Name: Metody in vitro Test metylacji do badania metylacji białek argininy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj metodę in vitro do badania metylacji białek argininy przy użyciu transferaz PRMT. Technika obejmuje immunoprecypitację i analizę SDS-PAGE, umożliwiając wiarygodną ocenę aktywności enzymatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Nagrodę za Zasługi od Departamentu Spraw Weteranów Stanów Zjednoczonych oraz grant NIH R01CA138528 dla RW.

1. Przygotowanie konstrukcji wyrażeń
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem protokołu należy sklonować PRMT do wektorów ekspresyjnych ssaków z N-końcowym znacznikiem epitopu (Myc lub HA) oraz substratem w ramce z S-transferazą glutationu (GST) w celu ekspresji białek na wysokim poziomie i oczyszczenia z lizatów komórek bakteryjnych, przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie PRMT
<ol>
	<li>Użyj naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm, aby utrzymać ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (Beas2B). Przechodź komórki co 3 dni i nie pozwól im rosnąć do zgrywania.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewać 7,5 x 105 komórek w 10 ml pożywki hodowlanej w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm. Obracać w celu równomiernego rozproszenia komórek i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% nawilżonym roztworem CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 5 ml pożywki hodowlanej bez surowicy i antybiotyków. Zawirować i zassać pożywkę. Powtórz ten krok jeszcze raz, a na koniec dodaj 5 ml surowicy/pożywki wolnej od antybiotyków i przystąp do transfekcji.</li>
	<li>Rozcieńczyć 6 μg plazmidowego DNA w 750 μl pożywki wolnej od surowicy w sterylnej probówce wirówkowej z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>W innej plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 30 μl odczynnika do transfekcji w 750 μl pożywki wolnej od surowicy.</li>
	<li>Przenieść rozcieńczony roztwór odczynnika do transfekcji (krok 2.5) do probówki zawierającej rozcieńczone DNA (krok 2.4). Delikatnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Mieszaninę transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Po 15 minutach delikatnie odpipetować mieszaninę transfekcji na komórki, zamieszać do równomiernego wymieszania i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% wilgotnym inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Po 3 godzinach odessać pożywkę zawierającą mieszaniny transfekcji z komórek. Dodaj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną surowicą i antybiotykami.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% nawilżonym roztworem CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach poddać komórki lizie w 1 ml buforu do lizy (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu i 1 μg/ml fluorku fenlymetylosulfonylu). Zebrać lizaty do plastikowej probówki wirówkowej z podnośnikiem do komórek i inkubować lizaty na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować lizaty przy 15 000 x g przez 10 minut na wirówce stołowej, aby usunąć lizaty z resztek komórkowych. [* Zdecydowanie zaleca się potwierdzenie ekspresji HA-PRMT1 poprzez immunoblotting podwielokrotności lizatów przeciwciałami anty-HA, przed przystąpieniem do oczyszczania enzymów do testu metylacji.]</li>
	<li>W celu oczyszczenia PRMT inkubować 3 mg lizatów komórkowych z 30 μl zawiesiny matrycy powinowactwa anty-HA w proporcji 50:50 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i obracać przez noc w temperaturze 4 °C w rotatorze probówkowym.</li>
	<li>Następnego dnia wiruj probówki o masie 14 000 x g na wirówce stołowej przez 2 minuty, aby zebrać kulki. Odrzucić supernatant i przepłukać kulki 3x 1 ml buforu RIPA [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA i 1% Triton-X-100] w każdym płukaniu, a następnie odwirować przy 14 000 x g przez 2 min. Po trzecim płukaniu przemyć kulki raz 100 μl buforu metylacyjnego (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM β-merkaptoetanolu, 100 mM sacharozy). Po odwirowaniu usunąć supernatant. Kulki zawierające unieruchomione PRMT są gotowe do użycia w teście metylacji. [* Zdecydowanie zaleca się użycie unieruchomionych PRMT natychmiast w teście metylacji.]</li>
</ol>
3. Oczyszczanie podłoża
<ol>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię GST-G3BP1 przekształconą BL21 w 5 ml pożywki Luria-Bertani (LB) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
	<li>Następnego dnia przenieś kulturę na noc do 50 ml świeżej pożywki LB i kontynuuj wzrost do OD600 0,5-0,7 (zajmuje to około 2 godzin).</li>
