Name: Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj protokół przygotowania monowalentnych kropek kwantowych z wykorzystaniem fosforotioatowego DNA do obrazowania pojedynczych cząsteczek białek błonowych w żywych komórkach. Metoda ta umożliwia precyzyjne śledzenie dynamiki receptorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez DOD W81XWH-10-1-1023 (Z.J.G.), grant P50 GM081879 od UCSF Center for Systems and Synthetic Biology (Z.J.G.), NIH 5R21EB015088-02 (Y.J.) i NIH 1R21EB018044 (Z.J.G. & Y.J.). D.S. był wspierany przez Human Frontier Science Program Interdyscyplinarne stypendium badawcze na stażu podoktorskim.

1. Produkcja monowalentnych kropek kwantowych
<ol>
	<li>Przeniesienie fazowe QD z fazy organicznej do fazy wodnej
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 200 μM 1 μM roztworu QD fazy organicznej z 400 μl chloroformu w szklanej fiolce o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Zmieszać 400 μl 0,3 M roztworu chloroformu bromku tetrabutyloamonu (TBAB) z 36 μl czystego tiolu mPEG (CH3O(CH2CH2O)6C2H5SH) i wstrząsnąć O/N.</li>
		<li>Dodać 800 μl 0,2 M wodnego roztworu NaOH i wstrząsać przez 30 sekund. Przeniesienie fazowe następuje w ciągu kilku minut, na co wskazuje przeniesienie kolorowych cząstek do fazy wodnej powyżej gęstszej fazy organicznej.</li>
		<li>Jeżeli cząstki agregują się w trzeciej fazie między fazą wodną a fazą organiczną, należy wydłużyć czas inkubacji z tiolem mPEG. Jeśli faza wodna pozostaje czysta, oznacza to, że QD nie uległy przeniesieniu fazowemu (patrz rysunek 3A). Alternatywnie, zwiększ stężenie tiolu mPEG w kroku 2, aby złagodzić słabe przenoszenie faz</li>.
		<li>Odzyskać (zabarwioną) fazę wodną, a następnie zagęścić zebrane mięśnie czasu reakcji za pomocą kolumny wirowej Centricon (odcięcie masy cząsteczkowej 30 kDa) do 1 ml.</li>
		<li>Dodać stężony roztwór QD do kolumny Sephadex NAP10 wstępnie zrównoważonej 10 mM buforem Tris zawierającym 30 mM NaCl (pH 8,0). Eluować QD za pomocą 1,5 ml buforu elucyjnego za pomocą przepływu grawitacyjnego.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie mięśni czasu środkowego za pomocą spektroskopii absorpcyjnej przy długości fali 350 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mQD
	<ol>
		<li>Kup (lub zsyntetyzuj) ptDNA. W protokole tym stosuje się sekwencję 5'-AS50(CT)10(ACTG)5 -3' (patrz Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>kolejność</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'-AS50(CT)10(ACTG)5-3'</td>
			<td>ASASASAS<br/>
			ASASA SAS 
			ASASAS<br />
			CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'-NH2-(CT)10(CAGT)5-3'</td>
			<td>NH2-/C6spacer/ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-DNA</td>
			<td>BG-/C6spacer/ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Sekwencje DNA używane do produkcji i celowania w mQD.
<ol start="2" style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Przygotować 1 ml roztworu QD o stężeniu 100 nM w 10 mM buforze Tris zawierającym 30 mM NaCl (pH 8).</li>
	<li>Dodaj kroplami 500 μl roztworu ptDNA o stężeniu 100 nM do wodnych separatorów czasu na 1 minutę, energicznie mieszając. Wymieszaj lub umieść na shakerze na dodatkowe 9 godzin. 
	Uwaga: Teoretycznie powinno to dać stosunek ptDNA:QD 1:2. Jednak rzeczywista stechiometria nigdy nie jest idealna - zwykle wynik jest bliższy 1:1,5. Aby uzyskać stosunek ptDNA:QD 1:1, konieczna jest densytometria po elektroforezie żelowej w celu ilościowego określenia dokładnego stosunku koniugacji przy znanych objętościach użytych powyżej.</li>
	<li>Usunąć ~10 μl mieszaniny QD, aby uruchomić na analitycznym żelu agarozowym. Usuń również podobne stężenie niesprzężonych QD w fazie wodnej (z kroku 1.2.1).
	<ol>
		<li>Dodać ~2 μl 6x buforu ładującego Ficoll (w celu zwiększenia gęstości roztworu) i uruchomić te dwie próbki razem na żelu agarozowym 0,8% wag./v w buforze boranu sodu przez 15 minut przy 150 V. Widoczne jest pojedyncze pasmo na niesprzężonym pasie kontrolnym migrującym w pobliżu studni oraz dwa pasma na pasie ze sprzężonymi QD (patrz żele na rysunku 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz niesprzężoną frakcję QD, używając względnej intensywności dwóch pasm (patrz równanie na rysunku 2B). Następnie użyj tej frakcji do obliczenia dodatkowej objętości roztworu ptDNA o stężeniu 100 nM wymaganej do dopasowania liczby karbów.</li>
	<li>Powtórz kroki od 1.2.3 do 1.2.5 jeszcze raz z tą obliczoną objętością lub do momentu, gdy sprzężone QD zapadną się w pojedyncze pasmo na żelu, wskazując na całkowite sprzężenie wszystkich QD.</li>
	<li>Dodać 100 μl 10 mM (CO2H)CH2O(CH2CH2O)6C11H23SH (karboksylowy PEG6 alkanowy tiol) w 10 mM buforze Tris zawierającym 30 mM NaCl (pH 8) do sprzężonych mQD wytworzonych powyżej i wstrząsać przez 10 min. 
	Uwaga: Te ligandy PEG pasywują powierzchnię QD. Dłuższy PEG będzie lepiej pasywował QD, jednak zwiększy również ich rozmiar. Hydrofobowa funkcjonalność alkanu tiolowego ma znacznie większe powinowactwo do QD, w ujęciu zbiorczym, niż mniej hydrofobowy PEG-tiol stosowany do przenoszenia faz. Dlatego nie pozwól, aby ten krok trwał zbyt długo, w przeciwnym razie ptDNA zostanie zastąpione przez alkan-PEG-tiol. Po ~ 30 minutowej inkubacji znaczna część DNA zostanie przemieszczona z QD (Figura 3B).</li>
	<li>Aby usunąć nadmiar alkanu, PEG-tiol, dodać 0,5 ml roztworu QD do kolumny sephadex NAP5 wstępnie zrównoważonej buforem elucyjnym (10 mM bufor Tris zawierający 30 mM NaCl). Zebrać mQD za pomocą 1,0 ml buforu elucyjnego za pomocą przepływu grawitacyjnego.</li>
