Name: Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę implantacji żelu fibrynowego do płuca myszy w celu badania angiogenezy i regeneracji pęcherzyków płucnych. Technika ta pozwala analizować tworzenie naczyń krwionośnych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze American Heart Association (A.M.), U.S. Department of Defense (BC074986) oraz Boston Children's Hospital Faculty Career Development Fellowship (T.M., A.M.). Autorzy dziękują Amandzie Jiang i Elisabeth Jiang za pomoc techniczną.

UWAGA: Badanie na zwierzętach in vivo zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Dziecięcego w Bostonie (numery protokołu: 13-10-2526R,14-02-2568R). Wszystkie leki stosowane w tym protokole są klasy farmaceutycznej i są przygotowywane w sterylnych warunkach. 
1. Przygotowanie żelu fibrynowego
<ol>
	<li>Przygotuj żel fibrynowy, który zawiera VEGF i bFGF.
	<ol>
		<li>Rozmrozić roztwory podstawowe fibrynogenu i trombiny, które są przechowywane w temperaturze -80 °C do temperatury pokojowej (25 °C).</li>
		<li>Dodać trombinę (stężenie końcowe: 2,5 U/ml), CaCl2 (stężenie końcowe: 45 mM), VEGF (stężenie końcowe: 0-100 ng/ml) i bFGF (stężenie końcowe: 0-100 ng/ml) do roztworu fibrynogenu (stężenie końcowe: 12,5 mg/ml w 0,9% roztworze chlorku sodu 43-45) w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać, pipetując.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować 200 μl mieszaniny na sterylne plastikowe naczynie kroplami za pomocą końcówki pipety p200.</li>
		<li>Inkubować krople w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aż zastygną. 
		UWAGA: Zestalony żel można przechowywać w szczelnie zamkniętym plastikowym naczyniu w temperaturze pokojowej (25 °C) przez kilka godzin przed implantacją (ryc. 1a).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed implantacją przyciąć żel fibrynowy do kostek o wymiarach około 3 x 3 x 3 mm za pomocą małych nożyczek chirurgicznych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Znieczulić dorosłą mysz (8-12 tygodni) przez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie ketaminy (100 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg) i potwierdzić, że mysz jest odpowiednio znieczulona, szczypiąc palec u nogi myszy.
	<ol>
		<li>Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogol futro po lewej stronie klatki piersiowej myszy.</li>
	<li>Wykonaj intubację dotchawiczą myszy.</li>
	<li>Umieść mysz na stojaku do intubacji pod kątem 70° i przytrzymaj mysz w miejscu, zaczepiając jej górne siekacze o małą gumkę znajdującą się w górnej części stojaka.</li>
	<li>Delikatnie cofnij język na bok za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Wizualizacja krtani za pomocą światłowodowego oświetlacza mikroskopu na gęsiej szyi.</li>
	<li>Wprowadzić elastyczny cewnik dotchawiczy (21 G) do tchawicy.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz spontanicznie oddycha w płynny sposób (regularne 100-150 oddechów/min, brak paradoksalnego lub płytkiego oddychania).</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Przewietrzyć mechanicznie mysz za pomocą respiratora dla gryzoni (150 oddechów/min i 7 ml/kg objętości oddechowej).</li>
	<li>Policz żebra, aby zlokalizować przestrzeń międzyżebrową między 4. a 5. żebrem.</li>
	<li>Stwórz sterylne pole nad obszarem, dokładnie wycierając alkoholem i jodonem powidonu. Odpowiednio przykryj pole operacyjne sterylnym obłożeniem chirurgicznym.</li>
</ol>
3. Chirurgia myszy
<ol>
	<li>Po miejscowym wstrzyknięciu 0,25% bupiwakainy (200 μl) w skórę należy wykonać poprzeczne nacięcie skóry (o długości około 1 cm) w przestrzeni międzyżebrowej za pomocą nożyczek preparacyjnych.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu 0,25% bupiwakainy (200 μl) do mięśnia międzyżebrowego, należy wykonać nacięcie mięśniowe między 4. a 5. żebrem za pomocą cienkich małych nożyczek.</li>
	<li>Włóż zwijacz preparacyjny między żebra, aby w pełni uwidocznić lewe płuco.
