Name: Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj ilościowe fluorescencyjne Western blotting do wykrywania i kwantyfikacji białek w różnych tkankach. Ta metoda zapewnia większą czułość i precyzję niż tradycyjne techniki ECL.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe: Finansowanie Programu Strategicznego Instytutu BBSRC - CF & TMW; Finansowanie BBSRC East Bio DTP – LG; Darwin Trust w Edynburgu – MLH. Chcielibyśmy również podziękować dr Barry'emu McCollowi za zgodę na włączenie optymalizacji TREM2 do tego manuskryptu.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Protein+Protocols+on+CD-ROM%22">Protein Protocols on CD-ROM</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblotting+and+immunodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10(2008).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457(2013).</li>
<li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li>
<li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
<li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li>
<li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li>
<li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75%2FMortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95(2013).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+%CE%B2-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GalR1%2C+but+not+GalR2+or+GalR3%2C+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li>
<li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proceed+Online%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+%28Wlds%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Należyte rozważenie i planowanie są niezbędne przed każdym eksperymentem i mogą ostatecznie zadecydować o powodzeniu zastosowanej techniki. Postępy w wykrywaniu białek za pomocą WB mogą stanowić mnóstwo potencjalnych przeszkód przy próbie wyboru odpowiednich przeciwciał, metod transferu i wizualizacji do wykorzystania. Na szczęście, przy użyciu starannej listy kontrolnej i odpowiednich środków kontrolnych, QFWB może być rutynowo stosowany do określania obecności białek i coraz bardziej subtelnych różnic w ekspresji między próbkami. Protokół ten zawiera obszerny przewodnik po fluorescencyjnym ilościowym western blot, a także kilka strategii rozwiązywania problemów, aby uniknąć i/lub przezwyciężyć niektóre z wielu typowych pułapek z nim związanych.
Kluczowe kroki stosowane w celu utrzymania czułości i uzyskania naprawdę wymiernych i porównywalnych pomiarów obejmują: 1) solidną ekstrakcję białka z próbek tkanek; 2) przygotowanie próbki; 3) dokładne obciążenie białkami określone na podstawie analizy całkowitej białka; 4) optymalny transfer białek za pomocą I-Blot; 5) przygotowanie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych w buforze blokującym zawierającym 0,1% Tween20 oraz 6) prawidłowa wizualizacja i analiza za pomocą kamerytora w podczerwieni i powiązanego oprogramowania.
Detekcja fluorescencyjna w podczerwieni jest naprawdę ilościowa i zapewnia większą czułość w porównaniu z bardziej tradycyjnymi technikami wykrywania ECL3,11. Ten system wykrywania jest wieloaspektowy i jako taki nie ogranicza się do QFWB. System ten jest zdolny do obrazowania znakowania immunohistologicznego przy niskiej mocy, co pozwala na wizualizację i ilościowe określenie całych odcinków tkanek12. Jest to jeden z obszarów potencjalnego przyszłego rozwoju pod względem rozdzielczości, który może sprawić, że obrazowanie na czerwono będzie rywalizować z konwencjonalnym wychwytywaniem immunofluorescencji za pomocą konwencjonalnych mikroskopów pod względem oceny ilościowej.
Jednak przy większej wrażliwości na subtelne zmiany w ekspresji białek kluczowe znaczenie ma ograniczenie zmienności do minimum, a środki kontroli są rygorystyczne dzięki solidnym protokołom. Rozpoczyna się to od rygorystycznej ekstrakcji białka z próbki tkanki, a następnie produkcji całkowitych żeli barwionych białkami, aby zapewnić równomierne obciążenie próbki, optymalizacji przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych w celu określenia, czy wykrycie jest prawdziwe, oraz przetestowania wytycznych producenta w odniesieniu do czasu transferu w celu uzyskania wydajnego transferu białka.
Niemniej jednak, nawet jeśli warunki dla WB zostaną zoptymalizowane, nadal mogą pojawić się problemy związane z prowadzeniem westernów, które mogły nie zostać tutaj w pełni zbadane. Należą do nich między innymi takie czynniki, jak solubilizacja białek i wybór buforu ekstrakcyjnego. Niektóre mogą zakłócać testy stężenia białek, a niektóre tkanki są szczególnie trudne do rozludnienia, co wymaga bardziej niezawodnych technik, takich jak użycie automatycznego macerowania szczelnych pojemników, takich jak probówki M, wraz z dysocjatorem Macs. Ponadto proste środki kontroli przechowywania materiału ekstrahowanego i nieekstrahowanego w temperaturze -80 °C mogą stanowić różnicę między uzyskaniem optymalnego etykietowania natychmiast po ekstrakcji a uzyskaniem słabych wyników kilka tygodni później.