	<li>Zagęścić zebrane QD za pomocą kolumny wirującej Centricon (30 kDa). Przechowywać te mQD w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy. Nie zamrażaj ich. 
	Uwaga: Jeśli na dnie tubki widoczny jest kolorowy granulek, kropki zagregowały się i prawdopodobnie nie nadają się już do użytku.</li>
</ol>
2. Produkcja celującego DNA (benzylguaniny-)
<ol>
	<li>Wyprodukuj lub kup DNA zakończone aminami. W protokole tym stosuje się sekwencję 5'-NH2-(CT)10-(CAGT)5-3' (patrz Tabela 1). Łącznik poly-CT zwiększa dostęp do funkcji ukrytych głęboko w glikokaliksie, ale może nie być potrzebny we wszystkich zastosowaniach. Jeśli jest dostęp do syntezatora DNA, należy wyprodukować aminomodyfikowane DNA przy użyciu odpowiedniego modyfikatora 5' aminomodyfikatora (modyfikatora 5' amino-modyfikatora C6).</li>
	<li>Rozpuścić BG-N-hydroksysukcynimid (BG-NHS) w suchym dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 10 mg/ml. 
	Uwaga: BG-NHS absorbuje wodę z powietrza i prowadzi do hydrolizy reaktywnego estru NHS, szczególnie w rozpuszczalnikach higroskopijnych, takich jak DMSO i dimetyloformamid (DMF). BG-NHS najlepiej przechowywać w temperaturze -80 °C w postaci proszku we własnej fiolce w wtórnym pojemniku zawierającym środek osuszający. Ogrzać do suchego oleju przed otwarciem fiolki. Alternatywnie, natychmiast podwielokrotność estru BG-NHS do jednorazowego użytku należy przekształcić w suchy rozpuszczalnik polarny i zamrozić w temperaturze -80 °C lub w pełni przereagować z aminowym DNA w kroku 2.2.</li>
	<li>Reaguj, mieszając BG-NHS w DMSO z kroku 2.1 z DNA zakończonym aminami w wodzie buforowanej HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) (pH 8,5). W typowej reakcji 20 μl 10 mg/ml BG-NHS w DMSO z 2 μl 2 mM NH2-(CT)10-(CAGT)5 w 58 μl wody dejonizowanej buforowanej 20 μl 0,5 M HEPES pH 8,5. Przeprowadzać reakcje w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Mieszaj szybko, ponieważ reakcja postępuje szybko i musi konkurować z hydrolizą estrów NHS.</li>
	<li>Sonikować przez 5–10 minut, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Inkubacja ~ 1 godzina w RT. Stosunek stechiometryczny BG:DNA można zmienić, aby doprowadzić reakcję do końca.</li>
	<li>Odsolić reakcję za pomocą standardowej kolumny NAP5 do 100 mM octanu trietyloaminy (TEAA, pH 7).</li>
	<li>Oczyść BG-DNA z nieprzereagowanego aminowego DNA za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, przeprowadzając gradient 100 mM TEAA:acetonitryl (ACN) między 8% a 95% acetonitrylu przez 30 minut. Nieprzereagowany aminowy DNA wymyje się przed BG-DNA. Zbierz frakcję BG-DNA w stożkowej probówce.
	<ol>
		<li>Użyj kolumny Zorbax C18 do standardowego oczyszczania oligonukleotydów i następującego gradientu: 
		0→15 min: 8→30% ACN; 
		15→21 min: 30–90% ACN; 
		21→25 min: 90→8% ACN; 
		25→30 min: 8% PKW;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować zebraną frakcję. Ponownie zawiesić DNA w wodzie dejonizowanej. Aby zachować szczególną ostrożność, liofilizuj jeszcze dwa razy, aby usunąć resztki TEAA. Resztkowe TEAA mogą być toksyczne dla komórek w wyższych stężeniach.</li>
	<li>Ponownie zawiesić liofilizowane BG-DNA w wodzie, upewniając się, że umyłeś boki probówki i rozcieńczyć do ~25 μM. Porcję i przechowywać w temperaturze 4 °C. Próbki przechowywano przez ~9 miesięcy bez zauważalnej degradacji.</li>
</ol>
3. Oznaczanie żywych komórek za pomocą monowalentnych kropek kwantowych
<ol>
	<li>Opcjonalnie pasywować mQD tuż przed eksperymentem obrazowym przy użyciu odczynników, takich jak kazeina (0,5%) lub albumina surowicy bydlęcej (BSA, 1-3%).</li>
	<li>Komórki płytki wyrażające białko znakowane SNAP na szkle o jakości fluorescencji o całkowitym wewnętrznym odbiciu (TIRF). W tym eksperymencie używamy linii komórkowej U2OS wyrażającej receptor Notch1 oznaczony SNAP i wysokiej jakości szklane powierzchnie.</li>
	<li>Po przyczepieniu komórek do szkła (~24 godziny) usuń pożywkę wzrostową, przemyj PBS i inkubuj komórki przez 10–30 minut w temperaturze pokojowej w ~100–150 μl PBS lub pożywki komórkowej zawierającej ~1 μM BG-DNA z kroku 2.6 powyżej.</li>
	<li>Po inkubacji z BG ostrożnie umyć komórki PBS lub pożywką komórkową. Inkubować komórki przez ~ 5–10 minut z mQD wyprodukowanymi w kroku 1.2.9 (i opcjonalnie pasywowanymi w kroku 3.1).</li>
	<li>Opcjonalnie przemyć niezwiązane mQD i umieścić komórki z powrotem w buforze/pożywce odpowiedniej zarówno do obrazowania, jak i hodowli. W przypadku komórek, które miały być obrazowane w trybie TIRF, końcowy etap płukania był często zbędny, ponieważ niezwiązane mQD w roztworze dyfundowały tak szybko w porównaniu z związanymi mQD, że były niewykrywalne podczas analizy.</li>
</ol>
4. Mikroskopia i analiza
<ol>
	<li>Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu TIRF. 
	Uwaga: Oscylomierz musi być wyposażony w rozłączne filtry wzbudzenia i emisji lub niestandardową kostkę filtra QD. Kolejki przełożonych najlepiej wzbudza się laserem o niskiej długości fali (405 lub 488 nm). Odstępy czasu o różnej średnicy mają charakterystyczne długości fal emisyjnych, zwykle związane z dużym przesunięciem Stoke'a.</li>
	<li>Ze względu na jasność mQD, zbieraj obrazy z dużą liczbą klatek na sekundę w TIRF podczas obrazowania podstawowej strony żywej komórki. 
	Uwaga: Alternatywnie, dynamikę pojedynczych cząsteczek można śledzić w innych płaszczyznach ogniskowych za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Zautomatyzowane oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząstek jest na ogół skuteczne w dokładnym śledzeniu jasnych i fotostabilnych mQD.</li>
</ol>