	<ol>
		<li>Zeskrob niewielki obszar (1 x 1 mm kwadratowy) opłucnej trzewnej środka lewego płuca za pomocą cienkich kleszczy.</li>
		<li>Delikatnie uciskaj obszar za pomocą sterylnego bawełnianego wacika, aż krwawienie i wycieki powietrza zostaną całkowicie opanowane.</li>
		<li>Nałożyć niewielką ilość świeżej mieszaniny fibrynogenu/trombiny (kleju fibrynowego) (krok 1.1.2. 20 μl) na obszar za pomocą końcówki pipety p200.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie umieść jeden żel fibrynowy (krok 1.2) za pomocą małych kleszczy na obszarze (ryc. 1b).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że żel jest dobrze zamocowany w okolicy podczas ruchów oddechowych płuc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że nie ma masywnego wycieku powietrza ani krwawienia z płuc.</li>
	<li>Zamknij nacięcia (warstwy mięśniowe i skórne) za pomocą wchłanialnego szwu, którego nie trzeba usuwać.</li>
	<li>Odessać klatkę piersiową za pomocą igły 27 G i strzykawki o pojemności 1 ml, aby zapobiec odmie opłucnowej.</li>
	<li>Zakończ wentylację mechaniczną.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie myszy
<ol>
	<li>Upewnij się, że mysz spontanicznie oddycha w płynny sposób (regularne 100-150 oddechów/min, bez paradoksalnego lub płytkiego oddychania).</li>
	<li>IP wstrzyknąć 1 ml wstępnie podgrzanego 0,9% NaCl, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	<li>Pozwól myszy odzyskać sprawność na podkładce z krążącą ciepłą wodą.</li>
	<li>Wyjmij rurkę dotchawiczą po upewnieniu się, że mysz ma stabilny oddech.</li>
	<li>Wstrzyknąć meloksykam (5 mg/kg, wstrzyknięcie podskórne (SC), przez 3 dni jako pooperacyjny środek przeciwbólowy.</li>
	<li>Uważnie monitoruj ruchy myszy w odstępach co najmniej 15 minut, aż stanie się mostkowa (zdolna do przewrócenia się na brzuch i pozostania w pozycji pionowej) i przytomna.</li>
	<li>Po wyzdrowieniu wróć mysz do nowej klatki odizolowanej od myszy bez operacji.</li>
	<li>Codziennie po zabiegu chirurgicznym należy monitorować miejsce operacyjne pod kątem objawów infekcji (zaczerwienienie, obrzęk, wydzielina), podstawowych funkcji biologicznych zwierzęcia (przyjmowanie pokarmu i wody, oddawanie moczu, kału, przyrost masy ciała), a także klinicznych objawów niepokoju (piloerekcja, zmniejszona lokomocja).</li>
</ol>
5. Zbieranie płuc
<ol>
	<li>7 do 30 dni po implantacji należy poddać mysz eutanazji za pomocą CO2 za pośrednictwem źródła sprężonego gazu.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie między czubkiem wyrostka ksyloidalnego a wcięciem mostkowym (sternotomia środkowa) i zbierz całe płuco z wszczepionym żelem do analizy histologicznej i biochemicznej, przecinając tchawicę i preparując wszystkie połączenia z sercem, płucami i tchawicą.</li>
	<li>Utrwalić wszczepiony żel z płucami z 4% roztworem paraformaldehydu przez noc w temperaturze 4 ºC, zatopić w związku OCT i wykonać seryjne odcinki schodkowe o grubości 30 μm.</li>
	<li>Wykonać analizy histologiczne (barwienie hematoksyliną i eozyną) i immunohistochemiczne (marker śródbłonka: CD31, marker nabłonkowy: akwaporyna (AQP)5 i białko powierzchniowo czynne (SP)-B) przy użyciu mikroskopu konfokalnego 22,37,40.</li>
	<li>Kompiluj stosy przekrojów optycznych (o grubości 30 μm), aby utworzyć trójwymiarowe obrazy komórek śródbłonka i nabłonka płuc za pomocą oprogramowania do analizy obrazów 3D 37.</li>