	<li>Gdy OD600 osiągnie 0,5-0,7, dodać izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM i kontynuować hodowlę przez dodatkowe 4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 1 500 x g przez 10 minut i przetworzyć granulki do oczyszczenia GST lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 5 ml buforu do lizy (1x PBS z inhibitorami proteazy, 100 μg/ml lizozymu i 0,1% Triton-X-100) i inkubować lizaty w temperaturze 37 °C przez 30 min. W tym czasie lizaty będą wydawać się mętne i lepkie z powodu uwalniania bakteryjnego genomowego DNA.</li>
	<li>Ścinanie genomowego DNA metodą sonikacji (10 impulsów po 1 sekundę każdy, o amplitudzie 30%).</li>
	<li>Oczyścić lizaty przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 10 minut i przenieść klarowny supernatant do probówki o pojemności 15 ml. Jeśli supernatant nie jest klarowny, powtórzyć proces wirowania jeszcze raz.</li>
	<li>W międzyczasie umyj koraliki sefarozy GST dwukrotnie lodowatym PBS i przygotuj zawiesinę sefarozy GST w stosunku 50:50 w PBS. Dodać 200 μl zawiesiny sefarozy GST do oczyszczonego lizatu komórek bakteryjnych i obracać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po 1 godzinie odwirować probówki o sile 500 x g przez 3 minuty, aby zebrać kulki. Umyj koraliki 3x lodowatym PBS.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutationu) i obracać w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 15 000 x g przez 2 minuty i przenieść supernatant zawierający oczyszczone białko do innej probówki wirówkowej z tworzywa sztucznego. Przeprowadzić analizę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) na 5 μl oczyszczonego białka wraz ze znanymi ilościami albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu oszacowania stężenia oczyszczonego białka.</li>
</ol>
4. Test metylacji
UWAGA: Wykonaj następujące kroki w oddzielnym obszarze przeznaczonym do pracy z radioizotopami i zgodnie z protokołami instytucji dotyczącymi przeprowadzania eksperymentów z izotopami promieniotwórczymi.
<ol>
	<li>Dodać 2 μg oczyszczonego substratu GST i mieszaninę główną zawierającą 1x bufor metylacyjny (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM β-merkaptoetanolu, 100 mM sacharozy), 1 μCi S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioniny i wodę do końcowej objętości 10 μl do unieruchomionych PRMT (etap 2.13) i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po 1 godzinie zatrzymać reakcję, dodając 10 μl 2x buforu próbki SDS. Po denaturacji próbek w temperaturze 95 °C przez 10 minut, należy rozdzielić próbki na żelu SDS-PAGE.</li>
	<li>Następnie przenieś oddzielone białka z żelu SDS na membranę nitrocelulozową za pomocą półsuchego transferu elektroforetycznego.</li>
	<li>Po transferze przykryj membranę autofluorem (wzmacniaczem obrazu autoradiograficznego) i delikatnie kołysz przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po 2 godzinach odlej autofluor i zachowaj do późniejszego wykorzystania. [*Oznacz rurkę jako materiał radioaktywny]</li>
	<li>Szybko wysuszyć membranę na bibule filtracyjnej, zamknąć ją w plastikowej torbie i naświetlić membranę na kliszy rentgenowskiej w temperaturze -20 °C. Wystarczający czas ekspozycji wynosi od 5 do 30 dni.</li>
</ol>
5. Potwierdzenie ekspresji PRMT i równego obciążenia substratu
<ol>
	<li>Po osiągnięciu wystarczającej ekspozycji przenieś membranę do plastikowego pudełka zawierającego bufor blokujący [sól fizjologiczna buforowana Tris z Tween-20 (TBST + 3% beztłuszczowego mleka)] i delikatnie kołysaj przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący wraz z odpadami promieniotwórczymi. Inkubować błonę z przeciwciałem anty-HA (rozcieńczenie 1:1 000) w TBST przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Przemyć membranę TBST 3x i inkubować membranę z wtórnym przeciwciałem anty-mysim znakowanym HRP (rozcieńczenie 1:5 000) w TBST w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym kołysaniem.</li>
	<li>Po 1 godzinie przemyć membranę TBST 3x i przeprowadzić detekcję chemiluminescencyjną białek za pomocą substratu HRP.</li>
	<li>Po wykryciu PRMT znakowanych HA należy inkubować membranę z roztworem barwiącym Ponseau-S przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Szybko umyj membranę 3x wodą, aby wykryć podłoża oznaczone GST. Zeskanuj obraz.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół opisany w niniejszym dokumencie jest rutynowo stosowany do ustalenia statusu metylacji zidentyfikowanych substratów PRMT. Ten solidny i spójny test dostarczy również ostatecznych dowodów na specyficzność PRMT w odniesieniu do ich substratów. Kluczowymi elementami sukcesu tego testu są: 1. Ekspresja PRMT w komórkach ssaków, 2. Aktywność oczyszczonych PRMT, 3. Ekspresja i oczyszczanie substratu oraz 4. Całkowity zachodni transfer białek do błony nitrocelulozowej.
Rekombinowane PRMT wyra...

