Name: Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek ssaków w jednorazowym bioreaktorze pneumatycznym. Protokół obejmuje kalibrację czujników, montaż systemu i kontrolę parametrów wzrostu komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był częściowo wspierany przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa, Biuro Rektora poprzez Gateway Science Initiative.

1. Zaloguj się
<ol>
	<li>Włącz bioreaktor. Kliknij w dowolnym miejscu, aby otworzyć stronę logowania. Wybierz nazwę użytkownika i wprowadź hasło, a następnie kliknij "Zaloguj się".</li>
</ol>
2. Kalibracja
<ol>
	<li>Skalibruj czujnik pH (2 punkty przed autoklawowaniem).</li>
	<li>Sprawdź czujnik pH i upewnij się, że końcówka czujnika jest wypełniona roztworem elektrolitu. Przygotować dwie zlewki z roztworami kalibracyjnymi pH (elektrolitem) o pH 4 i pH 7 i mieć pod ręką butelkę do mycia z wodą destylowaną.</li>
	<li>Podłącz pH do czujnika pH. Przejdź do zakładki "Akcje" w interfejsie Hello i kliknij "kalibruj". Wprowadź temperaturę bufora w polu Temp roztworu kalibracyjnego.</li>
	<li>Umieść czujnik pH w buforze 1 (pH 4) i wprowadź wartość w polu "zero". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk "kalibruj 1". Wypłucz czujnik pH wodą destylowaną.</li>
	<li>Umieść czujnik w buforze 2 (pH 7). Wprowadź wartość bufora 2 w polu "span". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk kalibracji 2.</li>
	<li>Kliknij "Zapisz", a następnie kliknij "Zamknij".</li>
	<li>Skalibruj czujnik tlenu rozpuszczonego (DO).</li>
	<li>Upewnij się, że czujnik tlenu rozpuszczonego został spolaryzowany, podłączając go do systemu na kilka godzin. Przejdź do zakładki "Akcje" w interfejsie Hello i kliknij kalibruj. Kliknij przycisk "DO A".</li>
	<li>Odłącz czujnik tlenu rozpuszczonego i wprowadź 0 w polu "zero". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk "Kalibruj 1".</li>
	<li>Podłącz ponownie czujnik tlenu rozpuszczonego i wprowadź 100 w polu "Zakres". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk "Kalibruj 2".</li>
	<li>Kliknij "Zapisz", a następnie kliknij "zamknij".</li>
</ol>
3. Autoklaw i instalacja czujników i naczyń z odczynnikami
<ol>
	<li>Po kalibracji umieścić czujniki i studzienkę termiczną w torebkach autoklawu i autoklawie na 30 minut w temperaturze 121 °C, 15 psi.</li>
	<li>Zdezynfekuj woreczki autoklawu 70% alkoholem izopropylowym (IPA) i przenieś woreczki do szafy bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Usunąć zewnętrzne opakowanie naczynia.</li>
	<li>Zdezynfekuj opakowanie wewnętrzne za pomocą 70% IPA i przenieś naczynie do szafy bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Usuń opakowanie wewnętrzne i sprawdź naczynie i rurki pod kątem uszkodzeń powstałych podczas transportu.</li>
	<li>Zainstaluj czujniki pH i tlenu rozpuszczonego w dwóch przednich portach. Zamontuj studzienkę termiczną w lewym tylnym porcie. Otwórz nasadkę czujnika.</li>
	<li>Przeprowadź czujnik przez port czujnika. Mocno wkręć czujnik w port.</li>
	<li>Statek transferowy z BSC.</li>
	<li>Zawieś czujnika tlenu rozpuszczonego i pH na zewnątrz tulei naczynia i sprawdź, czy nic nie znajduje się w tulei. Wsuń naczynie do rękawa, stopami do przodu.</li>
	<li>Ostrożnie włóż czujnik temperatury do studzienki termicznej naczynia. Upewnij się, że dno naczynia opiera się o grzejniki.</li>
	<li>Wyjmij zestawy wężyków z ich toreb. Dopasuj kody kolorystyczne na rurkach do odpowiednich złączy i pomp na jednostce sterującej bioreaktora.</li>
	<li>Zamontuj główny przewód gazowy, wciskając złącze do wylotu gazu. Zamontuj mikroprzewód gazowy, przekręcając złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara do wylotu gazu. Zamontuj rurkę filtra wylotowego:</li>
	<li>Otwórz piekarnik z filtrem. Zamocuj filtr wylotowy na kanale U tak, aby jego rurka przechodziła przez dwa haczyki do filtra i wyjmowała z piekarnika.</li>
	<li>Zamontuj rurkę za pomocą worka skraplacza w uchwycie na przewody. Zamknij drzwi.</li>
	<li>Poprowadź linie dodawania A i B, obie linie mediów oraz linię pobierania za czujnikiem tlenu rozpuszczonego i na stół obok jednostki sterującej bioreaktora.</li>
	<li>Podłącz do czujników tlenu rozpuszczonego i pH.</li>
</ol>
4. Dodawanie nośników średnich i mikronośników
<ol>
