Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie dużych ilości komórek ssaków. Osiąga się to poprzez najpierw kalibrację pH i tlenu rozpuszczonego lub sond DO, a następnie autoklawowanie sond pH, DO i tulei sondy temperatury. Drugim krokiem jest włożenie sond i tulei do naczynia i umieszczenie naczynia na bioreaktorze oraz podłączenie wydechu, filtra, przewodów gazowych i sondy temperatury.

Następnym krokiem jest podłączenie przewodów tlenu rozpuszczonego i pH oraz aseptyczne połączenie medium i mikronośników, które są pompowane do bioreaktora. Ostatnim krokiem jest uruchomienie sterowników, aby upewnić się, że bioreaktor osiąga pożądaną prędkość wirnika, temperaturę i nasycenie tlenem. Ostatecznie, po zaszczepieniu i monitorowaniu komputerowym, kultura może zostać przetworzona w celu ekstrakcji i oczyszczenia pożądanego produktu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak bioreaktor z mieszadłem wielokrotnego użytku, jest to, że bioreaktor z kołem powietrznym jest łatwy w użyciu i minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Zacznijmy. Aby rozpocząć protokół, zaloguj się do ekranu powitalnego.

Następnie sprawdź czujnik pH i upewnij się, że końcówka czujnika jest wypełniona roztworem elektrolitu. Zaopatrzyć się w jedną zlewkę z roztworem o pH czterowym, drugą zlewkę z roztworem o pH 7 i butelkę do mycia wodą destylowaną. Następnie podłącz pH do czujnika pH.

Przejdź do karty akcji w interfejsie hello, wybierz pozycję kalibruj. Następnie wybierz zakładkę PHA i kalibrację dwupunktową. Wprowadź temperaturę buforu w polu temperatury roztworu kalibracyjnego.

Umieść czujnik w roztworze pH cztery, aby skalibrować Wprowadź wartość w polu zerowym. Gdy wykres się ustabilizuje, popchnij, skalibruj i przepłucz czujnik pH wodą destylowaną. Powtórz kalibrację dla pH siedem i zapisz ustawienia.

Wprowadź wartość bufora w polu zakresu i poczekaj, aż przeszczep się ustabilizuje. Aby rozpocząć rozpuszczony tlen lub przeprowadzić kalibrację. Upewnij się, że czujnik DO był podłączony do systemu przez kilka godzin i został spolaryzowany na karcie kalibracji, wybierz DOA i kalibrację dwupunktową.

Odłącz czujnik tlenu rozpuszczonego. Wprowadź zero w zakładce zero i poczekaj, aż wykres się ustabilizuje. Przed wybraniem opcji kalibracji podłącz ponownie czujnik do i wprowadź 100 w polu zakresu.

Gdy wykres się ustabilizuje, kliknij przycisk kalibruj dwa. Następnie zapisz ustawienia i zamknij program. Po kalibracji umieść czujniki i studzienkę termiczną w woreczkach autoklawu i sterylizuj je w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 PSI.

Po zakończeniu autoklawu zdezynfekuj woreczki autoklawu 70% alkoholem izopropylowym i przenieś woreczki do szafy bezpieczeństwa biologicznego lub BSC. Zdezynfekuj i wprowadź naczynie z odczynnikiem do BSC. Wyjmij opakowanie wewnętrzne i sprawdź, czy naczynie i rurki nie są uszkodzone.

Następnie zainstaluj czujnik tlenu rozpuszczonego w lewym przednim porcie naczynia z odczynnikiem, a studzienkę termiczną w lewym tylnym porcie. Zainstaluj czujnik pH w prawym przednim porcie, aby zainstalować. Otwórz nasadkę czujnika i delikatnie wkręć czujnik w port na górze naczynia.

Następnie przenieś naczynie z BSC. Upewnij się, że czujnika pH i tlenu rozpuszczonego znajdują się na zewnątrz tulei naczynia i nic nie znajduje się w tulei. Przytrzymaj naczynie tak, aby być skierowanym do przodu i wsuń nóżki naczynia najpierw do rękawa.

Upewnij się, że dno naczynia spoczywa na grzejnikach. Następnie ostrożnie zamontuj czujnik temperatury w naczyniu termicznym. Studnia. Następnie wyjmij zestawy wężyków z torby.

Dopasuj kodowanie kolorystyczne na rurce do odpowiednich złączy i pomp w jednostce sterującej bioreaktora. Poprowadź przewody dodawania i pobierania próbek pożywki za czujnikiem tlenu rozpuszczonego i czujnikiem termicznym. Dobrze włóż rurkę do pompy oznaczonej kolorami po lewej stronie bioreaktora.

