Name: Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj model uszkodzenia płuc wywołanego Pseudomonas aeruginosa u myszy poprzez iniekcję dotchawiczą. Ta metoda pozwala badać zapalenie, śmierć komórek i mechanizmy naprawy płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM).

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami oraz Instytucjonalne Komitety Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Illinois w Chicago.
UWAGA: Wszystkie procedury z użyciem pseudomonas powinny być wykonywane zgodnie z praktykami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), które obejmują między innymi: maskę, ochronę oczu, fartuch lub kombinezon oraz podwójne rękawice. Praca w certyfikowanym Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego. Narzędzia mające kontakt z bakteriami należy traktować wybielaczem lub środkiem dezynfekującym na bazie dwutlenku chloru. Do transportu próbek należy używać zapieczętowanego pudełka.
1. P. aeruginosa Kultura i wzrost
<ol>
	<li>Przechowywać P. aeruginosa PA103 jako wywar bakteryjny w zakrętce kriowialnej w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Umieść fiolkę w stojaku w pudełku z ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem i zabierz do laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2).</li>
	<li>Umieść bakterie na płytkach agarowych z krwią owczą i hoduj w temperaturze 37 °C przez ~15 godzin w inkubatorze.</li>
	<li>W kapturze BSL2 zdrap bakterie z płytki za pomocą pętli na bakterie i ponownie zawieś w 5 ml PBS.</li>
	<li>Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Miano należy jednak ustalać co 2 tygodnie.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć bakterie w PBS (zwykle od 1:104 do 1:107) i usunąć znane rozcieńczenie na płytkach agarowych z krwią owczą.</li>
	<li>Inkubuj płytki przez ~ 15 godzin. Policz kolonie i oblicz jednostkę tworzącą kolonię (CFU), aby określić stężenie bakterii.</li>
	<li>Zawiesić odpowiednie stężenia (~5 x 103 jtk/μl) w 0,5 ml PBS w 1,5 ml sterylnych kriowialiach z zakrętką. Zapieczętuj kriowiale i umieść je w stojaku kriowialnym na ręcznikach papierowych zawierających środek dezynfekujący w pudełku z zatrzaskową pokrywą.</li>
	<li>Przetransportuj pudełko do zakładu dla zwierząt BSL2. Tam otwórz pudełko w szafce BSL2.</li>
</ol>
2. Wkraplanie P. aeruginosa
<ol>
	<li>Przeprowadzanie operacji przetrwania w sposób aseptyczny (sterylne rękawice, sterylne narzędzia i techniki aseptyczne). Użyj sterylnej serwety, aby zapewnić powierzchnię roboczą dla sterylnych (autoklawowanych) narzędzi chirurgicznych. Sterylizuj narzędzia za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami między każdą procedurą wkraplania tchawicy.</li>
	<li>Zważ myszy przed znieczuleniem. Znieczulić myszy ketaminą (100 mg / kg), ksylazyną (5 mg / kg), w 0,1 - 0,2 ml PBS dootrzewnowo (i.p.). Określ skuteczność środka znieczulającego na podstawie braku reakcji na szczypanie palca. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.</li>
	<li>Unieruchamiaj myszy na desce chirurgicznej w szafce BSL2.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar do wycięcia. Ogol ten obszar i przygotuj skórę za pomocą naprzemiennych wacików z alkoholem i jodopowidonem 3 razy.</li>
	<li>Obszar nacięcia należy potraktować środkiem znieczulającym miejscowo (lidokainą), ponieważ znieczulenie to jest wystarczające do wykonania drobnej operacji, takiej jak nacięcie skóry, aby uzyskać dostęp do tchawicy.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (około 5 mm) w linii środkowej szyi i użyj kleszczy, aby delikatnie przesunąć mięsień, aby uzyskać dostęp do tchawicy. Odsłoń tchawicę przez chirurgiczne rozwarstwienie.</li>
	<li>Pobrać roztwór bakterii do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G. Na każdą mysz należy podać 20-30 μl bakterii w odpowiednim stężeniu (do 105 CFU na każdą mysz).</li>
	<li>Wbić igłę do tchawicy. Powoli wstrzykiwać roztwór do tchawicy.</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzę sapie, co zwykle oznacza, że roztwór dotarł do płuc.</li>
	<li>Zamknąć ranę sterylnymi szwami (6-0 monofilament) w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Stosować 0,1 mg/kg buprenorfiny we wstrzyknięciu podskórnym jako analgezję pooperacyjną w celu opanowania bólu pooperacyjnego.</li>
	<li>Upewnij się, że czas wymagany od wstępnej indukcji znieczulenia do zamknięcia nacięcia jest krótszy niż 15 minut.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu strzykawki i igły należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Narzędzia chirurgiczne należy potraktować środkiem dezynfekującym na bazie dwutlenku chloru przez 15 minut, spłukać i wrócić do laboratorium w celu sterylizacji i ponownego użycia w razie potrzeby.</li>
