Name: Analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę analizy metabolicznej w czasie rzeczywistym organoidów krypt jelitowych myszy przy użyciu analizatora XF 24. Technika ta umożliwia pomiar zużycia tlenu i stężenia kwasu mlekowego w hodowlach 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 oraz P3013330 z National Institutes of Health.
Chcielibyśmy podziękować Michele Houston, Elenie Dhimie i dr Annie Velcich za ich cenne uwagi dotyczące opracowania protokołu izolacji krypty.
Dziękujemy również Centrum Szkolenia i Badań nad Cukrzycą Albert Einstein College of Medicine, wspieranemu przez NIH P60DK20541, oraz Dr. Michaelowi Brownlee i Dr. Xue-Liang Du, którzy odpowiednio kierują i prowadzą placówkę Seahorse.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Albert Einstein College of Medicine.
1. Izolacja i kultura krypty
<ol>
	<li>Izolacja krypt z jelita cienkiego:
	<ol>
		<li>Odizoluj krypty jelitowe od dowolnego modelu myszy, który Cię interesuje. Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy.</li>
		<li>Otwórz brzuch wzdłużnie i napełnij jelito cienkie (SI) lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, PBS (-Ca2+; -Mg2+) z 2x antybiotykiem przeciwgrzybiczym (anty-anty). Szybko wyizoluj jelito cienkie.</li>
		<li>Dokładnie wypreparować tłuszcz krezkowy za pomocą skalpela. Uważaj, aby nie przebić tkanki – przez cały czas utrzymuj tkankę wilgotną lodowatym PBS. Otwórz jelito wzdłużnie i dokładnie umyj lodowatym PBS.</li>
		<li>Przetnij jelito cienkie na dwie części i spłaszcz za pomocą mokrej bawełnianej końcówki, delikatnie zeskrob kosmki za pomocą wstępnie schłodzonego szkiełka. Kilkakrotnie energicznie umyć w lodowatym PBS.</li>
		<li>Inkubować przez 3 minuty w 20 ml 1x PBS na 3 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)/0,5 mM ditiotreitol (DTT) w celu nieenzymatycznej dysocjacji tkanki.</li>
		<li>Pokrój tkankę na małe kawałki (2-4 mm) za pomocą żyletki na wstępnie schłodzonym szkiełku. Przenieś kawałki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml lodowatego PBS.</li>
		<li>Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą sterylnej jednorazowej pipety o pojemności 10 ml. Niech fragmenty tkanki osadzają się grawitacyjnie. Usunąć supernatant za pomocą pipety. Powtórz jeszcze trzy razy; Upewnij się, że supernatant jest klarowny.</li>
		<li>Dodać 20 ml PBS na 2 mM EDTA. Obracać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, delikatnie kołysząc.</li>
		<li>Pozostawić tkankę do osadu i odrzucić supernatant. Dodaj 15 ml lodowatego PBS i pipetuj 5 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Pozwól fragmentom tkanki osiąść i zebrać supernatant jako frakcję 1 (F1). Powtórz zbieranie F2-F5, każda frakcja utrzymywana oddzielnie.</li>
		<li>Dodaj 15 ml lodowatego PBS i tym razem energicznie potrząsaj ręcznie przez 15 sekund. Zbierz F6 i powtórz dla F7, F8. Jeśli kawałki tkanki zaczną unosić się na wodzie, dotknij, aby pomóc im się uspokoić.</li>
		<li>Zbadać podwielokrotność każdej frakcji pod mikroskopem. Zbierz te frakcje, które zawierają krypty.</li>
		<li>Przepuść zebrane frakcje przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm, zbierając krypty w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml lodowatego PBS z 2 kryptami anty-anty i transferowymi do probówki o pojemności 15 ml. Powtórz pranie jeszcze raz.</li>
		<li>Umyj krypty raz za pomocą 10 ml lodowatego ADF, Advanced DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham"s F-12) – 2x anty-anty.</li>
		<li>Umyj krypty raz za pomocą 10 ml ADF – 1x anti–anti.</li>
		<li>Policz krypty za pomocą hemocytometru. Dostosuj objętość roztworu krypty i przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml tak, aby końcowe stężenie krypty po ponownym zawieszeniu wynosiło 100-500 krypt na 50 μl galaretowatej mieszaniny białek (Matrigel). Wirować przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić krypty w galaretowatej mieszaninie białek.</li>
		<li>Płytka 50 μl zawiesiny krypty – galaretowatej mieszaniny białek na basenie w 24-dołkowej płytce (obszar wzrostu: 2 cm2), ostrożnie umieszczając kroplę zawiesiny na środku każdej studzienki. Przechowywać płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C CO2 przez ~30 minut, aż zawiesina zastygnie.</li>
		<li>Dodać 500 μl lodowatej pożywki (Advanced DMEM/F12 z 1x anty – anty, 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x Suplement B27, 1x Suplement N2, 1 mM N-acetylo-L-Cysteina (NAC), 50 ng/ml Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-Spondyna).
		<ol>
			<li>Rozpuść czynniki wzrostu w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura i przejście organoidów w krypcie:
	<ol>
		<li>Organoidy krypty pasażowe 14-21 dni po wysiewie (lub w razie potrzeby) w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Zmieniaj media w każdy piątek i poniedziałek. W środy zastąp połowę mediów świeżymi mediami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń pożywkę hodowlaną. Przemyć próbkę dwukrotnie 500 μl PBS w odstępach 5-minutowych.</li>