Podłącz główną i mikro linię gazową. Wciśnij złącze głównego przewodu gazowego do wylotu gazu, aby zainstalować główny przewód gazowy. Następnie przekręć złącze mikroprzewodu gazowego zgodnie z ruchem wskazówek zegara do wylotu gazu, aby zainstalować mikroprzewód gazowy.

Aby zainstalować rurkę piekarnika z filtrem, otwórz piekarnik filtrujący i przymocuj rurkę filtra wylotowego do uan. Upewnij się, że rurka przechodzi przez dwa haczyki do filtra i wyjmuje z piekarnika. Przeprowadź dolną linię przez haczyk w dolnej części piekarnika filtrującego i zamknij drzwiczki.

Następnie podłącz do czujników tlenu rozpuszczonego i pH. Po zakończeniu instalacji utwórz sterylne połączenie za pomocą łączników przynęty między nieużywaną żyłką Medium Edition a źródłem średniej torby na butelkę. Przejdź do zakładki akcji w interfejsie Hello.

Kliknij opcję Sterowanie pompami, wybierz opcję Pompa mediów, a następnie kliknij suwak, aby włączyć pompę mediów. Następnie dodaj od 1,5 do 3,0 litra pożywki i kliknij suwak, aby wyłączyć pompę. System jest teraz gotowy do pompowania do reaktora wcześniej przygotowanych mikronośników.

Można je dodać za pomocą linii dodawania. Przymocuj butelkę MICROCAR do odpowiedniej linii dodatkowej za pomocą sterylnego zamka na przynętę. Włącz pompę dodającą na ekranie pompy sterującej.

Po dodaniu mikronośników wyłącz pompę za pomocą suwaka, wróć do ekranu głównego w interfejsie hello, wybierz akcje, a następnie zaawansowane. Wybierz odpowiedni kontroler, aby edytować ustawienia. Ustaw kontrolery na auto i wprowadź nastawy.

Po ustawieniu sterowników włącz pompę powietrza. Zajrzyj do naczynia na odczynnik, aby upewnić się, że koło powietrzne się obraca. Upewnij się, że czujnik tlenu rozpuszczonego jest w pełni spolaryzowany i że wartość do ustabilizowała się.

Następnie skalibruj formę czujnika do, sterylne połączenie między nieużywaną linią dodawania pożywki oznaczoną jednym pomarańczowym paskiem a źródłem worka na butelkę z komórkami za pomocą łączników przynęty. Następnie zainstaluj silikonową część rurki w pompie mediów. Upewnij się, że rurka clamp jest otwarty i że rozgałęziony przewód clamp jest zamknięty.

Przejdź do zakładki pompy sterującej, a następnie włącz pompę mediów. Dodaj ogniwa i wyłącz pompę pożywki. Po zaszczepieniu przejdź do zakładki akcji i wybierz opcję pobierz próbkę.

Upewnij się, że przewód do pobierania próbek znajduje się w pompie do pobierania próbek i manipuluj kurkiem odcinającym pobieranie próbek zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Wyjąć strzykawkę z próbką w celu zliczenia komórek, a inne dalsze aplikacje wykonują zliczanie komórek. Wreszcie, gdy komórki osiągną pożądaną gęstość 1,2 razy 10 do sześciu komórek na mililitr, septycznie dodaj inokulum wirusa do 20-mililitrowej strzykawki.

Podłączyć strzykawkę do zapasowego portu dodawania w reaktorze. Użyj ekranu pompy sterującej, aby włączyć pompę addycyjną i dodać inokulum wirusa. Większość komórek A 5 49 przylegała do mikronośników w ciągu dwóch godzin.

Po 12 godzinach komórki wykazywały oznaki spłaszczania i rozprzestrzeniania się na powierzchni mikrosamochodu. Po 24 godzinach mikronośniki wykazywały równomierny rozkład komórek. Kolonizacja mikrosamochodów zachodzi szybko, jak pokazano tutaj.

Procent kolonizacji mikrosamochodów przez 54 9 komórek wynosi 75% do 24 godzin. Ten wykres pokazuje liczbę zdolnych do życia komórek 54 9 w hodowli przed i po zakażeniu adenowirusem. Komórki nadal rosną wykładniczo do 1 miliona komórek na mililitr po 48 godzinach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zmontować i obsługiwać bioreaktor z kołem powietrznym do hodowli komórek ssaków o dużej gęstości do produkcji komórkowej lub białkowej. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.