	<li>Trzymaj myszy pojedynczo w czystych klatkach w ciepłym otoczeniu.</li>
	<li>Sprawdzaj stan zwierzęcia co 30 minut, aż odzyska przytomność i zacznie się poruszać, a później w odstępach 12-godzinnych przez pierwsze 3 dni po operacji.</li>
	<li>Trzymaj myszy w obiekcie BSL2 dla zwierząt przez cały czas trwania eksperymentu. Upewnij się, że tylko tkanka zawarta w szczelnie zamkniętym pudełku opuszcza zakład BSL2 dla zwierząt. Jeśli myszy wyrażają którekolwiek z konających zachowań (zdefiniowanych jako niewydolność oddechowa, letarg, brak poruszania się w odpowiedzi na delikatną stymulację) w dowolnym momencie badania, należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 ze źródła w butelce, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Poddaj obiekt eksperymentalnemu eutanazji przez wykrwawienie w znieczuleniu.
	<ol>
		<li>Zbierz tkankę płucną od myszy poddanych eutanazji. Wykonaj te procedury w okapie BSL2. W razie potrzeby przenieść próbkę za pomocą szczelnie zamkniętych probówek umieszczonych w stojaku na ręcznikach papierowych zawierających środek dezynfekujący w pudełku z zatrzaskową pokrywą w celu dalszego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li>
<li>Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li>
<li>Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+and+repair+in+lung+and+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Injury and repair in lung and airways.</a> Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).</li>
<li>Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+adult+lung%3A+Their+development+and+role+in+homeostasis%2C+regeneration%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).</li>
<li>Singleton, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+2+and+c-abl+are+novel+regulators+of+hyperoxia-mediated+nadph+oxidase+activation+and+reactive+oxygen+species+production+in+caveolin-enriched+microdomains+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium.</a> J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-host+interactions+in+pseudomonas+aeruginosa+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxm1+mediates+the+progenitor+function+of+type+ii+epithelial+cells+in+repairing+alveolar+injury+induced+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa.</a> J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).</li>
<li>Kurahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+septic+shock+in+pseudomonas+aeruginosa+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia.</a> J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).</li>
<li>Kumar, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+airway+stem+cells+yield+alveoli+in+vitro+and+during+lung+regeneration+following+h1n1+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection.</a> Cell. 147, 525-538 (2011).</li>
<li>Delano, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+induces+early+alterations+in+innate+immunity+that+impact+mortality+to+secondary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection.</a> J Immunology. 186, 195-202 (2011).</li>
<li>Lange, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+sepsis+following+smoke+inhalation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A murine model of sepsis following smoke inhalation injury.</a> Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).</li>
<li>Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chemokines+in+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of chemokines in neutrophil biology.</a> Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).</li>
<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).</li>
<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+immunomodulation+of+the+nf-kappab+pathway+in+airway+epithelium+impacts+host+defense+against+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa.</a> J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).</li>
<li>Pinto, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+experimental+model+of+neutrophilic+pulmonary+response+induction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pneumologia%22%5BJournal%5D)">Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice.</a> J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Model uszkodzenia płuc myszy Pseudomonas, który tutaj opisujemy, naśladuje cały proces zapalenia, uszkodzenia płuc, naprawy i ustąpienia, które występują po ostrym uszkodzeniu płuc lub zapaleniu płuc. Ma wyjątkowe zalety w porównaniu z kilkoma innymi modelami urazów, ponieważ jest klinicznie istotny, stosunkowo bezpieczny i łatwy w obsłudze.
Krytycznym krokiem w procedurze jest to, że wstrzykiwanie roztworu bakteryjnego musi być bardzo powolne. Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt szybkie, myszy praw...