	<li>Przejdź do zakładki "akcje" i kliknij "Sterowanie pompami" w interfejsie komputera.</li>
	<li>Utwórz sterylne połączenie między nieużywaną linią dodawania pożywki (1 pomarańczowa opaska) a źródłem pożywki w butelce/worku, przyspawan rurki lub używając złączek Luer.</li>
	<li>Kliknij suwak, aby włączyć pompę mediów. Kliknij suwak, aby wyłączyć pompę mediów po dodaniu żądanej ilości medium.</li>
	<li>Umieść kulki mikronośne w Ca2+, Mg2+ wolnym PBS na 3 godziny w RT.</li>
	<li>Umyj koraliki kilkakrotnie za pomocą Ca2+, Mg2+ free PBS.</li>
	<li>Autoklaw przez 15 min w temperaturze 115 °C, 15 psi. 
	UWAGA: W tym eksperymencie dodaj 3 g/L (suchą masę).</li>
	<li>Wpompować do reaktora mikronośniki, które zostały uwodnione, umyte i autoklawowane w taki sam sposób, w jaki pożywka została dodana w kroku 4.1.</li>
</ol>
5. Równoważenie i jednopunktowa kalibracja DO
<ol>
	<li>Ustaw sterowniki w pozycji Auto i wprowadź żądane wartości zadane. W tym przypadku należy użyć nastawy mieszania (SP) = 15 obr./min, temperatury SP = 37,0 °C, pH = 7,2, DO = 100%. Poczekaj, aż parametry się zrównoważą.</li>
	<li>Upewnij się, że czujnik jest w pełni spolaryzowany. Upewnij się, że obecna wartość DO ustabilizowała się.</li>
	<li>Przejdź do zakładki "Akcje" i kliknij "kalibruj". Kliknij "DO A", kliknij "Jeden punkt".</li>
	<li>Wpisz "100" w polu "Rozpiętość". Kliknij przycisk "Kalibruj 1", kliknij "Zapisz" i kliknij "Zamknij":</li>
</ol>
6. Rozpoczynanie biegu
<ol>
	<li>Przejdź do zakładki Akcje. Kliknij "Partia". Użyj klawiatury ekranowej lub klawiatury zewnętrznej, aby wprowadzić nazwę partii o długości do 16 znaków.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Ukryj" na klawiaturze ekranowej. Kliknij "Rozpocznij partię", potwierdź, klikając "Start" w nakładce.</li>
</ol>
7. Zaszczepić komórkami
<ol>
	<li>Uformuj sterylne połączenie między nieużywaną linią dodawania pożywki (1 pomarańczowa opaska) a źródłem butelki/worka komórkowego, zgrzewając rurki lub używając złączek Luer.</li>
	<li>Zamontuj silikonową część rurki w pompie mediów tak, aby strzałka była skierowana w stronę rurki między pompą a naczyniem.</li>
	<li>Sprawdź, czy rurka clamp jest otwarty, a jego rozgałęziony rurka clamp jest zamknięty. Kliknij suwak, aby włączyć pompę mediów i kliknij "Wyłącz" po dodaniu komórek.</li>
	<li>Przejdź do zakładki "Akcje" i kliknij "Sterowanie pompami".</li>
</ol>
8. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Po zaszczepieniu i tak często, jak jest to pożądane, w celu monitorowania kultury, należy pobrać próbkę z kultury w następujący sposób:</li>
	<li>Przejdź do zakładki "akcje" i kliknij "pobierz próbkę". Umieścić rurkę do pobierania próbek w pompie do pobierania próbek i manipulować kranem pobierania próbek zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.</li>
	<li>Na tych próbkach należy wykonywać co najmniej codzienną obserwację mikroskopową i liczbę komórek.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną pożądaną gęstość, w tym przypadku 1,2 x 106 komórek/ml, należy zainfekować komórki dodatkiem inokulum wirusa.</li>
	<li>Aseptycznie dodać inokulum do strzykawki o pojemności 20 ml i podłączyć strzykawkę do jednego z zapasowych portów dodawania w reaktorze. Wprowadzić inokulum do reaktora, naciskając tłok strzykawki.</li>
	<li>Kontynuuj pobieranie próbek i analizowanie kultury pod kątem stężenia wewnątrzkomórkowych cząstek adenowirusa.</li>
</ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
<li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Proc%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).</li>
<li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+Int%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li>
<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li>
<li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+Biotechnol+News%22%5BJournal%5D)">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. <a target="_blank" href="http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors">http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors</a> (2012).</li>
<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

Autorzy, D. Giroux i Y. Hashimura, są pracownikami firmy PBS Biotech, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystywane w tym artykule.