		<li>Usuń PBS i delikatnie rozdrobnij galaretowatą mieszaninę białek za pomocą sterylnej końcówki mikropipety P1000.</li>
		<li>Dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej do jednego dołka i ponownie zawiesić organoidy w pożywce o objętości 1 ml.</li>
		<li>Delikatnie rozerwać organoidy za pomocą P1000, pipetując w górę iw dół 20-30x (sprawdź pod mikroskopem prawidłową dysocjację organoidów z dobrą wydajnością krypty, aż do opracowania spójnej techniki).</li>
		<li>Przenieść krypty do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml; odwirować przy 100 x g w temperaturze 4 °C, 5 min.</li>
		<li>Przepłukać osad dwukrotnie 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Rozłupać w proporcji 1:3 lub 1:6 w zależności od potrzeb, ponownie zawieszając krypty w 50 μl Matrigel na studzienkę. Postępuj zgodnie z powyższym opisem (sekcja 1.1.16-18).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie organoidów w krypcie:
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę hodowlaną. Przemyć próbkę w 500 μl PBS.</li>
		<li>Rozproszyć galaretowatą mieszaninę białek za pomocą końcówki pipety P1000.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki do pojedynczego dołka i ponownie zawiesić organoidy w pożywce o objętości 1 ml.</li>
		<li>Delikatnie rozdrobnij organoidy za pomocą P1000, pipetując w górę iw dół 20-30x.</li>
		<li>Przenieść organoidy do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 100 x g w temperaturze 4 °C, 5 min.</li>
		<li>Przepłukać osad dwukrotnie 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Zawieś krypty w pożywce zamrażającej o pojemności 500 μl.</li>
		<li>Przenieś krypty do krioprobówki, umieść probówkę w pojemniku do zamrażania i przechowuj przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przenieś krypty do zbiornika z cieczą N2.
		<ol>
			<li>Odzyskać zamrożone organoidy kryptowe poprzez szybkie rozmrażanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przemyć 500 μl kompletnej pożywki hodowlanej, odwirować przy 100 x g, 5 minut i ponownie zawiesić w galaretowatej mieszaninie białek i kulturze, jak opisano powyżej. Aby uzyskać lepszą regenerację, dodaj inhibitor ROCK (Y-27632) do pożywki zamrażającej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test metabolizmu organoidów w krypcie
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki 24-dołkowej:
	<ol>
		<li>Izoluj i policz krypty zgodnie z protokołem (patrz sekcja 1.1 dla izolacji krypt i sekcja 1.2 dla przejścia krypty).</li>
		<li>Ponownie zawiesić krypty w galaretowatej mieszaninie białek (100-200 krypt na 20 μl).</li>
		<li>Zawiesina mieszaniny białek kryptowo-galaretowatych na 24-dołkowej płytce testowej (upewnić się, że na każdą próbkę przypada co najmniej trzy próbki) i pozostawić zawiesinę do zestalenia się w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 ; następnie dodać 500 μl kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Hoduj krypty (jak opisano w sekcji 1.1) i obserwuj pod mikroskopem, aż krypty wyrosną na w pełni rozwinięte organoidy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test strumienia zewnątrzkomórkowego:
	<ol>
		<li>Wkład hydratować przez noc w inkubatorze bez emisjiCO2 (0% CO2) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć organoidy 500 μl DMEM (bez: glukozy, L-glutaminy, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu oraz czerwieni fenolowej). Odczekaj 5 min.</li>
		<li>Dodaj 675 μl na pożywkę testową (DMEM z 2 mM L-glutaminą i 5 mM D-glukozą) do każdego dołka.</li>
		<li>Sprawdź mikroskopijną morfologię organoidów kryptowych, aby upewnić się, że organoidy i galaretowata mieszanina białek są nienaruszone po płukaniu. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze bez emisjiCO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować 10 μM związków do wstrzykiwań (oligomycyna, cyjanek karbonylu-p-trifluoro-metoksy-fenylo-hydrazon (FCCP), rotenon) w pożywce do oznaczania.</li>
		<li>Ustaw wkład, ładując kolejno 75 μl 10 μM związków do wstrzykiwań do portów wkładu: Port A - oligomycyna; Port B - FCCP; i Port C - rotenon (końcowe stężenia podczas testu wyniosą 1 μM).</li>
		<li>Inkubować wkład 30 min – 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez emisjiCO2</li>.
		<li>Jednocześnie włącz XF Analyzer i utwórz szablon protokołu testu.</li>
		<li>Umieść kasetę i płytkę narzędziową w analizatorze XF Analyzer i uruchom "kalibrację" wkładu.</li>
		<li>Sprawdź organoidy krypt pod mikroskopem, aby upewnić się, że są przyłączone do galaretowatej mieszaniny białek.</li>
		<li>Załaduj płytkę do hodowli komórek do instrumentu i uruchom protokół testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li>
<li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li>
<li>Medina, M. A., Castro I, N. unezde <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7(2013).</li>
<li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+changes+in+histone+modifications%2C+mRNA+levels%2C+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832%2F13+%CE%B2-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li>
<li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