<ol><li>Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+EGFR+signaling+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 168-172 (2000).</li>
<li>Luo, W., He, K., Xia, T., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+monitoring+in+living+cells+by+use+of+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule monitoring in living cells by use of fluorescence microscopy.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (1), 43-49 (2013).</li>
<li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li>
<li>Fernández-Suárez, M., Ting, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+super-resolution+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 929-943 (2008).</li>
<li>Sark, W. G. J. H. M., Frederix, P. L. T. M., Vanden Heuvel, D. J., Gerritsen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photooxidation+and+photobleaching+of+single+CdSe%2FZnS+quantum+dots+probed+by+room-temperature+time-resolved+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Photooxidation and photobleaching of single CdSe/ZnS quantum dots probed by room-temperature time-resolved spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (35), 8281-8284 (2001).</li>
<li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+events%2C+one+quantum+dot+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307 (5709), 538-544 (2005).</li>
<li>Howarth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nature Methods. 5 (5), 397-399 (2008).</li>
<li>Iyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic+aldehyde+and+hydrazine+activated+peptide+coated+quantum+dots+for+easy+bioconjugation+and+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aromatic aldehyde and hydrazine activated peptide coated quantum dots for easy bioconjugation and live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1006-1011 (2011).</li>
<li>Tikhomirov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+programming+of+quantum+dot+valency%2C+self-assembly+and+luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-based programming of quantum dot valency, self-assembly and luminescence.</a> Nature Nanotechnology. 6 (8), 485-490 (2011).</li>
<li>Farlow, J., Seo, D., Broaders, K. E., Taylor, M. J., Gartner, Z. J., Jun, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+targeted+monovalent+quantum+dots+by+steric+exclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of targeted monovalent quantum dots by steric exclusion.</a> Nature Methods. 10 (12), 1203-1205 (2013).</li>
<li>Gartner, Z. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+assembly+of+3-dimensional+microtissues+with+defined+cellular+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Programmed assembly of 3-dimensional microtissues with defined cellular connectivity.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences USA. 106 (12), 4606-4610 (2009).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modułowość konstrukcji mQD umożliwia zwiększenie stopnia elastyczności eksperymentalnej. Na przykład, różne mQD mogą być szybko przygotowane w unikalnych kolorach, co pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu celów. Sekwencja celująca w ssDNA może kierować mQD do białek, cukrów12, lipidów i powierzchni13. Dostępnych jest wiele znaczników enzymatycznych z reaktywnościami ortogonalnymi, co pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu celów za pomocą różnie ukierunkowanych mQD. Oprócz celowania za pomocą znacznika SNAP, udało się również znakować docelowe białka za pomocą mQD za pomocą znacznika CLIP, znacznika HALO i białek biotynylowanych. Protokół ten demonstruje specyficzne znakowanie receptora powierzchniowego na żywych komórkach za pomocą tych mQD, ale protokół można łatwo dostosować do wielu różnych kontekstów.
Istotnym wglądem metodologicznym w wytwarzaniu mQD o określonej wartościowości jest to, że ~ 50 zasad połączonych z fosforotionianem jest potrzebnych do owinięcia QD (a tym samym zapobieżenia jednoczesnemu wiązaniu się dwóch cząsteczek). Sekwencja poli-AS50 odtwarzalnie i stabilnie związana QD 605 nm firmy Life Technologies. Chociaż ten produkt został wycofany, strategia wykluczenia sterycznego można uogólnić na podobne produkty od innych dostawców o różnych rozmiarach, kształtach, właściwościach spektralnych.
Wydajność i stabilność QD owiniętych ptDNA zależy krytycznie od chemii powierzchni i struktury QD. W związku z tym sukces protokołu będzie zależał od komercyjnego źródła i struktury chemicznej QD. Dla celów niniejszego protokołu istnieją trzy główne różnice między różnymi komercyjnymi źródłami QD: różnica w warunkach niezbędnych do przeniesienia fazy; różnica w sile początkowego wiązania PEG-tiol-ligand, co może utrudniać przemieszczanie się przez ptDNA; oraz różnica w ilości odsłoniętego rdzenia CdSe, która może prowadzić do wygaszania QD w warunkach przenoszenia fazy tiolowej mPEG.
W chwili publikacji, QD o najlepszej strukturze do produkcji mQD to QD 4–10 nm CdSe/ZnS core/shell QD zakupione od Life Technologies z widmami emisji przy 545, 585, 605 i 625 nm (rysunek 2A). Odstępy czasu nienastawionego oparte na preparacie "Vivid" (545, 605 itd.) ulegają zanikowi po dodaniu tiolu mPEG i nie nadają się do tego zastosowania. Separatory QD firmy Aldrich i Ocean Nanotech działają dobrze, ale wymagają dłuższych etapów przenoszenia faz i wstępnej obróbki tlenkiem trioktylofosfiny. Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem QD firmy Life Technologies.
Sekwencja fosforonianu poli-A używana do owijania QD jest zakończona natywnym 20-merowym ogonem DNA zawierającym sekwencję (ACTG)5 , do której może hybrydyzować nić celująca. Ta sekwencja jest wygodna, ponieważ ma niewielką lub żadną strukturę drugorzędową i pozostanie hybrydyzowana w temperaturze 37 °C w PBS. Jeśli istnieje dostęp do syntezatora DNA, ptDNA można zsyntetyzować, a następnie oczyścić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC) przy użyciu kolumny C8 . ptDNA wymyje się później w HPLC niż równoważne oligonukleotydy z natywnym szkieletem. Zazwyczaj pozostawiamy grupę ochronną 5' DMT na naszych oligonukleotydach fosforoazotanu po oczyszczeniu.
Pasywacja QD owiniętych ptDNA jest zwykle wymagana w celu poprawy stabilności koloidalnej QD i zmniejszenia wiązania tła w większości zastosowań eksperymentalnych. Protokół wykorzystuje warstwę PEG do pasywacji QD. Karboksylowy tiol alkanowy PEG z dodatkowymi jednostkami PEG ((CO2H)CH2O(CH2CH2O)12C11H23SH, karboksyl-PEG12 alkanowy tiol) zapewnia znacznie zmniejszone tło, chociaż dłuższe PEG są zarówno większe, jak i ogólnie droższe. mQD pokryte karboksylowymi ligandami tiolowymi karboksylowymi PEG alkanowymi są wysoce stabilne w fizjologicznych, takich jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami i pożywki hodowlane. Długotrwałe przechowywanie (> 8 miesięcy) mQD w temperaturze 4 °C nie wykazało znaczącej agregacji ani oderwania ptDNA11. W zależności od eksperymentu, sama pasywacja PEG QD nie zawsze wystarczająco zmniejsza niespecyficzne wiązanie mQD. Inkubacja zarówno komórek, jak i mQD w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 3% BSA przez 20 minut przed użyciem znacznie zmniejsza niespecyficzne wiązanie z komórkami, chociaż zwiększa pozorny promień hydrodynamiczny mQD o ~50%. Pasywacja 0,5% kazeiną jeszcze bardziej zmniejsza niespecyficzne wiązanie, ale zwiększa pozorny rozmiar w większym stopniu niż BSA.
Koniec 5' nici DNA komplementarnej do mQD może być modyfikowany, aby umożliwić celowanie w wiele różnych biomolekuł. Istnieje wiele uznanych technik kowalencyjnej modyfikacji białek, lipidów i cukrów za pomocą jednoniciowego DNA (ssDNA). Tak długo, jak ssDNA jest prezentowane zewnątrzkomórkowo, jest dostępne dla rozpuszczalnych mQD. mQD z powyższymi sekwencjami szybko hybrydyzują ze swoją komplementarną nicią DNA w warunkach hodowli komórkowej. 10-20-krotny dystans poli-(CT) między ptDNA a sekwencją docelową może być wymagany do skutecznego celowania, aby podnieść sekwencję wiążącą ponad gruby i ujemnie naładowany glikokaliks komórki. W tym protokole zdecydowaliśmy się wyprodukować BG-DNA z komplementarną sekwencją (CAGT)5 , która zarówno zhybrydyzuje się z mQD, jak i kowalencyjnie połączy się z białkiem SNAP-tag w celu szybkiego i specyficznego znakowania. Podobny protokół dobrze sprawdza się w sprzęganiu innych estrów NHS z oligonukleotydami modyfikowanymi amino.
W przypadku obrazowania pojedynczych cząsteczek zwykle wymagana jest niska gęstość znakowania w celu rozdzielenia pojedynczych cząsteczek. Końcowe stężenie mQD wynoszące ~0,5 nM w PBS ze środkiem pasywującym jest dobrym celem. Jednak te wysokie rozcieńczenia czasami powodowały niedostateczne znakowanie komórek. W takim przypadku można dodać dodatkowe mQD, aż do uzyskania optymalnej gęstości etykietowania. W przypadku ludzkiego Notch1 znakowanego SNAP, stężenia >10 nM mQD wytworzyły gęste komórki znakujące, podczas gdy 0,5 nM mQD spowodowało przyłączenie ~ 20 mQD na podstawowej powierzchni docelowej komórki (patrz Figura 4B). Znakowanie komórek za pomocą mQD było w dużym stopniu zależne od konfluencji posianych komórek. Nadmiernie zlewające się komórki nie znakują się na ich podstawowych powierzchniach.
Podsumowując, opisano prostą metodę generowania monowalentnych i modułowych QD. Te mQD znajdują zastosowanie w szerokim zakresie zastosowań obrazowania żywych komórek, jak wykazano poprzez obrazowanie receptora Notch na żywych komórkach U2OS. Zastosowanie mQD nie ogranicza się do tego konkretnego przypadku, ale może być potencjalnie rozszerzone na inne cele komórkowe, takie jak inne białka, kwasy nukleinowe i enzymy.

