Name: Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Naucz się nieinwazyjnej metody wstrzyknięć dożylnych u noworodków myszy w wieku jednego do dwóch dni. Ta technika umożliwia precyzyjne podawanie substancji testowych w badaniach chorób pediatrycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować NINDS, FightSMA i Families of SMA za wsparcie finansowe. SEGL jest wspierany przez grant szkoleniowy NINDS #5T32NS077984-02.

Wszystkie procedury wymienione w protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Instytutu Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Ohio.
1. Przygotowanie przestrzeni roboczej
<ol>
	<li>Zebrać mokry lód w celu znieczulenia młodych myszy, pustą klatkę w celu oddzielenia matki od ściółki, mikroskop preparacyjny, źródło światła, które można ustawić pod kątem do wstrzyknięcia (użycie źródła światła pod kątem 90° do miejsca wstrzyknięcia zasłania żyłę), czystą powierzchnię do umieszczenia zwierzęcia do wstrzyknięcia, bawełniane waciki, strzykawka insulinowa 3/10 cc z igłą 3/8" 30 G (jedna na zwierzę) i 1% roztworem Evans Blue Dye (wykonanym z roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) do treningu.</li>
	<li>Usuń zaporę do osobnej klatki podczas manipulowania szczeniętami.</li>
</ol>
2. Procedura iniekcji
<ol>
	<li>Umieść pojedynczego szczeniaka bezpośrednio na mokrym lodzie na 30-60 sekund, aby znieczulić zwierzę. Nie pozostawiaj zwierzęcia na lodzie zbyt długo ze względu na ryzyko powikłań związanych z hipotermią, w tym migotania komór, niedotlenienia tkanek i kwasicy metabolicznej. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że 30-60 sekund wystarczy, aby spowolnić ruchy szczeniaka i umożliwić wstrzyknięcie. Jeśli wymagane jest głębsze znieczulenie, odpowiednie mogą być leki wziewne, takie jak 1-2% izofluran.</li>
	<li>Gdy zwierzę znajduje się na lodzie, naładuj strzykawkę 30 μl niebieskiego barwnika Evans</li>.
	<li>Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, co potwierdza brak ruchu na lodzie podczas oddychania, przesuń je pod mikroskopem. W przypadku wstrzyknięcia praworęcznego należy skierować pysk zwierzęcia w prawo. Umieść lewy palec wskazujący na pysku, a lewy środkowy palec ogonowy na słuchawce dousznej, tak aby słuchawka znajdowała się między palcem wskazującym i środkowym (ryc. 1).</li>
	<li>Zbadaj tuż przed zatyczką uszną pod kątem powierzchownej naczynia włosowatego, która porusza się, gdy manipuluje się skórą. Ta kapilara NIE jest celem, jednak identyfikacja jest ważna dla identyfikacji żyły skroniowej. Następnie zlokalizuj ciemną, zacienioną żyłę poniżej naczynia włosowatego, która pozostaje nieruchoma niezależnie od ułożenia skóry. Żyła skroniowa wydaje się zacieniona, biegnie od grzbietu do brzusznej i zasila żyłę szyjną (ryc. 1).</li>
	<li>Wejdź do żyły skroniowej z igłą skośną do góry. Jeśli zostanie prawidłowo włożony, możliwe jest zobaczenie wypełnienia skosu igły krwią przez skórę. Następnie powoli wciśnij tłok i zwróć uwagę na blanszowanie żyły po boku twarzy.</li>
	<li>Pozwól, aby igła pozostała w żyle przez dodatkowe 10-15 sekund, aby zapobiec cofaniu się wstrzykiwanego środka.</li>
</ol>
3. Po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Po prawidłowym wstrzyknięciu szczenię powinno niemal natychmiast zmienić kolor na niebieski. Wyjąć igłę i delikatną siłą przyłożyć bawełniany wacik do miejsca wstrzyknięcia, aż krew zakrzepnie.</li>
	<li>Monitoruj szczeniaka pod kątem oznak niepokoju. Pozwól szczeniakowi na 2-3 minuty na regenerację i ponowne rozgrzanie, rozpoznaj, kiedy szczenię jest przytomne, wyprostowane i porusza się, zanim wróci do klatki. Umieść szczenięta w dłoniach badacza w rękawiczkach, aby zapewnić odpowiednie ciepło, które w razie potrzeby pomoże w powrocie do zdrowia. Alternatywnie, umieść poduszkę grzewczą pod klatką domową, aby ułatwić ogrzanie wstrzykniętego szczeniaka. Ogólnie rzecz biorąc, po wstrzyknięciu niebieskiego barwnika Evansa, należy poddać szczenięta eutanazji. Nie należy dodawać barwnika podczas wstrzykiwania badanego materiału.</li>
	<li>Umieść szczenię z powrotem w klatce domowej i upewnij się, że szczenię jest pokryte ściółką i/lub gniazdem, aby zapewnić ponowną akceptację przez matkę.</li>
	<li>Użyj nowej strzykawki i bawełnianego wacika dla każdego szczeniaka, aby zachować sterylność.</li>
</ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nature. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+scAAV9+delivery+of+a+codon-optimized+SMN1+sequence+rescues+SMA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice.</a> Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).</li>