Nie ma żadnych ujawnień.

Przetestowaliśmy wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) krypt wyizolowanych od 8-miesięcznych myszy i wyhodowanych do organoidów ex vivo. Po zmierzeniu szybkości podstawowej, metabolizm krypty oceniano poprzez dodawanie kolejno oligomycyny, cyjanku karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) i rotenonu.
Podstawowy OCR i podstawowy ECAR rejestrowano od 0 do 29 min (ryc. 2A i 2B). W 29minucie oli...

Rak jelita grubego (CRC) jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Sporadyczny rak jelita grubego – tj. pojawiający się w późniejszym okresie życia (>50 roku życia) i bez wyraźnych predysponujących czynników genetycznych – stanowi ~80% wszystkich przypadków, przy czym częstość występowania jest silnie uzależniona od długoterminowych wzorców żywieniowych1,2. Guzy te wykazują przesunięcie metaboliczne w kierunku zależności od oksydacyjnej glikolizy, znanej jako efekt Warburga, który może częściowo powodować wyższe stężenia komórkowych elementów budulcowych i energii (poprzez glutaminolizę), aby umożliwić i być może napędzać wysokie tempo proliferacji komórek nowotworowych3-5. Badania nad rakiem jelita grubego, a także innymi nowotworami przewodu pokarmowego, w tym rakiem jelita cienkiego, dostarczają ważnych informacji na temat przyczyny powstawania nowotworów. Badanie różnic metabolicznych między normalnym, pronowotworowym i nowotworowym stanem układów narządów przewodu pokarmowego może pomóc w określeniu względnego ryzyka rozwoju nowotworu, a także we wczesnym wykryciu nowotworu. Co więcej, zrozumienie metabolizmu bioenergetycznego obejmującego oddychanie mitochondrialne i glikolizę dostarczy fundamentalnych informacji na temat tego, w jaki sposób fizjologia komórki, starzenie się i stan chorobowy zaburzają homeostazę jelit. Wykorzystanie technologii testów bioenergetycznych do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego może ocenić tempo oddychania mitochondrialnego i glikolizy jednocześnie w komórkach rosnących w kulturze w czasie rzeczywistym6,7.
Do niedawna badania in vitro jelita cienkiego ograniczały się do linii komórkowych pochodzących z łagodnych lub złośliwych nowotworów8,9 i nie reprezentowały fizjologii normalnego nabłonka jelitowego i wpływu mikrośrodowiska, w którym się znajdują. W 2009 roku Sato i wsp. 10 wprowadzili system hodowli ex vivo w celu wyhodowania trójwymiarowych (3D) organoidów nabłonka jelitowego myszy lub nabłonkowych "mini-jelit", odpowiednich do badań eksperymentalnych, diagnostycznych i terapeutycznych10,11. Co więcej, krypty wyizolowane od myszy o ograniczonej kaloryczności zachowują swoje zmienione właściwości wzrostu jako organoidy w takich kulturach12. W porównaniu z transformowanymi liniami komórkowymi, kryptowe hodowle organoidów mogą być wykorzystywane do generowania fizjologicznie istotnych danych, stanowiąc znacznie lepszy model do zrozumienia stanu in vivo.
Dostosowaliśmy technologię analizy bioenergetycznej do badania metabolizmu energetycznego organoidów krypt jelitowych. Organoidy krypt jelit myszy hodowano ex vivo w celu opracowania przedstawionych badań metabolizmu energetycznego organoidów kryptowych. Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) organoidów krypt mierzono przy braku i obecności dwóch różnych inhibitorów metabolicznych (oligomycyny, rotenonu) i nośnika jonów (cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon). Odpowiedź metaboliczna organoidów kryptowych na te związki chemiczne została z powodzeniem odzwierciedlona poprzez zmianę wartości ECAR i OCR.