Udowodniono, że nowoczesne metody QFWB są bardziej czułe na wychwytywanie subtelnych różnic w ekspresji białek i są bardziej wszechstronne, umożliwiając jednoczesne podwójne znakowanie3 w porównaniu ze starszymi technikami, takimi jak ECL. Bardzo ważne jest, aby protokoły western blotting były solidne i łatwe do powtórzenia w celu dokładnej kwantyfikacji i analizy statystycznej. Protokół ten jest wystarczająco czuły i solidny, aby można go było rutynowo stosować do wykrywania białek w różnych próbkach tkanek i gatunkach3 oraz umożliwia ilościowe określanie białek o niskiej i wysokiej liczebności w tym samym QFWB, zmniejszając w ten sposób zużycie materiałów eksploatacyjnych, a także czas na eksperyment11. Ponadto zwiększona czułość tej techniki pozwala na walidację coraz bardziej popularnych badań -omicznych 9,14 , jednak dokładność ma kluczowe znaczenie i należy przestrzegać odpowiednich środków kontroli, unikając w ten sposób błędnego pozyskiwania danych.

Western blotting (WB) to technika analityczna pierwotnie opracowana pod koniec lat siedemdziesiątych w celu określenia obecności lub braku interesującego białka w złożonej próbce biologicznej, takiej jak homogenat tkankowy1. Metodologia, powszechnie nazywana immunoblotem białkowym, ze względu na kluczową interakcję przeciwciało-antygen, składa się z 5 odrębnych etapów: 1) elektroforetycznego rozdzielania białek przez ich punkt izoelektryczny; 2) przenieść do membrany nitrocelulozowej lub polifluorku winylidenu (PVDF); 3) znakowanie przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała specyficznego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania; 4) inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu; oraz 5) wizualizacja.
Metodologia wizualizacji ewoluowała z czasem, aby poprawić bezpieczeństwo i czułość. Niektóre z pierwszych balansów bieli przeprowadzono przy użyciu znaczników znakowanych radiowo, które następnie przeszły do metod kolorymetrycznych, a następnie szerzej stosowanych metod cheluminescencyjnych (ECL). Radioaktywność była bezpośrednio znakowana na sondach pod kątem określonych antygenów, podczas gdy metodologie kolorymetryczne i ECL wykorzystują technikę pośredniego znakowania za pomocą reportera enzymu, takiego jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa streptawidyny (HRP)2. Intensywność znakowania produktu chromagenowego lub luminescencyjnego mierzy się za pomocą densytometrii, przy czym siła sygnału, silna lub słaba, wskazuje mniej więcej na obecność białka będącego przedmiotem zainteresowania w próbce. ECL jest bardziej czułą i dlatego preferowaną metodologią2, ale wszystkie 3 metody zostały początkowo opracowane na kliszy rentgenowskiej, a następnie ustalono bardziej wyrafinowane techniki obrazowania cyfrowego3. Postęp w cyfrowym obrazowaniu WB nie tylko pozwolił badaczowi określić obecność lub brak interesującego go białka, ale także pozwolił na wnioskowanie o poziomie ekspresji wybranego białka w porównaniu z innymi próbkami i dlatego może być określany jako "półilościowy". Niedawno opracowano prawdziwie ilościową i bardziej czułą technologię western blotting, w której mierzony poziom fluorescencji jest bezpośrednio związany z ilością i ekspresją pojedynczego białka w próbce: ilościowy fluorescencyjny western blotting (QFWB).