<li>Rahim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+AAV2%2F9+to+the+fetal+and+neonatal+mouse+leads+to+differential+targeting+of+CNS+cell+types+and+extensive+transduction+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+spinal+muscular+atrophy+phenotype+in+a+mouse+model+by+early+postnatal+delivery+of+SMN%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN.</a> Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).</li>
<li>Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV-9+transduction+in+mice+is+influenced+by+animal+age+but+not+by+the+route+of+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration.</a> Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).</li>
<li>Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+transfer+into+the+CNS+across+the+BBB+after+neonatal+systemic+delivery+of+single-stranded+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors.</a> Brain research. 1389, 19-26 (2011).</li>
<li>Porensky, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+administration+of+morpholino+antisense+oligomer+rescues+spinal+muscular+atrophy+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse.</a> Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li>
<li>Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+neonatal+intravascular+injections%3A+modeling+newborn+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J. vis. Exp. (56), (2011).</li>
<li>Sands, M. S., Barker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+intravenous+injection+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animal+science%22%5BJournal%5D)">Percutaneous intravenous injection in neonatal mice.</a> Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).</li>
<li>Bevan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+heart+failure+in+the+SMNDelta7+model+of+spinal+muscular+atrophy+and+correction+by+postnatal+scAAV9-SMN+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery.</a> Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).</li>
<li>Valori, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+scAAV9+expressing+SMN+prolongs+survival+in+a+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy.</a> Science translational medicine. 2, (2010).</li>
<li>Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+intraperitoneal+or+intravenous+injections+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+8+transduce+dorsal+root+ganglia+and+lower+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons.</a> Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).</li>
<li>Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Joint%2C+bone%2C+spine+%3A+revue+du+rhumatisme%22%5BJournal%5D)">Gaucher disease.</a> Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).</li>
<li>Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+gene+transfer+leads+to+widespread+correction+of+pathology+in+a+murine+model+of+lysosomal+storage+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).</li>
<li>Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+systemic+clinical+disease+in+MPS+VII+mice+following+AAV-mediated+neonatal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer.</a> Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).</li>
<li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).</li>
<li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Bardet-Biedl syndrome.</a> European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).</li>
<li>Bevan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+delivery+in+large+species+for+targeting+spinal+cord%2C+brain%2C+and+peripheral+tissues+for+pediatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders.</a> Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neonatal+blood-brain+barrier+is+functionally+effective%2C+and+immaturity+does+not+explain+differential+targeting+of+AAV9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9.</a> Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wewnątrznaczyniowe dostarczanie środków do OUN lub w całym ciele jest trudne w mysich modelach choroby u noworodków. Opisany protokół jest szybkim, stosunkowo nieinwazyjnym sposobem dożylnego podawania roztworów noworodkom myszy przy minimalnych wymaganiach sprzętowych. Chociaż żyła skroniowa twarzy może być oglądana gołym okiem, zastrzyki mogą mieć większą dokładność przy użyciu mikroskopu i światłowodowego źródła światła, szczególnie w przypadku niewprawnego wstrzykiwacza. Wstrzyknięcia donaczyniowe u nowonarodzonych m...

Dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w mysich modelach chorób dziecięcych pozostaje wyzwaniem. Myszy, które modelują stany chorobowe noworodka, są niewymiarowe i niedojrzałe rozwojowo, a zatem mogą być trudne do bezpośredniego wstrzyknięcia w odpowiednie struktury w obrębie OUN. Donaczyniowe wstrzykiwanie środków leczniczych jest nieinwazyjną, dobrze tolerowaną metodą dostarczania komórek, leków lub wektorów wirusowych do całego organizmu, w tym do OUN1-5 i siatkówki3,5-9. Poprzednie publikacje opisywały iniekcję żyły skroniowej twarzy przy użyciu transiluminatora10,11, bez mikroskopu preparacyjnego11,12 lub wymagającą wstrzyknięcia10 przez dwie osoby. Technika wstrzykiwania opisana w tym protokole jest korzystna, ponieważ jedna osoba może wstrzykiwać młode, a źródło światła do oglądania żyły skroniowej nie dotyka szczeniaka, eliminując potrzebę stosowania taśmy chirurgicznej lub mocowania szczeniaka do stałej powierzchni, takiej jak transiluminator11. Dostarczenie wektora wirusowego związanego z adenowirusem serotypu 9 (AAV9) u myszy powoduje silną ekspresję w neuronach i astrocytach w całym mózgu i rdzeniu kręgowym (ryc. 1). Donaczyniowe dostarczanie wektorów wirusowych do powierzchownej żyły skroniowej twarzy było niezawodnie stosowane w różnych badaniach na nowonarodzonych myszach w leczeniu dziecięcego zaburzenia nerwowo-mięśniowego rdzeniowego zaniku mięśni (SMA)2,4,13,14 i ostatecznie wydłużyło życie leczonych myszy.
Wewnątrznaczyniowe wstrzyknięcie noworodkom myszy również skutecznie celuje w obwodowy układ nerwowy i narządy obwodowe (Rysunek 2). Po wstrzyknięciu AAV obserwowano transdukcję zwojów korzenia grzbietowego, wątroby, serca, mięśni szkieletowych, płuc i splotu mięśniowo-jelitowego1,3,6,7,15. Rozległa transdukcja OUN i obwodów sprawia, że ta metoda iniekcji jest idealna w chorobach wymagających globalnej ekspresji transgenu, takich jak choroba Gauchera16 i inne lizosomalne choroby spichrzeniowe17,18, choroba Battena i związane z nią neuronalne lipofuscynozy ceroidowe,19 oraz zespół Bardeta-Biedla - genetyczne zaburzenie wieloukładowe, którego objawy występują we wczesnym dzieciństwie20. Wstrzyknięcie donaczyniowe noworodkom myszy powinno być również uważane za nową metodę modelowania ogólnosystemowych chorób dziecięcych. Technika ta została przełożona na większe modele zwierzęce5,21, a wstrzyknięcie donaczyniowe już istnieje jako klinicznie akceptowalna metoda dostarczania leków.
Obecny protokół opisuje prostą, efektywną metodę dostarczania środków do noworodków myszy przez powierzchowną żyłę skroniową twarzy nie później niż w 2. dniu po urodzeniu. Wstrzyknięcie może być wykonane przez pojedynczego, doświadczonego osobnika i jest dobrze tolerowane zarówno przez młode, jak i matki. Szczenięta odczuwają minimalny stres i szybko wracają do zdrowia. Co ważne, udane wstrzyknięcie będzie skutkowało globalnym dostarczeniem podawanego środka. Protokół ten jest odpowiedni do dostarczania wektorów wirusowych, środków farmaceutycznych lub komórek nowonarodzonym myszom.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka insulinowa Thinpro</td><td>Terumo</td><td>SS30M3009</td><td>3/10 cc, igła 3/8", 30 G, 1 na mysz</td></tr><tr><td>Niebieski barwnik Evans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td>Rozcieńczony do 1% z 1x aplikatory z bawełnianą końcówką buforowaną fosforanem</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło światła</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Wstrzyknięcie dożylne jest klinicznie stosowanym sposobem dostarczania leków. W przypadku dorosłych gryzoni i większych zwierząt wstrzyknięcia dożylne są technicznie wykonalne i rutynowe. Jednak niektóre modele mysie mogą mieć wczesny początek choroby z szybkim postępem, który utrudnia podawanie potencjalnych terapii. Żyła skroniowa (lub twarzowa) znajduje się tuż przed zatyczką uszną u myszy i jest wyraźnie widoczna przez pierwsze dwa dni po urodzeniu po obu stronach głowy przy użyciu mikroskopu preparacyjnego. W tym oknie można wstrzyknąć do żyły skroniowej objętość do 50 μl. Iniekcja jest bezpieczna i dobrze tolerowana zarówno przez młode, jak i matki. Typowa procedura iniekcji jest wykonywana w ciągu 1-2 minut, po czym szczenię wraca do klatki domowej. W trzeciej dobie po porodzie żyła jest trudna do uwidocznienia, a procedura iniekcji staje się technicznie zawodna. Technika ta została wykorzystana do dostarczania wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV), które z kolei mogą zapewnić prawie całą cielesną, stabilną ekspresję transgenu przez całe życie zwierzęcia, w zależności od wybranego serotypu wirusa.