Badania bioenergetyczne komórek wyjaśnią wzajemne interakcje między stanem metabolicznym a ryzykiem choroby i fenotypem w raku, otyłości, cukrzycy, zaburzeniach metabolicznych i chorobach mitochondrialnych oraz pomogą w rozwoju metod badań przesiewowych z bezpośrednim wpływem na medycynę translacyjną. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji krypt jelita cienkiego i hodowli organoidów kryptowych. Ponadto wprowadzamy nowatorską metodę wykorzystania krypt kultur organoidowych do testów metabolicznych.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Matryca membrany podstawnej, GFR, bez czerwieni fenolu, bez LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), bez magnezu, bez wapnia, pH 7,2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Podłoże bez glukozy, L-glutaminy, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Stężenie końcowe 15 mg/l w DMEM (D5030) - step 2.2.2</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk-Antybiotyk, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Stężenie końcowe 1x lub 2x</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płyn</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX&handel; suplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Stężenie końcowe 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Stężenie końcowe 1 mM</td></tr><tr><td>100x suplement N-2, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; suplement minus Witamina A, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia R-Spondyna 1, CF, 50 &mu; g</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Stężenie końcowe 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi EGF, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Stężenie końcowe 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi Noggin, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Stężenie końcowe 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; glukoza w proszku</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Stężenie końcowe 5</td></tr><tr><td>mM Ambion&reg; 0,5 M EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Stężenie końcowe 3 mM dla <silny>krok 1.1.5</silny>; 2 mM dla <silny>krok 1.1.8</silny></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>DTT (ditiotreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Stężenie końcowe 3 mM</td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0,1% w PBS</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% w PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; Zamrażanie kultur komórkowych Technologie średniego</td><td>życia</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Stężenie końcowe 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Stężenie końcowe 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Cyjanek karbonylu-p-trifluoro-metoksy-fenylo-hydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Stężenie końcowe 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Stężenie końcowe 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Stężenie końcowe 0,1 N w PBS</td></tr><tr><td>XF24 Zewnątrzkomórkowy analizator strumienia (analizator XF)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Błona śluzowa jelita cienkiego wykazuje powtarzalną architekturę zorganizowaną w dwie podstawowe struktury: kosmki, wystające do światła jelita i składające się z dojrzałych enterocytów, komórek kubkowych i komórek enteroendokrynnych; oraz krypt, rezydujących bliżej błony podśluzowej i mięśniowej, zawierających dorosłe komórki macierzyste i progenitorowe oraz dojrzałe komórki Panetha, a także komórki zrębu i odporności mikrośrodowiska krypty. Do ostatnich kilku lat badania in vitro jelita cienkiego ograniczały się do linii komórkowych pochodzących z łagodnych lub złośliwych nowotworów i nie reprezentowały fizjologii prawidłowego nabłonka jelitowego i wpływu mikrośrodowiska, w którym się znajdują. Tutaj demonstrujemy metodę zaadaptowaną z Sato et al. (2009) do hodowli pierwotnych organoidów krypty jelit myszy pochodzących od myszy C57BL / 6. Ponadto przedstawiono wykorzystanie kultur organoidów kryptowych do oznaczania profilu metabolicznego krypty w czasie rzeczywistym poprzez pomiar podstawowego zużycia tlenu, szybkości glikolitycznej, produkcji ATP i wydolności oddechowej. Organoidy zachowują właściwości określone przez ich źródło i zachowują aspekty swojej adaptacji metabolicznej odzwierciedlone w zużyciu tlenu i tempie zakwaszenia zewnątrzkomórkowego. Badania metaboliczne w czasie rzeczywistym w tym systemie hodowli organoidów kryptowych są potężnym narzędziem do badania metabolizmu energetycznego organoidów kryptowych oraz tego, jak można go modulować za pomocą czynników odżywczych i farmakologicznych.

