Name: Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę przygotowania aktywowalnych liposomów z barwnikiem bliskiej podczerwieni do obrazowania zapalenia in vivo. Technika ta znacząco zwiększa czułość detekcji w badaniach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698/10-1 i RU-1652/1-1. Dziękujemy Doreen May za doskonałą pomoc techniczną oraz firmie DYOMICS GmbH z Jeny za życzliwe wsparcie.

UWAGA: Wszystkie procedury są zatwierdzone przez regionalny komitet ds. zwierząt i zgodne z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt.
1. Przygotowanie materiałów i instrumentów
<ol>
	<li>Przygotowanie spontanicznie powstałej dyspersji pęcherzykowej (SFV)
	<ol>
		<li>Rozpuścić i przygotować roztwory podstawowe następujących fosfolipidów: 214 mg/ml fosfatydylocholiny jaj (EPC), 134 mg/ml cholesterolu, 122 mg/ml 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (mPEG2000-DSPE) i 2 mg/ml 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa) (NBD-DOPE) w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach.</li>
		<li>Dostarczyć około 3 ml chloroformu do kolby okrągłodennej i przenieść odpowiednią objętość roztworu podstawowego fosfolipidów do kolby okrągłodennej w celu przygotowania liposomów złożonych z EPC:Chol:mPEG2000-DSPE w stosunku molowym 6,5:3:0,5. W celu podwójnego znakowania fluorescencyjnego liposomów dodać 0,3% mol NBD-DOPE do roztworu lipidowego.</li>
		<li>Odparować chloroform z organicznego roztworu fosfolipidów pod zmniejszonym ciśnieniem (300 mbar) w temperaturze 55 °C za pomocą wyparki obrotowej.</li>
		<li>Po utworzeniu jednorodnego filmu fosfolipidowego należy zmniejszyć ciśnienie do 10 mbar na 1-2 godziny, aby usunąć resztki osadu chloroformu.</li>
		<li>Podczas parowania chloroformu rozpuść DY-676-COOH (6,181 μM) w 10 mM buforze Tris o pH 7,4 i napełnij naczynie Dewara ciekłym azotem. Włączyć łaźnię ultradźwiękową i ustawić na 50 °C.</li>
		<li>Przenieść odpowiednią objętość (0,5–1 ml) roztworu DY-676-COOH (6,181 μM) do kolby okrągłodennej w celu uwodnienia suchego filmu fosfolipidowego i energicznie wirować, aż utworzy się spontanicznie utworzona dyspersja pęcherzykowa (SFV). Upewnij się, że wszystkie fosfolipidy są rozproszone, aby uniknąć utraty lipidów.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść kolbę okrągłodenną zawierającą dyspersję SFV do ciekłego azotu i zamrozić dyspersję na 3–5 minut. Umieścić kolbę okrągłodenną w łaźni ultradźwiękowej o temperaturze 50 °C w celu rozmrożenia dyspersji, a następnie energicznie wirować dyspersję przez 1–2 minuty. Powtórz tę procedurę sześć razy, co daje w sumie siedem cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytłaczanie SFV w celu utworzenia jednorodnych pęcherzyków liposomowych
	<ol>
		<li>Przenieść dyspersję SFV do strzykawki o pojemności 1 ml (strzykawka-a) i wytłaczać dyspersję przez membranę poliwęglanową 100 nm za pomocą ekstrudera LiposoFast-Basic do strzykawki-b.</li>
		<li>Wyciśnij dyspersję ze strzykawki b z powrotem do strzykawki a, a następnie powtórz cykl dziesięć razy. Na skutek wytłaczania roztwór w strzykawce z czasem zmienia się z zamglonego wyglądu w wyraźną dyspersję. Po dziesięciu cyklach (dwadzieścia pojedynczych etapów wytłaczania) wyjmij strzykawkę b z urządzenia i po raz ostatni wyciśnij dyspersję ze strzykawki a bezpośrednio do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie liposomalnego kapsułkowanego DY-676-COOH z wolnego barwnika
	<ol>
		<li>Przygotować kolumnę do chromatografii żelowej przy użyciu kulek G25 nasączonych 10 mM buforem Tris o pH 7,4 (długość kolumny 28 cm, średnica 0,8 cm).</li>
		<li>Przenieść 0,5 ml wytłaczanej dyspersji pęcherzykowej na złoże żelowe i pozwolić próbce spłynąć do matrycy żelowej.</li>
		<li>Eluować liposomy za pomocą 10 mM buforu Tris o pH 7,4 (Rysunek 1A) i myć kolumnę, aż wolny barwnik całkowicie spłynie z kolumny. W razie potrzeby zbierz i poddaj recyklingowi wolny barwnik poprzez odsalanie i odwadnianie zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Zagęścić eluowane liposomy przez ultrawirowanie (200 000 x g, 2 godziny w temperaturze 8 °C), a następnie rozproszyć je w odpowiedniej objętości sterylnego 10 mM buforu Tris o pH 7,4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja stężenia DY-676-COOH w kapsułkach
	<ol>
		<li>Przygotować krzywą kalibracyjną, rozpuszczając DY-676-COOH (0, 82, 124, 247, 494, 988 nM) w 10 mM buforze Tris o pH 7,4 zawierającym 0,1% Triton X100.</li>
		<li>Rozpuścić 2 μl (100 nmol końcowego lipidu z 50 mmol/l podstawy) liposomów przez 5 minut w temperaturze pokojowej w 100 μl buforu Tris zawierającego 1% Triton X100 w celu zniszczenia pęcherzyków i uwolnienia kapsułkowanego barwnika. Następnie rozcieńczyć próbki 10 mM buforem Tris o pH 7,4 do końcowego stężenia Triton-X100 wynoszącego 0,1% (v/v), uzyskując całkowitą objętość 1 ml. Przygotować wszystkie próbki w dwóch egzemplarzach.</li>