Dynamika pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach przyczynia się do ich biologicznej funkcji. Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki jest popularną metodą badania dynamiki pojedynczej cząsteczki na powierzchni komórki1,2,3. Jednak najczęściej stosowane sondy obrazowe w tych badaniach mają kilka istotnych wad. Na przykład konwencjonalne barwniki organiczne i białka fluorescencyjne zapewniają umiarkowaną jasność, około 105–106 M-1 cm-1, ale są niestabilne fotochemicznie, bielejąc się po emisji około 105–10 6 fotonów w typowych warunkach obrazowania żywych komórek4,5. Natomiast nanocząstki półprzewodnikowe, często nazywane kropkami kwantowymi (QD), są znacznie jaśniejsze i bardziej stabilne, ze współczynnikami ekstynkcji w zakresie 106–107 M-1 cm-1 i przekraczającymi 107–108 wyemitowanych fotonów przed fotobieleniem5. Poprawiona jasność i fotostabilność QD w porównaniu z fluoroforami organicznymi umożliwia obserwację pojedynczych cząsteczek ze znacznie większą liczbą klatek na sekundę i na znacznie dłuższych trajektoriach6.
Pomimo ich zalet i dostępności komercyjnej, te potężne środki do obrazowania mają jeszcze kilka zobowiązań. Po pierwsze, mają słabo zdefiniowaną wartościowość ukierunkowaną, co może skutkować sieciowaniem docelowych biomolekuł6. Po drugie, mają one na ogół duży rozmiar hydrodynamiczny (> 20 nm), co ogranicza dostęp do niektórych zatłoczonych środowisk komórkowych7. Po trzecie, mają ograniczoną modułowość kierowania7. Kilka strategii próbowało rozwiązać te problemy8,9,10, ale generalnie wymagają specjalistycznej wiedzy i odczynników do wdrożenia.
Aby rozwiązać te problemy, niedawno opisaliśmy strategię "Wykluczenie steryczne" dla przygotowania monowalentnych, małych i modułowych QD11. Kolejki karnetów są owinięte pojedynczym polimerem DNA o długiej fosforotanii (ptDNA). ptDNA wiąże się z powierzchnią QD poprzez wielokrotne oddziaływania Zn-S między odsłoniętymi powierzchniowo atomami Zn a grupami fosforotionianowymi polimeru ptDNA. Pojedynczo związany polimer sterycznie i elektrostatycznie wyklucza wiązanie dodatkowych odpowiedników polimeru bez znacznego zwiększania całkowitego rozmiaru cząstki (około 2 nm). Wszystkie odczynniki są dostępne w handlu, produkty są formowane z wysoką wydajnością, a proces wymaga jedynie etapów odsalania w celu oczyszczenia. Po znakowaniu, QD owinięte pojedynczym ptDNA (mQD) wiążą się z komplementarnymi niciami DNA zawierającymi domeny docelowe (np. benzylguaninę (BG), benzylocytozynę lub alkilohalogenki).
Te funkcje są ukierunkowane na mQD specjalnie do znaczników enzymatycznych, takich jak SNAP, CLIP & HALO, które są genetycznie połączone z interesującym nas białkiem. Jest to protokół syntezy, celowania i obrazowania żywych komórek mQD wytwarzanych przez wykluczenie steryczne.