Organoidy krypt zostały utworzone z 8-miesięcznych myszy C57BL/6 karmionych oczyszczoną dietą dla gryzoni American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Jelitowe organoidy krypt mogą być hodowane w kulturze przez dłuższy czas z pojedynczej krypty (Rysunek 1A, pojedyncza czerwona strzałka). Organoidy wykształcają struktury przypominające krypty w 18-20 dniu hodowli (Rysunek 1B, czerwone strzałki). Krypty były pasażowane co 3 tygodnie, a organoidy skutecznie odzyskiwano po każdym pasażu.</p...

Organoidy kryptowe jelita cienkiego hodowane ex vivo dostarczają system hodowli tkankowej, który podsumowuje wzrost krypt zależny od komórek macierzystych i ich niszy. Opracowaliśmy metodę oznaczania profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w pierwotnych organoidach krypt myszy. Odkryliśmy, że organoidy zachowują właściwości fizjologiczne określone przez ich źródło.

Analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Celem tej procedury jest oznaczenie profilu metabolicznego pierwotnych organoidów krypty myszy w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw jelita cienkiego myszy, a następnie wyizolowanie krypt jelitowych, które Andre zgina w matryglu. Drugim krokiem jest hodowla krypt, aż utworzą w pełni rozwinięte organoidy kryptowe.Kolejnym krokiem jest przygotowanie testu kartridża do badań metabolicznych. Ostatnim krokiem jest załadowanie wkładu i płytki użytkowej do analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego XF 24 i przeprowadzenie analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w celu zmierzenia wskaźnika zużycia tlenu i stopnia zakwaszenia zewnątrzkomórkowego organoidów krypty K. Ostatecznie procedura ta pozwala na badanie profilu metabolicznego pierwotnych organoidów krypty jelita myszy w czasie rzeczywistym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie hodowli komórkowej do esejów metabolicznych, jest to, że pozwala nam ocenić metabolizm jelit w czasie rzeczywistym. Hodowle organoidów naśladują dokładniejsze wytwarzanie stanu odpornościowego, co pomaga generować więcej danych fizjologicznych. Technikę tę można również rozszerzyć o analizę innych kultur organoidów XI 3D.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak charakterystyka zmian metabolicznych w jelitach cienkich podczas nowotworu, a także w badaniach nad cukrzycą i metabolizmem, takich jak porównanie metabolizmu stanów normalnych i chorobowych. Aby rozpocząć tę procedurę, otwórz brzuch myszy poddanej eutanazji wzdłużnie. Napełnij jelito cienkie lodowatym PBS bez wapnia i magnezu oraz dwoma x antybiotykowym środkiem przeciwgrzybiczym.Następnie szybko odizoluj jelito cienkie. Usuń tłuszcz krezkowy za pomocą skalpela. Należy uważać, aby nie przebić tkanki i utrzymywać ją wilgotną lodowatym PBS podczas całego zabiegu.Otwórz jelito i dokładnie umyj je lodowatym PBS. Następnie przetnij jelito cienkie na dwie części. Spłaszcz je za pomocą mokrej bawełnianej końcówki.Następnie delikatnie zeskrob VII za pomocą szkiełka preco. Kilkakrotnie energicznie umyj chusteczki w lodowatym PBS. Następnie inkubuj je w 20 mililitrach jednego XPBS z trzema milimolowymi EDTA i 0,5 milimolowymi DTT przez trzy minuty.Następnie pokrój tkanki na dwa do czterech milimetrowych kawałków na szkiełku preco. Za pomocą żyletki przenieś kawałki do 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów lodowatego PBS. Następnie delikatnie pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą sterylnej jednorazowej pipety o pojemności 10 mililitrów.Po tym, jak fragmenty tkanki osiądą grawitacyjnie, usuń SUP natum za pomocą pipety. Powtórz procedurę jeszcze trzy razy i upewnij się, że supernatant jest klarowny. Teraz przenieś kawałki tkanki do 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów PBS z dwoma milimolowymi EDTA SW i inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut z delikatnym kołysaniem.Następnie pozwól tkance osiąść i wyrzuć supinat. Dodaj 15 mililitrów węgla lodowego PBS i rury w górę iw dół pięć razy. Pozwól fragmentom