		<li>Zmierzyć absorpcję i emisję wszystkich próbek (wolne liposomy poddane działaniu DY-676-COOH i Triton-X100) przy wzbudzeniu λ=645 nm i emisji λ = 700 nm. Ustalić i użyć krzywej kalibracyjnej wolnego barwnika w celu określenia stężenia barwnika w kapsułkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka liposomów
	<ol>
		<li>Określ rozmiary i potencjał zeta liposomów za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Próbki liposomalne rozcieńczyć wysterylizowanym filtrem (0,2 μm) 10 mM buforem Tris o pH 7,4 do stężenia 100–300 μM (lipid). Rozcieńczone próbki należy przenieść do jednorazowej kuwety o małej objętości i zmierzyć próbkę zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Scharakteryzuj liposomy za pomocą mikroskopii elektronowej, aby uzasadnić wielkość, integralność i jednorodność pęcherzyków liposomalnych zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Walidacja wygaszania fluorescencji i aktywacji przygotowanych liposomów
<ol>
	<li>Analiza fizykochemiczna wygaszania i aktywacji fluorescencji
	<ol>
		<li>Przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml dla Lip-Q i 2 probówki dla wolnego DY-676-COOH. Przenieść 100 nmol lipidów całkowitych (2,38 μl roztworu podstawowego Lip-Q o stężeniu 42 mmol/l, zawierającego 138 μg/ml kapsułkowanego DY-676-COOH) do odpowiednich probówek. Transfer wolny DY-676-COOH odpowiadający zawartości barwnika w Lip-Q (0,38 μg, co wynika np. z 138 μg/1 000 μl x 2,38 μl użytego Lip-Q). Inkubować jedną probówkę każdej sondy w temperaturze 4 °C i zamrażać drugą probówkę w temperaturze -80 °C przez noc (16 godzin).</li>
		<li>Podgrzać blok grzewczy do temperatury 30 °C. Napełnić komorę chłodzącą kruszonym lodem i zrównoważyć podwielokrotność 10 mM buforu Tris o pH 7,4 do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Wyjąć sondy z 4 °C i zrównoważyć w temperaturze pokojowej (owinięte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem) i szybko rozmrozić sondy od -80 °C w temperaturze 30 °C przez 5 minut. Schłodzić rozmrożone sondy na lodzie przez 1 minutę przed przeniesieniem ich do temperatury pokojowej (również owinięte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem).</li>
		<li>Dodać 10 mM buforu Tris (pH 7,4) do każdej z sond do 100 μl końcowej objętości i równoważyć wszystkie sondy w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Pobrać pipetę po 80 μl z każdej sondy do szklanej kuwety o małej objętości i zmierzyć absorpcję każdej sondy w zakresie 400–900 nm na spektrometrze. Umieść sondę z powrotem w odpowiednich rurkach.</li>
		<li>Przenieść 80 μl każdej sondy do odpowiedniej szklanej kuwety i zmierzyć emisję fluorescencji na spektrofluorometrze, wzbudzając sondy przy 674 nm i mierząc fluorescencję w zakresie 694–800 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wychwyt komórkowy i aktywacja fluorescencji
	<ol>
		<li>Pobrać i wyhodować następujące linie komórkowe w odpowiednich pożywkach hodowlanych zgodnie ze standardowymi warunkami (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotnej atmosfery). W tym przypadku użyj mysiej linii komórkowej makrofagów J774A.1 (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą), ludzką linię komórkową glejaka, U-118MG (MEM zawierającą niezbędne witaminy i 10% (v/v) płodową surowicę cielęcą) oraz ludzką linię komórkową włókniakomięsaka, HT-1080 (RPMI z 5% FCS).</li>
		<li>Pokryj szkiełka 8-dołkowe poli-L-lizyną (dodać 100 μl 0,001% poli-L-lizyny do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Odessać roztwór i pozostawić komorę do wyschnięcia przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej na sterylnym stole warsztatowym. Przepłukać szkiełka komory 3 razy 200 μl buforowanego roztworu soli Hanka, a następnie zamknąć je parafiną i folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
		<li>Podczas gdy szkiełka komory wysychają, przefiltruj i wysterylizuj liposomy i roztwór barwnika i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu, aż będą potrzebne.</li>
		<li>Do analizy wychwytu sondy za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego NIR in vivo należy przygotować 5 małych kolb hodowlanych dla każdej z 3 linii komórek testowych (łącznie 15 kolb). Wysiewaj 2 x 106 komórek J774A.1, U-118MG i HT-1080 w kolbie hodowlanej z 5 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej (w pięciokrotkach) i hoduj przez 16-24 godziny. Równolegle do kolb hodowlanych należy zasiać 30 000 komórek z każdej linii komórkowej (J774A.1 i HT-1080) lub 20 000 komórek (U-118MG) odpowiednio do 2 dołków szkiełka komorowego i hodować w pożywce hodowlanej o objętości 500 μl przez 16-24 godziny.</li>
		<li>Następnego dnia dodać 100 nmol (końcowa ilość lipidów) Lip-Q do 2 kolb na linię komórkową i do jednego dołka każdej linii komórkowej na szkiełku komorowym. Natychmiast przenieść 1 kolbę na linię komórkową do temperatury 4 °C, a drugą kolbę z powrotem do inkubatora. 