Porównując QFWB z znakowaniem ECL, użycie fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego generuje liniowy profil wykrywania4. Jest to przeciwieństwo technik ECL, w których liniowość sygnału występuje na ogół przy niskich ładunkach białka poniżej 5 μg i nasyceniu sygnału bezpośrednio związanym z ekspresją białka, tj. z wszechobecną ekspresją genów porządkowych5,6. Rozbieżność ta jest najprawdopodobniej spowodowana większą liczbą miejsc wiązania dostępnych dla substratu ECL awidyny w celu związania się z biotynylowanym wtórnym, co skutkuje większym prawdopodobieństwem potencjalnego nasycenia sygnału. Jest to jeden z głównych powodów, dla których immunoblotty ECL określa się jedynie jako "półilościowe"7. Punkt nasycenia sygnału ma kluczowe znaczenie przy pomiarze subtelnych różnic w poziomach ekspresji i może prowadzić do niedokładnych pomiarów. W ostatnich latach pojawienie się szeroko rozpowszechnionych technik proteomicznych, szczegółowo opisujących coraz większą czułość i identyfikację subtelnych różnic w ekspresji, spowodowało coraz większe poleganie na prawdziwie ilościowym western blot w eksperymentach walidacyjnych8,9. Kluczowe znaczenie ma zatem zastosowanie wrażliwej, solidnej i prawdziwie ilościowej metodyki.
Wiele "zoptymalizowanych" metodologii western blotting zostało wykorzystanych przez niezależne laboratoria, które często okazują się trudne do skonfigurowania lub powtórzenia z powodu subtelnych zmian metodologicznych, które mogą nie być widoczne w formalnie udokumentowanych protokołach. Jest to sprawdzony i solidny protokół dla QFWB, a dodatkowo zapewnia cenne strategie rozwiązywania typowych problemów, które mogą pojawić się podczas implementacji.
Ten protokół został pierwotnie zoptymalizowany do użytku z homogenatami mózgu myszy, ale od tego czasu jest skutecznie stosowany w szerokim zakresie próbek tkanek i gatunków4,9,10. Uwzględniono potencjalne warianty protokołu wymagane w przypadku konkretnych problemów z rozwiązywaniem problemów.

<table><tbody><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tubes</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Stos transferowy iBlot, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, Wielka Brytania</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, Wielka Brytania</td><td>LC5602</td><td>Zastosowanie w żelu 1 do Western blotting</td></tr><tr><td>SeeBlue Wstępnie barwione białko standard</td><td>Life Technologies, Wielka Brytania</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>Stosować w żelu 2 Żel barwiony białkiem całkowitym</td></tr><tr><td>Bufor do próbek NuPAge LDS 4x</td><td>Life Technologies, Wielka Brytania</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (tylko dla żeli Bis-Tris) (20x)</td><td>Life Technologies, Wielka Brytania</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 12 well</td><td>Life Technologies, Wielka Brytania</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka soli fizjologicznej buforowana fosforanem</td><td>Sigma-Aldrich, Wielka Brytania</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, Zestaw do oznaczania białek</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey bufor blokujący</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Kozia anty-królicza IgG (H+L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG przeciw mysim osłom (H+L), 0,5 mg&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Kozia anty-królicza IgG (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Osioł anty-kozi IgG (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Kamera na podczerwień</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Zaproszenie do składania ofert</td></tr><tr><td>iBlot 7-minutowy system Blotting Life</td><td>technologies, Wielka Brytania</td><td></td><td>Ten model nie jest już produkowany</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein stain</td><td>Expedeon, Wielka Brytania</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot bufor do usuwania western blot&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym western blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Pod koniec lat siedemdziesiątych po raz pierwszy publicznie zgłoszono użycie western blot, techniki oceny obecności i względnej obfitości określonych białek w złożonych próbkach biologicznych. Od tego czasu metodologia western blotting stała się powszechnym składnikiem eksperymentalnego repertuaru biologów molekularnych. Pobieżne przeszukanie PubMed przy użyciu terminu "western blot" sugeruje, że do roku 2014 ponad dwieście dwadzieścia tysięcy opublikowanych manuskryptów korzystało z tej techniki. Co ważne, w ciągu ostatnich dziesięciu lat nastąpił postęp techniczny w zakresie obrazowania w połączeniu z opracowaniem czułych etykiet fluorescencyjnych, które poprawiły czułość i zapewniły jeszcze większy zakres detekcji liniowej. Rezultatem jest teraz naprawdę kwantyfikowalny Western Blot oparty na fluorescencji (QFWB), który pozwala biologom przeprowadzać porównawczą analizę ekspresji z większą czułością i dokładnością niż kiedykolwiek wcześniej. Istnieje wiele "zoptymalizowanych" metodologii western blotting, które są stosowane w różnych laboratoriach. Często okazują się one trudne do wdrożenia ze względu na wymóg subtelnych, ale nieudokumentowanych zmian proceduralnych. Protokół ten zawiera wyczerpujący opis uznanej i niezawodnej metody QFWB, wraz ze strategiami rozwiązywania problemów.