tkanki osiąść i zbierz supinat jako frakcję pierwszą.Powtórz procedury, aby zebrać frakcję od drugiej do frakcji piątej i oddzielić frakcje. Następnie dodaj 15 mililitrów lodu o nazwie PBS i energicznie potrząsaj ręcznie przez 15 sekund. Zbierz frakcję szóstą i powtórz procedury dla frakcji siódmej i frakcji ósmej.Jeśli kawałki tkanki zaczną unosić się na wodzie, postukaj w rurkę, aby pomóc im się uspokoić. Następnie sprawdzić podwielokrotność każdej frakcji pod kątem zagnieceń pod mikroskopem. To jest przykład złego ułamka, a to jest przykład dobrego ułamka.Zbierz ze sobą te, które zawierają Crips. Następnie przepuść wyciągnięte frakcje przez sitko z nylonu o grubości 70 mikronów i zbierz Crips w 50-mililitrowej tubie. Następnie odwirować próbkę o temperaturze 100 razy G przez pięć minut, cztery stopnie Celsjusza, wyrzucić supinat i ponownie zawiesić PT w 10 mililitrach lodowatego PBS z dwoma x antybiotykowymi środkami przeciwgrzybiczymi.Następnie przenieś Crips do 15-mililitrowej rurki i powtórz pranie jeszcze raz. Następnie umyj krypty raz 10 mililitrami lodowatego zimnego, zaawansowanego DF D-M-E-M-F 12 zawierającego dwa x antybiotyku przeciwgrzybiczego. Następnie umyj krypty raz 10 mililitrami DF zawierającego jeden x antybiotyk przeciwgrzybiczy.Następnie policz krypty za pomocą hemocytometru. Dostosuj objętość roztworu krypty i przenieś ją do probówki o pojemności 1,5 mililitra, tak aby końcowe stężenie krypty po ponownym zawieszeniu wynosiło od 100 do 200 krypt na 20 mikrolitrów galaretowatej mieszaniny białek. Następnie odwirować roztwór krypty w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń senes i ponownie zawieś krypty w galaretowatej mieszance białek. Następnie rozłóż 20 mikrolitrów zawiesiny mieszaniny białek galaretowatych krypty na dołek na 24-dołkowej płytce użytkowej. Przechowywać płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aż zawiesina zastygnie.Następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego, kompletnego podłoża hodowlanego do każdej studzienki i hoduj Crips, aż wyrosną na w pełni rozwinięte organoidy W tej procedurze należy uwodnić wkład przez noc w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyć organoidy 500 mikrolitrami DMEM. Po pięciu minutach dodaj do każdego 675 mikrolitrów pożywki testowej.W takim razie sprawdź mikroskopijną morfologię organoidów krypty pod kątem inkubacji ich w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie należy przygotować 10 mikromolowych związków do wstrzykiwań w pożywce testowej. Skonfiguruj wkład, ładując kolejno 75 mikrolitrów 10 mikromolowych związków do wstrzykiwań do portów wkładu.Następnie inkubuj wkład przez 30 minut do jednej godziny w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W tym samym czasie włącz analizator XF i utwórz szablon protokołu testu. Umieść wkład i płytkę użytkową w analizatorze XF i uruchom kalibrację wkładu Następnie załaduj płytkę do hodowli komórkowej do przyrządu i uruchom test.Pokazany tutaj protokół to organoidy krypty pochodzące od ośmiomiesięcznej czarnej myszy C 57 w ciągu dwóch dni lub 18 dni. Kultura. Rysunek ten przedstawia test metaboliczny z wykorzystaniem organoidów pochodzących od ośmiomiesięcznych czarnych myszy C 57, u których przedstawiono wskaźnik zużycia tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego. Krypty są oznaczone kolorem czerwonym, a formant jest oznaczony kolorem niebieskim.Odczynniki wstępnie załadowane do kartridża wstrzykiwano sekwencyjnie jako oligo mycyna, B-F-C-C-P i C-rotenon. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rakiem i metabolizmem do zbadania zmian metabolicznych w organoidach kryptowych pochodzących od pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć kryptę jelitową, metabolizm organoidów w czasie rzeczywistym.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy technikę izolowania całych krypt z jelita cienkiego myszy. Wyizolowane całe krypty mogą być wykorzystywane do rozmnażania długowiecznych i samoodnawiających się organoidów 3D in vitro.