		UWAGA: Objętość sond dodawanych do kolb i szkiełek komorowych jest taka sama, co sprawia, że stężenie na szkiełkach komory jest 10-krotnie wyższe (5 ml to na 500 μl pożywki hodowlanej). Jest to konieczne, ponieważ detekcja mikroskopowa jest mniej czuła niż system obrazowania fluorescencyjnego NIR, w którym obrazowane są osady komórek z kolb.</li>
		<li>Dodać wolny DY-676-COOH o stężeniu równoważnym zawartości barwnika w Lip-Q do komórek w 2 kolbach na linię komórkową i do jednego dołka każdej linii komórkowej na szkiełku komorowym, a następnie natychmiast przenieść 1 kolbę na linię komórkową do temperatury 4 °C (wyczerpanie energii), a drugą kolbę wraz ze szkiełkiem komorowym z powrotem do inkubatora. Inkubować wszystkie komórki przez 24 godziny w odpowiednich warunkach. Komórki w kolbie bez sondy służą jako kontrola niepoddana działaniu substancji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie NIRF i analiza półilościowa
	<ol>
		<li>Po 24 godzinach inkubacji zebrać komórki do kolb, myjąc komórki 2 razy buforowym roztworem soli Hanksa (HBSS), a następnie zeskrobać komórki w 500 μl HBSS i osadzać przez odwirowanie (5 min przy 200 x g) w probówkach o pojemności 500 μl.</li>
		<li>Umieść probówki z granulkami ogniw (i HBSS) w kamerze NIRF i zobrazuj za pomocą filtrów do wzbudzenia (615–665 nm) i emisji (cięcia w >700 nm).</li>
		<li>Odejmij autofluorescencję i oceń intensywność celu w porównaniu z autofluorescencją zgodnie z instrukcjami producenta. W ten sposób uzyskane zostaną półilościowe poziomy intensywności fluorescencji jako średni sygnał (skalowane liczby/s), który reprezentuje poziomy zliczania po przeskalowaniu dla czasu ekspozycji, wzmocnienia kamery, binningu i głębi bitowej, tak aby pomiary były porównywalne między sobą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfokalna analiza mikroskopowa
	<ol>
		<li>Po 24 godzinnej inkubacji zebrać komórki na szkiełkach komorowych, przemłukując je 2 razy 500 μl HBSS.</li>
		<li>Utrwalić komórki za pomocą 200 μl HBSS zawierającego 3,7% (v/v) formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Podczas utrwalania rozcieńczyć barwienie DNA, Hoechst-33258 1:50 roztworem montażowym.</li>
		<li>Po utrwaleniu umyj komórki 2 razy HBSS, a następnie oddziel komory od szkiełek szkiełkowych. Dodać 50 μl roztworu montażowego zawierającego barwienie DNA w każdym miejscu odpowiadającym studzienkom szkiełek komory. Przykryj komórki szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci i susz na powietrzu przez 10 minut w temperaturze RT (ciemnej).</li>
		<li>Obrazowanie komórek pod odpowiednim mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym. Użyj następujących ustawień wzbudzenia i emisji do wizualizacji odpowiednich składników: jądra (Hoechst-33258: wzbudzenie 405 nm, emisja 420–480 nm). NBD-DOPE (lipid liposomalny: wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm). DY-676-COOH (barwnik fluorescencyjny NIR: wzbudzenie 633–645 nm, emisja 650–700 nm). 
		UWAGA: Upewnij się, że dostępny mikroskop fluorescencyjny jest wyposażony w odpowiednie filtry, które umożliwiają wzbudzenie i emisję fal o długości fali większej niż 630 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

3. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo stanu zapalnego oparte na liposomach
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt i materiałów
	<ol>
		<li>Trzymaj 8-12 tygodniowe samce myszy NMRI o wadze około 36 g w standardowych warunkach z jedzeniem i wodą ad libitum.</li>
		<li>Siedem dni przed rozpoczęciem eksperymentów należy podawać wszystkim myszom dietę o niskiej zawartości feoforbidu w celu zmniejszenia autofluorescencji tkanek.</li>
		<li>Dwadzieścia cztery godziny przed rozpoczęciem każdego eksperymentu należy ogolić myszy w żądanym obszarze (np. w całym obszarze pleców, jeśli pożądane jest obrazowanie obrzęku tylnych nóg).</li>
		<li>Zważyć zwierzęta i obliczyć ilość sondy do wstrzyknięcia na mysz (Lip-Q i Lip-dQ przy stężeniu 10 μmol (stężenie lipidów) na kg masy i wolnym DY-676-COOH (równoważnym zawartości barwnika w użytej Lip-Q).</li>
		<li>Zobrazuj zwierzęta w całym ciele za pomocą obrazowania fluorescencyjnego NIR z tymi samymi ustawieniami, co w przypadku granulek komórkowych. Pomiar ten zapewnia autofluorescencję zwierząt.</li>
		<li>Rozpuścić 10 mg zymozanu-A w 1 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja stanu zapalnego i obrazowanie NIRF in vivo
	<ol>
		<li>Przygotować 3 strzykawki na mysz zawierające następujące roztwory. Napełnić jedną strzykawkę 50 μl roztworu zymozanu-A (10 mg/ml), a drugą strzykawkę 50 μl izotonicznego roztworu soli fizjologicznej. Napełnić trzecią strzykawkę sondami, przy czym Lip-Q i Lip-dQ (10 μmol/kg masy (lipid)) są przeznaczone dla zwierząt badanych i wolne DY-676-COOH (stężenie jak w Lip-Q) dla zwierząt kontrolnych. Upewnij się, że sondy są rozcieńczone sterylnym HBSS do 150 μl końcowej objętości.</li>
		<li>Nałóż krem pod oczy zwierząt, aby uniknąć wysuszenia i znieczulij zwierzęta 2% izofluranem, aż zapadną w głęboki sen i nie będą reagować na dotyk łap (trwa to około 2 minut).</li>