Metylacja białek została po raz pierwszy opisana w 1968 roku1. Dopiero pierwsze sklonowanie PRMT1 w 1996 roku sprawiło, że naukowcy zaczęli doceniać znaczenie tej potranslacyjnej modyfikacji2. Co ciekawe, około 2% reszt argininy w białkach ekstraktów jądrowych jest metylowanych3, co wskazuje na obfitość tej modyfikacji. Arginina jest dodatnio naładowanym aminokwasem z zasadowym łańcuchem bocznym, a azot / azot w łańcuchach bocznych argininy może być modyfikowany potranslacyjnie poprzez dodanie grupy metylowej, proces znany jako metylacja argininy4-6. Metylacja argininy jest katalizowana przez klasę enzymów, a mianowicie metylotransferazy białkowe argininy (PRMT). Argininy mogą być monometylowane lub dimetylowane, przy czym te ostatnie mogą być symetryczne lub asymetryczne w zależności od rodzaju PRMT katalizujących proces4-6.
Białka, które wykazują motywy bogate w argininę i glicynę, są potencjalnymi celami dla katalizy za pośrednictwem PRMT. Wykazano, że metylacja substratów za pośrednictwem PRMT moduluje interakcję białko-białko, interakcję białko-kwas nukleinowy, funkcję białka, ekspresję genów i / lub sygnalizację komórkową, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla normalnej homeostazy komórkowej7-9. Aby zrozumieć biologiczną rolę metylacji argininy białek, wymagane są precyzyjne, wydajne i powtarzalne testy w celu ustalenia stanu metylacji zidentyfikowanych substratów PRMT.
Test metylacji in vitro, który ocenia zdolności oczyszczonych PRMT do katalizowania metylacji ich substratów, jest dobrze akceptowanym testem do badania metylacji argininy10-12. Ogólny sukces tego testu zależy w dużej mierze od aktywności oczyszczonych PRMT. PRMT mogą być eksprymowane i oczyszczane z komórek bakterii lub ssaków10,11. Ten test metylacji in vitro, jak szczegółowo opisano w sekcji protokołu, opiera się na metodzie pierwotnie opisanej przez Tini i współpracowników10. W tym protokole szczegółowo pokazujemy etapy związane z ekspresją i oczyszczaniem PRMT1 w komórkach ssaków. Zdolność oczyszczonego PRMT1 do katalizowania metylacji białka wiążącego białko aktywujące Ras-GTPazę 1 (G3BP1), znanego substratu PRMT8, oceniono później w obecności S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioniny jako donora metylu. Korzystając z tego testu, możemy wiarygodnie określić zdolność PRMT do metylacji nowych lub znanych substratów, co jest podstawowym krokiem w badaniu metylacji białek argininy.

