Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Celem tej procedury jest wykrycie i dokładne określenie ilościowe względnej obfitości określonych białek w złożonej próbce biologicznej za pomocą ilościowego, fluorescencyjnego skręcania i blottingu. Osiąga się to za pomocą pierwszych elektrofluorescencyjnie oddzielonych ekstraktów białkowych przy użyciu prefabrykowanego żelu gradientowego. W drugim etapie równoważne obciążenie białkiem jest weryfikowane na wszystkich torach próbki poprzez zastosowanie całkowitego barwienia białka, a następnie do przeniesienia próbek na membranę A-P-V-D-F stosuje się półsuchy system szybkiego transferu z blokiem oczu.

Na koniec białka są badane za pomocą specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych, a następnie odpowiednich przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluorescencyjnie, aby ułatwić ich czułe, solidne i liniowe wykrywanie w podczerwieni i dalekiej czerwieni. Ostatecznie, ilościowe fluorescencyjne kwitnienie zachodnie może być wykorzystane do powtarzalnego wykrywania, wizualizacji i dokładnego oznaczania ilościowego dużej liczby białek związanych z błoną i rozpuszczalnych w szerokim zakresie próbek tkanek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie oparte na ECL, jest to, że pozwala ona na większą czułość i zwiększoną precyzję w szerokiej skali liniowej w celu uzyskania prawdziwie ilościowego odczytu Rozpocznij od ręcznej maceracji próbki tkanki, a następnie homogenizuj w świeżo przygotowanym buforze ekstrakcyjnym przy masie około jednej do 10 tkanki na objętość buforu, aż do uzyskania gładkiego, spójnego homogenatu.

Następnie odwiruj lizat komórkowy przez 20 minut w temperaturze 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przenieś sat zawierający rozpuszczone białka do czystej probówki z mikrowirówką i przechowuj zarówno osady, jak i frakcje supernatantu S w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Po oznaczeniu stężenia białka w supinacie przenieść 15 mikrogramów białka na próbkę do nowych probówek do mikrowirówek.

Następnie doprowadź końcową objętość każdej próbki do 10 mikrolitrów wodą destylowaną i dodaj pięć mikrolitrów bufora ładującego Forex. Dokładnie wymieszaj roztwory komórkowe przez wirowanie, a następnie podgrzej próbki w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby zdenaturować białka. Po denaturacji dodać trzy mikrolitry odpowiedniego wzorca masy cząsteczkowej do pierwszego dołka każdego z żeli doświadczalnych i kontrolnych.

Następnie po elektroforezie załadować 10 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich kolejnych studzienek. Użyj noża do żelu, aby uwolnić żele z kasety i usuń dołki i stopkę żelu. Zaznacz żel, aby pomóc w późniejszej orientacji.

Następnie, aby określić równoważne obciążenie białkiem, zdekantuj około 30 mililitrów barwnika białkowego na kwadratową szalkę Petriego o wymiarach 12 na 12 centymetrów i umieść żel kontrolujący ładowanie w barwie, upewniając się, że roztwór pokrywa cały żel. Delikatnie mieszaj żel przez minimum godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzuć plamę białkową i umyj żel trzy razy w wodzie destylowanej przed wizualizacją bloku oczu. Dwa półsuche szybkie przenoszenie białek Po elektroforezie przygotować dolny stos transferowy, zdejmując foliową osłonę i wstępnie zwilżając membranę buforem roboczym bezpośrednio ze zbiornika żelu.

W tym czasie ponownie zwilż bibułę filtracyjną wodą destylowaną. Następnie nałóż eksperymentalny żel na przygotowany dolny stos transferowy, a następnie połóż bibułę filtracyjną przed obróbką na żelu i zwiń je oba, aby upewnić się, że między warstwami nie zostaną uwięzione żadne pęcherzyki. Połóż górny stos na bibule filtracyjnej i dolnym stosie.

Następnie zwiń kanapkę ze stosem transferowym, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki powietrza. Włóż gąbkę z zestawu do przenoszenia stosu na wkładkę chłonną i umieść kanapkę z stosem transferowym w przeznaczonym do tego miejscu. Następnie dokładnie zamknij pokrywę i rozpocznij blok I dwa, przenosząc białka przez siedem minut w programie trzecim.