		<li>Umieść mysz na ciepłej macie (nadal w narkozie) i wstrzyknij roztwór zymozanu-A podskórnie w prawą tylną nogę, a roztwór soli fizjologicznej w lewą tylną nogę. Natychmiast wstrzyknij sondę dożylnie, a następnie zobrazuj zwierzę, a następnie zarejestruj czas wstrzyknięcia/pomiaru (jako t = 0 godzina). Zapisz wynikowe obrazy jako kostki obrazu i powtórz powyższe kroki dla wszystkich innych zwierząt i odpowiednich sond.</li>
		<li>Zobrazuj zwierzęta co 2 godziny przez 10 godzin po wstrzyknięciu, a następnie po 24 godzinach po wstrzyknięciu, upewniając się, że stopień komory pomiarowej jest ciepły (na przykład poprzez umieszczenie ciepłej maty pod spodem), aby uniknąć hipotermii. Po każdym pomiarze umieść zwierzęta w klatce z jedzeniem i wodą ad libitum i umieść klatkę w komorze dla zwierząt w klimacie umiarkowanym. Poddaj zwierzęta eutanazji, najpierw znieczulając 2% izofluranem, aż zwierzęta przestaną reagować na dotyk, a następnie poddaj eutanazji dwutlenkiem węgla przez 5-10 minut, upewniając się, że zwierzęta całkowicie przestaną oddychać i nastąpi rigor mortis. </li>
		<li>Przeprowadź sekcję myszy zgodnie ze standardowymi protokołami, które można ocenić online (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) i zobrazuj narządy.</li>
		<li>Oceń wyniki pomiarów zgodnie z instrukcjami producenta, najpierw odejmując ogólną fluorescencję zwierząt (rozmieszanie), a następnie przypisując obszary zainteresowania do autofluorescencji (lewa tylna noga z solą fizjologiczną) i docelową fluorescencję obszaru objętego stanem zapalnym (prawa tylna noga z zymosanem-A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ liposomy mogą również służyć jako systemy dostarczania barwników fluorescencyjnych, umożliwiają obrazowanie chorób docelowych. Enkapsulacja wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych, takich jak zastosowany tutaj barwnik NIRF, DY676-COOH, prowadzi do wysokiego poziomu wygaszania fluorescencji uwięzionego barwnika. Wygaszanie fluorescencji, zjawisko obserwowane w przypadku wielu fluoroforów o wysokim stężeniu, może być wykorzystane w kilku zastosowaniach obrazowania in vivo , w których wymagana jest wys...

Liposomy zostały intensywnie zbadane i służą jako jeden z najbardziej biokompatybilnych systemów dostarczania leków biomedycznych do zastosowań klinicznych1,2. Składają się głównie z fosfolipidów i cholesterolu, z których oba są biokompatybilnymi związkami naśladującymi części naturalnych błon komórkowych. Podczas gdy substancje hydrofilowe mogą być uwięzione we wnętrzu wodnym, czynniki lipofilowe mogą być włączane do liposomalnej dwuwarstwy fosfolipidowej3. Enkapsulacja substancji w wodnym wnętrzu liposomów zapewnia ochronę przed degradacją in vivo, a także zapobiega toksycznemu działaniu układu gospodarza przed toksycznym działaniem leków cytotoksycznych stosowanych w terapii chorób, na przykład chemioterapeutyków mających na celu niszczenie komórek nowotworowych. Modyfikacja powierzchni liposomalnej za pomocą polimerów, takich jak glikol polietylenowy (PEGylacja), dodatkowo wydłuża czas liposomalnego krążenia krwi in vivo dzięki stabilizacji sterycznej4. Ponadto liposomy mogą sekwestrować wysokie stężenia kilku substancji, takich jak białka5,6, substancje hydrofilowe7,8 i enzymy9. W związku z tym służą jako wiarygodne narzędzia kliniczne, terapeutyczne i diagnostyczne, które zasługują na ich dopuszczenie do stosowania leków cytotoksycznych, takich jak doksorubicyna, w terapii nowotworów4. Ze względu na swoją elastyczność liposomy mogą być również ładowane fluorochromami do celów diagnostycznych i chirurgicznych pod kontrolą obrazu.
Obrazowanie fluorescencyjne dostarcza opłacalnego i nieinwazyjnego narzędzia diagnostycznego in vivo, które jednak wymaga pewnych podstawowych wymagań. Można wykazać, że fluorochromy, które najlepiej nadają się do obrazowania in vivo, mają charakterystyczne maksima absorpcji i emisji w zakresie, w którym dyspersja i rozpraszanie światła, a także autofluorescencja tkanek pochodzących z wody i hemoglobiny są niskie. Tak więc takie sondy mają swoje maksima abs/em między 650 a 900 nm10. Poza tym stabilność fluorochromów zarówno in vitro, jak i in vivo ma kluczowe znaczenie, ponieważ opsonizacja i szybki klirens mogą znacznie ograniczyć ich zastosowanie w obrazowaniu in vivo 11. Inne skutki, takie jak słaba stabilność i niska czułość lub działanie cytotoksyczne na narządy docelowe, jak obserwowane w przypadku zieleni indocyjaninowej (ICG)12-16, są niepożądane i muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu sond do obrazowania in vivo. Obserwacje te doprowadziły do aktywnego rozwoju kilku przedklinicznych fluorochromów NIR, nanocząstek, a także nowych technik obrazowania in vivo procesów zapalnych, nowotworów oraz chirurgii sterowanej obrazem17-20. Pomimo stabilności większości przedklinicznych barwników NIRF (fluorescencja bliskiej podczerwieni) in vitro, ich szybka perfuzja i klirens przez wątrobę i nerki utrudniają ich zastosowanie w obrazowaniu optycznym in vivo chorób i procesów zapalnych.