Płuca są narażone na patogeny środowiskowe i są podatne na stany zapalne i urazy1-3. W stanach patologicznych, takich jak zapalenie płuc lub zespół niewydolności oddechowej dorosłych (ARDS), patogeny, a także czynniki zapalne uwalniane przez leukocyty wywołują uszkodzenie i śmierć komórek pęcherzyków płucnych1-3. Ważne jest opracowanie modeli zwierzęcych ostrego uszkodzenia płuc, aby ułatwić badanie patologii urazu, a także mechanizmu naprawy.
Obecnie, większość ludzi korzysta z modeli uszkodzeń płuc myszywywołanych hiperoksją i bleomycyną 4. Jednak mechanizmy urazu spowodowanego hiperoksją nie są takie same, jak w przypadku najczęstszych urazów płuc, które występują podczas zapalenia płuc lub ARDS5. Ostre uszkodzenie wywołane bleomycyną jest rzadkie w kontekście klinicznym4. Tutaj przedstawiamy model uszkodzenia płuc myszy przy użyciu wstrzyknięcia dotchawniczego P. aeruginosa 6,7. Model ten jest istotny klinicznie i naśladuje procesy zachodzące po zapaleniu płuc8.
Jako oportunistyczny, szpitalny patogen osób z obniżoną odpornością, P. aeruginosa zazwyczaj infekuje drogi oddechowe, drogi moczowe, oparzenia, rany, a także powoduje inne infekcje krwi6. Bakterie uwalniają czynnik wirulencji egzotoksynę A, namnażają się i wywołują odpowiedź immunologiczną6. Dotchawicze podawanie P. aeruginosa do tchawicy odzwierciedla sytuację w narażeniu ludzi na bakterie wywołujące zapalenie płuc, a patologia prawdopodobnie różni się od niedawno zgłoszonego uszkodzenia płuc wywołanego wirusem grypy H1N1 model9. Ponieważ P. aeruginosa jest patogenem oportunistycznym, jest stosunkowo bezpieczny w obsłudze w porównaniu z niektórymi bardziej zjadliwymi patogenami. Tutaj zastosowaliśmy wstrzyknięcie dotchawicze do podania bakterii, ponieważ zaobserwowaliśmy, że ta metoda wprowadziła więcej bakterii do dystalnego obszaru pęcherzyków płucnych w porównaniu z niektórymi innymi procedurami, takimi jak użycie cewnika przez usta.
W porównaniu z innymi modelami ostrego uszkodzenia płuc, opisany tutaj model P. aeruginosa jest odpowiedni do badania uszkodzeń płuc wywołanych przez bakterie i nadmierny stan zapalny. W przeciwieństwie do innych modeli zwierzęcych, które wykorzystują P. aeruginosa do wywoływania sepsy10,11, tutaj używamy wstrzyknięcia tych bakterii do tchawicy w celu wywołania miejscowego ostrego uszkodzenia płuc.

<table><tbody><tr><td>Środek znieczulający: ketamina, ksylazyna, lidokaina, buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>igła farmaceutyczna 27 G</td><td></td> Strzykawka <td>Fisher 1482648</td><td></td></tr> Nożyczki <tr><td></td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>1 ml</td></tr><tr><td></td><td>Kleszcze do narzędzi</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Szycie narzędzi</td><td></td><td></td>Fine Science</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>19-037-526</td><td></td></tr><tr><td>Miernik oczu, rękawica, fartuch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabinet bezpieczeństwa biologicznego Środek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>dezynfekujący na bazie dwutlenku chloru</td><td></td></tr><tr><td>Płytki agarowe z krwią owczą Clidox&nbsp;</td><td>Zasilacz Medex</td><td>HL-1160</td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa model indukowanego uszkodzenia płuc

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Aby badać ostre uszkodzenia płuc i zapalenie płuc u ludzi, ważne jest opracowanie modeli zwierzęcych, które naśladowałyby różne patologiczne cechy tej choroby. Tutaj opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa lub PA). Korzystając z tego modelu, udało nam się wykazać stan zapalny płuc we wczesnej fazie urazu. Ponadto zaobserwowano nieszczelność bariery nabłonkowej pęcherzyków płucnych, analizując płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL); i śmierć komórek wyrostka zębodołowego obserwowano za pomocą testu tunelowego z wykorzystaniem tkanki przygotowanej z uszkodzonych płuc. W późniejszej fazie po urazie zaobserwowaliśmy proliferację komórek niezbędną do procesu naprawy. Uraz ustąpił po 7 dniach od rozpoczęcia iniekcji P. aeruginosa. Model ten naśladuje sekwencyjny przebieg zapalenia płuc, urazu i naprawy podczas zapalenia płuc. Ten klinicznie istotny model zwierzęcy nadaje się do badania patologii, mechanizmu naprawy po ostrym uszkodzeniu płuc, a także może być wykorzystany do testowania potencjalnych środków terapeutycznych dla tej choroby.