<table><tbody><tr><td>S-adenozylo-L-[metylo-3H] metionina</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik butelkowy</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Fiolki scyntylacyjne</td><td>National Diagnostics</td><td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharoza</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutation Reduced</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matryca powinowactwa anty-HA</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad żel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-HA</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody in vitro test metylacji do badania metylacji białek argininy

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Metylacja argininy białka jest jedną z najpowszechniejszych modyfikacji potranslacyjnych w jądrze. Metylację białka argininy można zidentyfikować i/lub określić za pomocą podejść proteomicznych i/lub immunoblottingu za pomocą przeciwciał specyficznych dla metylo-argininy. Jednak techniki te czasami mogą być mylące i często dają fałszywie dodatnie wyniki. Co najważniejsze, techniki te nie mogą dostarczyć bezpośrednich dowodów na poparcie specyficzności substratu PRMT. Z drugiej strony testy metylacji in vitro są użytecznymi testami biochemicznymi, które są czułe i konsekwentnie ujawniają, czy zidentyfikowane białka są rzeczywiście substratami PRMT. Typowy test metylacji in vitro obejmuje oczyszczone, aktywne PRMT, oczyszczony substrat i znakowany radioizotopem donor metylu (S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioninę). Tutaj opisujemy krok po kroku protokół izolacji katalitycznie aktywnego PRMT1, wszechobecnego członka rodziny PRMT. Aktywność metylotransferazy oczyszczonego PRMT1 została później przetestowana na białku wiążącym białko aktywujące Ras-GTPazę 1 (G3BP1), znanym substraencie PRMT, w obecności S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioniny jako donora metylu. Protokół ten może być wykorzystany nie tylko do ustalenia stanu metylacji nowych fizjologicznych substratów PRMT1, ale także do zrozumienia podstawowego mechanizmu metylacji białek argininy.

Zdolność HA-PRMT1 do metylowania GST-G3BP1 określono za pomocą testu metylacji in vitro. W reakcji metylacji, w której jako donor grup metylowych zastosowano GST-G3BP1 oraz 1 μCi S-adenozylo-L-[metyl-3H]metioniny, wykorzystano HA-PRMT1 oczyszczone z lizatów komórek Beas2B. PRMT1 efektywnie katalizowało metylację GST-G3BP1 (Rycyna 1, panel górny). Reakcje metylacji z wykorzystaniem pull-down przeprowadzonych na lizatach komórek Beas2B przetransfekowanych pustym wektorem posłużyły jako ...

Metylacja argininy białek, katalizowana przez klasę enzymów, tj. metylotransferazy białkowe argininy (PRMT), to proces enzymatycznego dodawania grup metylowych do arginin w białkach. Test metylacji in vitro jest najbardziej wiarygodnym narzędziem do oceny stanu metylacji znanych lub nowych substratów PRMT.