Dlatego prezentujemy protokół enkapsulacji fluorochromów, takich jak dobrze scharakteryzowany barwnik fluorescencyjny bliskiej podczerwieni DY-676-COOH, znany ze swojej tendencji do samoczynnego gaszenia przy stosunkowo wysokich stężeniach21 w liposomach. Przy wysokich stężeniach tworzenie H-dimerów i/lub oddziaływania pi-stacking między cząsteczkami fluoroforu znajdującymi się w promieniu Förstera powodują transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między cząsteczkami fluorochromu. Przy niskim stężeniu zwiększa się przestrzeń między cząsteczkami fluoroforu, zapobiegając w ten sposób interakcji pi-stacking i tworzeniu się H-dimerów, co skutkuje wysoką emisją fluorescencji. Przełączanie między wysokim i niskim stężeniem oraz towarzyszące mu wygaszanie i aktywacja fluorescencji jest obiecującą strategią, którą można wykorzystać do obrazowania optycznego22. Pod tym względem enkapsulacja wysokich stężeń barwnika NIRF DY-676-COOH w wodnym wnętrzu liposomów jest korzystniejsza do obrazowania in vivo niż wolny barwnik. Wyzwanie związane z tą metodą polega po pierwsze na prawidłowej enkapsulacji, a po drugie, na walidacji korzyści wynikających z kapsułkowania wysokich stężeń barwnika. Niezbędne jest porównanie właściwości obrazowania wygaszonych liposomów z właściwościami wolnego barwnika, a także z niegaszonym preparatem liposomowym o niskich stężeniach barwnika. Za pomocą prostego, ale bardzo skutecznego protokołu hydratacji i ekstruzji folii w połączeniu z naprzemiennymi cyklami zamrażania i rozmrażania pokazujemy, że enkapsulacja stężeń hartujących DY-676-COOH w liposomach jest możliwa. Inne metody stosowane do przygotowania liposomów, takie jak metoda odparowywania z odwróconymi fazami23, a także metoda wstrzykiwania etanolu24, umożliwiają przygotowanie liposomów o wysokiej skuteczności enkapsulacji dla wielu substancji hydrofilowych. Jednak charakter substancji, która ma być kapsułkowana, może mieć wpływ na skuteczność kapsułkowania. W efekcie, przedstawiony tutaj protokół hydratacji i ekstruzji folii wykazał najwyższą skuteczność enkapsulacji DY-676-COOH. Aby zilustrować korzyści płynące z liposomalnej enkapsulacji DY-676-COOH, wykorzystano model obrzęku wywołany zymosanem, który pozwala na badanie procesów zapalnych w ciągu kilku godzin. W tym miejscu wykazano, że liposomy o wysokich stężeniach kapsułkowanego DY-676-COOH są bardziej odpowiednie do optycznego obrazowania procesów zapalnych całego ciała in vivo niż wolny barwnik lub niegaszona formuła liposomalna o niskich stężeniach barwnika. W ten sposób podstawowy protokół zapewnia prostą i szybką metodę wytwarzania wygaszonych liposomów fluorescencyjnych oraz walidacji ich potencjału aktywacji i obrazowania zarówno in vitro, jak i in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiały i urządzenia do przygotowania liposomów</td></tr><tr><td>egg phospahtidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051P</td><td>Rozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (214 mg/ml)</td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Rozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (134 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa)Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>880120P</td><td>Rozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (122 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaN-(7-nitro-2-1, 3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145P</td><td>Rozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (2 mg/ml)</td></tr><tr><td>Sartorius MC1 (d = 0,01 mg)Sartorius AG</td><td></td> <td>Research RC 210 P</td><td>stosowany do ważenia fosfolipidów</td></tr><tr><td>Rotavapor</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-114</td><td>stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-481</td><td>stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego</td></tr><tr><td>Regulator próżni</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>B-720</td><td>stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego</td></tr><tr><td>Vacobox</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>B-177</td><td>stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego</td></tr><tr><td>Chłodziarka cyrkulacyjna</td><td>LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG</td><td>WKL 230</td><td>stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego</td></tr><tr><td>DY-676-COOH</td><td>Dyomics GmbH</td><td>676-00</td><td>Rozpuścić w 10 mM Tris i przechowywać zapasy w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Applichem</td><td>A1086</td><td>bufor 10 mM, pH 7,4</td></tr><tr><td>Trichlormethan</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>Y015.2</td><td>stosowany do przygotowania liposomów</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Merck Eurolab GmbH</td><td>USR 170 H</td><td>używany do przygotowania liposomów</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, nr 146-3011-00)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0256</td><td>stosowany do preparatu liposomów</td></tr><tr><td>Sephadex G25 podłoże&nbsp;</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-0033-01</td><td>używany do oczyszczania liposomów</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Ferak Berlin GmbH</td><td>505002</td><td>używany do niszczenia liposomów&nbsp; do oznaczania ilościowego barwnika</td></tr><tr><td>LiposoFast-Basic</td><td>Avestin Inc.