Ponieważ czułość QFWB i liniowy zakres wykrywania są większe niż konwencjonalne wykrywanie ECL, istnieje szereg środków kontrolnych, które są kluczowe dla zapewnienia dokładnych danych i tym samym pomagają w skutecznej interpretacji. Po pierwsze, włączenie dodatnich próbek kontrolnych, jak pokazano na rysunku 1. Po drugie, optymalizacja transferu w celu zagwarantowania równoważnego ruchu białek o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej z żelu do błony, jak pokazano na rysunku 2. Po trzecie, optymalizacja przeciwciał, zwłaszcza przeciwciał drugorzędowych, których optymalizacja jest często pomijana, ale które mogą wytwarzać niespecyficzne prążki zdolne do zakłócania prawidłowej interpretacji białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania. Zobacz rysunek 3. Po czwarte, może się również zdarzyć, że gdy białko wydaje się niewykrywalne, ale oczekuje się, że będzie obecne, może to być również problem z przeciwciałami wtórnymi, który można skorygować, po prostu używając wtórnego wyhodowanego w innym gatunku gospodarza. Zobacz rysunek 4. Po piąte, znakowanie i analiza białek ogółem jest znacznie bardziej wiarygodną i wymierną metodą w porównaniu z wykorzystaniem tradycyjnych pojedynczych białek, które są powszechnie eksprymowane dla wewnętrznych wzorców referencyjnych3. Stwierdzono, że wiele z tych pojedynczych białek ulega zróżnicowanej ekspresji w modelach chorób neurodegeneracyjnych, a także między różnymi próbkami tkanek, a jednorodność ekspresji może się zmieniać w tej samej tkance3. W związku z tym produkcja żelu do kontroli obciążenia potwierdzi jednorodność obciążenia próbki w połączeniu z analizą całkowitego białka poprzez porównanie i ilościowe określenie obciążenia białkami na każdym torze przy różnych zakresach mas cząsteczkowych mierzonych dla każdej próbki w celu wskazania błędu standardowego, jak pokazano na rysunku 6. Co ważne, wszystkie te techniki rozwiązywania problemów i kontrole są tak skuteczne, jak czułość i spójność narzędzi analitycznych stosowanych przez operatora (rysunek 5). Wreszcie, technika ta nadaje się do usuwania i ponownego sondowania membran z większą elastycznością niż ECL ze względu na takie czynniki, jak między innymi zwiększona czułość, zmniejszone tło, detekcja podwójnego koloru i stabilność membrany w warunkach długotrwałego przechowywania. Zobacz rysunek 7.

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Celem tej procedury jest wykrycie i dokładne określenie ilościowe względnej obfitości określonych białek w złożonej próbce biologicznej za pomocą ilościowego, fluorescencyjnego skręcania i blottingu. Osiąga się to za pomocą pierwszych elektrofluorescencyjnie oddzielonych ekstraktów białkowych przy użyciu prefabrykowanego żelu gradientowego. W drugim etapie równoważne obciążenie białkiem jest weryfikowane na wszystkich torach próbki poprzez zastosowanie całkowitego barwienia białka, a następnie do przeniesienia próbek na membranę A-P-V-D-F stosuje się półsuchy system szybkiego transferu z blokiem oczu.Na koniec białka są badane za pomocą specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych, a następnie odpowiednich przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluorescencyjnie, aby ułatwić ich czułe, solidne i liniowe wykrywanie w podczerwieni i dalekiej czerwieni. Ostatecznie, ilościowe fluorescencyjne kwitnienie zachodnie może być wykorzystane do powtarzalnego wykrywania, wizualizacji i dokładnego oznaczania ilościowego dużej liczby białek związanych z błoną i rozpuszczalnych w szerokim zakresie próbek tkanek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie oparte na ECL, jest to, że pozwala ona na większą czułość i zwiększoną precyzję w szerokiej skali liniowej w celu uzyskania prawdziwie ilościowego odczytu Rozpocznij od ręcznej maceracji próbki tkanki, a następnie homogenizuj w świeżo przygotowanym buforze ekstrakcyjnym przy masie około jednej do 10 tkanki na objętość buforu, aż do uzyskania gładkiego, spójnego homogenatu.Następnie odwiruj lizat komórkowy przez 20 minut w temperaturze 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przenieś