<table><tbody><tr><td colspan="4">mQD Production</td></tr><tr><td>Phosphorothioate DNA:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(A*)x50-(ACTG)x5</td><td>IDT</td><td></td><td>Większość firm zajmujących się syntezą DNA</td></tr><tr><td>Kropki kwantowe:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QDots 525, 585, 605 & 625</td><td>Invitrogen</td><td>Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605)</td><td>Niestandardowa synteza QD dla QD625.</td></tr><tr><td>QD610</td><td>Ocean Nanotech</td><td>QSP-610-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QD 610 lamda</td><td>Aldrich</td><td>731854</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, 99,8%</td><td>ACROS</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Bromek tetrabutyloamoniowy, 98,0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>426288</td><td></td></tr><tr><td>mPEG tiol [2,5,8,11,14,17,20-heptaoksadokozan-22-tiol], MW 354,5, 95%</td><td>Polipure</td><td>11156-0695</td><td></td></tr><tr><td>HSC11EG6CO2H&nbsp; [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H]</td><td>ProChimia</td><td>TH 003-m11.n6-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy, 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, 99,0%</td> <td>ACROS</td><td>S/4845</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza LE</td><td>U.S. Biotech Sources</td><td>G02PD-125</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">BG-Produkcja DNA</td></tr><tr><td colspan="4">Amine DNA:</td></tr><tr><td>(CAGT)5-NH2</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Większość firm zajmujących się syntezą DNA</td></tr> <tr><td>(CAGT)5(T)40-NH2</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Większość firm zajmujących się syntezą DNA</td></tr><tr><td>NHS-GLA-Benylguanina</td><td>Nowa Anglia Biosciences</td><td>S9151</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8428</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna NAP5 GE</td><td>Healthcare</td><td>17-0853-01</td><td></td></tr><tr><td>C18 Kolumna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetonitrylu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Hodowla komórek ssaków i Obrazowanie</td></tr><tr><td>Linia komórkowa wyrażająca białko znakowane SNAP</td><td>New England Biosciences</td><td>E9100S</td><td></td></tr><tr><td>McCoys 5A</td><td>UCSF Zakład</td><td></td> hodowli komórkowej <td>specyficzny dla hodowli U2OS</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>UCSF Zakład</td><td></td><td>hodowli komórkowej specyficzny dla hodowli U2OS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek II Chambered Szkło nakryciowe</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Matryplate 96-dołkowa płytka</td><td>Brooks Life Science Systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% rozpuszczalna w alkaliach kazeina</td><td>EMD Millipore</td><td>70955</td><td>Nie wszystkie kazeiny są takie same</td></tr><tr><td colspan="4">(Opcjonalnie) Odczynniki do syntezy DNA</td></tr><tr><td>5' Modyfikator aminy C6</td><td>Glen Research</td><td>Oct-06</td><td></td></tr><tr><td>dA-tiofosforamidyt</td><td>Glen Research</td><td>10-700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Analysis Software</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>RyTrack.pro</td><td>http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker</td><td></td><td></td><td></td>http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software</tr></tbody></table>

produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Wielowartościowość komercyjnych kropek kwantowych (QD) i trudności związane z produkcją kropek monowartościowych ograniczyły ich zastosowania w biologii, gdzie grupowanie i przestrzenna organizacja biomolekuł jest często przedmiotem badań. Opisujemy tutaj protokół wytwarzania monowalentnych kropek kwantowych (mQD), który można osiągnąć w większości biologicznych laboratoriów badawczych poprzez proste zmieszanie QD rdzenia/powłoki CdSe/ZnS z fosforotionianem DNA (ptDNA) o określonej długości. Po tym, jak pojedyncza nić ptDNA owinie QD, dodatkowe nici są wykluczane z powierzchni. Produkcja mQD w ten sposób może odbywać się na małą i dużą skalę, przy użyciu komercyjnych odczynników i w minimalnych krokach. Te mQD mogą być specyficznie kierowane na cele biologiczne poprzez hybrydyzację z komplementarnym jednoniciowym docelowym DNA. Demonstrujemy zastosowanie tych mQD jako sond obrazowych, znakując receptory Notch oznaczone SNAP na żywych komórkach ssaków, na które są ukierunkowane mQD zawierające ugrupowanie benzylguaninowe.