Ten jednorazowy system bioreaktora jest stosunkowo prosty w użyciu i zapewnia analizę w czasie rzeczywistym na potrzeby monitorowania i analizy reaktora. Doskonale nadaje się do hodowli komórek ssaków i owadów o gęstości komórek sięgającej ponad 30 milionów komórek/ml. Oprócz komórek A549 opisanych w niniejszymraporcie11, w bioreaktorze wyhodowaliśmy również komórki owadów SF-9. Delikatne mieszanie zapewniane przez pneumatyczne koło pneumatyczne zmniejsza uszkodzenia komórek. Podczas ustawiania tego reaktora należy wykonać kilka kroków. Po pierwsze, właściwa kalibracja czujników pH i tlenu rozpuszczonego jest ważna dla optymalnego monitorowania kultury i dodawania odczynników w celu dostosowania pH lub tlenu w systemie. Po drugie, butelki z odczynnikiem i nasionami muszą być napełnione, a nasadki typu luer wykonane w sterylnym środowisku, takim jak BSC. Po wyjęciu butelek z odczynnikami ze sterylnego środowiska, połączenia z przewodami zasilającymi bioreaktor muszą być wykonane ostrożnie, aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
Chociaż ten system bioreaktorów działa dobrze w przypadku linii komórkowych ssaków i owadów, nie jest przeznaczony do hodowli bakteryjnych. System nie jest w stanie zapewnić szybkiego mieszania i natleniania, które jest wymagane dla komórek bakteryjnych. Wzrost bakterii najlepiej przeprowadzić w bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem. W porównaniu z innymi bioreaktorami jednorazowego użytku do hodowli komórek ssaków lub owadów, system ten jest łatwy w użyciu, zapewnia wystarczające dane do analizy przebiegów i ma podobny lub lepszy wzrost komórek niż inny oceniany przez nas system jednorazowego użytku.
Jednorazowy system bioreaktora pneumatycznego ma potencjał, aby sprostać wielu zastosowaniom badawczym i klinicznym w dziedzinie bioterapeutyków, szczepionek, komórek macierzystych i medycyny spersonalizowanej4. Ponadto elastyczność tego systemu pozwala na zastosowanie bioreaktorów opartych na partiach, partiach zasilających, perfuzji i transfekcji5. Wreszcie, systemy bioreaktorów jednorazowego użytku mają potencjał, aby zaspokoić potrzeby produkcji przemysłowej na dużą skalę oraz przestrzegać wytycznych i zaleceń krajowych i międzynarodowych agencji regulacyjnych6-10.

Linie komórek ssaków można zaklasyfikować do jednej z trzech kategorii na podstawie ich cech wzrostu: komórki, które rosną w zawiesinie, komórki, które rosną jako agregaty, oraz komórki, które rosną zakotwiczone w substracie. Chociaż bioreaktor z kołem powietrznym pokazany w tym filmie jest w stanie wyhodować wszystkie trzy typy komórek, ten film zademonstruje wykorzystanie bioreaktora do hodowli komórek zależnych od zakotwiczenia na mikronośnikach. Komórki ssaków zależne od zakotwiczenia mogą być hodowane w celu wytworzenia większej liczby komórek - gdzie same komórki są produktem. Na przykład ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego są obecnie hodowane w celu pobrania komórek i wstrzyknięcia ich do chorej tkanki. Bioreaktor pneumatyczny pokazany na tym filmie okazał się odpowiedni do produkcji takich mezenchymalnych komórek macierzystych do tego zastosowania (Serra i in., komunikacja osobista, 2013).