</td><td></td><td>stosowany do wytłaczania liposomów</td></tr><tr><td>Poliwęglanowa membrana filtracyjna, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td><td>VWR</td><td></td><td>stosowany do wytłaczania liposomów za pomocą LiposoFast-Basic</td></tr><tr><td>Fluostar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>stosowany do oznaczania ilościowego barwnika</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>stosowany do oznaczania wielkości liposomów i zetapotencjału</td></tr><tr><td>Ultrawirówka&nbsp;</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>XL 80</td><td>służy do zagęszczania próbek</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>SW 55 TI</td><td>służy do zagęszczania próbek</td></tr><tr><td colspan="4">Materiały i urządzenia do oceny liposomów i obrazowania optycznego</td></tr><tr><td>Zymosan-A z Saccharomyces cereviciae</td><td>Sigma</td><td>Z4250-250MG</td><td>stosowany do indukcji stanu zapalnego</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (0,9%)</td><td>Fresenius GmbH</td><td>PZN-2159621</td><td>stosowana do rozcieńczania parownika Zymosan-A</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Ohmeda Isotec 4</td><td></td><td>stosowana do znieczulania zwierząt</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Actavis GmbH&nbsp;</td><td>PZN-7253744</td><td>znieczulenie</td></tr><tr><td>Thermo Mat Pro 20 W</td><td>Lucky Reptile</td><td>61202-HTP-20</td><td>stosowane do utrzymywania ciepła zwierząt podczas znieczulenia</td></tr><tr><td>Omnican-F (1 ml iniekcja)&nbsp;</td><td>Braun</td><td>PZN-3115465</td><td>stosowany do podskórnego i dożylnego stosowania sond</td></tr><tr><td>Pantenol krem pod oczy</td><td>Jenapharm</td><td>PZN-3524531</td><td>stosowany w celu zapobiegania suchości oczu zwierząt podczas znieczulenia</td></tr><tr><td>Hanks buforowany roztwór soli fizjologicznej</td><td>PAA Laboratories /Biochrom AG</td><td>L2045</td><td>bez Mg2+, Ca2+ i czerwieni fenolowej. Do rozcieńczania sond i do mycia komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka z 8-dołkową komorą</td><td>BD Biosciences</td><td>354108</td><td>używane do hodowli komórkowych, a następnie do mikroskopii&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych</td><td>Greiner BioOne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td><td>Gibco (life technologies GmbH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór poli-L-lizyny (0,01%, 50&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>służy do powlekania szkiełek komory hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Mocowanie Permafluor</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>S21022-3</td><td>Roztwór montażowy do mikroskopii</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Barwienie DNA AppliChem</td><td></td><td>do mikroskopii</td></tr><tr><td>Hera-Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>sterylny stół roboczy używany do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Komórka HERA</td><td>Heraeus Inkubator</td><td></td><td>używany do hodowli komórek</td></tr><tr><td>LSM510-Meta</td><td>Zeiss</td><td></td><td>używany do mikroskopii konfokalnej</td></tr><tr><td>System obrazowania fluorescencyjnego in vivo Maestro-TM</td><td>CRi, Woburn</td><td></td><td>używany do obrazowania fluorescencyjnego całego ciała małych zwierząt</td></tr><tr><td>Spektrofotometr (Ultrospec 4300 pro UV)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>używany do pomiaru absorpcji</td></tr><tr><td>Spektrofluorometr (Jasco FP-6200)</td><td>Jasco</td><td></td><td>używany do pomiaru emisji</td></tr><tr> fluorescencji<td colspan="4"><silny>Zwierzęta</silny></td></tr><tr><td>Myszy NMRI (8-12 tygodni, samiec)</td> <td>Elevage Janvier, Francja</td><td></td><td>używane do prób zapalnych</td></tr></tbody></table>

wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Obrazowanie optyczne oferuje szeroki zakres modalności diagnostycznych i cieszy się dużym zainteresowaniem jako narzędzie do obrazowania biomedycznego. Pomimo ogromnej liczby dostępnych obecnie technik obrazowania i postępu w oprzyrządowaniu, nadal istnieje zapotrzebowanie na wysoce czułe sondy, które nadają się do obrazowania in vivo. Jednym z typowych problemów dostępnych przedklinicznych sond fluorescencyjnych jest ich szybki klirens in vivo, co zmniejsza ich czułość obrazowania. Aby obejść szybki klirens, należy zwiększyć liczbę cząsteczek barwnika w miejscu docelowym, a tym samym zmniejszyć autofluorescencję tła, przeprowadzono enkapsulację barwnika fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni, DY-676-COOH w liposomach i weryfikację jego potencjału do obrazowania zapalenia in vivo. DY-676 jest znany ze swojej zdolności do samogaszenia w wysokich stężeniach. Najpierw określiliśmy stężenie odpowiednie do samogaszenia, a następnie zamknęliśmy to stężenie hartujące w wodnym wnętrzu pegylowanych liposomów. Aby potwierdzić potencjał hartowania i aktywacji liposomów, stosujemy ostrą metodę zamrażania, która prowadzi do uszkodzenia błon liposomalnych bez wpływu na kapsułkowany barwnik. Liposomy charakteryzujące się wysokim poziomem wygaszania fluorescencji zostały określone jako Lip-Q. Wykazaliśmy poprzez eksperymenty z różnymi liniami komórkowymi, że wychwyt Lip-Q odbywa się głównie przez fagocytozę, co z kolei umożliwiło scharakteryzowanie jego potencjału jako narzędzia do obrazowania in vivo stanu zapalnego w modelach mysich. Ponadto używamy modelu obrzęku wywołanego zymozanem u myszy, aby potwierdzić potencjał Lip-Q w optycznym obrazowaniu stanu zapalnego in vivo. Biorąc pod uwagę możliwe wchłanianie z powodu efektu zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) wywołanego stanem zapalnym, w badaniach na zwierzętach porównano zawsze aktywny preparat liposomowy o niskim, niewygaszonym stężeniu DY-676-COOH (określanym jako Lip-dQ) i wolnym DY-676-COOH z Lip-Q.

Enkapsulacja wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych, takich jak zastosowany tutaj barwnik NIRF DY676-COOH, w wodnistym wnętrzu liposomów prowadzi do wysokiego poziomu gaszenia fluorescencji. Gaszenie fluorescencji, zjawisko obserwowane u wielu fluoroforów przy wysokim stężeniu, może zostać wykorzystane w kilku zastosowaniach obrazowania in vivo, w których wymagana jest wysoka czułość i niezawodna detekcja obszaru docelowego. Zastosowanie liposomów zapewnia również ochronę barwnika, co jest niezbędne w aplik...