sat zawierający rozpuszczone białka do czystej probówki z mikrowirówką i przechowuj zarówno osady, jak i frakcje supernatantu S w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Po oznaczeniu stężenia białka w supinacie przenieść 15 mikrogramów białka na próbkę do nowych probówek do mikrowirówek.Następnie doprowadź końcową objętość każdej próbki do 10 mikrolitrów wodą destylowaną i dodaj pięć mikrolitrów bufora ładującego Forex. Dokładnie wymieszaj roztwory komórkowe przez wirowanie, a następnie podgrzej próbki w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby zdenaturować białka. Po denaturacji dodać trzy mikrolitry odpowiedniego wzorca masy cząsteczkowej do pierwszego dołka każdego z żeli doświadczalnych i kontrolnych.Następnie po elektroforezie załadować 10 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich kolejnych studzienek. Użyj noża do żelu, aby uwolnić żele z kasety i usuń dołki i stopkę żelu. Zaznacz żel, aby pomóc w późniejszej orientacji.Następnie, aby określić równoważne obciążenie białkiem, zdekantuj około 30 mililitrów barwnika białkowego na kwadratową szalkę Petriego o wymiarach 12 na 12 centymetrów i umieść żel kontrolujący ładowanie w barwie, upewniając się, że roztwór pokrywa cały żel. Delikatnie mieszaj żel przez minimum godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzuć plamę białkową i umyj żel trzy razy w wodzie destylowanej przed wizualizacją bloku oczu. Dwa półsuche szybkie przenoszenie białek Po elektroforezie przygotować dolny stos transferowy, zdejmując foliową osłonę i wstępnie zwilżając membranę buforem roboczym bezpośrednio ze zbiornika żelu.W tym czasie ponownie zwilż bibułę filtracyjną wodą destylowaną. Następnie nałóż eksperymentalny żel na przygotowany dolny stos transferowy, a następnie połóż bibułę filtracyjną przed obróbką na żelu i zwiń je oba, aby upewnić się, że między warstwami nie zostaną uwięzione żadne pęcherzyki. Połóż górny stos na bibule filtracyjnej i dolnym stosie.Następnie zwiń kanapkę ze stosem transferowym, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki powietrza. Włóż gąbkę z zestawu do przenoszenia stosu na wkładkę chłonną i umieść kanapkę z stosem transferowym w przeznaczonym do tego miejscu. Następnie dokładnie zamknij pokrywę i rozpocznij blok I dwa, przenosząc białka przez siedem minut w programie trzecim.Po zakończeniu programu wyjmij stos transferowy z maszyny do blokowania oczu i odklej górny stos transferowy i warstwy bibuły filtracyjnej, odsłaniając żel na dolnym stosie transferowym. Użyj skalpela, aby przeciąć wokół żelu, uważając, aby wykonać trójkątne cięcie w celach orientacyjnych na membranie po przycięciu membrany, aby sprawdzić barwienie białka o wydajności przenoszenia, żel, jak właśnie pokazano, a następnie szybko przenieś membranę do czystej 50-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów PBS dla pierwszego z trzech, Pięciominutowe mycie na wałku mechanicznym. Po trzecim przemyciu należy odrzucić bufor do przemywania i inkubować błonę w nierozcieńczonym buforze blokującym przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie inkubować błonę w pierwotnym przeciwciałie rozcieńczonym w pięciu mililitrach buforu blokującego i 0,1 między 20 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym mieszaniu. Następnego ranka, po odrzuceniu roztworu przeciwciała pierwotnego, przemyj membranę sześć razy przez pięć minut w PBS, jak właśnie pokazano. Następnie inkubować błonę w ciemności z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym, rozszerzonym w pięciu mililitrach buforu blokującego i 0,1% między 20 przy ciągłym mieszaniu, a następnie sześć pięciominutowych płukań PBS dla całego obrazowania.Najpierw zaloguj się do komputera i imagera. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania, aby zobrazować western blot. Najpierw otwórz pokrywę wywoływarki i wylej niewielką ilość PBS na szkło.W lewym dolnym rogu wyczuwalnika umieść membranę na górze PBS, upewniając się, że jest prostopadła do osi wyczuwalnika i że między membraną a osią siatki pozostała jednocentymetrowa przerwa. Zwiń membranę, aby upewnić się, że między szkłem a membraną nie utknęły pęcherzyki, a następnie policz liczbę kwadratów zajmowanych przez membranę na osiach x i y. Następnie zamknij pokrywę wywoływarki i wprowadź liczbę kwadratów do oprogramowania komputerowego.Wybierz odpowiedni kanał podczerwieni i odpowiednią intensywność, a następnie rozpocznij skanowanie, aby zobrazować całkowite zabarwienie białka żelu kontrolującego ładowanie. Napraw żel i imager, jak właśnie pokazano dla eksperymentalnej membrany, a następnie wybierz kanał 700. Ustaw intensywność na pięć i rozpocznij skanowanie.Aby określić ilościowo dane skanowania. Zacznij od dostosowania przycisków jasności i kontrastu zeskanowanego pliku, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu, obracając obrazy niezbędne do uzyskania żądanej orientacji. Następnie wybierz prostokąt z menu kształtów i użyj go, aby narysować prostokąt wokół całego pasa ruchu.Na pierwszym pasie próbki. Skopiuj i wklej kształt wokół pierwszego toru, aby pobrać próbkę z drugiego toru. Po upewnieniu się, że pomiar tła nie obejmuje sygnału na następnym pasie, narysuj prostokąt wokół każdego pasa dla pozostałych pasów próbki.Następnie wyświetl sygnał dla tabeli kształtów dla każdego prostokąta narysowanego w dowolnych jednostkach fluorescencyjnych i zapisz obraz jako żółć tiff. Istnieje szereg środków kontrolnych, które mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że dokładne dane są zbierane podczas ilościowego fluorescencyjnego Western blot. Na przykład pożądane jest włączenie dodatnich próbek kontrolnych.Po drugie, ważne jest, aby zoptymalizować czas transferu, aby zagwarantować równoważny ruch białek o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej z żelu do membrany. Po trzecie, należy określić odpowiednie rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, aby uniknąć nieprawidłowej interpretacji białek będących przedmiotem zainteresowania z powodu niespecyficznego prążkowania, jak pokazano na tych obrazach. Po czwarte, ważne jest, aby rozważyć, czy wtórne przeciwciało wyhodowane u innego gatunku gospodarza może być konieczne, szczególnie w przypadkach, gdy oczekiwane prążki białkowe nie zostaną wykryte.Po piąte, produkcja żelu do kontroli obciążenia może potwierdzić jednorodność ładunku próbki. W połączeniu z analizą całkowitego białka, żel może być następnie wykorzystany do porównania i ilościowego określenia obciążenia białkami na każdym torze w różnych zakresach masy cząsteczkowej mierzonych dla każdej próbki. Wreszcie, technika ta nadaje się do usuwania i ponownego sondowania membran z większą elastycznością niż luminescencja kemi ze względu na takie czynniki, jak między innymi zwiększona czułość, zmniejszone tło, detekcja podwójnego koloru i stabilność membrany w warunkach długotrwałego przechowywania.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać ilościowego fluorescencyjnego wykresu zachodniego do wykrywania i dokładnego określania ilościowego białek będących przedmiotem zainteresowania, a także jak rozwiązywać typowe problemy, które mogą wystąpić podczas wykonywania tej techniki.

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

V3 to procedura western blot z użyciem żeli bez plam. Technologia bezbarwna pozwala naukowcom na wizualizację jakości separacji białek, weryfikację wydajności transferu, a co najważniejsze, walidację zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kwantyfikacji białka jako niezawodnej kontroli obciążenia.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Technika ultra-szybkiego western blottingu jest rozwijana poprzez poprawę kinetyki wiązania antygen-przeciwciało poprzez technologię cyklicznego drenowania i uzupełniania (CDR) w połączeniu ze środkiem wzmacniającym immunoreakcję.

Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Poznaj ilościowe fluorescencyjne Western blotting do wykrywania i kwantyfikacji białek w różnych tkankach. Ta metoda zapewnia większą czułość i precyzję niż tradycyjne techniki ECL.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Przeglądaj więcej filmów