Zależne od zakotwiczenia komórki ssaków są zazwyczaj hodowane na małą skalę w naczyniach hodowlanych 2D, takich jak płytki do hodowli komórkowych, kolby do hodowli komórkowych lub butelki rolkowe, gdzie przylegają do specjalnie przygotowanej powierzchni wzrostu1. Gdy pożądanych jest więcej komórek, płytki lub kolby można rozszerzyć za pomocą większej liczby lub większych naczyń. Jednakże, aby uzyskać bardziej opłacalną hodowlę dużych ilości komórek zależnych od zakotwiczenia, zwiększenie powierzchni do przyczepiania komórek można osiągnąć za pomocą małych stałych kulek zwanych mikronośnikami. W zależności od charakterystyki przyczepu komórki, na rynku dostępnych jest kilka różnych rodzajów mikronośników, takich jak dekstran, peptyd lub pokryty kolagenem. Mikronośniki mają duży stosunek powierzchni do objętości, zapewniając większą powierzchnię do wzrostu komórek; Mikronośniki mogą być utrzymywane w zawiesinie z mieszaniem, co pozwala na hodowlę komórek do dużych gęstości w systemach bioreaktorów2. Obecnie typy bioreaktorów, w których przylegające komórki są hodowane na mikronośnikach, obejmują kolby obrotowe i systemy zbiorników z mieszadłem, które wykorzystują wirniki osiowe do utrzymywania zawieszenia mikronośników pokrytych komórkami.
Kilka czynników jest ważnych dla pomyślnej hodowli komórek, w tym napięcie tlenu, naprężenie ścinające, matryca powierzchniowa oraz stężenia składników odżywczych i metabolitów. Zastosowanie bioreaktorów pozwala na monitorowanie warunków wzrostu w czasie rzeczywistym i potencjału do znacznego obniżenia kosztów produkcji1. Istnieje kilka popularnych konstrukcji bioreaktorów do hodowli komórek in vitro, w tym zawiesina z mieszadłem, naczynie o obrotowych ściankach, puste światłowody, bioreaktor workowy na platformie kołyskowej i systemy ze złożem fluidalnym3. Wiele z tych systemów stwarza unikalne problemy związane z hodowlą komórek i zwiększaniem skali, takie jak wysokie koszty, gradienty stężeń składników odżywczych, ścinanie hydrodynamiczne, agregacja komórek oraz trudności w pobieraniu próbek, monitorowaniu i kontrolowaniu skalowania komórek.
Różne przylegające linie komórkowe są wykorzystywane do produkcji wirusów, zarówno do produkcji szczepionek wirusowych, jak i do produkcji wektorów wirusowych do zastosowań terapii genowej. W tym filmie, korzystając z systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego (Air-Wheel), demonstrujemy hodowlę komórek ludzkiego raka płuc (A549) na mikronośnikach do produkcji onkolitycznego adenowirusa. Konstrukcja bioreaktora pneumatycznego wykorzystuje pionowe koło mieszające, które jest napędzane przez wypor gazu rozpryskiwanego na dno bioreaktora. Ta delikatna metoda mieszania ogranicza hydrodynamiczne siły ścinające, ale nadal zapewnia optymalne mieszanie podłoża i komórek4. W porównaniu z reaktorem zbiornikowym z mieszadłem, reaktor pneumatyczny charakteryzuje się niskim naprężeniem ścinającym ściankowym nawet w przypadku systemów bioreaktorów pneumatycznych o dużej objętości (ilustracja 1). W przeciwieństwie do bioreaktorów zbiornikowych z mieszadłem, pionowy wirnik tego reaktora jednorazowego użytku jest obracany przez strumień pęcherzyków gazu w zbiorniku, co pozwala na delikatne i równomierne mieszanie medium (rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td><td>PBS Jednorazowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>montaż</td><td>PBS</td> Ludzkie komórki raka płuc PBS <td></td><td></td></tr><tr><td>(A549)</td> <td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoka glukoza Średnia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica</td><td></td><td></td><td></td>bydlęca</tr><tr><td>Trypsyna