	<li>Określ ilościowo rzutowane obszary nowo powstałych naczyń krwionośnych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu 46.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule przedstawiono nową metodę implantacji biomateriałów na powierzchni płuc żywej dorosłej myszy. Dzięki temu systemowi angiogeneza pochodząca z płuc gospodarza jest z powodzeniem rekapitulowana wewnątrz materiału. System ten pozwala naukowcom badać przesłuchy między komórkami śródbłonka, innymi komórkami (np. komórkami nabłonka, komórkami mezenchymalnymi, komórkami odpornościowymi) i różnymi komponentami ECM, które są wymagane do miejscowej angiogenezy 50-53 i regeneracji pęcherzyków płucnych ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wprowadzenie metody wszczepiania żelu fibrynowego na powierzchnię płuc dorosłej myszy, co pozwala badaczom scharakteryzować molekularne mechanizmy rozwoju naczyń płucnych i pęcherzyków płucnych, oraz wykorzystać tę wiedzę do opracowania materiałów biomimetycznych zdolnych do podsumowania fizjologicznego tworzenia naczyń płucnych i pęcherzyków płucnych w leczeniu różnych chorób płuc.
Ponad 35 milionów Amerykanów cierpi na przewlekłe choroby płuc, w tym przewlekłą obturacyjną chorobę płuc i zwłóknienie płuc. Pacjenci ci mają długotrwałe przewlekłe objawy ze strony układu oddechowego, takie jak duszność, ucisk w klatce piersiowej, dokuczliwy kaszel i zmęczenie, które znacznie upośledzają ich codzienne życie 1-3. Pomimo ogromnych wysiłków włożonych w opracowanie skutecznych terapii tych chorób płuc, obecnie nie ma na nie lekarstwa; W związku z tym jakość życia tych pacjentów jest niska, a koszty ekonomiczne i ludzkie są wysokie 4-7. Obecnie przeszczep płuc jest jedynym sposobem na uratowanie pacjentów ze schyłkową przewlekłą chorobą płuc. Jednak ze względu na niedobór dawców przeszczepów, wysokie koszty, poważne powikłania i niski wskaźnik przeżycia 8-11, przeszczep nie jest optymalnym podejściem. Niedawny szybki postęp w technikach inżynierii tkankowej umożliwił naukowcom bioinżynierię wszczepialnych płuc poprzez ponowne zasiedlenie zdecelularyzowanych całych płuc różnymi typami komórek progenitorowych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) 12,13. Jednak te bioinżynieryjne płuca funkcjonują u zwierząt gospodarzy tylko przez kilka godzin po implantacji 12,14,15. Wykorzystanie biomateriałów do regeneracji złożonych struktur i funkcji płuc również zakończyło się niepowodzeniem. Może to wynikać z faktu, że kluczowe procesy biologiczne, które rządzą regeneracją płuc u dorosłych, nie zostały dobrze zbadane. W płucach tworzenie się układu naczyniowego jest jednym z najwcześniejszych i najważniejszych zdarzeń podczas rozwoju i regeneracji 16-21. Nowo powstałe naczynia krwionośne w płucach nie tylko dostarczają tlen, składniki odżywcze i różne składniki komórkowe niezbędne do tworzenia narządów, ale także dostarczają pouczających sygnałów regulacyjnych do otaczających komórek 22-25. Tak więc angiogeneza odgrywa kluczową rolę w regeneracyjnej alveolaryzacji w płucach dorosłych 24,26,27. Ponadto rozregulowana angiogeneza przyczynia się do przewlekłych chorób płuc, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) 28, dysplazja oskrzelowo-płucna (BPD) 21-23 i zwłóknienie płuc 29. W związku z tym, aby opracować bardziej skuteczne strategie inżynierii płuc lub leczenia przewlekłych chorób płuc, konieczne jest zrozumienie podstawowych mechanizmów angiogenezy specyficznej dla płuc.