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie liposomu aktywacyjnego, który umożliwia obrazowanie stanu zapalnego in vivo z wysoką czułością. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw filmu lipidowego złożonego z fosfolipidów w drugim etapie. Spontaniczne pęcherzyki powstają w wyniku uwodnienia filmu fosfolipidowego stłumionym roztworem o stężeniu barwnika fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.Spontanicznie powstałe pęcherzyki lub SFV są wytłaczane w celu zapewnienia jednorodności pęcherzyków liposomalnych, a następnie liposomy są oczyszczane z resztkowych niekapsułkowanych cząsteczek barwnika. Ostatecznie pomiary spektrometryczne absorbancji i emisji fluorescencji służą do pokazania stanu wygaszenia kapsułkowanego barwnika in vivo. Obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni służy do wykazania potencjału liposomów do obrazowania procesów zapalnych.Główną przewagą tej technologii nad innymi istniejącymi jest to, że możemy określić sygnał bezpośrednio po internalizacji środka kontrastowego do komórek. Oznacza to, że są one aktywowane w komórce, więc sygnał, który jest wykrywany, pochodzi wyłącznie z komórek. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę i terapię raka.Ponieważ fagocyty, takie jak makrofagi związane z nowotworem, mogą wchłaniać i degradować liposomy, uwalniając leki terapeutyczne lub sondy obrazowe w guzach. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ na skuteczność enkapsulacji mają wpływ właściwości stosowania DAI i skuteczność procesu hydratacji Aby zainicjować spontanicznie powstałą dyspersję pęcherzową, należy rozpocząć od dodania około trzech mililitrów chloroformu do kolby okrągłodennej, a następnie odpowiedniej objętości świeżo przygotowanych roztworów łodyg fosfolipidów w stosunku molowym 6,5 do trzech do 0,5 w celu podwójnego znakowania fluorescencyjnego liposomów. Następnie dodaj 0,3 molowego procentu N-B-D-D-O-P-E do roztworu lipidowego.Następnie za pomocą wyparki obrotowej odparować chloroform z organicznego roztworu fosfolipidów pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 300 milibarów i 55 stopni Celsjusza. Po utworzeniu jednorodnego filmu fosfolipidowego należy zmniejszyć ciśnienie do 10 milibarów na jedną do dwóch godzin, aby usunąć wszelkie pozostałości osadu chloroformu podczas parowania chloroformu. Rozpuść barwnik fluorescencyjny, kwas karboksylowy, bufor procentowy i napełnij naczynie doer ciekłym azotem.Następnie włącz kąpiel ultradźwiękową ustawioną na 50 stopni Celsjusza. Teraz przenieś odpowiednią objętość barwnika kwasu karboksylowego do kolby okrągłodennej, aby uwodnić suchy film fosfolipidowy i energicznie wirować do kolby, aż utworzy się spontanicznie utworzona dyspersja pęcherzykowa, upewniając się, że wszystkie fosfolipidy są rozproszone, aby uniknąć utraty lipidów. Następnie ostrożnie zamrozić kolbę okrągłodenną zawierającą dyspersję SFV w ciekłym azocie.A po trzech do pięciu minutach umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej, aby rozmrozić dyspersję i energicznie wirować kolbę przez kolejną jedną do dwóch minut. Następnie, aby ułatwić tworzenie jednorodnych pęcherzyków, odessać dyspersję SFV do jednomililitrowej strzykawki, a następnie użyć podstawowej wytłaczarki lipo sofas, aby przepuścić ją przez 100-nanometrową membranę poliwęglanową do drugiej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Wytłacz dyspersję z powrotem do pierwszej strzykawki, powtarzając transfer 10 razy.Roztwór powinien zmienić się z zamglonego wyglądu w wyraźną dyspersję. Po 10. cyklu wytłaczania wyjmij drugą strzykawkę i wyciśnij dyspersję po raz ostatni bezpośrednio do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Teraz przenieś 0,5 mililitra wytłaczanej dyspersji pęcherzykowej na złoże żelowe 28-centymetrowej kolumny do chromatografii żelowej załadowanej kulkami G 25 nasączonymi buforem tris i pozwól próbce spłynąć do matrycy żelowej.Eluuj liposomy za pomocą buforu tris i zbieraj frakcję liposomową, aż liposom całkowicie odpłynie. Następnie skoncentrować usunięte liposomy przez ultrawirowanie i rozproszyć je w odpowiedniej objętości sterylnego buforu tris, mikrofotografie elektronowe liposomów powinny ujawnić w większości jednolitą morfologię pęcherzyków liposomalnych, aby przeanalizować zdolności liposomów, wygaszania i aktywacji fluorescencji. Następnie przenieś łącznie 100 nanomolowych odpowiednich lipidów do dwóch 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych.Następnie przenieś wolny kwas di karboksylowy odpowiadający zawartości barwnika w wardze Q do innej 1,5 mililitrowej probówki i inkubuj jedną probówkę każdej sondy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a drugą w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnego ranka ustaw blok grzewczy na 30 stopni Celsjusza. Napełnij komorę chłodzącą kruszonym lodem i zrównoważyć porcję buforu tris do temperatury pokojowej.Następnie szybko rozmrozić sondy z ujemnego 80 stopni Celsjusza przechowywania w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć minut, jednocześnie równoważąc sondy z czterech stopni Celsjusza do temperatury pokojowej przez pięć minut. Następnie schładzaj wszystkie sondy na lodzie przez minutę przed przeniesieniem ich z powrotem do temperatury pokojowej. Teraz dodaj bufor tris do każdej z sond do końcowej objętości 100 mikrolitrów.Następnie, po kolejnych 