EDTA, 0,25%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mikronośników Cytodex 1</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwpieniący C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Ostatnie postępy w hodowli ssaków, owadów i komórek macierzystych oraz ich zwiększaniu skutków, stworzyły ogromne możliwości dla nowych terapii i innowacji w medycynie spersonalizowanej. Jednak przełożenie tych postępów na zastosowania terapeutyczne będzie wymagało systemów in vitro, które pozwolą na stworzenie solidnych, elastycznych i opłacalnych systemów bioreaktorów. Istnieje kilka systemów bioreaktorów wykorzystywanych obecnie w warunkach badawczych i komercyjnych; Jednak wiele z tych systemów nie jest optymalnych do ustanawiania, rozszerzania i monitorowania wzrostu różnych typów komórek. Parametry hodowli najtrudniejsze do kontrolowania w tych systemach obejmują minimalizację ścinania hydrodynamicznego, zapobieganie tworzeniu się gradientu składników odżywczych, ustanowienie jednolitego napowietrzania pożywki hodowlanej, zapobieganie zanieczyszczeniu mikrobiologicznemu oraz monitorowanie i dostosowywanie warunków hodowli w czasie rzeczywistym. Korzystając z pneumatycznego systemu bioreaktorów jednorazowego użytku, demonstrujemy montaż i działanie tego nowatorskiego bioreaktora dla komórek ssaków hodowanych na mikronośnikach. Ten system bioreaktorów eliminuje wiele wyzwań związanych z obecnie dostępnymi systemami, minimalizując ścinanie hydrodynamiczne i tworzenie gradientu składników odżywczych oraz umożliwiając równomierne napowietrzanie pożywki hodowlanej. Co więcej, oprogramowanie bioreaktora pozwala na zdalne monitorowanie w czasie rzeczywistym i dostosowywanie parametrów pracy bioreaktora. Ten system bioreaktorów ma również ogromny potencjał w zakresie zwiększania skali komórek ssaków przylegających i zawiesinowych do produkcji różnych białek terapeutycznych, przeciwciał monoklonalnych, komórek macierzystych, leków biopodobnych i szczepionek.

Na Rysunku 3 przedstawiono parametry inicjacji pracy bioreaktora. Rysunek ten pokazuje ekran przed ustawieniem parametrów temperatury, rozpuszczonego tlenu, pH oraz mieszania. Po ustawieniu parametrów parametry procesu są stale monitorowane, a korekty mogą być wprowadzane w celu utrzymania wymaganych warunków. Oprogramowanie generuje ciągły odczyt, który pozwala na łatwą identyfikację problemów. W tym eksperymencie, przy użyciu 2,5 L DMEM zawierającego 10% FBS, 250 ppm SAFC Anti-foam C, 2 mm L-glutaminy i 3 g/L mikronośników, system zostaje ustabilizowany tak, aby procent tlenu wynosił 50%, temperatura 37 °C, a pH 7,2. Reaktor zostaje zaszczepiony komórkami A549 w stężeniu 7 x 104 komórek/ml (lub 10 komórek/mikronośnik). Parametry wybrane dla tego procesu spowodowały, że większość komórek przywarła do mikronośników w ciągu 2 h (Rysunek 4). Po 12 h komórki wykazują oznaki spłaszczania się i rozprzestrzeniania na powierzchni mikronośnika (Rysunek 5). Po 24 h mikronośniki mają stosunkowo równomierny rozkład komórek, bez mikronośników pozbawionych komórek oraz bez dużych skupisk komórek na mikronośnikach (Rysunek 6). Procent kolonizacji mikronośników przez komórki A549 wynosi 75% po 24 h i 90% w późniejszym czasie (Rysunek 7). Komórki nadal rosły wykładniczo do poziomu ~1 miliona komórek/ml po 48 h (Rysunek 8). Po infekcji dawką onkolitycznego adenowirusa (2 x 108 wirionów/ml) w 50 h, gęstość wzrosła do 1,2 miliona komórek/ml, a następnie zaczęła spadać w miarę postępu infekcji litycznej. Odnotowano ~10 000-krotną amplifikację inokulum wirusowego.