Izolacja krypt jelitowych: metoda izolowania całych krypt z jelita cienkiego modelu myszy

W tym filmie opisujemy metodologię tworzenia systemu hodowli narządów jelitowych ex vivo w celu zbadania interakcji między fragmentami tkanki jelitowej myszy a specyficznymi bakteriami jelitowymi. Urządzenie składa się z dwóch par portów wejścia-wyjścia, z których pierwszy łączy światło tkanki jelitowej i dostarcza do niej specyficzną zawiesinę bakteryjną, a drugi w sposób ciągły dostarcza pożywkę do studzienek urządzenia w celu utrzymania żywotności tkanek ex vivo.

System hodowli narządów jelitowych ex vivo do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Opisujemy instrukcje krok po kroku, aby: 1) efektywnie konstruować organoidy jelitowe za pomocą nanocząsteczek magnetycznych do transdukcji soczewicowacej lub retrowirusowej, oraz 2) generować zamrożone skrawki z zmodyfikowanych organoidów. Podejście to zapewnia potężne narzędzie do efektywnej zmiany ekspresji genów w organoidach w celu zbadania dalszych efektów.

Inżynieria genetyczna pierwotnych organoidów jelitowych myszy z wykorzystaniem wektorów wirusowych transdukcji nanocząstek magnetycznych do zamrożonego cięcia

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Poznaj metodę analizy metabolicznej w czasie rzeczywistym organoidów krypt jelitowych myszy przy użyciu analizatora XF 24. Technika ta umożliwia pomiar zużycia tlenu i stężenia kwasu mlekowego w hodowlach 3D.

Analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy

Przeglądaj więcej filmów