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, odpipetuj 80 mikrolitrów każdej sondy do szklanego weterynarza o małej objętości i zmierz absorpcję od 400 do 900 nanometrów na spektrometrze. Umieść sondy z powrotem w odpowiednich probówkach, a następnie przenieś 80 mikrolitrów każdej z nich do odpowiednich szklanych kuwet. Pomiar emisji fluorescencji na fluorymetrze spektralnym poprzez wzbudzenie sond na 674 nanometrach i pomiar fluorescencji od 694 do 800 nanometrów.Aby ocenić właściwości liposomów do wykrywania stanu zapalnego, napełnij jedną strzykawkę 50 mikrolitrami roztworu xin a, jedną 50 mikrolitrami izotonicznego roztworu soli fizjologicznej i jedną eksperymentalnym roztworem sondy, wszystkie rozcieńczone HBSS do końcowej objętości 150 mikrolitrów. Po potwierdzeniu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi nałóż krem pod oczy na zwierzę doświadczalne, a następnie umieść mysz na ciepłej macie. Wstrzyknąć roztwór xon a podskórnie w prawą tylną nogę zwierzęcia, a roztwór soli fizjologicznej w lewą tylną nogę.Następnie natychmiast wstrzyknij sondę dożylnie, a następnie zobrazuj zwierzę. Na koniec zapisz wynikowe obrazy jako kostki obrazu. Obrazowanie zwierząt co dwie godziny przez 10 godzin po wstrzyknięciu, a następnie ponownie po 24 godzinach.Sondy liposomalne ujawniają dominujący wychwyt fagocytarny, który jest hamowany przez wyczerpanie energii, co można zaobserwować poprzez wychwyt wargi Q przez wysoce fagocytarne lustrzane linie komórkowe mikrofagów i linie komórkowe mo fagocytarnego ludzkiego glejaka. Zgodnie z wychwytem fagocytarnym obserwowanym w hodowanych liniach komórkowych, dożylne wstrzyknięcie LIP Q prowadzi do zależnego od czasu wzrostu intensywności fluorescencji obrzęku w modelach mysich o bardzo niskiej fluorescencji tła i z maksymalną intensywnością fluorescencji wykrywaną po ośmiu do 10 godzinach po wstrzyknięciu. W przeciwieństwie do tego, po zastosowaniu wolnego kwasu karboksylowego lub zawsze włączonego liposomowego DQ wargi obserwuje się stosunkowo silną fluorescencję w bliskiej podczerwieni całego zwierzęcia w porównaniu z wargą Q. Szybka perfuzja i klirens wolnego kwasu karboksylowego, obserwowany od zera do czterech godzin po wstrzyknięciu, zakłóca obrazowanie, uniemożliwiając wiarygodne wykrycie obrzęku.Co więcej, niegaszona liposomowa warga DQ ujawnia maksymalną fluorescencję obrzęku w ciągu dwóch do czterech godzin po wstrzyknięciu, która pozostaje prawie stała do ośmiu godzin, a następnie stopniowo zmniejsza się w podobny sposób jak zgaszona warga. Obrazowanie fluorescencyjne obrzęku na podstawie Q narządów myszy poddanych eutanazji 24 godziny po podaniu sondy ujawnia łagodną fluorescencję ex vivo wątroby, pęcherzyka żółciowego i nerek oraz bardzo niską lub żadną fluorescencję śledziony, płuc i serca, co służy jako dowód na eliminację sond drogą paczologiczną dróg żółciowych. Podczas tego zabiegu należy pamiętać o użyciu wysokiego stężenia barwnika gaszącego zmysł grypy i odpowiednim rozproszeniu fosfolipidów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować liposomy aktywatowe do obrazowania zapalenia in vivo z wysoką czułością. Porządku? Nie zapominaj, że aby wykorzystać zwierzęta w badaniach, musisz postępować zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi, a to oznacza, że musisz ubiegać się o wykorzystanie zwierząt w eksperymentach. Potrzebna jest zgoda lokalnej komisji etycznej.

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy system wielokątowego rotacyjnego obrazowania optycznego (MAROI) do ilościowego oznaczania in vivo markera fluorescencyjnego dostarczanego przez nanopęcherzyki saposyny C (SapC)-dioleoilofosfatydyloseryny (DOPS). Wykorzystując mysie modele raka i zapalenia stawów, pokazujemy, w jaki sposób analiza krzywej sygnału MAROI może być wykorzystana do precyzyjnego mapowania i biologicznej charakterystyki procesów chorobowych.

In vivo (in vivo) Obrazowanie optyczne guzów mózgu i zapalenia stawów za pomocą fluorescencyjnych nanopęcherzyków SapC-DOPS

Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Niskointensywna pulsacyjna stymulacja ultradźwiękowa (LIPUS) to metoda nieinwazyjnej mechanicznej stymulacji komórek endogennych lub inżynieryjnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym artykule opisano, jak wdrożyć LIPUS do mikroskopu epifluorescencyjnego i jak zminimalizować niedopasowanie impedancji akustycznej wzdłuż ścieżki ultradźwięków, aby zapobiec niepożądanym artefaktom mechanicznym.

Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Obecny protokół opisuje szczegółową operację obrazowania fluorescencyjnego NIR-II w czasie rzeczywistym myszy za pomocą urządzenia do obrazowania optycznego NIR-II.

Jasna sonda fluorescencyjna NIR-II do obrazowania naczyń krwionośnych i nowotworów

Ten artykuł opisuje dwukolorowe znakowanie długich RNA na końcach i ich unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację w pęcherzykach fosfolipidowych dla zastosowań mikroskopii pojedynczej cząsteczki FRET TIRF. Połączenie tych technik umożliwia precyzyjną wizualizację i analizę dynamiki RNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

Poznaj metodę przygotowania aktywowalnych liposomów z barwnikiem bliskiej podczerwieni do obrazowania zapalenia in vivo. Technika ta znacząco zwiększa czułość detekcji w badaniach biologicznych.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Przeglądaj więcej filmów