Podczas prawidłowej iniekcji żyła powinna na chwilę stać się przeźroczysta lub zblednąć. W przypadku wstrzykiwania barwnika całe szczenię powinno w ciągu kilku sekund stać się niebieskie. Jeśli doszło do nieprawidłowej iniekcji, często w okolicy głowy lub szyi pojawia się skoncentrowany bolus podskórny, a wstrzykiwana substancja może wyciekać z miejsca wkłucia. Nieprawidłowe iniekcje mogą również prowadzić do powstania siniaków wokół gardła. Szczenięta, które otrzymały zastrzyki podskórne (i.e. iniekcja nie zost...

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Ogólnym celem tej procedury jest dożylne dostarczenie badanego artykułu nowonarodzonemu myszowi. Osiąga się to poprzez najpierw zidentyfikowanie myszy w wieku od jednego do dwóch dni, które mają być leczone. Drugim krokiem jest przygotowanie materiałów iniekcyjnych.Następnie wykonuje się iniekcję. Ostatnim krokiem jest zwrócenie leczonych i obudzonych myszy ich matce. Ostatecznie wymagany jest dalszy test w celu ustalenia, czy badany artykuł ma pożądany efekt.Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie mają największe trudności z identyfikacją i celowaniem w odpowiednią żyłę. Na początek należy zebrać cały sprzęt potrzebny do wykonania zabiegu iniekcji. Ponadto należy przygotować 1% niebieski barwnik Evansa w PBS i jedną strzykawkę insulinową z igłą o rozmiarze 30 na zwierzę do wstrzyknięcia.Następnie usuń zaporę do osobnej klatki, manipulując szczeniętami. Kiedy będzie gotowy. Umieść pojedynczego szczeniaka bezpośrednio na mokrym lodzie na 30 do 60 sekund.Do znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia na lodzie zbyt długo ze względu na ryzyko powikłań związanych z hipotermią, gdy zwierzę znajduje się na lodzie. Strzykawka Lotus z 30 mikrolitrami niebieskiego barwnika Evana.Gdy zwierzę jest już w pełni znieczulone, co potwierdza brak ruchu na lodzie podczas oddychania, przesuń je pod mikroskopem w celu wstrzyknięcia praworęcznego, umieść pysk zwierzęcia we właściwym miejscu. Lewy palec wskazujący na pysku i lewy środkowy palec przytulony do wkładki dousznej tak, aby wkładka douszna znajdowała się między palcem wskazującym a środkowym. Zbadaj tuż przed wkładką douszną powierzchowną naczynkę, która porusza się, gdy manipuluje się skórą.Ta kapilara nie jest celem. Jednak identyfikacja jest ważna dla identyfikacji żyły skroniowej. Następnie zlokalizuj ciemną zacienioną żyłę poniżej naczynia włosowatego, która pozostaje nieruchoma niezależnie od pozycji skóry.Żyła skroniowa wydaje się zacieniona, biegnie grzbietowo do brzusznej i zasila żyłę szyjną. Wejdź do żyły skroniowej z igłą skośną do góry. Jeśli jest prawidłowo włożony.Możliwe jest obejrzenie wypełnienia skosu igły krwią przez skórę. Następnie powoli wciśnij tłok i zwróć uwagę na blednięcie żyły po boku twarzy. Pozostawić igłę w żyle przez dodatkowe 10 do 15 sekund, aby zapobiec cofaniu się wstrzyknięcia.Po prawidłowym wstrzyknięciu szczenię powinno zmienić kolor na niebieski. Niemal natychmiast. Wyjąć igłę i delikatną siłą przyłożyć bawełniany wacik do miejsca wstrzyknięcia, aż krew zakrzepnie.Pozwól szczeniakowi na dwie do trzech minut, aby doszedł do siebie i ponownie się rozgrzał. Upewnij się, że szczeniak jest przytomny, wyprostowany i porusza się. Przed powrotem do klatki szczenięta mogą zostać złożone w dłoniach badacza w rękawiczkach, aby zapewnić odpowiednie ciepło, które pomoże w powrocie do zdrowia.Alternatywnie, umieść poduszkę grzewczą pod klatką domową, aby ułatwić ogrzanie wstrzykniętego szczeniaka. Umieść szczeniaka z powrotem w domowej klatce i przykryj ściółką. Aby zapewnić akceptację reac przez matkę, użyj nowej strzykawki i bawełnianego wacika dla każdego szczeniaka, aby utrzymać bezpłodność po dożylnym wstrzyknięciu noworodkom ekspresji transgenu A V nine Inod GFP jest widoczna w całym mózgu, w tym w przednim prążkowiu, a także w moście i móżdżku.Ekspresja GFP jest również wykrywana w rdzeniu kręgowym i jest obserwowana zarówno w neuronach ruchowych rdzenia, jak i neuronach zwojów korzenia grzbietowego. Immunofluorescencja GFP jest wykrywalna u dorosłej myszy, serca i wątroby po dożylnym wstrzyknięciu noworodkowi samouzupełniającego się A A V nine GFP. Dla porównania, ekspresja GFP jest nieobecna w sercu i wątrobie myszy, którym wstrzyknięto unin po opanowaniu.Ta technika powinna zająć od trzech do pięciu minut na zwierzę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać zastrzyki dożylne nowonarodzonym myszom.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Źródło: Seman, B. G. i in. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Film prezentuje model noworodkowej myszy do badania infekcji ogólnoustrojowej z użyciem zamkniętych bakterii bioluminescencyjnych. Noworodki są wstrzykiwane wysokodawkowymi lub niskodawkowymi zawiesinami bakteryjnymi i zwracane matce na opiekę poporodową. Otoczone bakterie unikają wczesnego wykrywania odpornościowego, rozprzestrzeniają się systemowo i są wizualizowane w czasie za pomocą...

