrowia po późnych stadiach apoptozy12,13, po tym, jak komórki przeszły ważne punkty kontrolne, które zwykle wyznaczają "punkt bez powrotu"2-6. Te punkty kontrolne późnego stadium apoptozy obejmują mitochondrialne uwalnianie cytochromu c, aktywację kaspaz, fragmentację jądrową i tworzenie ciał apoptotycznych. Przyjęliśmy greckie słowo złożone "anastasis", które oznacza "powstanie do życia", aby opisać to odwrócenie apoptozy na skraju śmierci komórki2-6.
Dopóki cały proces odzyskiwania do umierania nie jest obserwowany przez obrazowanie żywych komórek, trudno jest odróżnić komórki, które przeszły anastazę, od komórek, które nigdy nie doświadczyły zdarzeń apoptozy. Dziesięciolecia prac ujawniły, że cechy morfologiczne samobójstwa komórek przez apoptozę są napędzane przez ewolucyjnie zachowane zdarzenia biochemiczne i molekularne16-19. Zdarzenia te sprzyjają samoniszczeniu komórek w celu regulacji procesów rozwojowych i homeostatycznych w organizmach jednokomórkowych i wielokomórkowych poprzez eliminację uszkodzonych lub niebezpiecznych komórek16-19. Podczas gdy komórki apoptotyczne można łatwo odróżnić za pomocą standaryzowanych morfologicznych, biochemicznych i molekularnych objawów apoptozy1,5,6,16,20, obecnie nie jest znany marker specyficzny dla anastazy12,13. Co ważne, komórki, które przeszły anastazę, wydają się być normalnymi, zdrowymi komórkami, a komórki, które właśnie zaczynają odwracać apoptozę, wyglądają jak apoptotyczne umierające komórki12,13. W związku z tym potrzebne są nowe narzędzia, aby stwierdzić z całą pewnością, że dana komórka, która przeżyła, doświadczyła wcześniej aktywnych procesów apoptotycznych.
Apoptoza jest ogólnie uważana za nieodwracalną kaskadę, ponieważ jest to szybki i masowy proces niszczenia. Chociaż może minąć od kilku minut do kilku dni, aby zainicjować apoptozę, gdy mitochondria uwolnią czynniki apoptogenne, takie jak cytochrom c do cytozolu 21,22, kaspazy mogą zostać aktywowane w ciągu 5 minut23,24, a następnie kondensacja cytoplazmatyczna i jądrowa w ciągu 10 minut25-27, a wkrótce potem śmierć komórki25-27. Aktywowane kaspazy koordynują apoptozę poprzez rozszczepianie i inaktywację kluczowych składników strukturalnych i funkcjonalnych w celu rozbiórki komórek2,28, takich jak inhibitor endonukleazy DFF45 / ICAD29,30. Kaspazy aktywują również czynniki proapoptotyczne, takie jak członek rodziny BCL-2 BID, który translokuje się do mitochondriów, aby promować mitochondrialne uwalnianie cytochromu c31,32. Aktywność kaspazy powoduje również ekspozycję powierzchni komórek na fosfatydyloserynę jako sygnał "zjedz mnie" w celu promowania pochłaniania umierających komórek przez makrofagi lub sąsiednie komórki poprzez fagocytozę33. Co więcej, zdarzenia apoptotyczne sprawiają, że mitochondria są dysfunkcyjne, zaburzając bioenergetykę komórkową i metabolizm34,35,36. W związku z tym wyzdrowienie z takiego zniszczenia wydaje się intuicyjnie mało prawdopodobne.
Wbrew pierwotnym oczekiwaniom, komórki mogą odwrócić proces apoptotycznej śmierci komórki nawet na późnym etapie. Poprzez ciągłe monitorowanie losu umierających komórek w hodowli, zaobserwowaliśmy odwracalność apoptozy w późnym stadium w szeregu pierwotnych komórek i linii komórkowych12,13. Usunięcie bodźca śmierci pozwoliło na powrót do zdrowia po jawnych cechach apoptozy, takich jak fragmentacja mitochondriów, kondensacja chromatyny, uszkodzenie DNA, pęcherzenie błony plazmatycznej, ekspozycja powierzchni komórki na fosfatydyloserynę, uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c, aktywacja kaspazy, fragmentacja jądrowa, kurczenie się komórek i tworzenie ciał apoptotycznych. Obserwacje te rodzą pytania bez odpowiedzi dotyczące funkcji, konsekwencji i mechanizmów anastazy. Aby odpowiedzieć na te pytania, warunkiem wstępnym jest wiarygodna identyfikacja komórek, które przeszły anastazę. W tym miejscu opisujemy metody mikroskopii na żywo i bioczujnik kaspazy do wykrywania komórek, które wcześniej odwróciły późne stadium apoptozy, a następnie przeżyły.