Od 24 do 72 h po iniekcji P. aeruginosa obserwowano zwiększoną komórkowość w przekrojach płuc (Rycina 1A-D). Płuca zaczęły regenerować się od 96 h po urazie (Rycina 1E). W 7. dniu po podaniu P. aeruginosa w dużej mierze przywrócono prawidłową morfologię pęcherzyków pęcherzyków płucnych (Rycina 1F). Barwienie metodą TUNEL w przekrojach płuc przygotowanych 24 h po podaniu P. aeruginosa wykazało śmierć komórek w pęcherzykach płucnych (Ryci...

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Ogólnym celem tej procedury jest naśladowanie zapalenia płuc, stanów uszkodzenia płuc u myszy poprzez podawanie Pseudomonas aerogen. W tym celu należy najpierw przygotować Pseudomonas w odpowiednim stężeniu do wstrzyknięcia. W drugim etapie tchawica myszy jest ostrożnie odsłaniana, a następnie bakterie są podawane do płuc przez wstrzyknięcie dotchawicze.W ostatnim kroku postęp choroby u myszy jest dokładnie monitorowany. Ostatecznie zapalenie płuc, zmiany w śmierci komórek w barierze pęcherzykowej i naprawa płuc mogą być badane w płucach myszy, którym wstrzyknięto Pseudomonas aerogen. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku leczenia ostrego uszkodzenia płuc spowodowanego zapaleniem płuc.Ponieważ model ten naśladuje procesy zachodzące po zapaleniu płuc Aby stworzyć kwaty p Aerogen, PA 1 0 3 do instalacji rozpocznij od transportu kriofiolki z bakteriami od minus 80 stopni Celsjusza, przechowywania do drugiego lub drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium BSL dwa w stojaku w pudełku wyłożonym ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem. Następnie pod smugą BSL z dwoma kapturami, kolonie bakterii P aerogen PA 1 0 3 umieszcza się na płytkach agarowych z krwią owczą i wyrasta z kolonii w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po około 15 godzinach użyj pętli bakteryjnej, aby przenieść kolonie do pięciu mililitrów PBS.Następnie seryjnie rozcieńczyć bakterie w większej ilości PBS do jednego do 10, do czterech, do jednego do 10 do siedmiu stężeń, rozcieńczyć rozcieńczenie na świeżych płytkach agarowych z krwią owczą. Następnie, po około 15 godzinach inkubacji, oblicz jednostki tworzące kolonie dla każdej płytki, aby określić stężenie bakterii. Następnie Eloqua odpowiednią ilość bakterii w 0,5 mililitra PBS w 1,5 mililitra, sterylne fiolki kriogeniczne z zakrętką, a następnie umieść fiolki zamknięte w stojaku na fiolki kriogeniczne na ręcznikach papierowych zawierających środek dezynfekujący w pudełku z zatrzaskową pokrywką w dwóch szafkach BSL, delikatnie zakryj oczy zwierzęcia działającą maścią wetową.Szybko ogol nacięcie i oczyść skórę za pomocą naprzemiennych wacików z alkoholem i jodowidonem trzy razy i potwierdź sedację palcem u nogi. Uszczypnij, unieruchamiaj mysz na desce chirurgicznej po potraktowaniu skóry środkiem znieczulającym miejscowo. Następnie wykonaj małe pięciomilimetrowe nacięcie na linii środkowej szyi zwierzęcia i użyj kleszczy, aby delikatnie przesunąć mięsień, aby uzyskać dostęp do tchawicy.Po wystawieniu tchawicy należy pobrać do jednej razy 10 do pięciu jednostek tworzących kolonię bakterii w 20 do 30 mikrolitrach PBS do jednomililitrowej jednorazowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27. Następnie włóż igłę do tchawicy i powoli wstrzyknij roztwór. Upewnij się, że zwierzę sapie, co zwykle oznacza, że roztwór dotarł do płuc.Teraz aseptycznie zamknij ranę sześcioma sterylnymi szwami monofilamentowymi i podaj analgezję pooperacyjną. Następnie po wstrzyknięciu każdego zwierzęcia należy wyrzucić strzykawki i igły do odpowiedniego pojemnika na ostre narzędzia stanowiące zagrożenie biologiczne. Jak się mają myersy