Przeniesienie QD z fazy organicznej do wodnej jest kluczowe dla produkcji mQD, jednak może być zależne zarówno od warunków, jak i od rodzaju QD. Przeniesienie fazy w sekcji 1.1 powinno wyglądać tak przejrzyście, jak w dwóch pierwszych fiolkach na Rysunku 3. Jeśli przeniesienie przypomina bardziej fiolkę 3, należy spróbować ponownie, zmieniając warunki.
Po pokryciu kropki kwantowych (QD) ujemnie naładowanym DNA powinny one migrować w żelu oddzielnie od nieopakowanych QD. Przy użyciu alikwotu nieopakowanych QD jako kontroli, po dodaniu ptDNA powinien pojawić się drugi, szybciej migrujący prążek, co widać na pierwszym żelu na Rysunku 2B. Całkowite utworzenie mQD jest demonstrowane przez zanik prążka nieruchomego i jego przejście w prążek ruchomy, co widać na ostatnim żelu na Rysunku 2B. Jeśli alikwot otrzymanego produktu mQD migruje jako pojedynczy prążek oddzielny od nieopakowanych QD, oznacza to, że mQD są monowalentne i gotowe do użycia w kolejnych krokach.
Labelowanie komórek powinno być specyficzne dla wybranego celu i powinno zależeć od poziomów ekspresji białka oraz stężenia mQD. W przypadku każdej konkretnej aplikacji często wymagana jest empiryczna optymalizacja zarówno stężenia mQD, jak i pasywacji mQD. Rysunek 4B przedstawia labelowanie komórek U2OS wykazujących ekspresję receptora Notch z tagiem SNAP przy użyciu mQD w stężeniu od 0,5 nM do 10 nM.
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="Schemat reakcji chemicznych przedstawiający oddziaływania białek celowanych za pomocą SNAP, CLIP i HALO z DNA." src="/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Modułowe celowanie mQDs. mQDs hybrydyzują z ssDNA funkcjonalizowanym różnymi cząsteczkami celującymi. DNA połączone z benzylguaniną kieruje mQDs do białek fuzyjnych znakowanych SNAP. Inne modyfikacje 5’ oraz sekwencje DNA umożliwiają kierowanie mQDs do wielu innych biomolekuł. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="Schemat procesu powlekania nanocząsteczek PEG z owijaniem DNA; układ przeniesienia fazowego; uwagi chemiczne." src="/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat produkcji mQD. (A) Kropki kwantowe (QD) w fazie organicznej są przenoszone do fazy wodnej poprzez traktowanie mPEG-tiolem i TBAB, owijane ptDNA i pasywowane karboksy-PEG6-alkanotiolem. Reprezentatywne obrazy TEM przedstawiają odpowiednio organiczne QD545, QD585 i QD605. (B) Metoda empirycznego wyznaczania stechiometrii oddziaływania między QD a ptDNA w kroku drugim opisanym powyżej. Stechiometrie QD i ptDNA są weryfikowane empirycznie za pomocą densytometrii w taki sposób, aby końcowa stechiometria reakcji wynosiła 1:1 (QD:ptDNA). Początkowa liczba moli ptDNA jest mnożona przez stosunek QD:mQD i korygowana o rzeczywistą objętość po konjugacji, aby uzyskać liczbę moli wymaganą do osiągnięcia konjugacji 1:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="Proces transferu fazowego kropek kwantowych; schemat przedstawiający udany/nieudany transfer oraz analizę pasywacji." src="/files/ftp_upload/52198/52198fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
	Rysunek 3. Szczegóły eksperymentalne produkcji mQDs. (A) Reprezentatywne zdjęcia udanego i nieudanego transferu fazowego. Kropki kwantowe powinny widocznie przenosić się między gęstą fazą organiczną a mniej gęstą fazą wodną. Niepełne rozdzielenie faz świadczy o słabym transferze. (B) ptDNA może zostać zastąpiony przez alkan-PEG-tiol. Dane z żelu po prawej stronie są reprezentatywne dla reakcji, w której znaczna frakcja ptDNA została wyparta z kropek kwantowych w wyniku nadmiernej pasywacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="Schemat ekspresji SNAP-tagu; znakowanie BG-DNA, hybrydyzacja kropkami kwantowymi. Wyniki analizy kropek kwantowych." src="/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Znakowanie białek z SNAP-tagiem w żywych komórkach. (A) Schemat przedstawiający ekspresję, przyłączenie i znakowanie receptora z SNAP-tagiem za pomocą mQD ukierunkowanego na BG. (B) Reprezentatywne znakowanie komórek wykazujących ekspresję konstruktu SNAP-Notch-mCherry przy różnych stężeniach mQD. mQDs pasywowane PEG12 kolokalizują z mCherry, co wskazuje na specyficzne znakowanie. Niższe gęstości znakowania (&lt;0,5 nM) są zazwyczaj preferowane dla śledzenia pojedynczych cząsteczek. Pasek skali wynosi 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Dostarczamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania monowalentnych docelowych kropek kwantowych (mQD) z fosforoazotanu DNA o określonej długości. Owijanie DNA odbywa się z dużą wydajnością, dlatego produkty nie wymagają oczyszczania. Demonstrujemy zastosowanie znacznika SNAP do kierowania mQD do receptorów na powierzchni komórki w zastosowaniach obrazowania żywych komórek.

Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie łatwego i dającego się uogólnić protokołu przygotowania monowalentnych kropek kwantowych do obrazowania pojedynczych cząsteczek docelowych białek błonowych w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez wprowadzenie najpierw stechiometrycznej ilości długiego ligandu polifosfooligonukleotydowego do kropki kwantowej. Długie DNA całkowicie owija kropkę kwantową i zapobiega wiązaniu się drugiej cząsteczki DNA, generując w ten sposób monowartościowe kropki kwantowe wyłącznie i ilościowo. Oddzielnie.Funkcjonalizowane benzo guine, komplementarne sekwencje DNA są przygotowywane do celowania w białka błonowe znakowane zatrzaskowo ulegające ekspresji na żywych komórkach. Następnie, sekwencyjne traktowanie żywych komórek eksprymujących białka błonowe znakowane zatrzaskowo za pomocą benzo guine, DNA, a następnie monowalentnych kropek kwantowych prowadzi do selektywnego znakowania docelowego receptora. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie docelowych trajektorii dystrybucji i dyfuzji białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki.Ostatecznie wyodrębnia się dynamiczne informacje czasoprzestrzenne w czasie rzeczywistym o białkach docelowych w żywych komórkach, aby ujawnić, jak cząsteczki docelowe działają in vivo. Główną zaletą tego podejścia do syntezy monowalentnych kropek kwantowych jest jego prostota i ogólna dostępność. W przeciwieństwie do wielu innych podejść, które wymagają specjalnych umiejętności lub sprzętu, to podejście jest stosunkowo proste.W związku z tym powinien być dostępny dla każdego laboratorium i dla każdej dyscypliny. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy Zeva i ja zaczęliśmy dyskutować o tym, w jaki sposób można połączyć naszą wiedzę na temat syntezy nanocząstek DNA, aby lepiej kontrolować reaktywność nanocząstek. W ciągu jednego weekendu przeprowadziliśmy wspólnie wstępne eksperymenty z zasadą zatwierdzania.Coraz częściej nasza pierwsza próba zakończyła się sukcesem. W tym filmie używamy monowalentnych kropek kwantowych do badania dynamiki pojedynczych cząstek receptora notch w żywych komórkach ssaków. Jednak te monowalentne kropki kwantowe powinny znaleźć szerokie zastosowanie we wszelkich badaniach, które wymagają śledzenia pojedynczych cząstek.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nie wszystkie dostępne na rynku kropki kwantowe są takie same, zarówno geometrycznie, jak i chemicznie. W związku z tym wymagana będzie pewna optymalizacja. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie przy przenoszeniu fazy, a etapy dodawania DNA związane z fosforem I mogą być onieśmielające dla laboratorium bez doświadczenia w chemii wielosyntetycznej.Na początek rozcieńczyć 200 mikrolitrów jednomikromolowego roztworu kropek kwantowych fazy organicznej z 400 mikrolitrami chloroformu w pięciomililitrowej szklanej fiolce. Połącz te kropki kwantowe z mieszaniną 400 mikrolitrów 0,3-molowego roztworu chloroformu bromku tetrabutyloamonu i 36 mikrolitrów czystego tiolu pec i wstrząśnij przez noc. Następnie dodaj 800 mikrolitrów 0,2-molowego roztworu wodnego wodorotlenku sodu i wstrząsaj przez 30 sekund.Przeniesienie fazowe następuje w ciągu kilku minut, na co wskazuje przeniesienie kolorowych cząstek do fazy wodnej powyżej gęstszej fazy organicznej. Jeśli cząstki agregują się w trzeciej fazie między fazą wodną a organiczną, należy wydłużyć czas inkubacji za pomocą tarczy pec. Jeśli faza wodna pozostaje czysta, oznacza to, że kropki kwantowe nie uległy przeniesieniu fazowemu.Zwiększ stężenie tarczy piersiowej, aby złagodzić słabe przenoszenie fazy. Następnie odzyskaj kolorową fazę wodną. Następnie skoncentruj zebrane kropki kwantowe za pomocą kolumny spinowej racona do jednego mililitra.Dodaj stężony roztwór kropek kwantowych do kolumny cidex NEP 10 wstępnie zrównoważonej 10-milimolowym buforem tris zawierającym 30 milimolowy chlorek sodu. pH osiem wymyj kropki kwantowe za pomocą 1,5 mililitra buforu elucyjnego przez przepływ grawitacyjny. Przystąp do pomiaru stężenia kropek kwantowych za pomocą spektroskopii absorpcyjnej na 350 nanometrach.Aby przygotować monowalentne docelowe kropki kwantowe, kup lub zsyntetyzuj fosfo osiem DNA, przygotuj jeden mililitr 100-anolowego roztworu kropek kwantowych w 10-milimolowym buforze tris zawierającym 30 milimolowy chlorek sodu o pH osiem. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 100 nanomolowego roztworu fosfo IO eight DNA. Kroplami do wodnych kropek kwantowych przez jedną minutę, energicznie mieszając.Wymieszaj lub umieść mieszaninę na shakerze na dodatkowe dziewięć godzin. Usuń około 10 mikrolitrów mieszaniny kropek kwantowych, aby uruchomić na analitycznym żelu agros. Usuń również podobne stężenie niesprzężonych kropek kwantowych w fazie wodnej.Następnie przy około dwóch mikrolitrach sześciokrotnego bufora ładującego fi w celu zwiększenia gęstości roztworu. Uruchom te dwie próbki razem na żelu AROS o objętości 0,8% w buforze bidenowym sodu przez 15 minut przy napięciu 150 woltów. Wynikiem powinno być pojedyncze pasmo w niesprzężonym torze kontrolnym migrujące w pobliżu studni i dwa pasma w pasie ze sprzężonymi kropkami kwantowymi.Oblicz niesprzężoną frakcję kropek kwantowych, używając względnej intensywności dwóch pasm. Następnie użyj tego ułamka do obliczenia dodatkowej objętości 100 nanomolowego roztworu fosfo ósmego DNA wymaganej do dopasowania liczby kwantowych kropek kwantowych. Powtórz procedurę jeszcze raz z tą obliczoną objętością lub do momentu, gdy sprzężone kropki kwantowe zapadną się w pojedyncze pasmo na żelu, wskazując na całkowite sprzężenie wszystkich kropek kwantowych.Następnie dodaj 100 mikrolitrów 10-milimolowego karboksylu. Przymocuj sześć alkanowych tioli do sprzężonych monowalentnych, docelowych kropek kwantowych i potrząsaj przez 10 minut. Aby usunąć nadmiar pegola alkanowego, dodaj 0,5 mililitra roztworu kropek kwantowych do pięciokolumnowej kolumny ACE fitex knap wstępnie zrównoważonej buforem wyjaśniającym.Następnie zbierz monowalentne, docelowe kropki kwantowe z jednym mililitrem buforu elu za pomocą przepływu grawitacyjnego. Skoncentruj zebrane kropki kwantowe za pomocą centrycznej kolumny spinowej. Te monowalentne, ukierunkowane kropki kwantowe mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza miesięcznie, zjadały monowalentne kropki kwantowe tuż przed eksperymentem obrazowania przy użyciu odczynników, takich jak kazeina lub komórki albuminy surowicy bydlęcej, wyrażające białko snap tagg na całkowitym odbiciu wewnętrznym, fluorescencji lub szkle o jakości darniowej.W tym konkretnym eksperymencie używamy linii komórkowej U2 OS wyrażającej zatrzaskowo oznaczony receptor z wycięciem i wysokiej jakości szklanych powierzchni po przyczepieniu komórek do szkła, usuwamy pożywkę wzrostową i przemywamy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. Następnie inkubować komórki przez 10 do 30 minut w temperaturze pokojowej w PBS lub pożywce komórkowej zawierającej DNA gwinejki benzoilowej, przygotowanej zgodnie z opisem w protokole tekstowym po inkubacji z benzo Guin, DNA, ostrożnie umyć komórki PBS lub pożywką komórkową, a następnie inkubować komórki przez około pięć do 10 minut z monowartościowymi kropkami kwantowymi. Umyj niezwiązane monowartościowe kropki kwantowe i zwróć komórki do buforu lub pożywki odpowiedniej zarówno do obrazowania, jak i obrazowania hodowli.Komórki korzystające z mikroskopu darniowego ze względu na jasność monowalentnych kropek kwantowych zbierają obrazy z dużą liczbą klatek na sekundę w murawie, jednocześnie obrazując podstawową stronę żywej komórki. Gdy kropki kwantowe zostaną pokryte ujemnie naładowanym DNA, powinny migrować na żelu oddzielnie od nierapowanych kropek kwantowych, używając podwielokrotności nieopakowanych kropek kwantowych jako kontroli. Drugie szybsze pasmo migracji powinno pojawić się po dodaniu Phosphol IO eight DN. Całkowite powstawanie monowartościowych kropek kwantowych jest demonstrowane wraz z utratą pasma nieruchomego i jego zapadnięciem się w pasmo ruchome.Jeśli podwielokrotność iloczynu monowalentnych kropek kwantowych migruje jako pojedyncze pasmo dające się oddzielić od nieopakowanych kropek kwantowych, to kropki kwantowe są rzeczywiście monowalentne i gotowe do wykorzystania w dalszych krokach. Pokazano tutaj reprezentatywne znakowanie komórek wyrażających konstrukt wiśniowy M o zatrzaskowym nacięciu w różnych stężeniach monowalentnych kropek kwantowych. Monowalentne kropki kwantowe pasywowane PEG 12 zlokalizowane wspólnie z wiśnią M, wskazujące na specyficzne oznakowanie.Niższe gęstości etykietowania są generalnie preferowane do śledzenia pojedynczych cząstek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zsyntetyzować fluorescencyjną nanocząstkę, która jest jasna, modularna monowalentna i ukierunkowana Po opanowaniu technikę tę można wykonać w dwóch przygotowaniach danych monowalentnych kropek kwantowych i godzinnym znakowaniu fotokomórek, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Należy pamiętać, że przy użyciu dostępnych na rynku odczynników wyjściowych możemy wyprodukować monowalentne kropki kwantowe o doskonałych właściwościach fotofizycznych, które można wykorzystać do długich eksperymentów śledzenia pojedynczych cząstek.Po tej procedurze inne białka mogą być znakowane za pomocą fuzji znaczników snap, aby śledzić ich dynamikę molekularną na żywych komórkach. Praca z kropką kwantową może być niezwykle trudna do odkurzenia, więc nie zapomnij założyć rękawic ochronnych i fartuchów laboratoryjnych podczas wykonywania tej procedury.