Każdy organ wykazuje unikalne właściwości mechaniczne i chemiczne, które mogą różnić się między stanami fizjologicznymi i patologicznymi 30-33. Te specyficzne dla narządów mikrośrodowiska regulują zachowanie komórek śródbłonka i koordynują tworzenie sieci naczyniowej w sposób specyficzny dla narządu 24,34-36. W związku z tym, aby opracować skuteczniejsze strategie regeneracji płuc, należy zrozumieć mechanizm leżący u podstaw angiogenezy specyficznej dla płuc. Podczas gdy konwencjonalne testy angiogenezy in vivo, takie jak podskórna implantacja hydrożelu, są szeroko stosowane w badaniach nad angiogenezą 37-39, metody te nie podsumowują angiogenezy specyficznej dla narządu. Niedawno opracowano nowatorską metodę wszczepiania Matrigelu do elastycznej formy w płucu myszy i wykazano, że skutecznie rekrutuje naczynia krwionośne i komórki nabłonka płuc do żeli 22. To unikalne podejście pozwoli naukowcom zbadać mechanizm angiogenezy specyficznej dla płuc, a także interakcje między naczyniami krwionośnymi a nienaczyniowymi komórkami płuc w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Ponieważ 1) Matrigel nie nadaje się do stosowania klinicznego; 2) elastyczna forma używana do odlewania żelu może wpływać na interakcje między hydrożelami a tkanką płucną gospodarza oraz 3) elastyczna forma na płucach potencjalnie powoduje upośledzenie funkcji płuc i ból podczas oddychania, jako bardziej istotne klinicznie podejście, matryca fibryny 3D zawierająca czynniki angiogenne (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) / podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)) została wszczepiona do płuca myszy bez odlewania w elastycznej formie, i z powodzeniem dokonał rekapitulacji angiogenezy pochodzącej z płuc gospodarza. Wiadomo, że żel fibrynowy, włókienka polimerowe wytwarzane z fibrynogenu rozszczepionego trombiną, wychwytuje różne czynniki angiogenne, takie jak bFGF i VEGF, w celu przyspieszenia angiogenezy in vivo 40,41. Ze względu na swoje zdolności regeneracyjne i biodegradowalny charakter 42, żel fibrynowy jest szeroko stosowany w dziedzinie inżynierii tkankowej.
Ten artykuł przedstawia nowatorskie i unikalne podejście do wszczepiania żelu fibrynowego na powierzchnię płuc żywej dorosłej myszy i pokazuje, że angiogeneza pochodząca z płuc gospodarza jest rekapitulowana w żelach in vivo. Ta metoda, która umożliwia naukowcom badanie angiogenezy specyficznej dla płuc, prawdopodobnie doprowadzi do opracowania nowych podejść terapeutycznych dla różnych rodzajów chorób płuc i znacznie przyspieszy wysiłki na rzecz skutecznej regeneracji płuc u dorosłych.

<table><tbody><tr><td>Fibrynogen z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>Do wytwarzania fibryny w żelu</td></tr><tr><td>Trombina z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>Do wytwarzania fibryny w żelu</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz VEGF 164</td><td>R& D</td><td>493-MV</td><td>Do suplementacji fibryny</td></tr><tr><td>żel Rekombinowany mysz bFGF</td><td>R& D</td><td>3139-FB</td><td>Do suplementacji żelem fibrynowym</td></tr><tr><td>Stanowisko do intubacji gryzoni</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>Do intubacji</td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło światła</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>Do intubacji</td></tr><tr><td>21 G Elastyczny cewnik</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>Do intubacji</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>MiniVent Aparat Harvard</td><td>CGS-8009</td><td>Do wentylacja</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromikroskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>Szew absobowalny</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Szew chirurgiczny</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Przeciwciało immunohistochemiczne</td></tr><tr><td>przeciwko AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemia</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemia</td></tr></tbody></table>

implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Ostatnie znaczące postępy w badaniach nad komórkami macierzystymi i technikach bioinżynieryjnych poczyniły ogromne postępy w wykorzystaniu biomateriałów do regeneracji i naprawy uszkodzeń w prostych tkankach w dziedzinie ortopedii i periodontologicznej. Jednak próby regeneracji struktur i funkcji bardziej złożonych trójwymiarowych (3D) narządów, takich jak płuca, nie były zbyt udane, ponieważ biologiczne procesy regeneracji narządów nie zostały dobrze zbadane. Staje się jasne, że angiogeneza, czyli tworzenie nowych naczyń krwionośnych, odgrywa kluczową rolę w regeneracji narządów. Nowo powstałe naczynia krwionośne nie tylko dostarczają tlen, składniki odżywcze i różne składniki komórek, które są niezbędne do regeneracji narządów, ale także dostarczają sygnałów instruktażowych do regenerujących się lokalnych tkanek. Dlatego, aby skutecznie zregenerować płuca u osoby dorosłej, konieczne jest zrekapitulowanie specyficznych dla płuc mikrośrodowisk, w których angiogeneza napędza regenerację miejscowych tkanek płucnych. Chociaż konwencjonalne testy angiogenezy in vivo, takie jak podskórna implantacja hydrożeli bogatych w macierz zewnątrzkomórkową (ECM) (np. fibryny lub żele kolagenowe lub mieszanina białkowa Matrigel - ECM wydzielana przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm), są szeroko stosowane do badania ogólnych mechanizmów angiogenezy, angiogeneza specyficzna dla płuc nie została dobrze scharakteryzowana, ponieważ metody ortotopowej implantacji biomateriałów w płucach nie były dobrze znane Ustanowione. Celem tego protokołu jest wprowadzenie unikalnej metody wszczepiania żelu fibrynowego na powierzchnię płuc żywej dorosłej myszy, co pozwoli na pomyślną rekapitulację angiogenezy pochodzącej z płuc gospodarza wewnątrz żelu. Takie podejście umożliwia naukowcom zbadanie mechanizmów, za pomocą których specyficzne dla płuc mikrośrodowisko kontroluje angiogenezę i regenerację pęcherzyków płucnych zarówno w warunkach normalnych, jak i patologicznych. Ponieważ wszczepione biomateriały uwalniają i dostarczają sygnały fizyczne i chemiczne do sąsiednich tkanek płucnych, implantacja tych biomateriałów na chore płuca może potencjalnie znormalizować sąsiednie chore tkanki, umożliwiając naukowcom opracowanie nowych podejść terapeutycznych dla różnych rodzajów chorób płuc.

Aby zbadać, czy tworzenie naczyń krwionośnych pochodzących z płuc gospodarza zostaje odtworzone wewnątrz biomateriałów wszczepionych do płuc, żele fibrynowe uzupełnione głównymi czynnikami angiogennymi VEGF i bFGF (po 0, 10 i 100 ng/ml każdy) zostały wszczepione na powierzchnię żywych płuc myszy, zgodnie z opisem zastosowania Matrigel 22. Żele fibrynowe 47 zawierające te angiogenne czynniki wzrostu zostały przygotowane zgodnie z Rysunkiem 1a. Po torakotomii niewielki obszar powierzc...

Rekapitulacja mikrośrodowiska specyficznego dla danego narządu, która stymuluje miejscową angiogenezę, jest niezbędna do skutecznej regeneracji uszkodzonych tkanek. W niniejszym raporcie przedstawiono nowatorską metodę wszczepiania żeli fibrynowych na powierzchnię płuc żywej myszy w celu zbadania, w jaki sposób mikrośrodowisko specyficzne dla płuc moduluje angiogenezę i regenerację pęcherzyków płucnych u dorosłych myszy.

Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest zastosowanie implantacji żelu fibrynowego do zbadania regeneracji naczyń krwionośnych i pęcherzyków płucnych myszy. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw kropli żelu fibrynowego, uzupełnionego czynnikami angiogennymi. W drugim etapie zwierzę doświadczalne jest wentylowane mechanicznie, a klatka piersiowa jest otwierana.Następnie żel fibrynowy jest ostrożnie mocowany do płuca myszy za pomocą kleju fibrynowego. Następnie, w ostatnim etapie, płuco i wszczepiony żel są pobierane od siedmiu do 30 dni później w celu analizy histologicznej. Ostatecznie naczynie krwionośne i tworzenie wyrostka zębodołowego w obrębie implantu żelowego można ocenić za pomocą analizy immunohistochemicznej.Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyniowej, takie jak to, w jaki sposób narządy ryzykują mikrośrodowisko, kontrolują angiogenezę i morfogenezę narządów, demonstrując procedurę, bema model kolega z naszego laboratorium Aby przygotować żele fibrynowe, które zawierają zarówno VEGF, jak i BFGF, zacznij od podgrzania do minus 80 stopni Celsjusza, zapasów fibrynogenu i trombiny do temperatury pokojowej. Gdy buliony zostaną całkowicie rozmrożone, dodaj trombinę, chlorek wapnia VEGF i BFGF do roztworu fibrynogenu w 1,5 mililitrowej probówce. A następnie wymieszać roztwór, pipetując.Następnie delikatnie odpipetować 200 mikrolitrów mieszaniny, kropla po kropli na sterylne plastikowe naczynie. Inkubuj krople w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut, aż zastygną. Następnie użyj małych nożyczek chirurgicznych, aby przyciąć żele do kostek o wymiarach około trzech na trzy na trzy milimetry.Po potwierdzeniu pełnej sedacji u myszy w wieku od 8 do 12 tygodni przez uszczypnięcie palca, przykryj oczy zwierzęcia maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie ogol sierść po lewej stronie klatki piersiowej. W celu intubacji dotchawiczej umieść mysz na stojaku do intubacji ustawionym pod kątem 70 stopni i zaczep górne siekacze o małą gumową opaskę znajdującą się w górnej części stojaka, aby utrzymać zwierzę na miejscu. Użyj kleszczy, aby delikatnie cofnąć język na bok, a następnie uwidocznij krtań za pomocą światłowodowego oświetlacza mikroskopu na gęsiej szyi.Następnie włóż elastyczny cewnik dotchawiczy o rozmiarze 21 do tchawicy. Upewnij się, że mysz spontanicznie oddycha płynnie, a następnie umieść zwierzę w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj respiratora dla gryzoni, aby mechanicznie przewietrzyć zwierzę przy 150 oddechach na minutę i siedmiu mililitrach objętości oddechowej na kilogram.A następnie policz żebra, aby zlokalizować przestrzeń międzyżebrową między czwartym a piątym żebrem. Następnie dokładnie przetrzyj obszar alkoholem i jodowidonem, aby stworzyć sterylne pole i pokryj obszar operacyjny sterylnym tra, aby umieścić żel na płucu. Następnie wykonaj jednocentymetrowe poprzeczne nacięcie skóry nad przestrzenią międzyżebrową.A następnie wykonaj nacięcie mięśnia między czwartym a piątym żebrem. Włóż retraktor preparacyjny między żebra, aby w pełni uwidocznić lewe płuco, a następnie użyj cienkich kleszczy, aby zeskrobać jeden na jeden milimetr kwadratowy opłucnej trzewnej ze środka lewego płuca za pomocą sterylnego bawełnianego wacika. Następnie delikatnie uciskaj obszar, aż krwawienie i wycieki powietrza zostaną całkowicie opanowane, a następnie nałóż niewielką ilość zestalonego kleju trombinowego fibrynogenu na ten obszar.Następnie delikatnie umieść jeden żel fibrynowy na kleju i obserwuj ruchy oddechowe płuc, aby ustalić, czy żel jest dobrze utrwalony. Następnie zamknij nacięcia wchłanialnym szwem. Odessać klatkę piersiową za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby zapobiec odmie opłucnowej, a następnie zakończyć wentylację mechaniczną.Po upewnieniu się, że mysz oddycha płynnie, wstrzyknij jeden mililitr