W poprzednich eksperymentach stwierdziliśmy, że monitorowanie i regulacja przepływu gazów są kluczowe dla maksymalizacji wzrostu komórek (dane niepublikowane). Szybko rosnące komórki mogą doprowadzić do wyczerpania zapasów tlenu w systemie, w wyniku czego poziom DO może spaść do zera. Choć komórki nadal rosły, tempo wzrostu było znacznie wolniejsze. Krytyczne jest monitorowanie i dostosowywanie przepływu tlenu, aby zaspokoić zapotrzebowanie komórek w fazie wzrostu logarytmicznego. Każdy cykl można analizować pod kątem optymalnego wzrostu, porównując pH, DO i temperaturę z codziennymi zliczeniami komórek.
<img alt="Wykres naprężeń ścinających na ściance bioreaktora; przedstawia PBS w porównaniu do bioreaktora z mieszadłem w Pa; zależność naprężeń od objętości." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Dynamika płynów w pneumatycznym systemie bioreaktora (PBS) w porównaniu z bioreaktorem z mieszadłem mechanicznym podczas pomiaru sił ścinania na ściance przy różnych objętościach reaktora.
<img alt="Stojak na probówki do wirówek używany w eksperymentach laboratoryjnych do organizacji i przechowywania próbek." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Mieszadło pneumatycznego reaktora Air-Wheel.
<img alt="Wyświetlacz monitorujący bioreaktor; parametry: mieszanie, temperatura, rozpuszczony tlen, wykres pH." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zrzut ekranu oprogramowania Pneumatic Air Wheel przedstawiający parametry niezbędne do uruchomienia procesu w bioreaktorze.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, kulki 180 µm, badanie lokalizacji komórkowej, analiza emisji zielonej." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Kolonizacja mikronośników przez komórki A549 2 h po inokulacji. (Średnica mikronośnika ok. 180 µm.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej hodowli komórkowej z zaznaczoną ekspresją białek za pomocą markerów GFP." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. 12 hr po rozpoczęciu hodowli komórki A549 przyкрепiają się, spłaszczają i rozprzestrzeniają na mikronośnikach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej kolonii zielonych glonów podkreślający strukturę komórkową za pomocą emisji optycznej." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Mikronośniki pokryte komórkami po 24 h hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres kolonizacji mikronośników w czasie; oś y: procent kolonizacji, oś x: dni; analiza trendu." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Procent kolonizacji mikronośników przez komórki A549 po inokulacji.
<img alt="Wykres krzywej wzrostu żywych komórek; gęstość w funkcji czasu w kulturze; analiza proliferacji komórek." src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Liczba żywych komórek A549 w kulturze przed i po infekcji adenowirusem.Należy zauważyć, że etap infekcji wirusowej nastąpił w 50. godzinie.

Korzystając z bioreaktora pneumatycznego, demonstrujemy montaż, działanie i wydajność tego jednorazowego systemu bioreaktorów do wzrostu komórek ssaków.

Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie dużych ilości komórek ssaków. Osiąga się to poprzez najpierw kalibrację pH i tlenu rozpuszczonego lub sond DO, a następnie autoklawowanie sond pH, DO i tulei sondy temperatury. Drugim krokiem jest włożenie sond i tulei do naczynia i umieszczenie naczynia na bioreaktorze oraz podłączenie wydechu, filtra, przewodów gazowych i sondy temperatury.Następnym krokiem jest podłączenie przewodów tlenu rozpuszczonego i pH oraz aseptyczne połączenie medium i mikronośników, które są pompowane do bioreaktora. Ostatnim krokiem jest uruchomienie sterowników, aby upewnić się, że bioreaktor osiąga pożądaną prędkość wirnika, temperaturę i nasycenie tlenem. Ostatecznie, po zaszczepieniu i monitorowaniu komputerowym, kultura może zostać przetworzona w celu ekstrakcji i oczyszczenia pożądanego