Metody in vitro Test metylacji do badania metylacji białek argininy

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie stanu metylacji białka metylotransferazy argininy lub substratów PRMT. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję PRT znakowanych epitopami w komórkach ssaków. P RMT są następnie immunoprecytowane z lizatów komórkowych przy użyciu prędkości SRO pokrytych antyhemaglutyniną lub anty HA, a następnie poddawane intensywnemu płukaniu w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek.Następnie umyte kulki są inkubowane z białkiem substratu oczyszczonym z bakterii i trytu znakowanym L-metioniną ślimaka lub samem. Na koniec reakcja zostaje zatrzymana, a stan metylacji substratu określa się za pomocą siarczanu sylu sodu, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym lub analizy strony SDS, a następnie automatycznej radiografii. Ostatecznie zdolność p RMT do metylacji substratu określa się poprzez porównanie reakcji metylacji przy użyciu immunoprecypitacji przeprowadzonej na lizatach pustych komórek wektorowych i transfekowanych BRMT.Podejścia proteomiczne lub immunoblotting za pomocą przeciwciał specyficznych dla metyloargininy mogą czasami być mylące, często dając fałszywe wyniki pocztowe. Co najważniejsze, nie mogą one dostarczyć bezpośrednich dowodów na poparcie specyficzności substratów PRMT. Główną zaletą testu metylacji in vitro, który zademonstruję w tym filmie, jest to, że jest czuły i konsekwentnie ujawnia, czy zidentyfikowane białka, w których substraty PRMT W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewają 750 000 ludzkich komórek nabłonka oskrzeli w 10 mililitrach pożywki hodowlanej.W 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym zakręć naczyniem, aby równomiernie rozproszyć komórki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% wilgotnym inkubatorze CO2. Następnego dnia odessać pożywkę i dodać pięć mililitrów pożywki hodowlanej bez surowicy i antybiotyków, zawirować i odessać pożywkę. Powtórz ten krok jeszcze raz i na koniec dodaj pięć mililitrów surowicy wolnej od antybiotyków pożywki i przystąp do transfekcji.Aby wykonać transfekcję, najpierw rozcieńcz sześć mikrogramów plazmidowego DNA PRMT w 750 mikrolitrach wolnego podłoża surowicy w sterylnej 1,5-mililitrowej plastikowej probówce wirówkowej w innej 1,5-mililitrowej plastikowej probówce wirówkowej. Rozcieńczyć 30 mikrolitrów odczynnika do transfekcji w 750 mikrolitrach pożywki wolnej od surowicy. Następnie przenieś rozcieńczony roztwór odczynnika do transfekcji do probówki zawierającej rozcieńczone DNA, delikatnie mieszając pipetowanie w górę i w dół.Inkubować mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie delikatnie odpipetuj mieszaninę transfekcji na komórki i obracaj, aby równomiernie wymieszać. Po trzygodzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza odessać z komórek pożywkę zawierającą mieszaniny transfekcji.Następnie dodaj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną surowicą i antybiotykami. Po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza komórki liku w jednym mililitrze buforu do lizy. Zebrać lizaty na plastikową probówkę wirówkową z podnośnikiem komórek.Następnie inkubuj lizaty na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować. Lizaty w temperaturze 15 000 GS przez 10 minut na wirówce stołowej.Aby usunąć lizaty z resztek komórkowych w celu oczyszczenia P mts. Inkubować trzy miligramy lizatów komórkowych z 30 mikrolitrami 50 do 50 zawiesiny matrycy powinowactwa anty HA w buforze fosforanu soli fizjologicznej. Lub PBS obraca się przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w rotatorze rurowym.Następnego dnia wiruj probówki w temperaturze 14 000 GS na wirówce stołowej przez dwie minuty, aby zebrać kulki. Po wyrzuceniu snat, umyj kulki jednym mililitrem buforu RIPA, a następnie odwiruj jak poprzednio. Po trzykrotnym umyciu kulek buforem RIPA, należy przepłukać kulki raz 100 mikrolitrami buforu metylacyjnego.Po odwirowaniu usunąć supernatant. Kulki zawierające unieruchomione p RMT są gotowe do użycia w teście metylacji. Przeprowadzić test metylacji w oddzielnym obszarze przeznaczonym dla izotopu promieniotwórczego.Praca zgodnie z protokołami