<table><tbody><tr><td>Mikroskopia konfokalna LSM780</td><td>Carl Zeiss</td> Naczynie do hodowli <td></td><td></td></tr><tr><td>ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 niezależne medium</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Czerwony CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjnie oznakowany aneksyn V</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (po grecku "wskrzeszenie do życia") odnosi się do odzyskiwania umierających komórek. Zanim komórki te wyzdrowieją, przeszły przez ważne punkty kontrolne apoptozy, w tym fragmentację mitochondriów, uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c do cytozolu, aktywację kaspaz, kondensację chromatyny, uszkodzenie DNA, fragmentację jądra, pęcherzenie błony plazmatycznej, kurczenie się komórek, ekspozycję powierzchni komórki na fosfatydyloserynę i tworzenie ciał apoptotycznych. Anastaza może wystąpić, gdy bodźce apoptotyczne są usuwane przed śmiercią, umożliwiając w ten sposób umierającym komórkom odwrócenie apoptozy i potencjalnie innych mechanizmów śmierci. Dlatego wydaje się, że anastaza obejmuje fizjologiczne procesy gojenia, które mogą również niewłaściwie podtrzymywać uszkodzone komórki. Funkcje i mechanizmy anastazy są nadal niejasne, częściowo utrudnione przez ograniczone narzędzia do wykrywania przeszłych zdarzeń po odzyskaniu pozornie zdrowych komórek. Strategie wykrywania anastazy umożliwią badania mechanizmów fizjologicznych, zagrożeń związanych z nieumarłymi komórkami w patologii choroby oraz potencjalnych środków terapeutycznych modulujących zespolenie. W tym miejscu opisujemy skuteczne strategie wykorzystujące mikroskopię żywych komórek i bioczujnik kaspazy ssaków do identyfikacji i śledzenia anastazy w komórkach ssaków.

Aby zbadać odwracalność apoptozy, komórki hodowli tkankowej są najpierw poddawane działaniu bodźca śmierci w celu wywołania apoptozy. Gdy komórki wykazują cechy charakterystyczne dla apoptozy, stosuje się świeżą pożywkę hodowlaną, aby wypłukać bodziec, a następnie inkubuje się obumierające komórki, aby umożliwić ich regenerację (Rysunek 1A). Kluczowym pytaniem badawczym jest tutaj to, jak daleko poszczególne obumierające komórki w hodowli mogą zaawansować w procesie apoptozy, by wciąż móc przejść anastaz...

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie i śledzenie odwrócenia procesu apoptotycznej śmierci komórki i hodowanych komórek za pomocą mikroskopii żywych komórek. Zdrowe komórki rozprzestrzeniają się na podłożu i zawierają rurkowate nitkowate mitochondria wokół jądra. Jednakże, gdy komórki popełniają samobójstwo w wyniku apoptozy, umierające komórki wykazują unikalne cechy morfologiczne, które wykrywają i śledzą odwrócenie apoptozy.Komórki są posiewane w naczyniach do hodowli komórek ze szklanym dnem. Następnym krokiem jest wykonanie barwienia żywych komórek w celu oznaczenia mitochondriów i jąder. Pozwala to na wykrycie cech morfologicznych komórek zdrowych i apoptotycznych.Za pomocą mikroskopii żywych komórek znakowane zdrowe komórki są następnie wystawiane na działanie bodźca śmierci w celu wywołania apoptozy. Po wykryciu apoptozy umierające komórki są myte, a następnie inkubowane ze świeżą pożywką do hodowli komórek, aby umożliwić regenerację komórek, obrazowanie żywych komórek służy do wykrywania i śledzenia odwrócenia apoptozy i jej konsekwencji, takich jak naprawa komórek i przeżycie, jak pokazano odpowiednio w odzyskiwaniu morfologicznym i migracji komórki. Apoptoza to rodza

strategies-for-tracking-anastasis-cell-survival-phenomenon-that

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek apoptotycznego raka piersi poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i dalsze wykrywanie przejścia komórek raka piersi niebędących komórkami macierzystymi do komórek podobnych do komórek macierzystych raka piersi po odwróceniu apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Opisano dokładną metodę oceny śmierci komórek. Protokół ten stanowi ulepszenie konwencjonalnych protokołów z użyciem Annexin V/jodku propidyny (PI), które wykazują do 40% wyników fałszywie dodatnich w liniach komórkowych i komórkach pierwotnych pochodzących z szerokiej gamy modeli zwierzęcych.

Zmodyfikowany test apoptozy z użyciem Annexin V i jodku propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórek

Poznaj metody wykrywania i śledzenia anastazy w komórkach ssaków za pomocą mikroskopii komórek żywych i biosensorów fluorescencyjnych. Technika ta pozwala obserwować odwrócenie apoptozy.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Przeglądaj więcej filmów