pojedynczo w czystych klatkach w ciepłym otoczeniu?Sprawdzanie zwierząt co 30 minut, aż odzyskają przytomność i zaczną się poruszać. Traktuj narzędzia chirurgiczne środkiem dezynfekującym z dwutlenkiem chloru przez 15 minut. Następnie wypłucz i zwróć narzędzia do laboratorium w celu dalszej sterylizacji, jeśli to konieczne.Trzymaj myszy w obiekcie dla dwóch zwierząt BSL przez cały czas trwania eksperymentu, a następnie po wykrwawieniu w znieczuleniu zbierz tkankę płucną od każdego zwierzęcia pod kapturem BSL dwa. Na koniec, jeśli pożądane jest dalsze przetwarzanie, przenieść próbki w szczelnie zamkniętych probówkach umieszczonych na stojaku na ręcznikach papierowych zawierających środki dezynfekujące w pudełku z zatrzaskową pokrywą do odpowiedniego zakładu przetwarzania. W tym reprezentatywnym eksperymencie po 24 do 72 godzinach od wstrzyknięcia aerogenu P można zaobserwować zwiększoną komórkowość w odcinkach płuc.Po 96 godzinach płuca zaczęły się regenerować, a po siedmiu dniach normalna morfologia pęcherzyków płucnych jest w dużej mierze przywrócona. Barwienie tunelowe wycinków płuc wykonane 24 godziny po instalacji aerogenu P wykazuje śmierć komórek w komórkach pęcherzyków płucnych w celu zbadania procesu naprawy. W tym urazie model BRDU może być wstrzykiwany myszom trzy dni po podaniu p aerogenu.Jak pokazano, zwierzęta leczone aerogenem p wykazują nadmierną proliferację w tkance płucnej w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi leczonymi. Aby zbadać zmiany w barierze, przepuszczalności i stanie zapalnym po urazie, można pobrać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe lub płyn jelitowy w różnych punktach czasowych. Na przykład po wstrzyknięciu p aerogenu stężenie białka w jelicie jest znacznie zwiększone po 48 godzinach od instalacji bakteryjnej, co wskazuje na nieszczelność bariery nabłonkowej liczby komórek.W tym czasie jelita są również znacznie zwiększone, co sugeruje reakcję zapalną po czterech do pięciu dniach od wstrzyknięcia aerogenu P, zarówno poziom białka w jelitach, jak i liczba komórek zaczynają się zmniejszać, co sugeruje powrót do zdrowia. Co więcej, poziom białka zapalnego makrofagów 2, cytokiny biorącej udział w przyciąganiu neutrofili, znacznie wzrasta po 48 godzinach, a następnie powraca do poziomu podstawowego po 96 godzinach. W lizatach płuc bez aerogenu p obserwuje się tylko niewielką liczbę monocytów w płynie jelitowym.Natomiast w jelicie obecna jest duża liczba neutrofili, wyizolowanych po 48 godzinach od wstrzyknięcia. Po 96 godzinach skład komórek jelita powraca do poziomów kontrolnych Po tej procedurze. Inne metody, takie jak histologiczne, cięcie lub pobieranie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: które komórki lub czynniki są zaangażowane w stan zapalny i naprawę po ostrym uszkodzeniu płuc?

pseudomonas-aeruginosa-induced-lung-injury-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Opisano proste metody demonstrowania produkcji cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa.

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Przedstawiona tutaj jest procedura krok po kroku do wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydu dotchawiczego i przeprowadzenie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, dobra odtwarzalność i miareczkowanie ciężkości choroby to zalety tego podejścia.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Poznaj model uszkodzenia płuc wywołanego Pseudomonas aeruginosa u myszy poprzez iniekcję dotchawiczą. Ta metoda pozwala badać zapalenie, śmierć komórek i mechanizmy naprawy płuc.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

Przeglądaj więcej filmów