instytucji dotyczącymi pracy z izotopami promieniotwórczymi. Przygotować oczyszczony glutation, s transferazę lub substrat GST zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Połączyć dwa mikrogramy z mieszanką wzorcową zawierającą jeden x bufor metylacyjny i mikrokiurię L metioniny ślimaka znakowanej tridium.Dodać mieszaninę do unieruchomionych p RMT i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez godzinę. Po godzinie przerwij reakcję, dodając 10 mikrolitrów dwóch XSDS. Bufor próbki po denaturacji próbek w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.Oddziel próbki według strony SDS później. Przenieść oddzielone białka z żelu SDS na membranę nitrocelulozową za pomocą półsuchego transferu elektroforetycznego. Po transferze należy pokryć membranę obrazem radiologicznym z autem.Wzmacniacz i delikatnie kołysz przez dwie godziny w temperaturze pokojowej Po dwóch godzinach odlej wzmacniacz i zachowaj do późniejszego użycia. Szybko wysusz membranę na bibule filtracyjnej, zamknij ją w plastikowej torbie i wystaw membranę na folię rentgenowską w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wystarczające czasy ekspozycji wahają się od pięciu do 30 dni.Po osiągnięciu wystarczającej ekspozycji przenieś membranę do plastikowego pudełka zawierającego bufor blokujący i delikatnie kołysz przez godzinę. Usunąć bufor blokujący wraz z odpadami promieniotwórczymi. Następnie inkubować błonę z przeciwciałem anty HA w T tris, buforowanym roztworze soli fizjologicznej z dwoma 20, skróconym TBST przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym kołysaniem następnego dnia.Umyj membranę trzykrotnie TBST. Następnie inkubować błonę z peroksydazą chrzanowego znakowaną anty mysim przeciwciałem drugorzędowym w TBST w temperaturze pokojowej przez godzinę z delikatnym kołysaniem. Po trzykrotnym przemyciu membrany TBST, przeprowadzić detekcję chemiluminescencyjną białek substratem peroksydazy chrzanowej po wykryciu znacznika HA P RMT.Inkubuj membranę z roztworem barwiącym poncho S przez pięć minut. W temperaturze pokojowej szybko umyj membranę trzykrotnie wodą przed zeskanowaniem obrazu. Aby wykryć substraty oznaczone GST, za pomocą testu metylacji in vitro określono zdolności znacznika HA PMT 1 do metylacji GST znacznika G 3 PP.HA TAG prm T jeden oczyszczony z komórki B2B. Lizaty zastosowano w reakcji metylacji zawierającej GSTG trzy, jeden BP i jeden mikro curry L metioniny ślimaka znakowanej trytem. Jako donor metylu, p MT można skutecznie katalizować metylację reakcji metylacji GS TG three BP one za pomocą pulldownów wykonywanych na lizatach pustego wektora.Transfekowane komórki B2B służyły jako kontrola negatywna. Immuno blotting przeciwciałami anty HA potwierdził ekspresję p rmt. Następnie zastosowano jedno barwienie ponchos, aby wykazać równe obciążenie GSTG, trzy BP jeden w obu reakcjach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić test metylacji in vitro.

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie i ilościowy pomiar wolnych i związanych z białkami argininy i metylo-arginin za pomocą spektroskopii 1H-NMR.

Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Imprinting jest zjawiskiem występującym w reprodukcji roślin i ssaków. Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w mechanizmach imprintingu. Izolacja endospermy oraz określenie stanu metylacji genów podlegających imprintingowi u Arabidopsis mogą być trudne. W niniejszym protokole opisujemy, jak izolować endospermę i określać poziom metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

W niniejszym artykule przedstawiono prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta na oddziaływaniu między kulkami magnetycznymi a białkami z markerem (np. nanociałami) z jednej strony oraz na powinowactwie między białkiem z markerem a drugim, znakowanym białkiem (np. poliovirus) z drugiej strony.

Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

Poznaj metodę in vitro do badania metylacji białek argininy przy użyciu transferaz PRMT. Technika obejmuje immunoprecypitację i analizę SDS-PAGE, umożliwiając wiarygodną ocenę aktywności enzymatycznej.

Metody in vitro Test metylacji do badania metylacji białek argininy

Przeglądaj więcej filmów