przedwojennego 0,9% chlorku sodu dootrzewnowego, aby zapobiec odwodnieniu i pozwól myszy dojść do siebie na podkładce z krążącą ciepłą wodą. Gdy zwierzę zacznie stabilnie oddychać, wyjmij rurkę dotchawiczą i wstrzyknij pooperacyjny środek przeciwbólowy. Kiedy zwierzę w pełni wyzdrowieje, należy je umieścić w nowej klatce odizolowanej od myszy bez operacji, codziennie monitorując zwierzę pod kątem oznak infekcji lub powikłań.Siedem do 30 dni po implantacji należy poddać mysz eutanazji zgodnie z protokołem i wykonać nacięcie między czubkiem wyrostka mieczykowatego a wcięciem mostka. A następnie przeciąć tchawicę, rozcinając wszystkie połączenia od płuca do serca i tchawicy, zebrać całe płuco i wszczepiony żel, a następnie utrwalić żel i tkankę płucną w 4% roztworze aldehydu paraform przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia, zanurzyć tkankę płucną w związku OCT, a następnie zebrać seryjne odcinki schodkowe płuca i żelu o grubości 30 mikrometrów. Wybarwić skrawki hematyną i eoiną oraz przeciwciałami przeciwko odpowiednim markerom zainteresowania.A następnie, po zrobieniu Zackowi zdjęć sekcji, skompiluj stosy sekcji optycznych, aby utworzyć trójwymiarowe obrazy komórek śródbłonka i nabłonka płuc. Korzystanie z oprogramowania do analizy obrazu 3D. Na koniec określ ilościowo rzutowane obszary nowo powstałych naczyń krwionośnych za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.Siedem dni po implantacji żel fibrynowy jest wprowadzany do płuc gospodarza Rekonstrukcja 3D konfokalnych obrazów fluorescencyjnych wykazała, że komórki śródbłonka CD 31 dodatnie pochodzące od gospodarza tworzą sieci naczyniowe wewnątrz żeli siedem dni po implantacji w sposób zależny od dawki A-V-E-G-F-B-F-F, akwaporyna typu pierwszego z pięcioma dodatnimi i typu drugiego z białkiem powierzchniowo czynnym B dodatnie komórki nabłonka płuc są również rekrutowane wzdłuż nowo utworzonych naczyń krwionośnych wewnątrz żeli, które są uzupełniane z wyższymi stężeniami VGF i B, FGFH i d. Barwienie skrawków histologicznych ujawnia, że inne typy komórek gospodarza również migrują do żelu siedem dni po implantacji. Odkrycia te razem sugerują, że regeneracyjne sieci naczyniowe pochodzące z płuc gospodarza i tworzenie pęcherzyków płucnych są z powodzeniem konstruowane wewnątrz żeli fibrynowych po suplementacji czynnikami angiogennymi i zagnieżdżeniu się na powierzchni płuca dorosłej myszy po jego rozwoju.Technika ta utorowała drogę mniejszej liczbie badaczy w dziedzinie biologii płuc i medycyny podstawowej do zbadania mechanizmu normalnej angiogenezy i tego, jak wpływa ona na stan chorobowy płuc myszy.

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Płuco jest perfundowane zarówno przez tętnicę oskrzelową systemową, jak i tętnice płucne.  W większości patologii płuc to mniejsze uczynki układowe wykazują solidną neowaskularyzację.  Zatrzymanie przepływu krwi w płucach sprzyja energicznej angiogenezie oskrzeli.  Zapewniamy chirurgiczne szczegóły indukowania niedokrwienia lewej tętnicy płucnej, które sprzyja neowaskularyzacji oskrzeli.

Angiogeneza w niedokrwiennym płucu szczura

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę badania aktywności przeciwzwłóknieniowej ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu podawanych dożylnie, uzyskanych z całej pępowiny po indukcji uszkodzenia płuc przez wstrzyknięcie dotchawicze bleomycyny u myszy C57BL/6. Protokół ten można łatwo rozszerzyć na badania przedkliniczne innych środków terapeutycznych.

Indukcja uszkodzenia płuc myszy przez wstrzyknięcie dotchwiaczą bleomycyny

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Poznaj metodę implantacji żelu fibrynowego do płuca myszy w celu badania angiogenezy i regeneracji pęcherzyków płucnych. Technika ta pozwala analizować tworzenie naczyń krwionośnych in vivo.

Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Przeglądaj więcej filmów