production-and-targeting-of-monovalent-quantum-dots

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nanocząstki, takie jak półprzewodnikowe kropki kwantowe (QDs), mogą być wykorzystywane do tworzenia agentów fotoaktywowalnych w zastosowaniach przeciwdrobnoustrojowych lub przeciwnowotworowych. Niniejsza technika przedstawia sposób nadawania rozpuszczalności w wodzie kropkom kwantowym z tellurku kadmu (CdTe), ich sprzęganie z antybiotykiem oraz przeprowadzanie testu inhibicji bakteryjnej w oparciu o krzywe wzrostu i liczenie kolonii na płytkach.

Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Opisujemy przygotowanie koloidalnych kropek kwantowych o zminimalizowanym rozmiarze hydrodynamicznym do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek. W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi, nanocząstki te mają rozmiar zbliżony do białek globularnych i są zoptymalizowane pod kątem jasności pojedynczych cząsteczek, stabilności przeciwko fotodegradacji oraz odporności na nieswoiste wiązanie z białkami i komórkami.

Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania półprzewodnikowych bocznych kropek kwantowych zdefiniowanych przez bramkę na heterostrukturach arsenku galu. Te nanoskalowe urządzenia są używane do wychwytywania kilku elektronów w celu wykorzystania ich jako bitów kwantowych w kwantowym przetwarzaniu informacji lub do innych eksperymentów mezoskopowych, takich jak pomiary przewodności koherentnej.

Nanowytwarzanie bocznych kropek kwantowych GaAs/AlGaAs zdefiniowanych przez bramkę

Omówiono proces produkcji i eksperymentalne techniki charakterystyki pomp jednoelektronowych opartych na kropkach kwantowych krzemowo-metalowo-tlenkowo-półprzewodnikowych.

Kropki kwantowe krzemowo-metalowo-tlenkowo-półprzewodnikowe do pompowania pojedynczych elektronów

W tym protokole synteza bezcdowych kropek kwantowych InP/ZnS (QD) jest szczegółowa. Płyny QD na bazie InP zyskują na popularności ze względu na toksyczność jonów Cd2+, które mogą być uwalniane w wyniku degradacji nanocząstek. Po syntezie QD są rozpuszczane w wodzie przy użyciu amfifilowego polimeru do zastosowań biomedycznych.

Synteza bezkadgingowych kropek kwantowych InP/ZnS odpowiednich do zastosowań biomedycznych

Tutaj prezentujemy niezawodną metodę monitorowania inkorporacji nanocząstek do matrycy gospodarza polimeru poprzez enkapsulację pęcznienia. Pokazujemy, że stężenie powierzchniowe kropek kwantowych selenku kadmu można dokładnie zobrazować za pomocą przekrojowego obrazowania fluorescencyjnego.

Zaawansowana analiza składu kompozytów nanocząstkowo-polimerowych z wykorzystaniem bezpośredniego obrazowania fluorescencyjnego

Przedstawiono protokół do produkcji wysokowydajnych, czystych niebieskich diod elektroluminescencyjnych opartych na kropkach kwantowych ZnCdS/ZnS poprzez zastosowanie katody z autooksydowanego aluminium.

Ulepszony wtrysk elektronów i uwięzienie ekscytonów dla czystych niebieskich diod elektroluminescencyjnych z kropkami kwantowymi poprzez wprowadzenie częściowo utlenionej katody aluminiowej

Przedstawiono protokół syntezy klastrów In37P20(O2C14H27)51 i ich konwersji na kropki kwantowe z fosforku indu.

Synteza klastrów In37P20(O2CR)51 i ich konwersja do kropek kwantowych InP

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Obecny protokół opisuje metodę immunoznakowania białka w skrawkach tkanki serca za pomocą kropek kwantowych. Technika ta stanowi użyteczne narzędzie do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji i ekspresji dowolnego białka na poziomie ultrastrukturalnym.

Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Poznaj protokół przygotowania monowalentnych kropek kwantowych z wykorzystaniem fosforotioatowego DNA do obrazowania pojedynczych cząsteczek białek błonowych w żywych komórkach. Metoda ta umożliwia precyzyjne śledzenie dynamiki receptorów.

Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

Przeglądaj więcej filmów