Modelowanie infekcji u noworodkowych myszy z użyciem kapsulowanych bioluminescencyjnych bakterii

Ten film demonstruje proces wstrzykiwania do komory mózgowej w celu zbadania dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii (MCMV) w mózgu noworodka myszy. MCMV, zaprojektowany do ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) zapewniającego widoczność, jest wstrzykiwany do bocznej komory mózgu szczeniaka myszy. Wstrzyknięty wirus krąży w płynie mózgowo-rdzeniowym, infekując komórki w okolicy okołokomorowej, w tym w strefie brzeżnej, splocie naczyniówkowym i strefie podkomorowej.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe w celu analizy dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii w mózgu noworodka myszy

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Opisujemy protokół przeprowadzania przeszczepu in utero (IUT) poprzez dożylne i dożylne drogi iniekcji w modelu mysim. Protokół ten może być stosowany do wprowadzania komórek, wektorów wirusowych i innych substancji do unikalnego środowiska płodu tolerancyjnego na odporność.

Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie powtarzalnej drogi podawania dożylnego, która może być stosowana u szczurów i myszy przez cały okres noworodkowy. Procedura ta jest ważna dla przedklinicznych badań na gryzoniach, które mają na celu odzwierciedlenie podawania leków na oddziałach opieki neonatologicznej, głównie przy użyciu podawania dożylnego.

Model iniekcji żyły zaoczodołowej u noworodków gryzoni

Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Ten protokół pokazuje wstrzyknięcie do żyły skroniowej w celu dostarczenia dożylnego komórek raka u dzieci noworodkom myszy, umożliwiając precyzyjne, możliwe do powtórzenia modelowanie wczesnych reakcji immunologicznych przeciwko rakiem. Metoda ta umożliwia ocenę wpływu interwencji, takich jak immunomodulacja czy terapia, kiedy są one zastosowane w okresie noworodkowym.

Model noworodka dożylnego przeszczepu do oceny działań odpornościowych we wczesnym okresie życia przeciwko komórkom nowotworowym

Naucz się nieinwazyjnej metody wstrzyknięć dożylnych u noworodków myszy w wieku jednego do dwóch dni. Ta technika umożliwia precyzyjne podawanie substancji testowych w badaniach chorób pediatrycznych.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Przeglądaj więcej filmów