Po zakończeniu programu wyjmij stos transferowy z maszyny do blokowania oczu i odklej górny stos transferowy i warstwy bibuły filtracyjnej, odsłaniając żel na dolnym stosie transferowym. Użyj skalpela, aby przeciąć wokół żelu, uważając, aby wykonać trójkątne cięcie w celach orientacyjnych na membranie po przycięciu membrany, aby sprawdzić barwienie białka o wydajności przenoszenia, żel, jak właśnie pokazano, a następnie szybko przenieś membranę do czystej 50-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów PBS dla pierwszego z trzech, Pięciominutowe mycie na wałku mechanicznym. Po trzecim przemyciu należy odrzucić bufor do przemywania i inkubować błonę w nierozcieńczonym buforze blokującym przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować błonę w pierwotnym przeciwciałie rozcieńczonym w pięciu mililitrach buforu blokującego i 0,1 między 20 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym mieszaniu. Następnego ranka, po odrzuceniu roztworu przeciwciała pierwotnego, przemyj membranę sześć razy przez pięć minut w PBS, jak właśnie pokazano. Następnie inkubować błonę w ciemności z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym, rozszerzonym w pięciu mililitrach buforu blokującego i 0,1% między 20 przy ciągłym mieszaniu, a następnie sześć pięciominutowych płukań PBS dla całego obrazowania.

Najpierw zaloguj się do komputera i imagera. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania, aby zobrazować western blot. Najpierw otwórz pokrywę wywoływarki i wylej niewielką ilość PBS na szkło.

W lewym dolnym rogu wyczuwalnika umieść membranę na górze PBS, upewniając się, że jest prostopadła do osi wyczuwalnika i że między membraną a osią siatki pozostała jednocentymetrowa przerwa. Zwiń membranę, aby upewnić się, że między szkłem a membraną nie utknęły pęcherzyki, a następnie policz liczbę kwadratów zajmowanych przez membranę na osiach x i y. Następnie zamknij pokrywę wywoływarki i wprowadź liczbę kwadratów do oprogramowania komputerowego.

Wybierz odpowiedni kanał podczerwieni i odpowiednią intensywność, a następnie rozpocznij skanowanie, aby zobrazować całkowite zabarwienie białka żelu kontrolującego ładowanie. Napraw żel i imager, jak właśnie pokazano dla eksperymentalnej membrany, a następnie wybierz kanał 700. Ustaw intensywność na pięć i rozpocznij skanowanie.

Aby określić ilościowo dane skanowania. Zacznij od dostosowania przycisków jasności i kontrastu zeskanowanego pliku, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu, obracając obrazy niezbędne do uzyskania żądanej orientacji. Następnie wybierz prostokąt z menu kształtów i użyj go, aby narysować prostokąt wokół całego pasa ruchu.

Na pierwszym pasie próbki. Skopiuj i wklej kształt wokół pierwszego toru, aby pobrać próbkę z drugiego toru. Po upewnieniu się, że pomiar tła nie obejmuje sygnału na następnym pasie, narysuj prostokąt wokół każdego pasa dla pozostałych pasów próbki.

Następnie wyświetl sygnał dla tabeli kształtów dla każdego prostokąta narysowanego w dowolnych jednostkach fluorescencyjnych i zapisz obraz jako żółć tiff. Istnieje szereg środków kontrolnych, które mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że dokładne dane są zbierane podczas ilościowego fluorescencyjnego Western blot. Na przykład pożądane jest włączenie dodatnich próbek kontrolnych.

Po drugie, ważne jest, aby zoptymalizować czas transferu, aby zagwarantować równoważny ruch białek o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej z żelu do membrany. Po trzecie, należy określić odpowiednie rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, aby uniknąć nieprawidłowej interpretacji białek będących przedmiotem zainteresowania z powodu niespecyficznego prążkowania, jak pokazano na tych obrazach. Po czwarte, ważne jest, aby rozważyć, czy wtórne przeciwciało wyhodowane u innego gatunku gospodarza może być konieczne, szczególnie w przypadkach, gdy oczekiwane prążki białkowe nie zostaną wykryte.

Po piąte, produkcja żelu do kontroli obciążenia może potwierdzić jednorodność ładunku próbki. W połączeniu z analizą całkowitego białka, żel może być następnie wykorzystany do porównania i ilościowego określenia obciążenia białkami na każdym torze w różnych zakresach masy cząsteczkowej mierzonych dla każdej próbki. Wreszcie, technika ta nadaje się do usuwania i ponownego sondowania membran z większą elastycznością niż luminescencja kemi ze względu na takie czynniki, jak między innymi zwiększona czułość, zmniejszone tło, detekcja podwójnego koloru i stabilność membrany w warunkach długotrwałego przechowywania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać ilościowego fluorescencyjnego wykresu zachodniego do wykrywania i dokładnego określania ilościowego białek będących przedmiotem zainteresowania, a także jak rozwiązywać typowe problemy, które mogą wystąpić podczas wykonywania tej techniki.