produktu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak bioreaktor z mieszadłem wielokrotnego użytku, jest to, że bioreaktor z kołem powietrznym jest łatwy w użyciu i minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Zacznijmy. Aby rozpocząć protokół, zaloguj się do ekranu powitalnego.Następnie sprawdź czujnik pH i upewnij się, że końcówka czujnika jest wypełniona roztworem elektrolitu. Zaopatrzyć się w jedną zlewkę z roztworem o pH czterowym, drugą zlewkę z roztworem o pH 7 i butelkę do mycia wodą destylowaną. Następnie podłącz pH do czujnika pH.Przejdź do karty akcji w interfejsie hello, wybierz pozycję kalibruj. Następnie wybierz zakładkę PHA i kalibrację dwupunktową. Wprowadź temperaturę buforu w polu temperatury roztworu kalibracyjnego.Umieść czujnik w roztworze pH cztery, aby skalibrować Wprowadź wartość w polu zerowym. Gdy wykres się ustabilizuje, popchnij, skalibruj i przepłucz czujnik pH wodą destylowaną. Powtórz kalibrację dla pH siedem i zapisz ustawienia.Wprowadź wartość bufora w polu zakresu i poczekaj, aż przeszczep się ustabilizuje. Aby rozpocząć rozpuszczony tlen lub przeprowadzić kalibrację. Upewnij się, że czujnik DO był podłączony do systemu przez kilka godzin i został spolaryzowany na karcie kalibracji, wybierz DOA i kalibrację dwupunktową.Odłącz czujnik tlenu rozpuszczonego. Wprowadź zero w zakładce zero i poczekaj, aż wykres się ustabilizuje. Przed wybraniem opcji kalibracji podłącz ponownie czujnik do i wprowadź 100 w polu zakresu.Gdy wykres się ustabilizuje, kliknij przycisk kalibruj dwa. Następnie zapisz ustawienia i zamknij program. Po kalibracji umieść czujniki i studzienkę termiczną w woreczkach autoklawu i sterylizuj je w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 PSI.Po zakończeniu autoklawu zdezynfekuj woreczki autoklawu 70% alkoholem izopropylowym i przenieś woreczki do szafy bezpieczeństwa biologicznego lub BSC. Zdezynfekuj i wprowadź naczynie z odczynnikiem do BSC. Wyjmij opakowanie wewnętrzne i sprawdź, czy naczynie i rurki nie są uszkodzone.Następnie zainstaluj czujnik tlenu rozpuszczonego w lewym przednim porcie naczynia z odczynnikiem, a studzienkę termiczną w lewym tylnym porcie. Zainstaluj czujnik pH w prawym przednim porcie, aby zainstalować. Otwórz nasadkę czujnika i delikatnie wkręć czujnik w port na górze naczynia.Następnie przenieś naczynie z BSC. Upewnij się, że czujnika pH i tlenu rozpuszczonego znajdują się na zewnątrz tulei naczynia i nic nie znajduje się w tulei. Przytrzymaj naczynie tak, aby być skierowanym do przodu i wsuń nóżki naczynia najpierw do rękawa.Upewnij się, że dno naczynia spoczywa na grzejnikach. Następnie ostrożnie zamontuj czujnik temperatury w naczyniu termicznym. Studnia. Następnie wyjmij zestawy wężyków z torby.Dopasuj kodowanie kolorystyczne na rurce do odpowiednich złączy i pomp w jednostce sterującej bioreaktora. Poprowadź przewody dodawania i pobierania próbek pożywki za czujnikiem tlenu rozpuszczonego i czujnikiem termicznym. Dobrze włóż rurkę do pompy oznaczonej kolorami po lewej stronie bioreaktora.Podłącz główną i mikro linię gazową. Wciśnij złącze głównego przewodu gazowego do wylotu gazu, aby zainstalować główny przewód gazowy. Następnie przekręć złącze mikroprzewodu gazowego zgodnie z ruchem wskazówek zegara do wylotu gazu, aby zainstalować mikroprzewód gazowy.Aby zainstalować rurkę piekarnika z filtrem, otwórz piekarnik filtrujący i przymocuj rurkę filtra wylotowego do uan. Upewnij się, że rurka przechodzi przez dwa haczyki do filtra i wyjmuje z piekarnika. Przeprowadź dolną linię przez haczyk w dolnej części piekarnika filtrującego i zamknij drzwiczki.Następnie podłącz do czujników tlenu rozpuszczonego i pH. Po zakończeniu instalacji utwórz sterylne połączenie za pomocą łączników przynęty między nieużywaną żyłką Medium Edition a źródłem średniej torby na butelkę. Przejdź do zakładki akcji w interfejsie Hello.Kliknij opcję Sterowanie pompami, wybierz opcję Pompa mediów, a następnie kliknij suwak, aby włączyć pompę mediów. Następnie dodaj od 1,5 do 3,0 litra pożywki i kliknij suwak, aby wyłączyć pompę. System jest teraz gotowy do pompowania do reaktora wcześniej przygotowanych mikronośników.Można je dodać za pomocą linii dodawania. Przymocuj butelkę MICROCAR do odpowiedniej linii dodatkowej za pomocą sterylnego zamka na przynętę. Włącz pompę dodającą na ekranie pompy sterującej.Po dodaniu mikronośników wyłącz pompę za pomocą suwaka, wróć do ekranu głównego w interfejsie hello, wybierz akcje, a następnie zaawansowane. Wybierz odpowiedni kontroler, aby edytować ustawienia. Ustaw kontrolery na auto i wprowadź nastawy.Po ustawieniu sterowników włącz pompę powietrza. Zajrzyj do naczynia na odczynnik, aby upewnić się, że koło powietrzne się obraca. Upewnij się, że czujnik tlenu rozpuszczonego jest w pełni spolaryzowany i że wartość do ustabilizowała się.Następnie skalibruj formę czujnika do, sterylne połączenie między nieużywaną linią dodawania pożywki oznaczoną jednym pomarańczowym paskiem a źródłem worka na butelkę z komórkami za pomocą łączników przynęty. Następnie zainstaluj silikonową część rurki w pompie mediów. Upewnij się, że rurka clamp jest otwarty i że rozgałęziony przewód clamp jest zamknięty.Przejdź do zakładki pompy sterującej, a następnie włącz pompę mediów. Dodaj ogniwa i wyłącz pompę pożywki. Po zaszczepieniu przejdź do zakładki akcji i wybierz opcję pobierz próbkę.Upewnij się, że przewód do pobierania próbek znajduje się w pompie do pobierania próbek i manipuluj kurkiem odcinającym pobieranie próbek zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Wyjąć strzykawkę z próbką w celu zliczenia komórek, a inne dalsze aplikacje wykonują zliczanie komórek. Wreszcie, gdy komórki osiągną pożądaną gęstość 1,2 razy 10 do sześciu komórek na mililitr, septycznie dodaj inokulum wirusa do 20-mililitrowej strzykawki.Podłączyć strzykawkę do zapasowego portu dodawania w reaktorze. Użyj ekranu pompy sterującej, aby włączyć pompę addycyjną i dodać inokulum wirusa. Większość komórek A 5 49 przylegała do mikronośników w ciągu dwóch godzin.Po 12 godzinach komórki wykazywały oznaki spłaszczania i rozprzestrzeniania się na powierzchni mikrosamochodu. Po 24 godzinach mikronośniki wykazywały równomierny rozkład komórek. Kolonizacja mikrosamochodów zachodzi szybko, jak pokazano tutaj.Procent kolonizacji mikrosamochodów przez 54 9 komórek wynosi 75% do 24 godzin. Ten wykres pokazuje liczbę zdolnych do życia komórek 54 9 w hodowli przed i po zakażeniu adenowirusem. Komórki nadal rosną wykładniczo do 1 miliona komórek na mililitr po 48 godzinach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zmontować i obsługiwać bioreaktor z kołem powietrznym do hodowli komórek ssaków o dużej gęstości do produkcji komórkowej lub białkowej. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Regulacja składników odżywczych za pomocą ciągłego karmienia dostosowanego do wzrostu poprawia tempo wzrostu sferoid komórek ssaków w porównaniu do przerywanego karmienia partiami dla kultur w bioreaktorach z mieszaną zawiesiną.  Niniejsze badanie demonstruje metody wymagane do ustalenia prostych kultur karmionych o skorygowanej dawce.

Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

Funkcjonalne zachowanie komórek w hodowli można poprawić poprzez hodowlę w bardziej podobnych do in vivo 3-wymiarowych środowiskach hodowli16-21. Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i działanie systemu bioreaktora z pustymi włóknami do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo.

Bioreaktory z pustych włókien do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Poznaj metodę hodowli komórek ssaków w jednorazowym bioreaktorze pneumatycznym. Protokół obejmuje kalibrację czujników, montaż systemu i kontrolę parametrów wzrostu komórek.

Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Przeglądaj więcej filmów